Les plaquetes activades rescaten cèl·lules apoptòtiques mitjançant l’activació paracrina de la proteïna quinasa egf i dna-dependent | mort i malaltia cel·lular

Les plaquetes activades rescaten cèl·lules apoptòtiques mitjançant l’activació paracrina de la proteïna quinasa egf i dna-dependent | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Lesions cerebrals
  • Senyalització cel·lular
  • Plaquetes

Resum

L’activació plaquetària és una resposta de primera línia a lesions, no només essencial per a la formació de coàguls, sinó també important per a la reparació de teixits. De fet, la influència reparadora de les plaquetes ha estat explotada de forma terapèutica quan l’aplicació de concentrats de plaquetes agilitza la recuperació de ferides. Malgrat això, els mecanismes de citoprotecció desencadenats per plaquetes són poc entesos. Aquí, demostrem que les plaquetes activades s’acumulen al cervell fins a nivells excepcionalment alts després de lesions i factors alliberadors que protegeixen potentment les neurones de l’apoptosi. La microarray cinomica i els posteriors estudis amb inhibidors de la cinasa demostren que la neuroprotecció basada en plaquetes està basada en l'activació paracrina del receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) i la proteïna cinasa depenent de l'ADN (P-DNA). Aquesta mateixa cascada anti-apoptòtica estimulada per plaquetes activades també va proporcionar quimiosistència a diversos tipus de cèl·lules canceroses. Sorprenentment, el perfil proteòmic profund de l'alliberament plaquetari no va identificar cap lligant EGFR conegut, cosa que indica que les plaquetes activades alliberen un activador atípic del EGFR. Aquest estudi és el primer que associa formalment l’activació plaquetària a EGFR / DNA-PK - una cascada citoprotectora endògena.

Principal

Les plaquetes són petits fragments de cèl·lules anuclears discoides que són protagonistes de l’hemostàsia: una resposta fisiològica de primera línia a lesions de teixit agut. En condicions basals, les plaquetes circulen entre 150 i 400 × 10 9 per litre i segresten una àmplia gamma de molècules bioactives dins dels seus grànuls intracel·lulars. 1 Tanmateix, per lesió al teixit, la disrupció vascular desencadena una deposició localitzada de plaquetes, l'activació i l'alliberament del contingut granular. Aquestes molècules alliberades de plaquetes (PRMs) recluten i activen les plaquetes, produint un agregat multicel·lular que restringeix la pèrdua de sang. En conjunció, la cascada de coagulació s’activa, donant lloc a la generació de trombina que consolida el creixent tromb mitjançant la promoció de l’activació plaquetària i la catalització de la formació de fibrina.

A més d’aquest paper crític en l’hemostàsia, les plaquetes també participen en nombrosos processos no hemostàtics, incloent inflamació, reparació de 2 teixits, 3 angiogènesis i desenvolupament limfàtic. 4 Les plaquetes també afavoreixen la proliferació de les cèl·lules tumorals i la metàstasi mitjançant adhesió i senyalització peri-cel·lular. 5, 6, 7 Aquesta pleiotropia s’atribueix a la matriu de molècules alliberades de les plaquetes activades.

La influència reparadora de les plaquetes també té una utilitat clínica important. Durant dècades, s’han aplicat “concentrats de plaquetes” als llocs de lesions per agilitar la recuperació d’òrgans com l’os, la 8 pell 9 i el tendó. 10 Es creu que els efectes beneficiosos dels concentrats de plaquetes es deuen als nombrosos factors de creixement que s’alliberen de les plaquetes activades. 3 Tanmateix, aquest raonament es pot considerar especulatiu, atesa la manca d'evidència experimental directa. A més, hi ha poca informació sobre els senyals peri-cel·lulars derivats de les plaquetes que faciliten la reparació de teixits.

Les plaquetes estan restringides normalment al compartiment intravascular. Tot i això, l’acumulació plaquetària extravascular també es pot produir en determinades condicions patològiques. Un exemple notable d’això és el neurotrauma. Aquí, veiem que es produeixen nivells excepcionalment alts d’activació plaquetària al cervell després del neurotrauma, proporcionant així un suport en principi que els productes plaquetaris poden influir en la supervivència neuronal. Per tant, es va examinar la influència de les PRM sobre les neurones corticals primàries lesionades. Com que les neurones són post-mitòtiques, aquest enfocament va permetre elucidar efectes que no tenien relació amb la proliferació. Trobem que les PRM redueixen de forma selectiva i potent l’apoptosi neuronal mitjançant l’ activació paracrina del receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) i l’activació a l’aigua de la proteïna quinasa depenent de l’ADN (DNA-PK) - un enzim reparador d’ADN omnipresent. Curiosament, el mateix mecanisme depenent de les plaquetes també protegeix diversos tipus de cèl·lules humanes no neuronals de càncer contra l’apoptosi induïda per la quimioteràpia. Així, les plaquetes activades desencadenen un potent i gran senyal paracrí d’acció àmplia que atenua l’apoptosi.

