Una baixa expressió baixa de p85α en els fibroblasts estromals afavoreix la metàstasi cel·lular de càncer de mama mitjançant una paracrina mediada per exosoma wnt10b | oncogen

Una baixa expressió baixa de p85α en els fibroblasts estromals afavoreix la metàstasi cel·lular de càncer de mama mitjançant una paracrina mediada per exosoma wnt10b | oncogen

Anonim

Temes

  • Microambient contra el càncer
  • Metàstasi

Resum

P85α, que actua com a supressor del tumor, es troba freqüentment regulat en diversos càncers humans. Tot i això, el paper de la p85α en el microambient tumoral és desconegut. Aquí, informem que l’expressió aberrant de p85α en l’estroma del càncer de mama és clínicament rellevant per a la progressió de la malaltia del càncer de mama. Els fibroblasts estromals poden adquirir els distintius dels fibroblasts associats al càncer (CAF) com a resultat de la pèrdua d’expressió p85α. El paracrí Wnt10b a partir de fibroblasts deficients de p85α pot promoure la progressió del càncer mitjançant la transició epitelial a mesenquimal (EMT) induïda per la via canònica Wnt. A més, els exosomes tenen un paper clau en el transport parantrí Wnt10b, des dels fibroblasts fins a les cèl·lules epitelials del càncer de mama. Els nostres resultats revelen que l'expressió p85α en els fibroblasts estromals té un paper crucial en la regulació i la progressió del càncer de mama modificant la molèstia estromal-epitelial i la remodelació del microambient tumoral. Per tant, p85α pot funcionar com a supressor del tumor i representar un nou candidat a diagnòstic, pronòstic i teràpia dirigida.

Introducció

Els tumors de mama són altament complexos i estan compostos per cèl·lules epitelials neoplàstiques dins d’un microambient associat a un tumor. L’entorn peritumoral consta d’una matriu extracel·lular i nombrosos components estromals, incloent fibroblasts associats al càncer (CAFs), cèl·lules immunes inflamatòries, cèl·lules mare mesenquimals i cèl·lules endotelials de la sang i sistemes limfàtics. 1, 2 Les interaccions estromal-epitelials tenen un paper crític en la tumourigenesi mitjançant la regulació de la proliferació cel·lular, la supervivència, la polaritat, la diferenciació i l’angiogènesi, així com modificant els compartiments cel·lulars, la qual cosa resulta en la coevolució de les cèl·lules tumorals i el seu microambient. 3, 4 Els fibroblasts són el principal tipus cel·lular que es troba al compartiment estromal i aquestes cèl·lules mantenen estrictament l’homeòstasi evitant la transformació neoplàstica de les cèl·lules epitelials en teixits normals mitjançant xarxes de citocines i factors de creixement. 4 CAF promouen la progressió del tumor, però l’aparició d’aquesta característica cel·lular i la regulació de les interaccions estromal-epitelials són poc enteses.

Tot i que les proves aclaparadores indiquen que el comportament de les cèl·lules tumourigèniques està altament regulat pel complex microambient tumoral, clàssicament s’ha considerat una instabilitat del genoma com el mecanisme subjacent de l’inici i la progressió del tumor. La inestabilitat cromosòmica pot donar compte de la generació de diverses cèl·lules canceroses transformades genèticament. El càncer de mama és una malaltia heterogènia amb anormalitats en la funció i l’expressió d’una varietat de proteïnes que contribueixen a la progressió, incloses BRCA1, RB1, TP53, PTEN, AKT1, PIK3CA, KRAS i GATA3. 5, 6 La majoria d’aquests gens estan implicats en la regulació del cicle cel·lular, l’apoptosi, la transcripció gènica i altres cascades de senyalització cel·lular. Per tant, la majoria de les investigacions s’han centrat en mutacions en les pròpies cèl·lules epitelials tumorals i la posterior progressió neoplàstica i diversitat de subtipus histològics. Tot i això, en realitat, l’estroma del tumor també es pot activar de manera inapropiada en la progressió del càncer. Alguns informes han revelat que vies específiques de senyalització en CAFs estan implicades en la supressió de la formació de tumors. La pèrdua o la regulació inferior de la CSL de Notch efector en fibroblasts és suficient per a l'activació de la CAF i afavoreix la tumourigenesi. 8 La pèrdua de receptor del factor II del factor de creixement del tumor (TGF-β) dels fibroblasts pot afavorir el creixement del carcinoma mamari i la invasió en el model de ratolí. 9 Els fibroblasts amb dèficit de timp poden augmentar els xenografts del tumor humà i la metàstasi espontània. 10 La pèrdua de Pten en fibroblasts estromals pot accelerar la iniciació, la progressió i la malignitat del càncer de mama. 11 En general, encara no està clar si les cèl·lules estromals que porten mutacions o alteracions en l'expressió d'aquests gens poden orquestrar la progressió de malignes mamàries modificant crucialment la crosstalk estromal-epitelial i remodelant el microambient tumoral. Addicionalment, els mecanismes moleculars subjacents al paper potencial dels gens estromals anormalment expressats en la transducció del senyal de càncer requereixen més dilucidació.

Els membres de la família de proteïnes 3-cinasa fosfosositides (PI3K), que consten de tres classes d’isoformes PI3K, són nòduls crítics del senyal intracel·lular. Les isoformes PI3K regulen la tumourigènesi i la progressió maligna mitjançant l’activació de múltiples proteïnes efectores a l’aigua que controlen diversos processos cel·lulars, com ara creixement, supervivència i motilitat. 12, 13, 14 Fins ara, només hi ha estat implicada la classe IA PI3Ks, que són heterodímeros compostes per una subunitat reguladora (p85α, p55α, p50α, p85β o p55γ) en complex amb una subunitat catalítica (p110α, p110β o p110δ). en càncer humà. 15, 16 Les mutacions oncogèniques de les subunitats PI3K són freqüents en diversos càncers humans, inclòs el càncer de mama; El PIK3CA està mutat entre un 25-40% dels càncers de mama, especialment en el càncer de mama ER-positiu. 14, 17 Tot i que el paper de la via PI3K en les cèl·lules canceroses s’havia dilucionat, cal explorar el mecanisme potencial de la via PI3K en l’estroma del tumor. En realitat, les alteracions de la via PI3K estan implicades en l'activació de l'estroma tumoral. 18, 19 Recentment, Pten, un regulador clau de la senyalització PI3K, ha demostrat ser un supressor en l'estroma del tumor. La supressió de Pten en fibroblasts estromals pot accelerar la iniciació, la progressió i la transformació maligna de tumors de mama. La P85α és també una subunitat reguladora crucial que media l'activació de la classe IA PI3Ks a través del receptor tirosina quinases. Les mutacions somàtiques en p85α poden promoure la supervivència de cèl·lules canceroses, el creixement cel·lular independent de l’ancoratge i l’oncogènesi mitjançant l’activació de la classe IA PI3Ks. Tanmateix, encara queden els efectes i el paper funcional de la p85α en els fibroblasts estromals peritumorals en l’inici i la progressió del carcinoma de mama.

