L’activació de proteases de superfície cel·lular afavoreix la necroptosi, la inflamació i la migració cel·lular investigació cel·lular

L’activació de proteases de superfície cel·lular afavoreix la necroptosi, la inflamació i la migració cel·lular investigació cel·lular

Anonim

Temes

  • Migració cel·lular
  • Inflamacions
  • Necroptosi
  • Proteases

Resum

La necroptosi és una mort cel·lular programada, independent de la caspasa, morfològicament similar a la necrosi. La necroptosi induïda pel TNF està mediada per proteïnes quases que interaccionen amb els receptors, RIP1 i RIP3, i el domini mixt semblant al domini cinasa (MLKL). Després de ser fosforilat per RIP3, la MLKL es traslada a la membrana plasmàtica i media la necroptosi. Tanmateix, l’execució de la necroptosi i el seu paper en la inflamació i altres respostes cel·lulars continuen sent en gran mesura evasius. En aquest estudi, s'informa que l'activació de proteases de superfície cel·lular mediada per MLKL de la família de desintegrin i metalloproteases (ADAM) promou la necroptosi, la inflamació i la migració cel·lular. Els ADAM s’activen específicament en la fase inicial de la necroptosi quan la MLKL està fosforilada i es trasllada a la membrana plasmàtica cel·lular. L’activació d’ADAMs indueix la vessament d’ectodomà de diverses proteïnes de la superfície cel·lular, incloses molècules d’adhesió, receptors, factors de creixement i citoquines. És important destacar que el vessament de proteïnes de la superfície cel·lular pertorba l’adhesió cel·lular i accelera la necroptosi, mentre que els fragments solubles de les proteïnes escindides desencadenen les respostes inflamatòries. També demostrem que la vessament d’ectodomà E-cadherina procedent de cèl·lules necroptòtiques afavoreix la migració cel·lular. Així, el nostre estudi proporciona un nou mecanisme d’inflamació induïda per necroptosi i noves visions sobre les funcions fisiològiques i patològiques d’aquesta forma única de mort cel·lular.

Introducció

La necroptosi és una forma de necrosi programada, caracteritzada per l’arrodoniment de la cèl·lula, guanyant en volum cel·lular, ruptura de membrana plasmàtica i alliberament de contingut intracel·lular 1, 2 . Distingit de l’apoptosi, que s’executa per proteases de la família de les caspases, es creu que la necroptosi és una forma de mort cel·lular independent de la proteasa. Recentment, la nostra comprensió del mecanisme molecular de la necroptosi ha estat molt millorada mitjançant l’estudi de la necroptosi induïda pel TNF. Actualment, se sap que les proteïnes cinases que interactuen amb els receptors RIPK1 (o RIP1) i RIPK3 (o RIP3) i que el domini mixt de la linasa cinasa (MLKL) constitueixen el nucli de la maquinària de necroptosi 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 RIP1 recluta RIP3 per iniciar la formació de necrosoma i activa RIP3 mitjançant la fosforilació sobre estímuls necroptòtics 3, 8, 9. Posteriorment, es recluta RIP3 i es phosphorylates activats MLKL 4, 5 . El MLKL fosforilat al seu torn oligomeritza i es trasllada a la membrana plasmàtica 10, 11, 12, 13 . La translocació de membrana plasmàtica de MLKL és essencial per augmentar la permeabilitat de la membrana plasmàtica. S'ha suggerit que MLKL media la interrupció de la permeabilitat de la membrana plasmàtica ja sigui activant canals iònics o formant estructures de porus directament a la membrana plasmàtica 10, 11, 12, 13 . En el primer cas, MLKL afecta la funció cel·lular i la permeabilitat de la membrana mitjançant l’associació amb l’objectiu específic del canal iònic 10, 11 . En aquest darrer cas, MLKL s’uneix a determinats lípids de la membrana plasmàtica i pertorba la integritat del liposoma in vitro 12, 13 . Tot i que es creu que la MLKL és un efector d’execució en la via de la necroptosi, la implementació de la necroptosi i el seu paper en la inflamació i altres respostes cel·lulars continuen sent en gran mesura evasius. En particular, la participació de proteases en necroptosi ha estat deixada de banda, ja que es creu que l'activació de proteases no forma part del procés necroptòtic. En aquest estudi, s'informa que l'activació de proteases de superfície cel·lular mediada per MLKL de la família de desintegrin i metalloproteases (ADAM) promou la necroptosi, la inflamació i la migració cel·lular.

Resultats

Els estímuls necroptòtics indueixen la divisió de E-cadherina a la superfície cel·lular

Quan les cèl·lules sofreixen necroptosi, s’arrodonen, s’inflen i després perden la integritat de la membrana plasmàtica 1, 14 . Vam observar que les cèl·lules adherides, com les cèl·lules HT29 epitelials intestinals humanes, van perdre el primer contacte cèl·lula-cèl·lula abans d’arrodonir-se durant la necroptosi induïda pel tractament TNF, el mimètic Smac i el inhibidor de la caspasa z-VAD-fmk (TSZ) (figura 1A). Com que la E-cadherina és una proteïna transmembrana major de la unió d’adherència entre les cèl·lules epitelials veïnes 15, es va examinar si l’expressió de E-cadherina està alterada durant la necroptosi. Sorprenentment, vam trobar que es va escindir la proteïna E-cadherina de 120 kDa de longitud completa i es va produir un fragment de C-terminal de 37 kDa després del tractament TSZ de 2 hores (figura 1B), molt abans que es desorganitzés la integritat de la membrana cel·lular (figura 1A). Com que l'ectodomina de 80 kDa d'E-cadherina es va detectar en el medi de cultiu de cèl·lules tractades per TSZ, l'E-cadherina probablement es va escindir extracel·lularment a la superfície cel·lular (Figura 1C). La pèrdua de E-cadherina a la superfície cel·lular durant la necroptosi es va confirmar a més mitjançant la tinció d’immunofluorescència (informació suplementària, figura S1A). A més, la clivatge de E-cadherina també va ser induïda per altres tipus d'estímul necroptòtics incloent Fas ligand o TRAIL combinat amb mimètic Smac i z-VAD-fmk o TNF-α, cicloheximide i z-VAD-fmk (TCZ; informació complementària, Figura S1B-S1D). La escisió de E-cadherina es va detectar específicament a les cèl·lules necroptòtiques després del tractament TSZ, però no a les cèl·lules apoptòtiques després del tractament amb TNF i mimac (TS) (figura 1D i informació complementària, figura S1E) o tractament amb staurosporina (informació complementària, figura S1F) o cèl·lules autofàgiques induïdes per tractament amb rapamicina (informació complementària, figura S1G). Tant RIP1 com MLKL eren necessaris per a la divisió de E-cadherina, perquè el tractament de les cèl·lules HT29 amb necrostatina-1, un inhibidor de RIP1 16 (Figura 1E) o la derrota de MLKL en cèl·lules HT29 van bloquejar la divisió de E-cadherina (Figura 1F). Com que RIP3 fosforila MLKL 4, 5, es va examinar si la fosforilació de MLKL mediada per RIP3 indueix la clivada de E-cadherina. Vam trobar que la co-expressió de MLKL i RIP3 va induir específicament la pèrdua d’expressió d’E-cadherina a les cèl·lules HEK293, però no va afectar els nivells de proteïna GFP ni la proteïna de canal de calci de superfície cel·lular, ORAI-1-YFP 17 (Figura 1G ). És important destacar que quan es va co-expressar MLKL amb RIP3 morta per cinasa o quan es van mutar els dos principals llocs de fosforilació RIP3 de MLKL (MLKL-T357A / S358A), l'expressió de E-cadherina ja no es va canviar (figura 1H). Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que l'estímul necroptòtic indueix la clivada de E-cadherina de la superfície cel·lular mitjançant un mecanisme depenent de la MLKL.