Els nostres resultats posen de manifest una acció beneficiosa de les plaquetes que probablement funciona dins del cervell lesionat, quan el coneixement existent sobre les plaquetes s’ha limitat al seu paper hemostàtic. Curiosament, també trobem que aquesta acció citoprotectora poc apreciada de les plaquetes pot tenir implicacions en el càncer en què l’associació entre el recompte de plaquetes més alt i el pronòstic dels pacients més pobres ha estat ben establerta. 11, 12, 13, 14 A més, aquest mecanisme anti-apoptòtic recent identificat hauria de fomentar millores racionalment dissenyades per a l’ús clínic dels concentrats de plaquetes.

Resultats

La comprensió sobre les plaquetes durant lesions cerebrals adquirides es refereix en gran mesura al seu paper en l’hemostàsia. No obstant això, donada la seva influència reparadora sobre altres teixits, les plaquetes també poden tenir un efecte beneficiós no hemostàtic sobre el cervell ferit. Primer es va intentar determinar fins a quin punt les PRM eren presents al cervell després del neurotrauma, una lesió cerebral adquirida on probablement es produeixi una activació extrema de les plaquetes. Per a això, es va mesurar GPVI soluble (sGPVI; un marcador específic de plaquetes que es desprèn de plaquetes 15 activades) al líquid cefalorraquidi (LCR) de pacients amb neurotrauma (Figura 1a). Mentre que els pacients control tenien sGPVI poc o nul en la CSF (mitjana = 0, 45 ng / ml), els nivells de sGPVI en la CSF de pacients amb neurotrauma van ser significativament elevats (mitjana = 35, 42 ng / ml). Segons el nostre coneixement, es tracta de la primera quantificació de qualsevol PRM al cervell després del neurotrauma. Notablement, el nivell de sGPVI en la CSF de pacients amb neurotrauma era comparable al del plasma durant la coagulació intravascular disseminada, que se situa entre 39, 9 i 72, 8 ng / ml. Així, després del neurotrauma es produeix una alliberació profunda de les molècules derivades de plaquetes.

Image

Les plaquetes s’acumulen i s’activen al cervell després del neurotrauma. ( a ) ELISA que mesura GPVI soluble en la LCR de pacients no neurotraumàtics ( n = 9, cercles oberts negres) i pacients de neurotrauma ( n = 31, cercles tancats blaus). S'indica la mitjana de intervals de confiança ± 95%. *** P <0, 001 per la prova de dues cues Mann-Whitney. ( b ) (i) La immunofluorescència representativa de la integrina marcadora de plaquetes α IIb β 3 mostra una deposició plaquetària marcada a l'escorça ipsilateral lesionada 30 minuts després del neurotrauma en comparació amb el còrtex contralateral corresponent. El diàmetre de l’impactador s’indica amb la línia discontínua vermella. La profunditat de l'impacte està indicada per la línia vermella contínua. (ii) Imatge magnificada d'una àrea de l'escorça ipsilateral (indicada per la caixa groga de i). La immunosignal de la integrina α IIb β 3 es mostra en blanc i el senyal Hoechst 33342 en blau. Els fulls de fletxa tancats mostren dipòsits plaquetaris intravasculars. Els fulls de fletxa oberts mostren grans dipòsits de plaquetes extravasculars. ( c ) Immunoblot representatiu dels lisats cerebrals del ratolí extrets dels hemisferis ipsilaterals (ipsi) i lesions contralaterals (contra) no ferits. La integrina α IIb β 3 es va utilitzar com a marcador de plaquetes. El fragment escindit de GPIb (GPIb α -tail) es va utilitzar com a marcador d'activació de les plaquetes. L’albúmina es va utilitzar com a indicador de la ruptura de la barrera hematoencefàlica. GAPDH es va utilitzar com a control de càrrega. Barra d’escala: ( b ) (i) 500 μ m. (ii) 50 μ m

Imatge a mida completa

Per establir les característiques espatiotemporals de l’activació / deposició de plaquetes després del neurotrauma, es va utilitzar un model de neurotrauma del ratolí; on un únic impacte unilateral de 2 mm de força contundent es va lliurar a l'escorça cerebral. Després de la lesió, els ratolins van ser perfusats de manera transcardial per eliminar sang lliure i el seu cervell va ser sotmès a immunofluorescència per al marcador específic de les plaquetes, la integrina α IIb β 3 . Com es mostra a la figura 1b, es va observar una considerable acumulació de plaquetes a l’hemisferi ipsilateral lesionat, però no a l’hemisferi contralateral no lesionat 30 minuts després del neurotrauma. Cal destacar que les plaquetes es van dipositar no només dins del lloc d’impacte inicial (eixos de color vermell; figura 1bi), sinó també en els llocs de lesions secundàries distals de l’hemisferi ipsilateral on predomina la mort de les cèl·lules apoptòtiques. La deposició de plaquetes dins de la lesió del trauma no es va limitar als vasos sanguinis, i es van produir nombrosos agregats extravasculars rics en plaquetes dins del parènquima cerebral lesionat (figura 1bii). Es van observar resultats similars quan es va realitzar una immunofluorescència per al marcador específic de plaquetes, GPIb α (dades no mostrades). Aquests estudis confirmen que l’activació plaquetària generalitzada es produeix a tot l’hemisferi ipsilateral després del neurotrauma focal.