En aquest estudi, demostrem que una expressió relativament baixa de p85α en l’estroma està associada a la tumourigenesi mamària. Concretament, la pèrdua d’expressió de p85α estimula la conversió de fibroblasts en miofibroblasts activats i dóna lloc a l’adquisició de funcions CAF característiques que promouen la proliferació i metàstasi de cèl·lules epitelials de càncer de mama mitjançant la senyalització Wnt10b de paracrina mediada per exosoma. Els nostres resultats revelen que l'expressió de p85α en fibroblasts té un paper crucial en la modificació de l'estructura intestinal-l'epitelial i la pertorbació de l'homeòstasi en el microambient tumoral, que posteriorment regula l'inici del càncer de mama i la progressió maligna.

Resultats

Una expressió baixa de p85α en l'estroma és associada amb una tumourigenesi mamària

Per investigar el paper de l’expressió estromal de p85α en el càncer de mama, es van analitzar els nivells d’expressió de p85α en els microarrays d’estroma del carcinoma de mama humans a partir de bases de dades de GEO. Curiosament, les mostres d’estroma de càncer de mama van mostrar menor expressió en comparació amb l’estroma de mama normal, cosa que indica que l’expressió p85α va disminuir significativament al compartiment estromal del càncer de mama (Figura 1a). A més, es va trobar que l'expressió p85α en un estroma del carcinoma de mama humà és menor en els pacients de recurrència en 3 anys que en el grup de no recurrència i els pacients amb un nivell relativament baix d'expressió de p85α mostraven un augment significatiu de la taxa de recurrència en comparació amb la nivell relativament alt del grup d’expressió p85α (figura suplementària S1A). Per avaluar encara més la relació entre l’expressió de p85α en l’estroma del càncer de mama i la progressió del càncer, es van recollir centenars de tumors de càncer de mama primaris, incloent-hi múltiples etapes de metàstasi del node tumoral (TNM), que es van examinar mitjançant l’anàlisi immunohistoquímica de l’expressió de p85α en un microarray tissular mitjançant Algoritme d’anàlisi d’imatges digitals. Els resultats van indicar que el nivell de proteïna de p85α en l’estroma del càncer de mama està inversament correlacionat amb l’etapa TNM del carcinoma de mama, on es va trobar una expressió reduïda de p85α en l’estroma del càncer de mama en fase TNM tardana en comparació amb la seva expressió en els teixits en fase TNM precoç (figura 1b). Tanmateix, aparentment, l’expressió de p85α no tenia relació amb l’edat i el grau de diferenciació cel·lular del pacient (Taula suplementària S1). A la figura 1c es mostra la coloració immunohistoquímica de p85α en mostres representatives de tumors de TNM en fase II i III.

Image

Una expressió baixa de p85α en l'estroma és associada amb una tumourigenesi mamària. ( a ) Nivells d'expressió gènica de p85α (PIK3R1) en estroma normal i de càncer de mama a partir de GSE9014. Les dades són la mitjana ± sem *** Valor P0.001. ( b ) Tauler esquerre: nivells d’expressió de P85α en mostres d’estroma de càncer de mama. Tauler dret: La proporció de diferent extensió de l’expressió p85α en diversos estromes de càncer de mama en estadi. Les dades són la mitjana ± sem * valor P = 0.05. ( c ) Imatges immunohistoquímiques representatives de diverses etapes del càncer de mama. Barra d’escala, 100 μm. Línies puntejades estructures cercades, epiteli contra el càncer, les fletxes, expressió significativa de p85α en l'estroma del càncer. ( d ) El mesurament del volum i el pes del tumor de les cèl·lules 4T1 cultivades per via sola per via sola, amb WT o p85α - / - fibroblasts. Cada grup té sis ratolins ( n = 6). Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( e ) Mesures de volum i pes del tumor de cèl·lules MDA-MB-231 similars a ( d ). Cada grup té sis ratolins ( n = 6). Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( f ) Quantificació de metàstasis hepàtiques en els ratolins descrits a ( d i e ) mitjançant la tinció H&E. Barra d’escala, 100 μm. Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01. ( g ) Expressió de P85α en fibroblasts coculturats amb cèl·lules canceroses de mama de GSE41678. Les dades són la mitjana de Mono mono, cultiu de cèl·lules canceroses; Co-231, fibroblasts coculturats amb MDA-MB-231. ** P- valor0.01, *** P- valor0.001.

Imatge a mida completa

Els fibroblasts són el component principal de l'estroma del càncer de mama. Per tant, per confirmar aquestes observacions clíniques, establim un model d’implantació de tumors de mama mitjançant injecció subcutània de cèl·lules 4T1 o MDA-MB-231 barrejades amb fibroblasts de tipus salvatge (WT) o p85α - / - . Als 16 o 23 dies després de la implantació, les cèl·lules 4T1 i MDA-MB-231 barrejades amb fibroblasts p85α - / - van generar tumors de major volum i pes que les cèl·lules 4T1 i MDA-MB-231 barrejades amb fibroblasts WT o sols, respectivament (Figures 1d i e). Els fibroblasts WT o p85α - / - sols van formar tumors en els ratolins (dades no mostrades). A més, l'avaluació d'òrgans recollits de ratolins que van ser assassinats va revelar metàstasis hepàtiques notables presents en els ratolins injectats amb cèl·lules 4T1 o MDA-MB-231 barrejades amb fibroblasts p85α - / -, mesurats quantificant el nombre de metàstasis al fetge (Figura 1f ). Aquestes dades van revelar que els fibroblasts p85α poden afavorir la metàstasi del càncer de mama en comparació amb els efectes dels fibroblasts WT. En consonància amb els resultats anatòmics, la tinció d’hematoxilina i eosina del teixit hepàtic també va confirmar aquests resultats (figura suplementària S1B).