Image

L’estímul necroptòtic indueix la divisió de E-cadherina a la superfície cel·lular. (A) Anàlisi microscòpica time-lapse de la morfologia cel·lular (DIC, contrast d’interferències diferencials) i de la presa de PI (vermell, que indica la permeabilitat de la membrana plasmàtica) després de la inducció de necroptosi per TSZ (TNF, Smac mimetic, z-VAD-fmk) en cèl·lules HT29 . (B) Les cèl·lules HT29 van ser tractades amb TSZ en diferents moments segons les indicacions. Es va analitzar els lisats cel·lulars (B) o (C) amb un mitjà d'immunoblotatge amb els anticossos indicats. (D) Les cèl·lules HT29 van ser tractades amb TNF solament, Smac mimètic, z-VAD-fmk sol, TNF i Smac mimètic (TS) o TNF, Smac mimètic i z-VAD-fmk (TSZ) durant 4 hores. Els lisats cel·lulars es van analitzar immunoblotxant amb els anticossos indicats. (E) Les cèl·lules HT29 es van pre-tractar amb o sense necrostatina-1 (Nec-1) i després es van tractar amb TSZ durant 1, 2 i 4 hores. Els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotando tal i com s’indica. (F) controlar shRNA o shRNA-MLKL HT29 cèl·lules es van tractar amb TSZ durant diferents punts de temps. Els lisats cel·lulars es van analitzar immunoblotxant amb els anticossos indicats. (G) Les cèl·lules HEK293 van ser transfectades amb construccions de GFP, ORAI-1-YFP, E-Cadherin-GFP, RIP3-V5 i MLKL-FLAG, tal com es va indicar. Després de 24 h, es van analitzar els lisats de cèl·lules mitjançant immunoblotatge amb els anticossos indicats. (H) Les cèl·lules HEK293 es van transfectar amb construccions E-Cadherin-GFP, RIP3-V5, RIP-kinasa dead-V5 (RIP3-KD-V5), MLKL-FLAG i MLKL fosfat-mutades (MLKL-T357A / S358A) segons les indicacions . Després de 24 h, es van analitzar els lisats de cèl·lules mitjançant immunoblotatge amb els anticossos indicats. Les dades mostrades són representatives de tres experiments independents.

Imatge a mida completa

Els estímuls necroptòtics indueixen un despreniment general d’ecodomàniques de proteïnes de la superfície cel·lular en la fase inicial de la necroptosi

Com que les cadherines són una gran família de molècules d’adhesió cel·lular 18, es va examinar si altres proteïnes d’aquesta família també s’escindeixen en cèl·lules no epitelials després de la inducció necroptòtica. Utilitzant un anticòs pan-cadherina que reconeix la regió C-terminal conservada de totes les cadherines, es va observar la divisió d'una proteïna cadherina, molt probablement N-cadherina 19, 20, en cèl·lules de Jurkat FADD - / - i fibroblasts embrionaris de ratolí (MEFs; Figura 2A i 2B). Curiosament, també vam trobar que els nivells de proteïna de membrana plasmàtica ATIA / vasorina 21 van disminuir significativament en les MEF i les cèl·lules L929 negatives per cadherina 22 després d’estimulació necroptòtica (Figura 2B i 2C). Aquests resultats suggereixen que la divisió de proteïnes de la membrana plasmàtica pot ser un fenomen general en la fase inicial de la necroptosi quan les cèl·lules encara estan intactes. Per explorar aquesta possibilitat, es va analitzar encara més l’abast del vessament de proteïnes de la superfície cel·lular durant la necroptosi. Vam trobar que els nivells totals de proteïnes van augmentar dràsticament en el medi de les cèl·lules tractades per TSZ en comparació amb la de les cèl·lules no tractades a 4 h abans que la membrana plasmàtica cel·lular es convertís en permeable (figura 2D). És important destacar que el derrocament de MLKL va bloquejar l’augment dels nivells de proteïnes en el medi de les cèl·lules tractades (figura 2D). Utilitzant espectrometria de masses, es van identificar una varietat de proteïnes de la superfície cel·lular del medi de cèl·lules HT29 tractades amb TSZ durant 4 h (figura 2E). La clivatge d'algunes d'aquestes proteïnes incloent la molècula d'adhesió de cèl·lules epitelials (EpCAM), la molècula d'adhesió de cèl·lules basals (BCAM) i el receptor de transferrina (TfR) es van confirmar per Western Blotting (Figura 2F). A més, la derrota de MLKL va evitar la divisió d'aquestes proteïnes (figura 2F). Així, les nostres dades revelen un vessament general d’ecodomàniques de proteïnes de la superfície cel·lular en la fase inicial de la necroptosi.

Image

L’estímul necroptòtic indueix un despreniment general d’ecododina de proteïnes de la superfície cel·lular. (A) Les cèl·lules Jurkat FADD - / - o (B) MEF van ser tractades amb TSZ durant 2, 4 i 6 h. Els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotando tal i com s’indica. (C) Les cèl·lules L929 es van tractar amb TZ durant 2, 4 i 6 h. Els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotando tal i com s’indica. (D) Controlar shRNA o MLKL-shRNA HT29 cèl·lules es van tractar amb TSZ durant 4 hores. Els medis condicionats es van recollir i analitzar mitjançant tinció de plata. (E) Llista de proteïnes de la superfície cel·lular identificades per espectrometria de masses en el medi condicionat a partir de cèl·lules HT29 tractades per TSZ. (F) controlar shRNA o shRNA-MLKL HT29 cèl·lules es van tractar amb TSZ durant 4 hores. Es van analitzar els lisats cel·lulars mitjançant immunoblotatge amb anticossos contra EpCAM, BCAM, TfR, MLKL i actina. Les dades mostrades són representatives de tres experiments independents.