Per establir un temps d’activació plaquetària després de la lesió, els ratolins van ser perfusats transcardialment entre 5 i 60 minuts després de la preparació del neurotrauma i els lisats de la còrtex ipsilateral i contralateral. Aquests lisats van ser sotmesos a una anàlisi de immunoblot. Com es mostra a la figura 1c, es va observar una major quantitat de deposició de plaquetes (presència de la integrina específica de les plaquetes, α IIb β 3 ) i d'activació de les plaquetes (presència del marcador específic d'activació de les plaquetes, el fragment de I 17-kDa GPIb α ). a l'escorça ipsilateral lesionada respecte a l'escorça contralateral no lesionada. És important destacar que també es van observar nivells més elevats d’albúmina en el còrtex ipsilateral a través de tots els punts de temps en relació amb el còrtex contralateral corresponent (figura 1c), cosa que indica que s’havia produït un trencament de la barrera hematoencefàlica. Per tant, poc després del neurotrauma (30 a 60 min), la deposició / activació de plaquetes manifesta i la interrupció de la barrera hematoencefàlica coincideixen dins del còrtex ipsilateral.

En conjunt, aquests experiments demostren que la superposició de la descomposició de barrera hematoencefàlica i la deposició / activació de plaquetes permeten als PRM entrar en el parènquima cerebral lesionat. La deposició espacial de les plaquetes és vasta i transcendeix molt més enllà del lloc de contusió inicial. A més, la magnitud de la deposició / activació de plaquetes és tal que la concentració de sGPVI derivada de plaquetes en la LCR després del neurotrauma s'aproxima a la que es troba al plasma durant la coagulació intravascular disseminada. És important destacar que aquesta comparació ens va proporcionar una concentració fisiopatològicament rellevant per a l'ús de PRM in vitro (els PRM es van utilitzar in vitro a menys de la meitat de la concentració que es troba en la CSF dels pacients amb neurotrauma).

Els PRM atenuen l’apoptosi neuronal

A continuació, es va investigar la influència de les PRM en lesions neuronals in vitro . Les neurones corticals primàries del ratolí van estar exposades a diversos estressors (incloent etoposida, L-glutamat, privacions de linsidomina i oxigen-glucosa) en presència o absència de PRMs i lesions cel·lulars es van avaluar 24 hores després. L’observació més sorprenent d’aquests estudis va ser que les PRM de plaquetes activades, però no de plaquetes en repòs, van reduir notablement la magnitud de la lesió induïda per l’etoposida, tal com indica una preservació mediada per PRM de la integritat de la membrana (figures 2a i b) i del metabolisme cel·lular ( Figura 2c). Com l'etoposide és un inhibidor de la topoisomerasa II que indueix danys en l'ADN i l'apoptosi posterior, 16 vam supervisar l'efecte de les PRM sobre l'activació de la caspasa. Els PRMs van atenuar l’activació induïda per l’etoposide de les caspases iniciadores amunt -8 i -9, van reduir l’activació a l’aigua de la caspasa efectora-3/7 (Figura 2d) i van evitar la divisió de PARP depenent de la caspasa (figura 2e). Per tant, les PRM bloquegen l’apoptosi en un període precoç abans de l’activació de les principals caspases intrínseques / extrínseques.

Image

Els PRM atenuen la toxicitat induïda per etoposides en neurones. Els principals cultius neuronals corticals de ratolí van ser tractats amb vehicle, 2 mg / l etoposide, etoposide + sobrenadant de plaquetes no activades (PRMs baixes) o etoposide + sobrenetant de plaquetes activades per trombina (PRMs). El grau de lesió es va avaluar 24 hores després, mesurant la interrupció de la membrana plasmàtica ( mitjançant alliberament de lactat deshidrogenasa (LDH); a ; n = 4), mesurant el metabolisme cel·lular ( mitjançant conversió MTS; c ; n = 5) i mesurant la caspasa-8, -9, -3/7 activació ( d ; n = 4). S'indica la mitjana amb SEM. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 i 'ns' no significatius per ANOVA unidireccional amb correcció de Newman-Keuls. ( b ) Imatges representatives de cultius neuronals tractats durant 24 h amb etoposide ± PRMs, després incubades amb Hoechst 33342 (de color blau) i 7AAD (de color rosa). La imatge de contrast d’interferència diferencial (DIC) dels cultius es mostra a la fila superior de micrografies. La imatge epifluorescència dels cultius es mostra a la fila inferior de micrografies, amb cèl·lules sanes en blau i cel·les mortes de color rosa. ( e ) Immunoblot representatiu de lisats de cultius neuronals tractats amb vehicle, PRMs i etoposides ± PRMs durant 24 hores. Els immunoblots demostren que els PRM redueixen la divisió de PARP induïda per l’etoposide. S'utilitzava tubulina com a control de càrrega. Barra d’escala: ( b ) 100 μ m

Imatge a mida completa

Els PRM també protegien les neurones de la linsidomina (figura suplementària S2a) - un potent estressor nitrosatiu. Així, les PRM protegeixen les neurones de lesions diferents mecanicament. En canvi, les PRM no van poder rescatar les neurones de la mort cel·lular induïda per L-glutamat (figura suplementària S2b) o per privació d’oxigen-glucosa (figura suplementària S2c). Curiosament, mentre que el tractament de neurones amb etoposida o linsidomina va desencadenar l’activació de la caspasa-3, l’exposició al glutamat L i la privació a l’oxigen-glucosa no van aconseguir cap activació perceptible de la caspasa-3 (figures suplementàries S2d i e). Aquests descobriments suggereixen que les PRM no protegeixen de les formes de mort cel·lular independents de la caspasa, sinó que les PRM atenuen específicament les lesions neuronals amortint els esdeveniments aigües endavant de l'activació de la caspasa pro-apoptòtica.