En particular, alguns informes han demostrat que les cèl·lules epitelials del càncer també poden regular l'estroma del tumor. 23, 24 Curiosament, quan es van cultivar diverses línies de cèl·lules fibroblastes humanes amb cèl·lules de càncer de mama MDA-MB-231, totes van mostrar una regulació baixa de l’expressió p85α (figura 1g). 25 També hem verificat aquestes dades a la base de dades pública mitjançant western blot (figura suplementària S1C). Per tant, segons una teoria de la coevolució estromal, 26 proposem que l’origen de l’expressió p85α anormal en CAFs no només es diferencia, sinó que també condueix a la coevolució de les interaccions estromal-epitelials.

Per tant, aquestes dades suggereixen que la correcció o la pèrdua aberrant d’una expressió de p85α en l’estroma del tumor podria estar correlacionada amb l’inici i la progressió del carcinoma de mama.

La supressió P85α converteix els fibroblasts en miofibroblasts activats que presenten característiques de CAFs

Els CAF inclouen un gran nombre de miofibroblasts, que són fibroblasts activats que tenen una capacitat de promoure substancialment la tumourigenesi. 27, 28 Les dades d’immunoblot i immunofluorescència van indicar que la supressió de p85α en fibroblasts va promoure significativament l’expressió d’actina muscular llisa α, que és un marcador de miofibroblasts (figures 2a i b). A més, es va detectar que la pèrdua d’expressió p85α s’activa notablement Akt, una quinasa crítica a l’interior de PI3K, que és coherent amb els informes anteriors sobre la funció de p85α com a subunitat reguladora clau de PI3K (Figura 2a). 29 Altres característiques dels miofibroblasts inclouen la formació de fibres d’actomiosina i una contractilitat més forta. Els assajos de contracció del gel de col·lagen van indicar que els fibroblasts p85α / / mostraven una major capacitat d'induir la contracció del gel en comparació amb els fibroblasts de WT (figura 2c). A més, els fibroblasts p85α - / van mostrar una estreta morfologia en plats (cultiu bidimensional) i gels de col·lagen (cultiu tridimensional; figura 2d). Recentment, altres informen que l'expressió CD44 contribueix a l'adquisició d'un fenotip de fibroblast activat en el microambient tumoral. 30, 31 De manera constant, hem trobat una acumulació i una acumulació de CD44 millorades a la superfície de fibroblasts p85α / / en comparació amb els fibroblasts de WT (Figura 2e).

Image

La supressió P85α converteix els fibroblasts en miofibroblasts activats que presenten característiques de CAFs. ( a ) Anàlisi del blot occidental de p85α, fosfo-Akt, Akt i α-expresió muscular actina (α-SMA) en WT i p85α - / - fibroblasts. p-Akt, Fosfós-Akt (Ser473); T-Akt, Akt (pan). ( b ) Anàlisi d'immunofluorescència de l'expressió α-SMA en WT i p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 50μm. ( c ) La zona dels gels contractats induïda per WT o p85α - / - fibroblasts. També es mostra l’aparició dels gels contractats que tenen quatre rèpliques a 72 h. ( d ) La morfologia de fibres WT o p85α - / - en un plat o gelosia de col·lagen descrit a la secció c ). ( e ) Anàlisi de la selecció de cèl·lules activades per fluorescència, Western blot i fluorescència (FACS) de l’expressió CD44 en WT i p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 20 μm. ( f ) Transcripció inversa: anàlisi de PCR de proteïnes de la família TGF-β i SDF-1. Expressió MMP2 i MMP9 en WT i p85α - / - fibroblasts. ( g ) Anàlisi quantitativa PCR de TGF-β1, SDF-1, MMP2 i MMP9 en WT i p85α - / - fibroblasts. Les dades són l’anàlisi mitjana immunosorbent (ELISA) relacionada amb l’enzim en relació amb l’enzim (ELISA) de TGF-β1, SDF-1, MMP2 i MMP9 en un medi condicionat de WT i p85α - / - fibroblasts. Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01. ( i ) Anàlisi ELISA de TGF-β1, SDF-1, MMP2 i MMP9 en expressions p85α - / - amb fibroblast condicionades quan es tracta amb o sense el inhibidor PI3K LY294002 (50 μ M) durant 24 hores i la solució DMSO com a un control. Fibroblasts con, p85α - / - tractats amb fibroblasts DMSO, LY, p85α - / - tractats amb LY294002. Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01.

Imatge a mida completa

A més, les CAF tenen el potencial de produir nivells elevats de factors segregats. 32, 33 Hem trobat que els fibroblasts p85α - / - poden expressar i secretar nivells augmentats de TGF-β, factor 1 derivat de cèl·lules estromals (SDF-1), metaloproteinasa-2 (MMP2) i MMP9 en comparació amb els de fibroblasts WT ( Figures 2f – h). No obstant això, LY294002, un inhibidor de la via de senyalització PI3K / Akt, va disminuir notablement la capacitat dels fibroblasts p85α - / - per expressar i segregar citocines (Figura 2i i Figura Suplementària S2).

Aquests resultats indiquen que p85α domina crucialment l'activació de fibroblastos estromals i promou l'expressió i la secreció d'alts nivells de citocines de manera Akt dependent de l'activitat.

La deficiència de fibroblast p85α afavoreix la proliferació i la metàstasi de cèl·lules epitelials mamàries canceroses

S'ha suggerit que l'expressió elevada de factors solubles en els fibroblasts p85α - / - actua com a possible regulador de la migració i migració de cèl·lules canceroses del càncer. 32 Per provar aquesta hipòtesi, es van tractar cèl·lules MDA-MB-231, MCF-7 i 4T1 amb medi condicionat preparat (figura 3a) a partir de WT i p85α - / - fibroblasts, respectivament, o es van cultivar amb WT o p85α - / - fibroblasts., respectivament, i després es va examinar la proliferació cel·lular. Com es mostra a les figures 3b-d, els fibroblasts p85α - / - van promoure la proliferació i la formació de colònies de plaques d’aquestes cèl·lules canceroses en comparació amb els fibroblasts de WT.

Image

La deficiència de fibroblast p85α afavoreix la proliferació i la metàstasi de cèl·lules epitelials mamàries canceroses. ( a ) Esquema del disseny experimental. ( b ) Proliferació cel·lular de cèl·lules MCF-7, MDA-MB-231 i 4T1 en medis WT o p85α - / - amb fibroblast. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( c ) Anàlisi de formació de colònies de plaques de cèl·lules MCF-7, MDA-MB-231 i 4T1 en medis WT o p85α - / - amb fibroblast. Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01. ( d ) Proliferació cel·lular de cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 en cultiu amb fibres WT o p85α - / - fibroblasts per separat per càmeres transwell (por de 0, 4-μm). Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01. ( e ) La morfologia de les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 en medis WT o p85α - / - amb fibroblast. Barra d’escala, 100 μm. ( f ) La morfologia de les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades a Matrigel tractades amb WT o p85α - / - medi amb condicionament del fibroblast. Barra d’escala, 100 μm. ( g ) L'amplada relativa del rastreig en cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 en un medi condicionat diferent de WT o p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 1 cm. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( h ) El test de migració i invasió de cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en transwell amb fibroblasts. Barra d’escala, 50 μm. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05.