Imatge a mida completa

L’activació de les metaloproteinases ADAM media la vessament de proteïnes de la superfície cel·lular en necroptosi

A continuació, vam provar si els inhibidors de la proteasa podrien bloquejar la clivada de E-cadherina en la necroptosi. L'addició de GM6001, un inhibidor de la metaloproteinasa (MMP) de matriu d'ampli espectre, va impedir la divisió de E-cadherina induïda per TSZ, mentre que altres inhibidors de proteases incloent un inhibidor de proteasa cisteïna (Z-LL) 2 cetona, un inhibidor de serina proteasa 3, 4-DCI i un còctel d’inhibidor de proteases amb una àmplia activitat d’inhibició de múltiples proteases no va impedir que es fes E-cadherina (figura 3A). De la mateixa manera, només l’inhibidor de MMP GM6001 va bloquejar la degradació d’ATIA / vasorina induïda per TSZ en MEFs (informació suplementària, figura S2A). Com que la E-cadherina de les cèl·lules no tractades no es separa quan es incuben les cèl·lules amb el medi de cèl·lules tractades per TSZ (Informació complementària, Figura S2B), la divisió de proteïnes de la superfície cel·lular va ser molt probable a causa de l’activació de la cèl·lula. -proteases superficials. Particularment, atès que s'ha demostrat que ADAM10, un membre de la família de metaloproteinasa ADAM unida a la membrana plasmàtica, escindia E-cadherina 23, aleshores hem investigat si els ADAM eren els responsables de la clivada de les proteïnes de la superfície cel·lular. De fet, tant inhibidors amplis com específics d’ADAM, inclosos TAPI-2, GI254023 i GW280264X, van inhibir significativament la divisió induïda per TSZ de les cèl·lules E-cadherina, EpCAM, TfR i BCAM en les cèl·lules HT29 (figura 3B). A les cèl·lules MEF o L929, la degradació de ATIA i N-cadherina també va ser bloquejada eficaçment pel doble inhibidor ADAM10 i ADAM17 GW280264X (informació complementària, figura S2C i S2D). A continuació, vam provar si els ADAM s’activen durant la necroptosi. Utilitzant un pèptid fluorogènic apagat que és un substrat específic de les ADAMs 24, vam observar un augment significatiu de l’activitat de la metaloproteasa després del tractament amb TSZ tant en cèl·lules HT29 com en MEFs (Figura 3C i informació complementària, figura S2E), mentre que aquesta activació no es va detectar a Cèl·lules eliminatòries o eliminatòries MLKL (figura 3D i informació suplementària, figura S2F).

Image

L’activació de les metaloproteinases ADAM media la vessament de proteïnes de la superfície cel·lular en necroptosi. (A) Les cèl·lules HT29 van ser tractades amb TSZ en presència de diferents inhibidors de protinasa durant els punts de temps indicats. Els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotando tal i com s’indica. (B) Les cèl·lules HT29 es van tractar amb TSZ en presència d'inhibidors de la metaloproteinasa ADAM TAPI-2 (10 μM), GI254023X (10 μM), GW280264X (10 μM) o control DMSO (0, 1%) en diferents moments. Els lisats cel·lulars es van analitzar immunoblotxant amb els anticossos indicats. (C) Activitat de metaloproteasa associada a les cèl·lules mesurada en cèl·lules HT29 tractades amb TSZ en els moments indicats. (D) shRNA-Control o shRNA-MLKL HT29 es van tractar amb TSZ durant 4 h i es va mesurar l'activitat de metaloproteasa associada a les cèl·lules. Els resultats mostrats són mitjanes ± SEM. a partir de tres experiments independents. (E) Cèl·lules HT29 que expressaven shRNA dirigit a ADAM9 # 1, 10 # 1, 15 # 1 i 17 # 1 van ser tractades amb TSZ durant 4 hores. Els lisats cel·lulars es van analitzar immunoblotxant amb els anticossos indicats. (F) control de shRNA, ADAM9 # 1, ADAM10 # 1 o ADAM9 # 1 i ADAM10 # 1 HT29 cèl·lules es van tractar amb TSZ en diferents moments i els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotting amb els anticossos indicats. (G) Control CRISPR, ADAM10 # 1, ADAM17 # 1 i ADAM10 # 1/17 # 1 de doble eliminació de les cèl·lules MEF van ser tractades amb TSZ durant 4 hores. Els lisats de cèl·lules es van analitzar immunoblotando tal i com s’indica. Les dades mostrades són representatives de tres experiments independents. ** p <0, 01.

Imatge a mida completa

Entre els 19 ADAM humans, es coneix que 12 són metaloproteasa activa 25 . Vam detectar que les metaloproteases actives ADAM9, ADAM10, ADAM15 i ADAM17 estan expressades en cèl·lules HT29 (informació suplementària, figura S3A) i va descompondre cadascuna d’elles (informació suplementària, figura S3B). Si bé la derrota de ADAM15 o ADAM17 no va tenir cap efecte en la divisió de la proteïna de superfície cel·lular, la derrota de ADAM9 o ADAM10 va impedir parcialment la divisió de E-cadherina i BCAM i va tenir una protecció menor sobre la divisió d'EpCAM (figura 3E). La derrota ADAM10 també va bloquejar la divisió de TfR induïda per TSZ (figura 3E). És important destacar que la derrota de ADAM9 i ADAM10 per dos conjunts diferents de shRNAs no superposats va inhibir la divisió de proteïnes de superfície cel·lular de manera més eficient (figura 3F i informació complementària, figura S3C). Per tant, ADAM9 i ADAM10 són crítics per a la divisió induïda per TSZ de proteïnes de superfície cel·lular en cèl·lules HT29. Resultats similars també es van observar en les cèl·lules Jurkat FADD - / - humanes (informació suplementària, figura S3D). A les cèl·lules MEF o L929, vam trobar que ADAM10 i ADAM17 eren crítics per a la divisió de proteïnes de superfície cel·lular ja que la doble eliminació de ADAM10 / 17 per la tecnologia CRISPR-Cas9 va inhibir de manera eficient la divisió induïda per TSZ (figura 3G i informació complementària, figura S3E i S3F). De forma col·lectiva, les nostres dades indiquen que s’utilitzen múltiples metaloproteinases ADAM per a la mediació de la vessament de proteïnes de la superfície cel·lular en resposta a estímuls necroptòtics.

MLKL es forma complex amb ADAM per mediar l’activació de metaloproteases ADAM

Com que MLKL fosforilat es localitza a la membrana plasmàtica on resideixen els ADAM funcionals, es va examinar si MLKL es troba en el mateix complex amb ADAMs després de la inducció de la necroptosi. Primer es va expressar MLKL, RIP3 i ADAM10 en cèl·lules HEK293 i es va examinar la interacció potencial entre ADAM10 i MLKL o RIP3 mitjançant immunoprecipitació amb anticorp NAM terminal específic ADAM10. Vam detectar que MLKL es co-precipitava amb ADAM10 només en presència de RIP3, i no obstant això, no es va disminuir cap RIP3 (figura 4A). Notablement, quan el RIP3 mort per cinasa es co-expressava amb MLKL, o quan es mutaven els dos llocs principals de RPH3-fosforilació de MLKL, el MLKL no ha pogut ser abatut mitjançant la immunoprecipitació ADAM10, cosa que suggereix que la fosforilació mediada per RIP3 de MLKL és essencial interacció de MLKL amb ADAM10 (Figura 4B). És important destacar que la MLKL fosforilada, no la RIP3, va formar un complex amb ADAM10 en estat necroptòtic (TSZ), però no apoptòtic (TS), a les cèl·lules HT29 (figura 4C). D'altra banda, MLKL només es va complexar amb ADAM9 en cèl·lules derrocadores de shRNA ADAM10 (Figura 4D), cosa que suggereix una possible funció redundant de ADAM9 i ADAM10 en la mediació de la divisió de proteïnes de la superfície cel·lular 26 . Estudis anteriors van suggerir que l’activació d’ADAM10 / 17 està regulada pel canvi conformacional d’oligòmer a monòmer a la superfície cel·lular 27, 28 . A continuació, es va realitzar una PAGE nativa blava per determinar l’estat oligomèric d’ADAM10 durant la necroptosi. Curiosament, vam trobar que el tractament amb TSZ va disminuir l’abundància d’oligòmers d’ADAM10 a les cèl·lules HT29 però no a les cèl·lules derrocadores de MLKL (Figura 4E). Per tant, aquestes dades suggereixen que la MLKL fosforilada pot mediar l’activació d’ADAMs mitjançant la formació d’un complex amb ADAMs.