Per aprofundir en les accions citoprotectores de les PRM, es va valorar la seva influència sobre l'estrès del proteasoma. Tot i que la inhibició del proteasoma pot activar la cascada apoptòtica tant en neurones com en cèl·lules no neuronals, 17, 18 PRM no van atenuar lesions causades pel tractament amb MG132 (figura suplementària S2f) ni el tractament amb bortezomib (figura suplementària S2g). Les lesions cel·lulars causades per la inhibició del proteasoma difereixen tant de la lesió etoposida com de la linsidomina, ja que no implica principalment danys en l'ADN. Aquests resultats suggereixen, doncs, que no només atenuen les PRM preferentment les lesions mediatitzades per la caspasa, sinó que també les PRM protegeixen eficaçment contra l’apoptosi causada per danys en l’ADN.

Caracterització de la citoprotecció mediada per PRM

Com que la neuroprotecció no s’havia relacionat prèviament directament amb l’activació de les plaquetes, hem caracteritzat més la capacitat de les plaquetes per atenuar l’apoptosi. Primer es va avaluar si la neuroprotecció encara es pot produir per plaquetes activades in situ (més que per PRM purificades), ja que el nostre protocol per preparar PRM elimina molècules <3 kDa i permet la degradació d'agents làser derivats de plaquetes (per exemple, la tromboxana A2) . Aquestes molècules omeses, però, no alteren principalment l’efecte citoprotector de les PRM, ja que l’activació in situ de plaquetes rentades encara redueix la lesió induïda per l’etoposida en cultius neuronals (* P <0.05; n = 3; dades no mostrades). Aquesta troballa demostra que l'efecte net de l'activació de les plaquetes és, de fet, la neuroprotecció. També es va examinar la potència de la neuroprotecció mediada per PRM. Tal com es mostra a les figures 3a i b, les PRM encara van reduir les lesions neuronals causades per una concentració superior a 5 vegades més d’etoposida. A més, es va observar la influència citoprotectora dels PRM fins i tot després de 48 h d’exposició a l’etoposide (figures 3c i d). Per tant, els PRM transmeten un senyal anti-apoptòtic potent i de llarga durada a les neurones. En particular, la influència beneficiosa de les PRM no va tenir relació amb la proliferació cel·lular, ja que no es va observar cap incorporació de bromodeoxiuridina en cultius neuronals després de 24 hores de tractament amb PRM (dades no mostrades). A continuació, per avaluar el potencial terapèutic de les PRM, vam afegir PRM a cultius neuronals 1 h després de l’inici de la lesió etoposida. Tot i que ja s’havia iniciat l’apoptosi, l’aplicació post-lesió de PRMs va atenuar significativament les lesions neuronals induïdes per l’etoposida (Figures 3e i f). Per tant, la capacitat de les PRM per rescatar neurones després de l'aparició de l'apoptosi suggereix que l'agent actiu dins dels PRMs té potencial terapèutic.

Image

Els PRM es protegeixen contra l'etoposida amb dosis elevades i lesions etoposides preiniciats. ( a i b ) Es van estimular els cultius neuronals primaris amb un vehicle, 10 mg / l etoposide ± PRMs. ( c i d ) Els cultius neuronals primaris es van estimular amb un vehicle, 2 mg / l etoposide ± PRMs. ( e i f ) Els cultius neuronals primaris es van estimular amb un vehicle o 2 mg / l etoposida durant 1 h abans de l'addició de PRM. El grau de lesió es va valorar 24 h ( a, b, e i f ) o 48 h ( c i d ) més tard mesurant la disrupció de la membrana plasmàtica ( mitjançant alliberament de lactat deshidrogenasa (LDH); a, n = 4; c, n = 4; e, n = 3) i mesurant el metabolisme cel·lular ( via conversió MTS; b, n = 5; d, n = 4; f, n = 7). S'indica la mitjana amb SEM. * P <0, 05; ** P <0, 01; **** P <0, 0001 i 'ns' no significatius per ANOVA unidireccional amb correcció de Newman-Keuls

Imatge a mida completa

Finalment, es va investigar si els PRM també podrien atenuar l’apoptosi en altres tipus cel·lulars. Tenint en compte la contribució ben reconeguda de les plaquetes a la progressió del càncer, 6 es va avaluar la capacitat dels PRM d’inhibir l’apoptosi induïda per l’etopàsida en una sèrie de línies cel·lulars de càncer humà. Els PRM van reduir l’extensió de la mort de cèl·lules induïda per l’etoposida en cèl·lules limfomàtiques monocítiques (U937, figura 4a), cèl·lules plasmàtiques mielocítiques (JIM-1, figura 4b) i limfòcits mielocítics (KMS26, figura 4c). Aquests descobriments amplien la importància de la citoprotecció mediada per plaquetes i són significatius, ja que l’etoposide és un quimioterapèutic utilitzat per tractar malignes, incloent carcinoma pulmonar de cèl·lules petites, càncers de línia germinal, sarcoma, limfoma i leucèmia. 19