Imatge a mida completa

Curiosament, hem trobat que les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 tractades amb medi condicionat de p85α - / - fibroblasts presenten una morfologia semblant a la claveguera i perden les seves juntes estretes intercel·lulars (figura 3e). A més, les cèl·lules tractades amb medi amb condicionament fibroblast p85α - / mostraven característiques d’estiraments diferents i una motilitat millorada en cultius tridimensionals a Matrigel (figura 3f). Aquestes observacions van suggerir que la pèrdua d’expressió de p85α en fibroblasts pot fer que les cèl·lules canceroses siguin capaces de millorar la motilitat i propietats invasives. La investigació posterior mitjançant assaig de rascades i anàlisis de migració / invasió transwell va confirmar que el medi condicionat dels fibroblasts p85α - / - estimulava potentment la migració i la invasió de cèl·lules epitelials del càncer de mama (figures 3g i h).

Els fibroblasts amb deficiència de P85 afavoreixen la inducció d'EMT a les cèl·lules epitelials del càncer de mama mitjançant una via parantrina Wnt / β-catenina

Les cèl·lules epitelials del càncer perden les unions entre cèl·lules i cèl·lules i la polaritat apical-basal provocant un canvi en la forma de la cèl·lula i la inducció de l'EMT, la qual cosa permet a les cèl·lules epitelials estacionàries adquirir trets consistents amb la motilitat, la invasivitat i l'autorenovació renovades. 35, 36 Tal com es mostra a la figura 3e, aparentment, les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 van patir un canvi fenotípic similar al EMT quan es van tractar amb un medi condicionat amb fibroblast p85α - / - . Per tant, es va mesurar l’expressió de marcadors EMT i es va trobar que els marcadors mesenquimals vimentina i caragol estaven regulats i els marcadors epitelials E-cadherina i occludina es van baixar quan es van tractar cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 amb p85α - / - fibroblast- medi condicionat condicionat en comparació amb els tractats amb medi WT amb fibroblast, respectivament (figures 4a i b). Aquests descobriments van indicar que els fibroblasts p85α / / podrien promoure la inducció d'un esdeveniment EMT en cèl·lules de càncer de mama.

Image

Els fibroblasts P85α - / - promouen la inducció d'EMT a les cèl·lules epitelials del càncer de mama mitjançant un camí paracrí Wnt / β-catenina. ( a ) Anàlisi Western blot de marcadors EMT en cèl·lules MCF-7, MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en WT o p85α - / - medi amb condicionament del fibroblast. ( b ) Anàlisi d'immunofluorescència de l'expressió de marcadors EMT en cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en medi WT o p85α - / - amb fibroblast. Barra d’escala, 50 μm. ( c ) Anàlisi del blot occidental de l’activació de Wnt / β-catenina mitjançant l’expressió i localització de la fosfo-β-catenina i β-catenina en cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en WT o p85α - / - medi amb fibroblast. El gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) es va utilitzar com a control de càrrega de proteïnes citoplasmàtiques i es va utilitzar la laminina B com a control de càrrega de proteïnes nuclears. ( d ) Anàlisi d'immunofluorescència de la ubicació de β-catenina en cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en WT o p85α - / - medi amb condicionament del fibroblast. Barra d’escala, 20 μm. ( e ) Immunostainció β-Catenina al teixit tumoral descrita a les figures 1d i e. Barra d’escala, 50 μm. ( f ) Anàlisi del blot occidental de la ruta Wnt i dels marcadors EMT en condicions de senyalització paracrina i autocrina. Els efectes de siPorcn es mostren al tauler superior. ( g ) El test de migració i invasió de les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en control negatiu o el medi P85α - / - amb condicionament del fibroblast per Porcn. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. Barra d’escala, 100 μm.

Imatge a mida completa

Els informes indiquen que la senyalització Wnt pot regular l’expressió gènica durant l’EMT en càncer de mama. Per tant, hem analitzat l'activitat de la ruta de senyalització de Wnt / β-catenina en el nostre model de recerca. En comparació amb el medi condicionat dels fibroblasts de WT, el medi condicionat amb fibroblast p85α - / - va disminuir notablement els nivells de β-catenina fosforilada a Ser33 / 37 / Thr41 i va promoure la translació de β-catenina al nucli (figures 4c i d), cosa que indica que la La via de senyalització de wnt / β-catenina es va activar. En consonància amb els resultats in vitro , els fibroblasts p85α / / també van activar la senyalització del tumor en Wnt del tumor (figura 4e).

Aquí, es va especular que la probable font de lligands Wnt secretats que actuen sobre cèl·lules epitelials eren fibroblasts (com a factor paracrí) o cèl·lules canceroses de mama (com a factor autocrí). Per explorar aquest problema, vam eliminar Porcupine (Porcn), que codifica per a una aciltransferasa essencial per a la lipidació i secreció Wnt, 38 en cèl·lules 4T1 o fibroblastst p85α - / - fibroblastst per bloquejar la senyalització autocrina o paracrina Wnt, respectivament. Curiosament, tal com es mostra a la figura 4f, el descompte de Porcn a les cel·les 4T1 no va canviar l’activació de la via Wnt ni els nivells de marcadors EMT. En canvi, la derrota de Porcn en els fibroblasts p85α - / - va inhibir l'activació de Wnt i EMT de cèl·lules 4T1. Una anàlisi més detallada de la migració i la invasió cel·lular també va suggerir que la paracrina Wnt estava relacionada amb la metàstasi de les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 (figura 4g). Per tant, vam concloure que els lligands Wnt que van induir EMT de cèl·lules epitelials representaven un factor paracrí provinent de fibroblasts p85α - / - .

El Wnt10b actua com a factor paracrí i té un paper crucial en la inducció de l’EMT de cèl·lules epitelials del càncer de mama i en la facilitat de la metàstasi.