Image

MLKL es forma complex amb ADAM per mediar l’activació de metaloproteases ADAM. (A) Les cèl·lules HEK293 es van transfectar amb ADAM10-Myc i MLKL-FLAG, RIP3-V5 o MLKL més RIP3-V5 tal com es va indicar. Els lisats cel·lulars es van immunoprecipitar amb anticossos anti-ADAM10. Els complexos immunoprecipitats es van analitzar immunoblotando tal com s’indica. (B) Les cèl·lules HEK293 van ser transfectades amb ADAM10-Myc i altres construccions tal com s'indica. Els lisats cel·lulars es van immunoprecipitar amb anticossos anti-ADAM10. Els complexos immunoprecipitats es van analitzar immunoblotando tal com s’indica. (C) Les cèl·lules HT29 van ser tractades amb TSZ o TS durant 4 hores. Els lisats cel·lulars es van immunoprecipitar amb anticossos anti-ADAM10. Els complexos immunoprecipitats es van analitzar immunoblotando tal com s’indica. (D) cèl·lules shRNA-Control o shRNA-MLKL HT29 van ser tractades amb TSZ durant 4 hores. Els lisats cel·lulars es van immunoprecipitar amb anticossos anti-ADAM9. (E) cèl·lules de control de shRNA o -MLKL HT29 van ser tractades amb TSZ durant 4 hores. Les cèl·lules van ser lisades en estat natiu i analitzades per PAGE natiu blau (panell superior) o SDS-PAGE (panell inferior) amb immunoblot anti-ADAM10. El lisat cel·lular procedent de cèl·lules derrocadores d’ADAM10 es va utilitzar com a control negatiu per a la immunoblucció d’anticossos ADAM10. Les dades mostrades són representatives de tres experiments independents.

Imatge a mida completa

L’activació de les metaloproteases ADAM accelera la mort de cèl·lules necroptòtiques i afavoreix la inflamació

És important destacar que l’abatiment d’ADAM9 o ADAM10 i, particularment, d’ADAM9 i ADAM10 doble cop protegit significativament les cèl·lules de TSZ, però no de TS, induïa la mort cel·lular (figura 5A i informació complementària, figura S4A). A més, la interrupció del contacte cèl·lula-cèl·lula i l’aferrament cel·lular per l’aparició de la necroptosi es va reduir significativament en les cèl·lules de doble assumpció ADAM9 i ADAM10 en comparació amb les cèl·lules control (figura 5B). S'han obtingut resultats similars en les MEF i les cèl·lules L929 d'ADAM10 i ADAM17 (informació suplementària, figura S4B i S4C). A més, l’inhibidor específic de la metaloproteinasa ADAM GW280264X també va retardar significativament la mort de les cèl·lules a les cèl·lules HT29 (informació suplementària, figura S4D i S4E). Abans vam trobar que l’afluència de calci és un esdeveniment precoç de la necroptosi 10 . Tot i això, l’esgotament del calci només protegia les cèl·lules de la permeabilització de la membrana plasmàtica, però no de la pèrdua del contacte cèl·lula-cèl·lula (informació suplementària, figura S4D i S4E). A més, l'esgotament de calci no va impedir la divisió d'E-cadherina induïda per TSZ (informació suplementària, figura S4F). Aquestes dades suggereixen que l’activació d’ADAMs i l’afluència de calci són dos esdeveniments separats en l’etapa inicial de la necroptosi. Curiosament, vam trobar que tot i que l’activitat de la metaloproteasa d’ADAM va augmentar quan es van cultivar cèl·lules HT29 o MEFs en suspensió, l’abatiment d’ADAM va tenir un efecte limitat en la necroptosi induïda per TSZ (informació suplementària, figura S5A-S5C) i de manera similar, la derrota d’ADAM9 i ADAM10 a les cèl·lules de Jurkat FADD - / - tampoc no es protegien contra la necroptosi induïda per TSZ (informació suplementària, figura S5D). A més, vam trobar que les cèl·lules HT29 tendien a formar agregats quan es cultivaven a densitat més alta (5 × 10 5 cel·lules / ml) i la derrota d’ADAM9 / 10 no afectava la necroptosi quan aquestes cèl·lules formaven agregats (informació suplementària, figura S5E), cosa que suggereix que l’agregació cel·lular és diferent de l’adhesió cel·lular i no afecta el procés de necroptosi. Col·lectivament, les nostres dades indiquen que l’activació d’ADAM fomenta la necroptosi específicament en cèl·lules adherides.

Image

L’activació de les metaloproteases ADAM accelera la mort de cèl·lules necroptòtiques i afavoreix la inflamació. (A) Les cèl·lules HT29 que expressaven shRNAs dirigides a ADAM9, ADAM10 o ADAM9 i ADAM10 van ser tractades amb TSZ en diferents moments i la mort cel·lular es va determinar mitjançant una tinció de PI. Els resultats mostrats són mitjanes ± SEM de tres experiments independents. (B) Anàlisi microscòpica time-lapse dels canvis morfològics cel·lulars després de la inducció de necroptosi per TSZ en control de shRNA o shRNA -ADAM9 / 10 HT29. (C) Parcel·les representatives de l'expressió de Ly-6G i 7/4 en cèl·lules de la cavitat peritoneal i (D) números d'afluència de neutròfils en la cavitat peritoneal en ratolins C57BL / 6 injectats amb PBS, control necroptòtic CRISPR- o CRISPR-ADAM10 / 17 MEF cèl · lules. (E) Els ratolins van ser tractats prèviament amb vehicle DMSO o GW280264X i seguits de la inducció de la pancreatitis aguda per caeruleïna. Es van mostrar les seccions pancreàtiques tenyides de H i E representatives de PBS o ratolins tractats amb caeruleïna. (F) Es va mesurar l’activitat sèrica d’amilasa a cada grup de ratolins ( n = 5 per grup).

Imatge a mida completa

Se sap que la desaparició de molècules de superfície cel·lular mediada per ADAM afavoreix la inflamació 29 . Per examinar si l’activació d’ADAM a les cèl·lules necroptòtiques té un paper en les respostes inflamatòries provocades per necroptosi, primer vam provar l’efecte del medi de cultiu cel·lular sobre l’activació de macròfags in vitro i vam trobar que el medi de tipus salvatge tractat amb TSZ, però no ADAM10 / 17. Doble knockout, els MEF van induir una regulació molt més gran de les expressions IFN-γ, IL-6, TNF-α i VEGF en cèl·lules macròfags J774 (informació suplementària, figura S6A i S6B). Els nivells de proteïnes d’IL-6 i TNF-α en el sobrenedant de cèl·lules J774 també van ser molt inferiors a les cèl·lules eliminatòries (informació suplementària, figura S6C). Aquestes dades indiquen un possible paper dels ADAM en les respostes inflamatòries induïdes per la necroptosi.