Image

Els PRM atenuen l’apoptosi en cèl·lules no neuronals. Les línies cel·lulars (indicades a l’esquerra) van ser tractades amb vehicle, etoposide ± PRMs. El grau de lesió es va avaluar 24 hores mitjançant una tinció amb el colorant nuclear 7AAD (FL-3) i CaspACE FITC-VAD-FMK (FL-1). Les tres columnes de l'esquerra representen les dades en brut (com a gràfic de difusió de FL-1 vers FL-3) d'un experiment únic representatiu, amb la porta de cèl·lula viva superposada. La columna de la dreta mostra la porció de cèl·lules vives col·lectades a través de múltiples experiments que demostren que la toxicitat per etopòsids es va reduir per PRM a ( a ) cèl·lules monocítiques U937 ( n = 8), ( b ) cèl·lules plasmàtiques JIM-1 ( n = 3) i ( c ) cèl·lules similars als limfòcits KMS26 ( n = 3). S'indica la mitjana amb SEM. * P <0.05, ** P <0.01 i 'ns' no és significatiu per ANOVA unidireccional amb correcció Newman-Keuls

Imatge a mida completa

Identificació de vies de senyalització que subjauen a la citoprotecció mediada per PRM

A continuació, volíem identificar la via de senyalització paracrina responsable de la citoprotecció mediada per PRM. Primer es va provar la dependència de la cinasa amb staurosporina (un inhibidor de la pan-kinasa que desencadena danys a l'ADN i apoptosi neuronal) i vam trobar que els PRM no van alterar l'extensió de lesions neuronals induïdes per staurosporina (figura suplementària S3). Aquesta troballa suggereix que l’acció neuroprotectora dels PRM es basa en l’activitat de la cinasa. Per identificar quines quinases són activades per les PRM, es va realitzar una pantalla cinòmica mitjançant la qual es van lesionar cultius neuronals amb etoposida en presència / absència de PRMs. Els lisats es van recol·lectar després de 30 i 180 minuts de tractament i després van ser sotmesos a un microarray anticorpi Kinexus (que utilitza anticossos específics de pan- i 40 340). A la taula complementària es presenten els conjunts de dades completes de microarray 1. La comparació i la recollida de dades de microarray entre els dos punts de temps elaboren una llista d’alta confiança de proteïnes de senyalització que estaven regulades diferencialment per PRMs (Figura 5a). És important destacar que la pantalla cinòmica va demostrar que les PRM causaven una reducció del 44% de la funció de caspasa-3, verificant la integritat de l'experiment inicial de cultiu cel·lular (Taula suplementària 1).

Image

Cribratge cinomic i predicció dels esdeveniments de senyalització que subjauen a la citoprotecció mediada per la PRM. ( a ) Cultius neuronals 30 min i 3 h després de l'estimòside d'etoposida ± PRMs van ser lisats i sotmesos a una anàlisi de microarrays cinòmiques produint una llista curta de proteïnes de senyalització alterades significativament (el vermell indica un esdeveniment regulat> 1, 2 × i el verd indica un esdeveniment regulat> 0, 55 × ) per PRMs després de lesions etoposides. ( b ) Les proteïnes de senyalització llistades curtes (Taula suplementària 1) van ser sotmeses a Angenuity Pathway Analysis (IPA) per obtenir sis vies de senyalització canòniques (dades no mostrades) per a la citoprotecció mediada per PRM. Les proteïnes de senyalització que mostraven interacció amb caspasa o altres processos apoptòtics es van fusionar manualment (a través de les vies de senyalització canònica previstes) per generar una única via de senyalització prevista que es basa en la citoprotecció mediada per PRM. Els símbols vermells representen esdeveniments regulats. Els símbols verds representen esdeveniments regulats. Estudis posteriors sobre inhibidors de la cinasa basats en aquesta via de senyalització putativa van posar de manifest l'ADN-PK com a efector clau de la cinasa de citoprotecció mediada per PRM

Imatge a mida completa

Per oferir una visió general del sistema, els conjunts de dades cinòmiques van ser sotmesos a Angenuity Pathway Analysis (Redwood City, CA, EUA) on l’analista (de l’Australian Proteome Analysis Facility) es va cegar tant al disseny experimental com a la hipòtesi general del projecte. Cinc de les sis principals vies canòniques identificades per Angenuity Pathway Analysis van indicar un impacte crític mediatitzat per la PRM sobre l'apoptosi i van predir una reducció de la funció de caspasa (dades no mostrades). Aquestes cinc vies principals es van ajuntar manualment en una única ruta de senyalització que subratlla positivament en la citoprotecció mediada per PRM (figura 5b).

Els PRM inhibeixen l’apoptosi mitjançant la preservació de l’activitat d’ADN-PK

A partir de la via de senyalització putativa exposada a la figura 5b, es van provar seqüencialment inhibidors farmacològics selectius de p38 α , JNK1, JAK1, DAPK1 (dades no mostrades) i ADN-PK per la seva capacitat d’abrogar citoprotecció mediada per PRM. Dels inhibidors provats, només el compost selectiu ADN-PK, NU7441, va atenuar la citoprotecció mediada per PRM tant en neurones corticals de ratolí com en monòcits U937 humans (figures 6a i b, respectivament). Per tant, l'activació paracrina de l'ADN-PK media la influència citoprotectora dels PRM.