A continuació, es va mesurar l'expressió de proteïnes de la família Wnt implicades en vies canòniques en fibroblasts p85α - / - i es va trobar que l'expressió de Wnt10b augmentava significativament en fibroblasts p85α - / - en comparació amb fibroblasts WT (figures 5a i b). A més, les anàlisis de Western blot van indicar que els fibroblasts p85α / / van expressar nivells de Wnt10b molt elevats tant en sobrenedants com en lisats cel·lulars. A més, Wntless i Vps35, que es requereixen específicament per a la secreció Wnt, 39, 40 també es van regular en els p85α - / - fibroblasts (figures 5c i d). Per examinar el paper de Wnt10b en la cèl·lula de càncer de mama EMT i metàstasi, es van tractar les cèl·lules 4T1 amb un medi condicionat de p85α - / - fibroblasts en què Wnt10b va ser enderrocat. Com es mostra a les figures 5e i f, el derrocament de Wnt10b va reduir significativament la capacitat dels fibroblasts p85α / / per promoure l'activació de la via Wnt, EMT de les cèl·lules canceroses i la motilitat cel·lular. A més, la derrota de Wnt10b va deteriorar notablement la capacitat dels fibroblasts p85α / / per promoure el creixement del tumor, la metàstasi i l'activació de la via Wnt in vivo (figures 5g i). A més, en l'estroma associat al càncer de mama humà, l'expressió de Wnt10b es va regular significativament (figura 5j). L' anàlisi de correlació també va demostrar la relació inversa entre p85α i Wnt10b (figura 5k). Aquestes dades suggereixen que el Wnt10b dels fibroblasts p85α / / té un paper crucial en la inducció de l'EMT del càncer de mama i la promoció de la tumourigenesi.

Image

El Wnt10b com a factor paracrí té un paper crucial en la inducció de l’EMT de cèl·lules epitelials del càncer de mama i facilita la metàstasi. ( a ) Anàlisi quantitativa de PCR de l'expressió de la família Wnt en fibroblasts p85α / / normalitzats a fibroblasts WT. ( b ) Anàlisi ELISA de l'expressió Wnt10b en WT i p85α - / - medi amb fibroblast. Les dades són la mitjana ± sem *** valor P = 0.001. ( c ) Anàlisi Western blot de l'expressió Wnt10b en WT i p85α - / - medi amb condicionament fibroblast, i Wnt10b, Wntless, VPS35 en lisats cel·lulars. ( d ) Anàlisi d'immunofluorescència de l'expressió Wnt10b i Wntless i localització en WT i p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 20 μm. ( e ) Anàlisi Western blot de la ruta Wnt i dels marcadors EMT a les cèl·lules MDA-MB-231 i a les cèl·lules 4T1 cultivades en el knockdown de Wnt10b i el control negatiu p85α - / - medi amb condicionament del fibroblast. Els efectes de shWnt10b es mostren al tauler superior. ( f ) L'assaig migratori de les cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en control negatiu o medi WTC10b knockdown p85α - / - medi amb fibroblast. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. Barra d’escala, 100 μm. ( g ) Mesures de volum i pes del tumor de cèl·lules 4T1 cultivades per via subcutània amb un vector de control negatiu o amb una derrota de Wnt10b p85α - / - fibroblasts. Cada grup té sis ratolins ( n = 6). Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( h ) Quantificació de metàstasi hepàtica en ratolins descrits a ( g ). Barra d’escala, 50 μm. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ( i ) Imatges representatives de la immunodepuració de β-catenina de tumors en els ratolins descrits a ( g i h ). Barra d’escala, 50 μm. ( j ) Nivell d'expressió gènica de Wnt10b en l'estroma de càncer de mama humà versus estroma de mama normal de GSE9014. Les dades són la mitjana ± sem *** valor P = 0.001. ( k ) Anàlisi de correlació entre Wnt10b i p85α (PIK3R1) en l'estroma mamari de GSE9014. La línia amb regressió lineal també es mostra com a línia vermella. També es mostren els valors P i R 2 .

Imatge a mida completa

Els exosomes de fibroblasts amb deficiència de p85a regulen la fractura estomal-epitelial en el càncer de mama

Recents informes van demostrar que els exosomes, que són vesícules nanositzades segregades per les cèl·lules, del microambient del tumor podrien afavorir els trets de progressió del càncer. 10, 41, 42 Per tant, hem investigat els efectes de la pèrdua de p85α en fibroblasts sobre la funció dels exosomes. Les observacions de microscòpia electrònica van indicar que hi ha estructures més semblants a exosomes situades a prop de la membrana cel·lular en fibroblasts p85α - / - que en fibroblasts WT (Figura 6a). A més, els exosomes purificats del WT i del medi amb condicionament del fibroblast p85α - / - mostraven un aspecte i mida comparables (figura 6b). També hem trobat per assaig de proteïnes de l’àcid bicinchonínic que els fibroblasts p85α / / poden produir més exosomes que els fibroblasts de WT (figura 6c). L’anàlisi de la mida de partícula d’exosomes aïllats va demostrar que la distribució de la mida de les partícules oscil·lava principalment entre 80 i 300 nm (figura 6d). Western blots va demostrar que l'expressió dels marcadors exosomes CD81 i TSG101, però no GM130, en els lisats exosomes va confirmar que no hi havia contaminació cel·lular en els nostres exosomes aïllats (Figura 6e). Per examinar més la transferència d’exosomes, es van marcar exosomes purificats de diversos fibroblasts amb el colorant lipofílic fluorescent DiD. L’ordenació de cèl·lules activada per fluorescència i l’anàlisi microscòpica de la transferència d’exosomes van indicar que els exosomes recollits de diversos fibroblasts transferits a cèl·lules vives però no mortes (fixes) mitjançant un transport actiu (figures 6f i g). L’ordenació de cèl·lules activades per fluorescència també va revelar que els exosomes dels fibroblasts p85α - / - tenien una major capacitat de transferència en comparació amb els dels fibroblasts WT.