Per provar aquesta possibilitat in vivo , vam injectar intraperitonealment un tractament tractat amb TSZ o un MEF de doble eliminatòria ADAM10 / 17, cultivats en suspensió, en ratolins C57BL / 6. Setze hores després de la injecció, els ratolins injectats amb ADAM10 / 17 dobles eliminacions MEF tenien molt menys neutròfils a la seva cavitat peritoneal en comparació amb els ratolins injectats amb cèl·lules control, cosa que suggereix que les respostes inflamatòries desencadenades per ADAM10 / 17 dobles eliminacions eren significativament inferiors a 30, 31 ( Figura 5C i 5D). Per avaluar encara més el paper de l’activació d’ADAM en la necroptosi / inflamació in vivo , es va analitzar l’efecte de la inhibició d’ADAM en el model de ratolí de pancreatitis induït per la caeruleïna i es va trobar que la inhibició d’ADAM amb GW280264X va protegir dràsticament els ratolins de la pèrdua i necrosi de cèl·lules del pàncreas (figura 5E) . Els ratolins tractats amb GW280264X van tenir nivells significativament més baixos d'amilasa sèrica en resposta a la caeruleïna (Figura 5F). Aquestes dades confirmen que l’activació d’ADAMs afavoreix la mort i la inflamació cel·lular.

La necroptosi afavoreix la migració cel·lular i la invasió

Mentre que el mitjà de cèl·lules necroptòtiques va desencadenar respostes inflamatòries dels macròfags, no va alterar la proliferació cel·lular i la viabilitat de les cèl·lules HT29, A549 i MDA-MB-231 (Figura 6A). Tot i això, el mitjà de cèl·lules HT29 tractades amb TSZ va promoure significativament la migració cel·lular A549 i MDA-MB-231 mitjançant migració transwell test (Figura 6B). El medi condicionat de cèl·lules tractades per TSZ també va augmentar la invasió cel·lular determinada per assaig d’invasió de matrigel transwell (figura 6C). És important destacar que el medi condicionat de les cèl·lules knockback ADAM9 / 10 no va estimular la migració cel·lular (figura 6D). Atès que estudis anteriors van demostrar que la E-cadherina soluble va promoure la migració cel·lular i la invasió 23, 32, vam esgotar la E-cadherina escindida del medi de les cèl·lules tractades per TSZ i vam trobar que l'eliminació de la cadherina E abolia l'efecte promotor del medi sobre la cèl·lula. migració (Figura 6E). A més, es va trobar que el medi condicionat recollit a partir de tipus knockout tractat per TSZ, però no ADAM9 / 10, va afavorir la migració de cèl·lules T i monòcits (informació suplementària, figura S7B i S7C). Per tant, els nostres resultats suggereixen que els factors solubles procedents de la vessament mediada per ADAM de proteïnes de superfície cel·lular de cèl·lules necroptòtiques promouen la migració i la invasió cel·lular.

Image

La necroptosi afavoreix la migració cel·lular i la invasió. (A) Diagrama superior, diagrama de flux d’aïllament del medi condicionat de cèl·lules HT29 tractades amb DMSO (Ctrl-CM) o tractades amb TSZ (TSZ-CM). Les cèl·lules del gràfic inferior, HT29, MDA-MB-231 i A549 es van tractar amb DMEM, Ctrl-CM o TSZ-CM durant 48 h, respectivament. Es va analitzar la viabilitat de les cèl·lules relatives a MTT. Els resultats mostrats són mitjanes ± SEM. (B) Les cèl·lules MDA-MB-231 i A549 van ser tractades amb Ctrl-CM, TS-CM o TSZ-CM durant 12 hores. Es va analitzar la migració cel·lular mitjançant assaig transwell. Imatges esquerres i representatives del test de transwell. Dades quantitatives correctes de les cèl·lules migrades. (C) Les cèl·lules MDA-MB-231 es van sembrar en els transwells recoberts amb un 10% de gel Matrigel i es van tractar amb Ctrl-CM o TSZ-CM a partir de cèl·lules HT29 durant 24 hores. Imatges esquerres i representatives del test de transwell. Dades quantitatives correctes de les cèl·lules migrades. (D) Les cèl·lules MDA-MB-231 es van tractar amb els mitjans condicionats a partir de cèl·lules control-shRNA o ADAM9 / 10-shRNA HT29 durant 12 h. Es va analitzar la migració cel·lular mitjançant assaig transwell. Imatges esquerres i representatives del test de transwell. Dades quantitatives correctes de les cèl·lules migrades. (E) Ctrl-CM o TSZ-CM es van immunoprecipitar amb anticorp control IgG (IgG-IP) o anticorp E-cadherin (E-cad-IP) i després es van utilitzar per tractar cèl·lules MDA-MB-231 durant 12 h. Es va analitzar la migració cel·lular mitjançant assaig tranwell. Panell superior esquerre, anàlisi immunoblot dels nivells d'e-cadherina soluble en medi condicionat després de la immunoprecipitació. Tauler inferior esquerre, imatges representatives del test de transwell. Tauler dret, dades quantitatives de les cèl·lules migrades. Els resultats mostrats són mitjanes ± SEM. ** p <0, 01; Barra d’escala, 200 μm. Totes les dades van ser resultats representatius de tres experiments independents.

Imatge a mida completa

Discussió

Tot i que la transferència de MLKL actiu a la membrana plasmàtica és un pas essencial en la necroptosi, el mecanisme d’execució de la necroptosi no està clar. Si bé la MLKL fosforilada pot afavorir la necroptosi mitjançant l’activació de canals d’ions de membrana plasmàtica o exercint la seva pròpia activitat formadora de porus, aquestes funcions de MLKL són indirectes o relativament tardanes en el procés d’execució de la mort. A més, se suposa que l’activació de la proteasa no és necessària per a l’afectació de la necroptosi i sovint aquest supòsit s’utilitza com a distintiu per distingir la necroptosi de l’apoptosi depenent de la caspasa. Els nostres resultats actuals suggereixen que l’activació de la metaloproteasa d’ADAM no només es produeix en la fase inicial de la necroptosi, sinó que també té un paper clau en la promoció de la necroptosi en cèl·lules adherides.

S'ha informat que l'activació d'ADAM és a les cèl·lules atacades per algunes proteïnes bacterianes que formen porus 33 . En particular, s'ha demostrat que la toxina α-estafilococica s'uneix a ADAM10 i fa que les cèl·lules siguin més susceptibles d'atacar-se amb una baixa concentració de toxina 24, 34 . El nostre estudi suggereix que la interrupció de l’adhesió cel·lular per l’activació d’ADAM té un paper important en la mort de cèl·lules necroptòtiques. Tot i que el mecanisme detallat de l’activació d’ADAM encara és mal entès, un estudi recent va informar que ADAM10 i ADAM17 formen homodímeros a la superfície cel·lular i la transició d’ADAM10 o 17 homodímeros a monòmers és essencial per a l’activació de la metaloproteasa 27 . Mostrem que MLKL forma un complex amb múltiples ADAM sobre estímul necroptòtic. A més, l’estímul necroptòtic disminueix l’abundància d’oligòmers d’ADAM10 a les cèl·lules HT29 mitjançant un mecanisme dependent de MLKL, cosa que suggereix que MLKL pot activar ADAM10 induint un canvi conformacional de la proteasa durant la necroptosi.