Image

La citoprotecció mediada per PRM es realitza mitjançant EGFR i activació de DNA-PK aigües avall. Els cultius neuronals ( a ; n = 5) o les cèl·lules U937 ( b ; n = 4) es van estimular amb el vehicle o 1–2 mg / l etoposide ± PRMs ± 10 nM NU7441 (un inhibidor específic del DNA-PK). El grau de lesió es va avaluar 24 hores després mitjançant la mesura de l’activació de la caspasa-3/7 ( a ) o de la viabilitat cel·lular ( b ;% de tinció negativa per a 7AAD i CaspACE FITC-VAD-FMK). ( c ) Imatges representatives de cultius neuronals estimulats amb un vehicle, 2 mg / l etoposide o 2 mg / l etoposide + PRMs. Els cultius es van fixar després d’1 h i van ser sotmesos a immunofluorescència per la subunitat catalítica d’ADN-PK (DNA-PKcs). Les micrografies superiors representen el taulell nuclear Hoechst 33342 i les micrografies inferiors representen el immunosenyal ADN-PKcs corresponent. ( d ) Immunoblot representatiu de cultius neuronals estimulat amb 2 mg / l etoposide ± PRMs. Els cultius van ser lisats 30 minuts després de l'estimulació i van ser sotmesos a anàlisis d'immunoblot per EGFR total i fosforilat (pEGFR). El subtext és l’anàlisi de densitometria que compara la relació mitjana de pEGFR / EGFR (mitjana ± SD; n = 4; # P <0, 05 entre grups amb / sense PRMs que utilitzen la prova t sense comparació amb correcció galesa). Les cultures tractades en presència de PRM han elevat significativament els nivells de pEGFR / EGFR en comparació amb els cultius tractats en absència de PRM. Els cultius neuronals ( e ) o cèl·lules U937 ( f ) es van estimular amb un vehicle o 1–2 mg / ml etoposide ± PRMs ± Gefitinib (un inhibidor específic de EGFR; 0, 4 μ M per a cultius neuronals; 10 μ M per a U937s). El grau de lesió es va avaluar 24 hores després mitjançant la mesura del metabolisme cel·lular ( mitjançant conversió MTS; e ; n = 4) o de la viabilitat cel·lular ( f ; n = 4;% tacat negativament per 7AAD i CaspACE FITC-VAD-FMK). * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 i 'ns' no és significatiu per ANOVA unidireccional amb correcció de Newman-Keuls. # P <0, 05 per prova de t independent de correcció galesa. Barra d’escala: ( c ) 10 μ m

Imatge a mida completa

L’ADN-PK és un enzim omnipresent responsable de la reparació de ruptures d’ADN de doble cadena. 20 Curiosament, la nostra pantalla cinòmica va indicar que els nivells d’ADN-PK eren un 317% més alts en cultius neuronals després del tractament amb etoposida + PRM, en relació als cultius tractats amb etoposidi sols (Figura 5a; Taula suplementària 1). En suport d’aquestes troballes, els estudis d’immunofluorescència van demostrar que 1 h de tractament amb etoposides reduïa dràsticament els nivells d’ADN-PK, mentre que el co-tractament amb PRM va restituir completament l’ADN-PK als nivells basals (Figura 6c). Per tant, les nostres dades suggereixen que una degradació primerenca de la maquinària de reparació d’ADN contribueix a la toxicitat d’etoposides i que els PRM protegeixen mitjançant la conservació de la reparació d’ADN mediada per l’ADN.

Les plaquetes inhibeixen l’apoptosi mitjançant l’ activació atípica de l’EGFR

Si bé el DNA-PK és un citoprotectant reconegut, 21, 22 els receptors que desencadenen la seva activació són poc entesos. L’únic receptor ben establert que promou l’activació d’ADN-PK és l’EGFR. 23, 24 Notablement, la nostra pantalla cinòmica va mostrar que les PRM, a més d’augmentar els nivells d’ADN-PK, també van desencadenar un augment concomitant del 192% en els nivells de fosfo-EGFR (Figura 5a; Taula complementària 1). Per tant, hem hipòtesi que els PRM protegeixen mitjançant l’ activació de la cascada ‘EGFRDNA-PK’. Per provar aquesta hipòtesi, primer vam confirmar que els PRM efectivament van augmentar l’activació d’EGFR (Figura 6d). A continuació, vam bloquejar l'EGFR mitjançant el compost anticancerigen, Gefitinib, un inhibidor de molècules petites de l'EGFR. 25, 26 Tal com es mostra a les figures 6e i f, Gefitinib va ​​disminuir significativament la citoprotecció mediada per PRM contra l'exposició a l'etoposide tant en neurones de ratolí com en monòcits U937 humans. Aquestes troballes suggereixen que el senyal citoprotector transduït per les PRM està mediat per l'activació EGFR.