Image

Els exosomes de fibroblasts amb deficiència de p85a regulen la fractura estomal-epitelial en el càncer de mama. ( a ) Imatge representativa de microscòpia electrònica de WT i p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 2000 nm. ( b ) Imatge de microscòpia electrònica representativa dels exosomes purificats del WT i del medi amb condicionament del fibroblast p85α - / - fibroblast, cada grup presenta tres rèpliques. Barra d’escala, 100 nm. ( c ) Quantificació del rendiment de proteïna exosoma de WT i p85α - / - fibroblasts mitjançant quantificació de proteïnes BCA. Les dades són la mitjana ± sem *** valor P = 0.001. ( d ) Distribució de la mida exosoma de fibroblastos WT i p85α / / mesurats per un analitzador Zetasizer. ( e ) Anàlisi del blot occidental d'exosomes de WT i p85α - / - fibroblasts. TSG101 i CD81 són marcadors d’exosomes. GM130 és un control de la contaminació cel·lular. ( f ) Citometria de flux de transferència de colorants DiD de WT o p85α - / fibroblasts a cèl·lules de càncer de mama (4T1). ( g ) Imatge de transferència de colorants DiD de diversos fibroblasts a cèl·lules canceroses de mama (4T1), tal com es descriu a la ( f ). Barra d’escala, 50 μm. ( h ) El assaig de migració i invasió de cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 tractades amb exosomes purificats de WT o p85α - / - medi amb fibroblast. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ** P- valor0.01. *** P- valor0.001. Barra d’escala, 100 μm. ( i ) Anàlisi del blot occidental de la ruta Wnt i dels marcadors EMT en cèl·lules MDA-MB-231 i cèl·lules 4T1 tractades amb exosomes purificats de fibres WT o p85α - / - . ( j ) Imatges representatives d'immunofluorescència de citoesquelet i vimentina en cèl·lules canceroses tractades amb exosomes de WT o p85α - / - fibroblasts. Barra d’escala, 25 μm. ( k ) Anàlisi de migració de cèl·lules MDA-MB-231 i 4T1 cultivades en un medi amb condició de shNC o shCD81 p85α - / - fibroblast. Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. ** P- valor0.01. Barra d’escala, 100 μm. ( l ) Anàlisi del blot occidental de marcadors EMT en cèl·lules MDA-MB-231 i cèl·lules 4T1 cultivades en medi shNC o shCD81 p85α - / - fibroblast. ( m ) El volum i el pes del tumor de les cèl·lules 4T1 cultivades per via subcutània amb fibroblasts shNC o shCD81 p85α - / - . Cada grup té sis ratolins ( n = 6). Les dades són la mitjana ± sem ** valor P0.01. ( n ) Quantificació de metàstasi hepàtica en ratolins descrits a ( m ). Les dades són la mitjana de ± sem * valor P = 0.05. Barra d’escala, 50 μm.

Imatge a mida completa

Per determinar si els exosomes produïts pels fibroblasts són suficients per induir l’activitat protusa i la metàstasi de cèl·lules canceroses de mama, vam exposar les cèl·lules MDA-MB-231 o 4T1 a exosomes aïllats de WT o p85α - / - fibroblasts, respectivament, i vam valorar la motilitat cel·lular. Com es mostra a la figura 6h, els exosomes derivats de fibroblasts p85α - / - van promoure sobretot la invasió i invasió MDA-MB-231 i 4T1 en comparació amb exosomes de fibroblasts WT. D’acord amb això, els exosomes dels fibroblasts p85α / / també indueixen més potentment l’EMT i la remodelació citoesquelètica a les cèl·lules epitelials del càncer de mama, que està estretament relacionada amb la metàstasi del tumor (figures 6i i j). Tetraspanin CD81, an exosome marker, is critically involved in exosome function, secretion and cellular uptake during intercellular communication. 43 To further explore the importance of exosomes in stromal–epithelial crosstalk and their effects on cancer epithelial cell motility, we generated p85α −/− fibroblasts in which CD81 was constitutively knocked down by short hairpin RNAs (shRNAs), thereby creating fibroblasts with aberrant exosome function. MDA-MB-231 or 4T1 cells were treated with the conditioned medium from negative control or CD81 knockdown fibroblasts, respectively. As shown in Figures 6k and l, the conditioned medium contained reduced amount of CD81 and significantly decreased the ability of p85α −/− fibroblasts to stimulate cell migration and EMT. Similarly, downregulation of CD81 expression inhibited the tumour-promoting effects of p85α −/− fibroblasts in vivo (Figures 6m and n). Taken together, these results reveal that exosomes from p85α −/− fibroblasts can induce EMT, promote cancer cell motility and increase tumour metastasis.

Exosomes act as a cargo delivery system that transports Wnt10b from stroma to cancer cells

Considering the fact that some reports have also demonstrated that active Wnt proteins could be secreted in exosomes, 44 we speculated that stromal-derived exosomes might carry Wnt10b into cancer cells to induce Wnt/β-catenin signalling and regulate stromal–epithelial dialogue. Western blots indicated that Wnt10b is more abundant in p85α −/− fibroblast-derived exosomes compared with WT fibroblast exosomes. On the other hand, the expression of Wnt10b in exosomes is far higher than in exosome-depleted conditioned medium when the total loading protein contents were equal (Figure 7a). Flow cytometric analysis of Wnt10b expression in exosomes captured by aldehyde latex beads confirmed this trend (Figure 7b). Furthermore, we found that Wnt10b colocalized with the exosome marker CD81 in p85α −/− fibroblasts via immunofluorescence (Figure 7c). Additionally, ELISA analyses showed that the Wnt10b concentration in p85α −/− fibroblast-conditioned medium was obviously reduced after ultracentrifugation overnight (Figure 7d). In addition, we found that the abundance of Wnt10b in exosomes was far higher (~16-fold) than in conditioned medium from p85α −/− fibroblasts (Figure 7e). Moreover, the ability of the conditioned medium to activate the Wnt pathway was also markedly reduced after ultracentrifugation (Figure 7f). Knockdown of CD81 in p85α −/− fibroblasts or treatment of p85α −/− fibroblasts with GW4869, an N-SMase inhibitor that blocks exosome generation, 45 reduced Wnt10b secretion in conditioned medium (Figures 7g and h). Consistently, disturbing exosomes resulted in increased intracellular accumulation of Wnt10b (Figures 7i and j). Moreover, we found that blocking exosomes via CD81 knockdown in p85α −/− fibroblasts abrogated the activation of Wnt/β-catenin signalling in vitro and in vivo (Figures 7k and l). We also knockdown p85α in WT fibroblasts to mimic p85α −/−, and the result also confirmed our conclusions (Figure 7m). These results indicated that exosomes acted as a cargo delivery system that transported Wnt10b from stroma to cancer cells (Figure 7n).