A les cèl·lules vertebrades, els ADAM medien l’alliberament de proteïnes associades a membranes diverses que inclouen cadherines, Fas ligand, TNF-α, ErbB2, EpCAM i moltes altres 35 . El procés de vessament induït per l’activació d’ADAMs modula els contactes cèl·lula-cèl·lula, l’adhesió cèl·lula-matriu, la migració cel·lular i la inflamació. En conseqüència, la desregulació dels ADAM està relacionada amb diverses patologies com ara malalties autoimmunes, neurodegeneració, infecció, inflamació i càncer25. Es creu generalment que la necroptosi desencadena directament la inflamació per l’alliberament de components cel·lulars descrits com a patrons moleculars associats als danys (DAMPs) a partir de cèl·lules permeabilitzades 36 . Tot i que aquesta noció de consens es recolza en l'observació que els DAMP són alliberats de cèl·lules necroptòtiques in vitro , actualment no hi ha proves in vivo que demostrin que l'alliberament de DAMPs efectivament desencadena una inflamació, la qual cosa pot ser deguda a la redundància entre les DAMP 36 . El nostre estudi demostra que la necroptosi no només pot donar lloc a l’alliberament de DAMPs de cèl·lules permeabilitzades, sinó que també indueix el vessament de diverses proteïnes de la superfície cel·lular mitjançant l’activació d’ADAM quan la membrana plasmàtica cel·lular encara està intacta. Actualment, hi ha més de 100 proteïnes de superfície cel·lular que s’identifiquen com a substrats de metaloproteases ADAM 35 . A més de les proteïnes d’adhesió (per exemple, E cadherina i EpCAM), els ADAM també escindeixen altres factors, incloses les citocines (per exemple, TNF-α, Fas ligand) i els receptors de citocines (per exemple, IL-6R i TNF-R), que són proinflamatoris 35 . Així, el nostre estudi revela un mecanisme abans desconegut de com la necroptosi indueix directament la inflamació. A més, estudis in vivo han suggerit que la mort de cèl·lules necroptòtiques pot induir la inflamació de manera indirecta interrompent la barrera epitelial per desencadenar respostes immunes impulsades per microbis en l'epiteli intestinal 37 . Els nostres resultats demostren que l’estímul necroptòtic indueix la proteòlisi de la E-cadherina i el contacte cèl·lula-cèl·lula es pot atenuar mitjançant la derrota de ADAM9 / 10, cosa que implica que l’activació d’ADAM durant la necroptosi pot contribuir encara més a la interrupció de la barrera epitelial i agreujar la inflamació en vivo . El nostre estudi també demostra que la clivat proteolítica i l’alliberament de fragments d’E-cadherina de cèl·lules necroptòtiques afavoreixen la migració i invasió de cèl·lules tumorals. Atès que es va informar E-cadherina soluble elevada en sèrum en una gran varietat de tipus de càncer i afavoreix el creixement del tumor i la metàstasi 32, seria interessant investigar el paper de la necroptosi en la metàstasi del tumor en el futur.

De manera col·lectiva, els nostres descobriments revelen un nou mecanisme d'inflamació i migració cel·lular induïda per necroptosi i proporcionen una visió nova sobre com la necroptosi pot modular la resposta immune o causar danys als teixits, aprofundint en la comprensió de les funcions fisiològiques i patològiques de la necroptosi.

Materials i mètodes

Construeix, shRNAs, reactius i anticossos

MLKL humà etiquetat amb epítops C-terminal FLAG es va generar subclonant MLKL a pcDNA3.1-FLAG a partir de pCMV-Tag2A-MLKL, que es va descriure anteriorment 10 . Els mutants del punt MLKL es van generar mitjançant mutagènesi dirigida al lloc i es van confirmar mitjançant una anàlisi de seqüenciació. pcDNA3.1 / V5-RIP3 i pcDNA3.1 / V5-RIP3-D160N es van generar mitjançant la subclonació de RIP3 a pcDNA3.1 / V5 a partir de les construccions RIP3- i RIP3-D160N-EGFP, que van ser proporcionades amablement pel Dr Francis Ka Ming Chan ( Escola de Medicina de la Universitat de Massachusetts). E-cadherin-GFP va ser un regal de la doctora Jennifer Stow (Addgene # 28009). pRK5M-ADAM10 va ser un regal del Dr Rik Derynck (Addgene # 31717). ORIA-1-YFP va ser un regal del doctor Anjana Rao (Addgene # 19756). Tots els construccions del plasmidi es van confirmar mitjançant la seqüenciació d'ADN.

ShRNA contra MLKL es va descriure anteriorment 10 . El vector de silenciació de lentivirus que expressa shRNA dirigit a ADAM9 # 1 humà (número TRC: TRCN0000046978), ADAM9 # 2 (número TRC: TRCN0000046980), ADAM10 # 1 (número TRC: TRCN0000006675), ADAM10 # 2 (número TRC: TRCN0000006674), ADAM10 # 2 Es van obtenir de Sigma 1 (número de TRC: TRCN0000371222) i ADAM17 # 1 (número de TRC: TRCN0000052172).

Per a la generació de construccions de lentivirus CRISPR-Cas9, dos oligonucleòtids guia contra ADAM10 del ratolí corresponent a la seqüència de codificació 5′-AGACTGCTCGTTTGGCACGC-3 ′ (ADAM10 # 1) i la seqüència de codificació 5′-CTCATGTGAGACTGCTCGTT-3 ′ (ADAM10 # 2); dos oligonucleòtids guia contra ADAM17 de ratolí corresponents a la seqüència de codificació 5′-CACTTTGGTGCCTTTCGTCC-3 ′ (ADAM17 # 1) i la seqüència de codificació 5′-GTGCTGCTGAATATTAGCTA-3 ′ (ADAM17 # 2) es van clonar al vector LentiCRISPR-v2 que conté Cas9, que va ser un regal del doctor Feng Zhang (Addgene # 52961).

El TNF-α i la z-VAD-fmk es van comprar a través de R + D. Es va comprar a Sigma el cicloheximide, GM6001, 3, 4-DCI, TAPI-2, GI254023 i un inhibidor de proteïnes. La GW280264X es va comprar a AOBIOUS (Gloucester, MA, EUA). Smac mimètic va ser un regal del Dr Shaomeng Wang (Universitat de Michigan, Ann Arbor). Les citocines i receptors inflamatoris del ratolí PCR Array es van comprar a QIAGEN. Els anticossos eren de fonts comercials: anti-actina (A3853) i anti-tubulina (T9026) de Sigma; anti-E-cadherina (HECD1; ab1416), anti-MLKL anti-humà (ab184718), fosfo-MLKL anti-humà (ab187091), fosfo-MLKL anti-ratolí (ab196436), anti-ADAM10 (ab1997), anti-anti neutròfil [7/4] (ab105157) i anti-ADAM17 (ab2051) d'Abcam. Anti-ratolí Ly-6G (11-9668) de eBioscience. Anti-humà ectodmain d’ADAM9 (AF939), anti-humà ectodmain d’ADAM10 (MAB1427), anti-EpCAM humà (MAB960), anti-TfR humà (AF2474) i anti-humà BCAM (MAB1481) de R&D Systems. Anti-E-cadherina C-terminal (4A2C7) de ThermoFisher. Anti-pan-cadherina (28E12) de la tecnologia de senyalització cel·lular). El doctor Jiahuai Han (Xiamen University) va proporcionar un anticorp per al ratolí MLKL. Es va descriure anteriorment anti-ATIA / vasorina 21 .