L’EGFR té un repertori ben definit de lligands extracel·lulars, a saber: EGF, Factor de Creixement Transformant- α , heparina-unió-FEG, Amfiregulina, Betacelulina, Epigen, Epiregulina i Neuregulines 1-6. 25 Es van realitzar perfils proteòmics profunds per determinar si hi havia lligands EGFR a les nostres preparacions de PRMs. En total, es van identificar 394 proteïnes a les PRM, de les quals 266 van ser identificades amb confiança per dos o més pèptids (taula suplementària 2). Tot i això, no es va identificar confidament cap lligant EGFR en els nostres preparatius de PRMs. De la mateixa manera, cap altra caracterització prèvia del relleome plaquetari no ha detectat la presència d’un lligant EGFR reconegut (Wijten et al 1 i referències al mateix). Tot i que no es va detectar cap lligam EGFR reconegut en les PRM, les proteïnes que contenien un 'domini similar a EGF' representaven la classe de proteïnes més abundant en les PRM (taula suplementària 2). Per tant, les plaquetes activades alliberen un nou lligand de l'EGFR que, al seu torn, afavoreix la supervivència cel·lular durant l'insult genotòxic mitjançant el manteniment de la reparació de l'ADN dependent de l'ADN.

Discussió

L’activació plaquetària és una resposta primària a lesions de teixit. Si bé la formació del tromb és la conseqüència més caracteritzada de l’activació plaquetària, la iniciació adequada de la inflamació, l’angiogènesi, la proliferació i la reparació de teixits també depèn de l’activació de les plaquetes. Investigacions recents suggereixen que la protecció peri-cel·lular pot ser una altra conseqüència de l’activació de les plaquetes. 7, 27, 28 El nostre estudi demostra de manera exclusiva que les plaquetes activades alliberen un agonista atípic del EGFR, que al seu torn, transdueix un senyal paracrí que atenua potencialment l’apoptosi mitjançant la preservació de la reparació d’ADN que depèn d’ADN-PK. La figura 7 presenta el nostre model de treball de citoprotecció basada en plaquetes, mitjançant la qual les plaquetes activades alliberen una proteïna similar a EGF que desencadena l’activació peri-cel·lular i la translocació nuclear de EGFR, donant lloc a EGFR: formació del complex ADN-PK, la preservació d’ADN-PK nivells i la promoció de la reparació de l’ADN. En suport d'aquest mecanisme, estudis previs han demostrat que el complex EGFR: ADN-PK manté la reparació de l'ADN 23 presumiblement mitjançant el bloqueig de la degradació de l'ADN-PK mediada per la caspasa durant l'estrès genotoxic. 29 Per tant, existeix una "finestra terapèutica" probablement per a la reparació de l'ADN mediada per l'ADN durant l'estrès genotòxic. Posem de manifest que l’activació plaquetària induïda per lesions s’alinea amb aquesta “finestra terapèutica” i ajuda a prevenir l’activació irreversible de l’apoptosi intrínseca i extrínseca (Figura 7).

Image

Model de treball de citoprotecció mediada per PRM contra lesions etoposides. ( a ) Les lesions etoposides en absència de l'activació plaquetària permeten a l'etoposida ferir cèl·lules mitjançant la inhibició de l'ADN-topoisomerasa II i provocant danys a l'ADN de doble fil. L'activació inicial de la caspasa després de danys en l'ADN condueix a la degradació de l'ADN-PK, impedint així la reparació del DNA i promovent la iniciació irreversible dels braços d'apoptosi caspasa-8 (extrínseca) i caspasa-9 (intrínseca). ( b ) Lesions etoposides en presència d'activació de plaquetes no es produeixen en l'apoptosi. Això és degut a que les plaquetes activades alliberen una proteïna similar al EGF (blau) que s’uneix i promou l’activació de la fosfo de l’EGFR. El EGFR activat amb fosfo es trasllada al nucli i forma un complex amb ADN-PK. Com que el complex EGFR: ADN-PK és resistent a la degradació mediada per la caspasa, qualsevol dany en l'ADN induït per l'etoposida és susceptible de reparar i per tant condueix a la supervivència cel·lular.

Imatge a mida completa

Tot i que les nostres dades indiquen que la senyalització EGFR-ADN-PK és un mediador important de la citoprotecció desencadenada de plaquetes, no exclouen la contribució d'altres cascades de senyalització per a la supervivència. De fet, la ruta canònica prevista exposada a la figura 5b estipula que altres quinases incloses p38 α , JNK1, JAK1, 4E-BP1 i DAPK1 són activades per PRM. Els estudis ara haurien d’abordar si l’activació d’aquestes quinases addicionals mediada per PRM subsisteix altres influències no hemostàtiques de les plaquetes.

El (s) factor (s) anti-apoptòtic alliberat de plaquetes activades té diverses característiques favorables. Primer, les PRM ofereixen protecció a diversos tipus de cèl·lules (figura 4) i, importantment, es poden utilitzar per rescatar cèl·lules ferides després de l’apoptosi iniciada (figures 3e i f). També es destaca la potència de l’antipopoptosi basada en plaquetes, els PRM sovint protegeixen completament les neurones de les lesions (figures 2a i 6e; figura suplementària S2a). Aquesta potència es deu al fet que els PRM interfereixen amb un pas molt precoç en la inducció apoptòtica; amb PRM disminuint l’activació de les caspases iniciadores (Figura 2d), prevenint una baixada immediata dels nivells d’ADN-PK després del tractament amb etoposides (Figura 6c) i atenuació de l’exposició de fosfatidilserina induïda per l’etoposida en cèl·lules U937 (dades no mostrades). It is also notable that PRMs maintained their protective action after heating (>50 o C; data not shown) and that the protective agent lacked pro-thrombotic activity when purified from other PRM constituents (data not shown). Thus, the anti-apoptotic factor in PRMs harbours desirable traits that encourage its future identification and development as a potential therapeutic.