Image

Exosomes act as a cargo delivery system that transports Wnt10b from stroma to cancer cells. ( a ) Western blot analysis of Wnt10b in exosomes purified from various fibroblasts. ( b ) Flow cytometry of CD81 and Wnt10b expression in exosomes purified from various fibroblasts. ( c ) Immunofluorescence analysis of Wnt10b and CD81 co-location in p85α −/− fibroblasts. Scale bar, 25μm. ( d ) ELISA analysis of Wnt10b in conditioned medium from p85α −/− fibroblasts before (conditioned medium (CM)) and after (120 000 g ) ultracentrifugation overnight. Data are the mean±sem * P- value0.05. ( e ) The protein abundance of Wnt10b in conditioned medium and exosomes from p85α −/− fibroblasts. Data are the mean±sem *** P- value0.001. ( f ) Western blot analysis of Wnt activity in 4T1 cells cultured in original CM or after (120 000 g ) ultracentrifugation overnight. ( g ) ELISA analysis of Wnt10b in CM from shNC or shCD81 p85α −/− fibroblasts. Data are the mean±sem * P- value0.05. ( h ) Western blot analysis of Wnt10b in cell lysates and concentrated conditioned medium from shNC or shCD81 p85α −/− fibroblasts and p85α −/− fibroblasts treated with DMSO or GW4869 (10 μ M ) for 2 days. ( i ) Flow cytometric analysis of Wnt10b intracellular accumulation in shNC or shCD81 p85α −/− fibroblasts and p85α −/− fibroblasts treated with DMSO or GW4869 as described in ( I ). ( j ) Immunofluorescence analysis of intracellular Wnt10b accumulation in shNC or shCD81 p85α −/− fibroblasts. Barra d’escala, 10 μm. ( k ) Western blot analysis of Wnt pathway activation in MDA-MB-231 cells and 4T1 cells cultured in shNC or shCD81 p85α −/− fibroblast-conditioned medium. ( l ) Representative images of β-catenin immunostaining in tumours from mice described in Figure 6m. Barra d’escala, 50 μm. ( m ) Western blot analysis of PI3K activity and Wnt10b in negative control vector (NC) and in p85α knockdown (shp85α) WT fibroblasts and exosomes. ( n ) Schematic representation of tumour-promoting effects provoked by fibroblasts instigated by loss expression of p85α.

Imatge a mida completa

Discussió

Mutations in or abnormal expression of the p85α regulatory subunit of PI3K are reported in various human cancers, 46, 47, 48 but the role of these mutations in tumour microenvironment remains unclear. In this study, we have determined that reduced expression of p85α occurs in the stromal compartment in breast cancer and has a critical role in stromal–epithelial crosstalk, as well as in tumour growth and metastasis. With respect to promoting tumourigenesis, p85α −/− fibroblasts exhibit similar functions to CAFs.

Cancer-related deaths are primarily attributed to metastasis. It is established that crosstalk between the neoplastic stroma and the epithelium is essential to metastasis, yet the master regulators of metastasis are largely unknown. Wnt pathway, including canonical (Wnt/β-catenin) and noncanonical (Wnt-PCP) Wnt signaling, has a key role in these progressions. Jeff Wrana's group had reported that stromal fibroblasts could regulate breast cancer cell migration via autocrine Wnt-PCP signaling. 41 However, in our research, we found that p85α −/− fibroblasts could promote breast cancer cell motility mainly via paracrine Wnt/β-catenin signaling. Although Wnt-PCP signaling and Wnt/β-catenin signaling are two different kinds of pathways, there is ample evidence that there is a close link between these pathways. Moreover, our findings also demonstrated that Wnt10b secreted from fibroblasts acted as a potent mediator of tumour–stroma communication to promote metastasis.

Interestingly, we also observed that considerable levels of Wnt10b were located in exosomes from p85α-deficient fibroblasts. Moreover, we observed that p85α −/− fibroblasts expressed increased levels of Wntless and Vps35 proteins, indicating that the loss of p85α comprehensively regulates the Wnt signalling axis not only with respect to production but also with respect to transportation. EMT is also involved in both Wnt/β-catenin signalling and cancer cell metastasis. To further verify the function of p85α in CAFs, we developed stable and ectopic expression of p85α in p85α −/− fibroblasts for rescue experiments in WT fibroblasts. As expected, the rescue experiments confirmed our conclusions (Supplementary Figures S3A–E). Therefore, we propose the following model to explain our findings: loss of p85α stimulates fibroblasts to express and secrete more Wnt10b. Then, these Wnt10b ligands are transported to adjacent epithelial cancer cells, where they activate Wnt/β-catenin signalling and then induce EMT, eventually leading to breast cancer cell metastasis.

Notably, we found that active Wnt10b is also present in exosomes from p85α-deficient fibroblasts that exhibit characteristics of CAFs. The exosomal Wnt derived from fibroblasts could activate canonical Wnt signalling and promote the mobility of breast cancer cells both in vitro and in vivo . Exosomes are nano-sized extracellular microvesicles that have an endosomal origin, are secreted by various cells and have important roles in intercellular communication. 45 Exosomes contain many bioactive molecules, such as nucleic acids and proteins that can mediate cell–cell communication associated with development and cancer progression. 49, 50 When we disturbed exosome function via knockdown of the exosomal marker CD81 in fibroblasts, Wnt10b secretion was inhibited, leading to accumulation of Wnt10b in fibroblasts. Hence, the CD81 knockdown in CAF-like fibroblasts failed to activate canonical Wnt signalling and could not promote tumourigenesis. Thus, we conclude that exosomes from fibroblasts in the tumour microenvironment transport Wnt proteins to cancer epithelial cells, which may be an indispensable and efficient approach to activate Wnt signalling and cellular functions involved in cancer progression.

Taken together, our data demonstrate that p85α expression is frequently reduced in breast cancer stroma and is functionally associated with the regulation of breast tumourigenesis and malignant progression through its ability to modify the tumour microenvironment. Thus, p85α acts as a tumour suppressor in the tumour microenvironment and may represent a new candidate for diagnosis, prognosis and targeted therapy.

Materials i mètodes

Productes químics i anticossos

LY294001 was purchased from Cell Signalling Technology (Beverly, MA, USA), GW4869 was purchased from Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). The antibodies used in this research were listed in Supplementary Table S4.

Cultiu cel·lular

The immortalized WT mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and the p85α / MEFs were a gift from Professor Lewis C Cantley. 51 The human breast cancer cell line MDA-MB-231, the mouse breast cancer cell line 4T1, the immortalized WT MEFs and the p85α / MEFs were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (HyClone, Logan, UT, USA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin and 10% fetal bovine serum (HyClone) at 37 °C and 5% CO 2 . Cell lines were acquired from the China Center For Type Culture Collection, where it was tested and authenticated, and were cultured continuously for no more than 2 months.

Conditioned medium preparation

Various MEFs were incubated with complete medium for 3 days. The conditioned medium was collected, centrifuged at 300 g for 10 min, 2000 g for 10 min and 10 000 g for 30 min, and then filtered with a 0.22-μm filter.

Cell migration and invasion assays

The cell migration and invasion assay was performed as described by Hu et al. 52

Subcutaneous tumourigenicity assays

A total of 1 × 10 6 4T1 or MDA-MB-231 cells mixed with 3 × 10 6 MEFs of various types in Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and coinjected subcutaneously into 4–6-week-old female BALB/c mice or nude mice. Each group had six mice in the animal experiments. Tumourigenicity assays were performed as described previously. 32 The animal care and experimental protocols were approved by the Experimental Animal Center of Wuhan University.