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules HT29, L929 i MEF es van cultivar en DMEM. Les cèl·lules de Jurkat FADD - / - es van cultivar en RPMI 1640. Les MEF de tipus salvatge i les de MEK deficients van ser proporcionades amablement pel Dr Jiahuai Han (Xiamen University). Tots els medis es van suplementar amb 10% de FBS (v / v), 2 mM de L-glutamina i 100 U / ml de penicilina / estreptomicina.

Per al cultiu de cèl·lules en suspensió, es van augmentar cèl·lules HT29 o MEFs mitjançant Cellstripper (Mediatech) i una solució de dissociació de cèl·lules no enzimàtica, per evitar la degradació de les proteïnes de la superfície cel·lular. Es van rentar les cèl·lules amb PBS i es van cultivar amb DMEM a una densitat de 5 × 10 4 cèl·lules / ml en una placa de cultiu de teixits no tractats de 12 pous. El segon dia de cultiu, les cèl·lules van ser tractades amb TSZ per induir necroptosi.

Infecció amb lentivirus

Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb plàmids de transferència pCMV-VSV-G i pCMV-dr8.2-dvpr i shRNA o CRISPR-Cas9. Després de 24 h, es va recollir el sobrenedant i es va utilitzar aquesta preparació lentiviral per infectar cèl·lules. Després de 24 hores d'infecció, es van seleccionar cèl·lules amb puromicina durant 48 hores addicionals. Per a la generació d'ADAM10 o ADAM17 eliminadors MEF, les cèl·lules eliminatòries CRISPR es van cultivar a baixa densitat durant dues setmanes per seleccionar clons. L’expressió de proteïna es va determinar mitjançant immunoblot per identificar clons sense expressió ADAM10 o ADAM17. Els MEF ADAM10 i ADAM17 de doble eliminació es van generar per la coinfecció de lentivirus ADAM10 i ADAM17 CRISPR-Cas9. Els clons de doble knockout van ser seleccionats i identificats mitjançant anàlisi immunoblot.

Inducció de necroptosi

La necroptosi es va induir per pretractament amb z-VAD-fmk (20 μM) i Smac mimètic (10 nM) o cicloheximid (10 μg / ml) durant 30 min i seguit de TNF-α (30 ng / ml), o TRAIL (10) ng / ml) o FasL (10 ng / ml) per als períodes de temps indicats. L’apoptosi va ser induïda per TNF-α (30 ng / ml) i Smac (10 nM) per als períodes de temps indicats. Per al tractament amb inhibidors de proteases, GM6001 (10 μM), (Z-LL) 2 cetona (10 μM), 3, 4-DCI (100 μM), TAPI-2 (10 μM), GI254023X (10 μM), GW280264X (10 μM) i còctel inhibidor de proteases (1: 200) es van utilitzar per pretractar les cèl·lules durant 1 h i després es van tractar amb TSZ durant els punts de temps indicats.

Test de migració transwell

Es va fer un assaig de migració transwell amb filtres de policarbonat de 6, 5 mm de diàmetre (mida de porus de 8 μm). Per a la prova d’invasió cel·lular, el filtre de la placa transwell (BD Biosciences) es va recobrir amb Matrigel (BD biosciences). Les cambres inferiors es van omplir amb 500 µl de DMEM que contenien un 10% de FBS. Les cèl·lules (4 × 10 4 ) suspeses en 200 µl de DMEM condicionat amb un 0, 5% de FBS es van sembrar a la cambra superior. Per a la prova de migració cel·lular, es va permetre a les cèl·lules migrar durant 12 hores. Durant el test d’invasió de Matrigel, es va permetre que les cèl·lules migressin durant 24 hores. Les cèl·lules no migrades es van eliminar amb cotonets i les cèl·lules migrades es van fixar amb un 4% de paraformaldehid fred i es van tacar amb un 1% de color violeta. Les imatges es van prendre mitjançant un microscopi invertit (ampliació 10 ×; Olympus) i les cèl·lules migrades es van quantificar mitjançant un recompte manual.

Test de quimiotaxi

Es va analitzar la quimiotaxi de cèl·lules T i monòcits mitjançant cambres Transwell de 24 pous amb porus de 5 μm (Corning). A les cambres superiors es van col·locar un total de 10 cèl·lules Jurkat FADD - / - o THP-1 en 100 μl tampó de quimiotaxi (RPMI 1640 / 0, 5% BSA). El medi condicionat recollit a partir de cèl·lules necroptòtiques es va col·locar als pous inferiors i les cambres es van incubar durant 3 h a 37 ° C. Les cèl·lules migrades ubicades als pous inferiors van ser recollides i comptades per FACS. Tots els experiments es van realitzar per triple. El percentatge de migració es va calcular pel nombre de cèl·lules de la cambra inferior dividit per la suma de cèl·lules posades a la cambra superior al començament dels experiments.

Mesura de l'activitat de metaloproteasa ADAM

Les cèl·lules (3 × 10 4 ) es van sembrar durant una nit a la placa de 96 pous i es van tractar amb DMSO o TSZ durant els temps indicats. Es van rentar les cèl·lules amb Tris de 25 mM, tampó de pH 8, 0 i es van incubar durant 30 min a 37 ° C amb un substrat peptídic fluorogènic de 10 μM (Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH2, sistemes de R&D) diluït en Tris de 25 mM, pH 8, 0. La intensitat de fluorescència es va llegir en un instrument Molecular Devices SpectraMax i es va analitzar amb el programari SoftMaxPro.

Anàlisi de PCR en temps real

L’ARN es va extreure amb TRIzol (ThermoFisher) i es va quantificar per espectrofotometria (NanoDrop, Peqlab). L’ARN es va transcriure inversament mitjançant Superscript III revers transcriptasa (ThermoFisher), segons el protocol del fabricant. Es van realitzar PCR regulars amb MyTaq Red Mix (Biolina). Les PCR en temps real es van realitzar mitjançant el kit SensiFAST SYBR Hi-ROX (Bioline). Les seqüències dels oligonucleòtids utilitzats en RT-PCR figuren a la informació complementària, Taula S1. Per a l'anàlisi periòdica de PCR, els productes PCR van ser sotmesos a electroforesi en gels d'agarosa al 1, 5%, visualitzats a la llum ultraviolada després de la tinció de bromur d'etidium, i després es van fer imatges. Per a PCR en temps real, el nombre de cicle llindar per als ADAM es va normalitzar al de GAPDH, i el valor resultant es va convertir a una escala lineal. Tots els assajos es van realitzar almenys tres vegades a partir de preparacions d’ARN independents.