Several points pertaining to the preparation and use of PRMs warrant mention. First, PRMs were prepared by pooling the supernatants from washed activated human platelets across ≥4 independent donors. Our preparations of PRMs were also of high purity, significantly overlapping with the other published in-depth characterisation of the platelet releasome (Wijten et al. 1 and references therein). In addition, numerous independent batches of PRMs were used throughout this study, with each batch offering potent cytoprotection. Hence, our study denotes that a potent anti-apoptotic agent is constitutively expressed and reproducibly released from activated human platelets.

Platelets, EGFR and DNA-PK in the context of brain injury

Only recently have studies begun to define the non-haemostatic roles of platelets in the brain. For example, recent studies show that platelets drive neuroinflammation during experimental stroke and multiple sclerosis. 30, 31 However, discrepant findings exist with respect to the capacity of platelets to influence neurotoxicity. One research group has shown that activated platelets are toxic to the central nervous system, 32, 33 whereas another study shows that intracranial administration of platelet lysates (rather than PRMs) reduces post-stroke lesion volume and neurological deficit in spontaneously hypertensive rats. 34 Hayon et al. 34 attributed the beneficial effect of platelet lysates to an increase in angiogenesis and proliferation and also concluded that a platelet-based promotion of cell survival likely contributed to the dramatic improvement in post-stroke injury. Our observations that platelets offer potent neuroprotection complement and provide an underlying molecular mechanism for the findings of Hayon et al. 34 Following stroke and neurotrauma, for example, such a platelet-based mechanism might delay apoptosis, affording time for the restoration of tissue homeostasis. Indeed, a platelet-based neuroprotective mechanism capitalises on the fact that platelets are frontline responders to injury capable of releasing anti-apoptotic effectors in a spatially and temporally appropriate manner.

In comparison with the emerging neural roles of platelets, it is well established that EGFR signalling can protect the brain from injury. 35, 36, 37, 38, 39 Similarly, DNA-PK is a recognised neuroprotectant, with studies showing that DNA-PK −/− neurons are hypersensitive to injury. 22, 40 Surprisingly, no prior study has established whether EGFR-mediated activation of DNA-PK is a protective pathway that operates during brain injury. Thus, a PRM that activates the EGFR-DNA-PK cascade (our present study) warrants further investigation.

Platelets, EGFR and DNA-PK in the context of cancer

It is well accepted that activated platelets deleteriously contributes to cancer aetiology. 6, 41 It is thought that activated platelets ensheath circulating cancer cells, allowing them to evade immune detection, protecting them from vascular shear forces and helping vessel wall attachment and metastasis. 41, 42, 43 In addition, activated platelets release paracrine factors that promote cancer cell proliferation, 44 chemo-resistance 7 and angiogenesis. 45, 46 Hence, platelet count is commonly used as a prognostic factor whereby patients with high platelet counts have reduced survival rates in a range of tumour types including cervical 47 and lung cancer. 48 Our data extend these observations and show that activated platelets increase the survival of cancer cells exposed to etoposide – a widely used chemotherapeutic. Therefore, we predict that blockade of platelet-based cytoprotection, in conjunction with radio/chemotherapy may enhance the efficacy of cancer treatments.

Interestingly, ectopic activation of the EGFR-DNA-PK cascade has also been closely linked to tumourigenesis and radio/chemo-resistance. 49, 50, 51, 52, 53 Indeed, as a high proportion of malignancies feature hyperactivation/mutation of EGFR, the EGFR is a mainstay of anti-cancer research. 25, 54, 55, 56 Similarly, DNA-PK-selective antagonists, including NU7441, are promising new anti-cancer drugs. 51, 57 In this context, discovery of platelets as a potent, atypical and injury-specific activator of EGFR-DNA-PK signalling is of explicit relevance to the field of cancer. Clinical trial records should now be stratified to determine whether the efficacy of EGFR-inhibitory regimes correlates with platelet counts in cancer patients.

Observacions finals

The widespread medical use of platelet concentrates to facilitate tissue repair led us to investigate whether pro-survival factors are released by activated platelets. We find that molecules released from platelets that are yet to be identified, potently protect a variety of cell types from apoptosis by transactivation of the EGFR and stimulation of downstream DNA-PK-mediated DNA repair. Our study is the first to connect platelets, frontline responders to tissue injury, to the highly studied EGFR-DNA-PK cascade. While this connection uncovers new avenues for neuroprotection, it also provides a plausible mechanistic basis for the correlative actions of platelets, EGFR and DNA-PK during cancer. Future research should now address platelet-based cytoprotection during neurotrauma, cancer, the clinical use of platelet concentrates, and indeed, any situation where large-scale platelet activation and apoptosis coincide.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

Fitxers Excel

  1. 1.

    Taula suplementària 1

  2. 2

    Taula complementària 2

Glossari

CSF

cerebrospinal fluid

DIC

differential interference contrast

ADN-PK

Proteïna quinasa depenent del DNA

EGFR

receptor del factor de creixement epidèrmic

pEGFR

phosphorylated activate EGFR

GP

glycoprotein

PARP

poly ADP ribose polymerase

PRMs

platelet-released molecules

STS

staurosporine

veh

vehicle

SIN-1

linsidomine

OGD

oxygen-glucose deprivation

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)