Exosome isolation

Exosomes were purified from cells cultured in exosome-depleted fetal bovine serum (ultracentrifuged at 120 000 g overnight) as described previously. 53 For western blot analysis, the exosome pellet was resuspended in 1% sodium dodecyl sulphate lysis buffer, and analysed with loadings of exosomes that amounted to equal content of proteins, respectively. For examination by electron microscopy, the exosome pellet was resuspended in phosphate-buffered saline, and analyzed again with loadings of exosomes that amounted to equal content of proteins, respectively. For cell treatment, the exosome pellets were resuspended in Dulbecco's modified Eagle's medium, respectively, and the exosomes isolated from equal volume of conditioned mediums were used. For quantification by the BCA assay, exosome size distribution measurement by Zetasizerand flow cytometry, the exosome pellets were resuspended in phosphate-buffered saline and exosomes isolated from equal volume of conditioned mediums were analyzed.

Analysis of human stroma gene expression data

The data regarding human breast cancer stroma (GSE9014) and human fibroblast cocultured with breast cancer cells (GSE41678) were downloaded from the NCBI GEO datasets database.

Tissue microarray and immunohistochemistry

The human breast tissue microarray chip was purchased from US Biomax Inc. (Rockville, MD, USA). Immunohistochemistry was performed as described by Hu et al. 52

Immunohistochemical score

For the immunohistochemical semiquantitative assessment of p85α expression, the product of the staining intensity scores and the quantity of immunoreactive cells were calculated based on the following scoring system: the optical stain intensity was graded as 0=negative, 1=weak, 2=moderate or 3=strong staining; the quantity of cells was graded as 0=no expression, 1=10% positive cells, 2=10–50% positive cells, 3=51–80% positive cells and 4=80% positive cells. The number of positive cells was assessed by counting three random fields at × 100 magnification. The final immunohistochemical score was obtained by multiplying the intensity score and the quantity score. According to the total Immunohistochemical score, p85α expression levels in tissues were categorized as low expression when the score was 3. The staining intensity was scored by two investigators in a blinded procedure.

Cell extracts and western blot analysis

The cell extracts were performed as described previously. 54 The supernatants were centrifuged to remove the cells and debris and concentrated with Amicon Ultra columns (Millipore, Billerica, MA, USA). Proteins were extracted from the nucleus and cytoplasm using Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kits (Beyotime, Jiangsu, China), respectively, according to the manufacturer's instructions. Western blotting was performed as described previously. 54

Immunofluorescència

The assay was performed as described by Hu et al. 52 Images were acquired using a confocal microscope (Leica, Wetzlar, Germany).

Measurement of collagen gel contraction

The assay was performed as described previously. 55

Anàlisi de classificació de cèl·lules activada per fluorescència

Fibroblasts of different genotypes were stained with antibodies against CD44 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) and assayed with flow cytometry (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).

Flow cytometry analysis of purified exosomes was performed as described previously. 56

RNA extraction, PCR and real-time quantitative PCR

The primers are listed in Supplementary Table S2. All quantitations were normalized to endogenous glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase as a loading control. Relative changes in gene expression were quantified using the 2−ΔΔCT method. 57

Immunoassay for conditioned medium

Approximately 1.5 × 10 6 fibroblasts were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal bovine serum on a 10-cm plate for 2–3 days. The supernatants were measured using a commercially available SDF-1 ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), a TGF-β1 ELISA Kit (Boster Bio-Tech, Wuhan, China), an MMP2 ELISA Kit (Boster Bio-Tech), an MMP9 ELISA Kit (Boster Bio-Tech) and a Wnt10b ELISA Kit (Cusabio Biotech, Wuhan, China).

Assaig de proliferació cel·lular

The assay was performed as described by Hu et al. 52

Colony formation assays

The assay was performed as described by Hu et al. 52

Matrigel three-dimensional cultures

Cells were suspended in conditioned media containing 2% growth factor reduced Matrigel (BD Biosciences) and plated on 100% Matrigel as described previously. 58

Prova de rascades

The assay was performed as described by Hu et al. 52

shRNA/siRNA preparation and cell transfection

shRNA sequences against Wnt10b and p85α were designed and synthesized by GenePharma Co. Ltd (Shanghai, China). The fragments were digested with Bbs I and Bam HI and were inserted into the pGPU/GFP/Neo vector (GenePharma Co. Ltd). shRNA sequences against CD81 were designed according to information given by Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA), which has been validated. The fragments were inserted into the retroviral vector pSuper. The full-length cDNA encoding p85α was cloned into the lentiviral vector pHAGE-CMV-MCS-PGK puro+3tag. An empty pHAGE-CMV-MCS-PGK puro+3tag plasmid was used similarly to establish control clones. Transient transfection was performed using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Small interfering RNA (siRNA) against Porcn was designed and synthesized by RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, China). Transient transfection of siRNA was also performed using Lipofectamine 2000. The siRNA and shRNA sequences are listed in Supplementary Table S3.

Microscòpia electrònica

WT or p85α MEFs were fixed in 2.5% glutaraldehyde. The next day, the cells were washed in phosphate-buffered saline and fixed with 1% osmium tetroxide, followed by washing in phosphate-buffered saline and dehydration through an alcohol gradient. After that, the cells were embedded in epoxide resin, sliced by an LKB-V ultramicrotome (LKB Bromma, Sollentuna, Sweden) and observed with a transmission electron microscope (Hitachi Ltd, Tokyo, Japan).

Purified exosomes were left to settle on carbon-coated grids. After the grids were stained with 3% uranyl acetate, they were air-dried and visualized using a transmission electron microscope.

Anàlisi estadística

Statistical significance was calculated using Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Data are reported as the mean±sem The results between the two independent groups were determined by Student's t -test, unless otherwise stated. In the case of different variances, a two-tailed unpaired t -test with Welch's correction was also performed. When data did not pass the normality test, a Mann–Whitney test was also used for the statistical analysis as indicated. Els valors de P <0, 05 es van considerar estadísticament significatius. Tots els experiments es van repetir almenys tres vegades.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

  2. 2

    Taula suplementària S1

  3. 3.

    Taula complementària S2

  4. 4.

    Taula complementària S3

  5. 5.

    Taula suplementària S4

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària S1

  2. 2

    Figura suplementària S2

  3. 3.

    Figura suplementària S3

    La informació complementària acompanya aquest article al lloc web d'Oncogene (//www.nature.com/onc)