Immunoblucció, reticulat i immunoprecipitació

Les cèl·lules es van recollir i lisar en tampó M2 (Tris 20 mM, pH 7, NP40 al 0, 5%, NaCl 250 mM, EDTA 3 mM, EGTA 3 mM, DTT 2 mM, PMSF 0, 5 mM, fosfat 20 mM-glicerol, vanadat de sodi 1 mM, 1 μg / ml Leupeptina). Els lisats cel·lulars es van separar per SDS-PAGE i es van analitzar per immunoblot. La proporció de dilució dels anticossos utilitzats per a Western Blotting és d’1: 1 000. Les proteïnes es van visualitzar mitjançant quimioluminiscència millorada, segons les instruccions del fabricant (Amersham).

Per a la immunoprecipitació endògena, es va realitzar un reticulat de proteïnes cel·lulars abans de la lisi cel·lular. Les cèl·lules es van rentar tres vegades amb solució PBS freda i glaçada i incubades amb reactiu de reticulació (DSP, 2 mM) a PBS durant 30 min a temperatura ambient, seguida de incubació de 10 mM de Tris, pH 7, 5 tampó durant 15 min per saciar el reacció. A continuació, les cèl·lules es van lisar en un tampó M2 que contenia 1% de digitonina. Es van precipitar les mostres amb anticossos (1 g) i perles de proteïna G-agarosa incubant a 4 ° C durant la nit. Les gotes es van rentar de quatre a sis vegades amb 1 ml de tampó M2 i les proteïnes enllaçades es van eliminar mitjançant ebullició en el tampó SDS i es van resoldre en un 4% -20% de gels SDS-poliacrilamida per a anàlisis de blot occidental.

Anàlisi d'espectrometria de masses

Les cèl·lules HT29 (5 × 10 7 ) van ser tractades amb DMSO o TSZ en 10 ml DMEM sense sèrum durant 4 hores. El medi condicionat es va recollir i ultra-centrifugar a 100 000 × g durant 1 h per eliminar les microvesícules. Les proteïnes del medi condicionat (5 ml) es concentraven per precipitació TCA. Les mostres de proteïnes concentrades es van analitzar mitjançant SDS-PAGE i es van realitzar digestions en gel com es va descriure anteriorment 38 . Les mostres digerides es van analitzar mitjançant nanoLC-MS / MS (nanoACQUITY UPLC i SYNAPT G2 HD mass spectrometer; Waters). Les dades d’espectrometria de masses es van obtenir amb el mode Anàlisi de dependència de dades, processat amb programari PLGS 2.4 (Waters) i la llista de pics resultant es va cercar a la base de dades NCBI amb el motor de cerca MASCOT, la seqüenciació de nou es va realitzar mitjançant el programari Masslynx Pepseq 4.1 (Waters) . Les proteïnes alliberades en el medi condicionat condicionat amb TSZ es van descriure mitjançant l'ús de la condició tractada amb DMSO com a línia base. Les proteïnes de la superfície cel·lular es van identificar mitjançant una anotació funcional a partir de les dades perfilades.

Cèl·lules necroptòtiques induïdes peritonitis in vivo

El control CRISPR o els ADM10 / 17 eliminats MEF es van cultivar en suspensió i es van tractar prèviament amb TSZ durant 2 hores i es van rentar tres vegades amb PBS. Les cèl·lules es van tornar a suspendre en PBS a una densitat d’1 × 10 8 cèl·lules / ml. Un total de 2 × 10 7 MEF pre-necroptòtiques en 200 μl PBS es van injectar intraperitonealment al ratolí C57BL / 6. La sola injecció de PBS va servir de control. Les cavitats peritoneals després de la injecció de 16 hores es van rentar amb 6 ml de PBS que contenien 3 mM EDTA i 10 U / ml heparina. El nombre total de cèl·lules d’exsudat peritoneal es va comptar mitjançant un hematocitòmetre i després centrifugar a 450 × g durant 10 min. Els pellets de cèl·lules suspesos en PBS es van tenyir doble amb anticossos Ly6G i 7/4 i es van analitzar per citometria de flux tal i com es descriu 30 . Els nombres de neutròfils de l’exsudat peritoneal es van determinar multiplicant el nombre de cèl·lules d’exsudat peritoneal total pel percentatge de cèl·lules de Ly-6G + 7/4 + .

Pancreatitis aguda induïda per la caeruleïna

Els ratolins C57BL / 6 a les 6-8 setmanes d’edat ( n = 5) van ser injectats intraperitonealment amb GW280264X (100 μg / kg, dissolts en DMSO, concentració final 0, 06%) o control del vehicle (0, 06% DMSO) durant 1 h. Després, es van injectar intraperitonealment ratolins amb caeruleïna (50 g / kg, Sigma) cada hora durant 10 hores consecutives. Després de la darrera injecció de caeruleïna, es van reinjectar ratolins amb GW280264X o control del vehicle tal com es descriu anteriorment. Els ratolins van morir 16 hores després de la darrera injecció i es van collir ràpidament mostres de teixit pancreàtic i sang. Es va realitzar la quantificació de lesions de pàncrees en seccions de teixit pancreàtic tacades amb H&E i es va mesurar l’activitat sèrica d’amilasa.

Anàlisi estadística

Per a la comparació entre tots els diferents grups, es van fer servir la prova t i l’anàlisi unidireccional de la variància de l’alumne. P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Contribucions d'autor

ZC i Z-GL van concebre l'estudi. ZC va realitzar la major part del treball experimental. L’AL va realitzar alguns experiments d’immunoprecipitació i mort cel·lular. WL, TL i X-MZ van realitzar experiments d’espectrometria de masses. ZC, SC i Z-GL van escriure el treball. Z-GL va supervisar l'estudi. Tots els autors van discutir els resultats i les implicacions i van comentar el manuscrit en totes les fases.

Interessos financers competitius

Els autors no declaren interessos financers competitius

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària, figura S1

    Necroptotic stimuli induces cleavage of E-cadherin.

  2. 2

    Informació complementària, figura S2

    ADAM metalloproteases mediate shedding of cell surface proteins during necroptosis.

  3. 3.

    Informació complementària, Figura S3

    shRNA- or CRISPR-Cas9-mediated knockdown of ADAM metalloproteases in HT29 or L929 cells, respectively.

  4. 4.

    Informació complementària, figura S4

    Activation of ADAM metalloproteases accelerates necroptotic cell death.

  5. 5.

    Informació complementària, Figura S5

    Analysis of TSZ-induced cell death in ADAM metalloproteases knocked down or knockout cells cultured in suspension.

  6. 6.

    Informació complementària, Figura S6

    Analysis of inflammatory cytokines by real-time PCR and ELISA assay.

  7. 7.

    Informació complementària, Figura S7

    ADAM metalloproteases mediated shedding of cell surface proteins promotes migration of T cells and monocytes.

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària, Taula S1

    Sequences of oligonucleotides used in this study

    (La informació complementària està enllaçada a la versió en línia del treball al lloc web de la investigació cel·lular .)