L'activació de receptors acoblats a proteïna g correlaciona amb la formació d'una via interna continuada de l'aigua | comunicacions de natura

L'activació de receptors acoblats a proteïna g correlaciona amb la formació d'una via interna continuada de l'aigua | comunicacions de natura

Anonim

Temes

  • Receptors acoblats a proteïnes G
  • Biofísica de membrana
  • Biologia estructural

Resum

Les estructures cristal·lines recents de receptors acoblats a proteïna G (GPCRs) han revelat molècules d'aigua ordenades, plantejant preguntes sobre el paper funcional d'aquestes aigües per a l'activació del receptor que a les estructures estàtiques no podrien respondre. Aquí, es van fer servir simulacions de dinàmiques moleculars per controlar -a resolució atòmica i alta temporal- canvis conformacionals d’importància central per a l’activació de tres GPCR prototípics amb estructures de cristall conegudes: el receptor adenosina A 2A, el receptor β 2- adrenèrgic i la rodopsina. Les nostres simulacions revelen que una capa hidrofòbica de residus d'aminoàcids al costat del característic motiu NPxxY forma una porta que s'obre per formar un canal continu d'aigua només quan l'activació del receptor. El residus de tirosina molt conservat Y 7.53 experimenta transicions entre tres conformacions diferents que representen metàstats inactius, activats amb proteïna G i GPCR. L’anàlisi addicional de les estructures de cristalls GPCR disponibles revela principis generals que regulen els rols funcionals de les aigües internes en els GPCR.

Introducció

Les molècules internes d'aigua són essencials per a la funció de moltes proteïnes de membrana com ara proteïnes de canal i de transport 1 . Per als receptors acoblats a proteïna G (GPCRs), que constitueixen la major classe de proteïnes de membrana que transmeten senyals extracel·lulars a través de la membrana plasmàtica, s’han proposat que les molècules internes d’aigua tinguin un paper important en l’activació dels receptors, però els models mecanicistes segueixen sent especulatius 2 . Estudis anteriors van revelar que molècules d'aigua de la regió citoplasmàtica de rodopsina (Rho) estan involucrades en l'alliberament hidrolític de la retina després de l'activació de Rho per la llum 3, 4 . Les estructures cristal·lines de Rho i el receptor adrenèrgic beta-2 (β 2 AR) van revelar més detalls. Es produeixen canvis conformacionals distingits durant l’activació d’aquests receptors, incloses les reorganitzacions de les xarxes d’enllaç d’hidrogen de proteïnes interiors, que podrien estar en contacte amb les aigües internes 5, 6 . Un important pas endavant va venir de les recents estructures de cristall d’alta resolució del receptor A 2A d’ adenenosina (A 2A R) i del receptor del delta opioide (δOR), que van revelar molècules d’aigua ordenades internes que podrien ser crucials per a l’activació GPCR 7, 8 . Sobre la base de les seves estructures de cristall, Liu et al. 7 van proposar que el A 2A R en estat no activat contingués un canal d’aigua intern gairebé continu, que es desorganitza en el receptor activat. Tanmateix, aquest suggeriment detallat sobre l’extensió del canal d’aigua intern no és concloent per diverses raons: (1) Com es mostra en aquest article, les molècules d’aigua del receptor A 2A són força mòbils, que exclouen la determinació de la seva localització espacial precisa dins. el marc estructural de la proteïna. (2) Per calcular la via d’aigua intrínseca del receptor, Liu et al. 7 va augmentar el radi de molècules d’aigua i va connectar totes les molècules d’aigua entre elles perquè no és possible distingir entre un canal d’aigua continu i un discontinu d’estructures de cristall.

Tot i això, és important conèixer la distribució espatiotemporal exacta de l’aigua a l’interior dels GPCRs i els seus llocs de contacte amb la columna vertebral polipeptídica i les cadenes laterals del receptor per comprendre finalment la relació d’un canal d’aigua intern amb la funció del receptor. Les aigües internes poden interferir fortament amb les xarxes internes d’enllaç d’hidrogen de la columna vertebral i les cadenes laterals d’una proteïna, influint així fortament en els seus canvis estructurals i conformatius. En particular, els detalls de com les molècules d’aigua intrínseques s’uneixen a l’estructura de les proteïnes i afecten així l’activació del GPCR a nivell atòmic no es poden solucionar mitjançant estructures de raigs X estàtiques. De forma alternativa, les simulacions de dinàmica molecular (MD) poden resoldre detalls atòmics de les transicions estructurals dels receptors i les seves aigües internes, que experimentalment no són accessibles 8, 9, 10, 11 . Aquí, mitjançant un total de simulacions de MD de tots els àtoms de 32 μs, hem estudiat amb resolució espacial i temporal alts passos importants durant l’activació de tres receptors diferents dels GPCR de classe A per dilucidar com les molècules d’aigua entren a l’espai interior d’un receptor, uneix i influeix en les transicions estructurals d'aquesta proteïna. Al contrari de Liu et al. 7, les nostres simulacions van revelar que en l’estat inactivat de la A 2A R la via interna de l’aigua és interrompuda per una porta d’aminoàcids hidrofòbics, que a l’activació del receptor evoquen canvis de conformació obrint un canal d’aigua intern continu. Analitzant totes les estructures de cristall GPCR disponibles actualment, vam poder identificar els rols funcionals habituals de les aigües internes dins dels membres dels GPCRs de classe A.

Resultats

Capes hidrofòbiques de residus d'aminoàcids en la A 2A R

Vam iniciar les nostres investigacions de MD a partir de la resolució de 1, 8-Å A, una estructura de cristalls 7 2A R (PDB 4EIY), que mostra una xarxa completa de 57 molècules de dissolvents dins del receptor juntament amb un ió sodi al lloc al·lostèric. Segons els factors b cristal·logràfics (Fig. 1a) moltes de les molècules d’aigua intrínseques del receptor són mòbils, propietat que es manifesta a més pel mapa de densitat d’electrons pobres en diverses regions del receptor, especialment aquelles properes a Y288 7, 53 en el motiu NPxxY i D52 2.50 al lloc al·lostèric. Mentrestant, es va publicar una altra estructura de cristall GPCR de resolució 1, 8 Å, la del DOR (PDB 4N6H) 12 . Això també conté aigües internes tal com ho fa la A 2A R (Fig. 1b).

Image

(a) A 2A R (PDB 4EIY) i (b) δOR (PDB 4N6H). La precisió per definir la posició de les molècules d'aigua individuals (representades com a esferes de colors) és donada pels factors b cristal·logràfics (vegeu el codi de colors). Amb el programa de COOT 56 es mostra un mapa de densitat d’electrons cristal·logràfic de molècules d’aigua a nivell de 1, 5 σ . El mapa 2F O -F C es troba a la graella blava i el mapa F O -F C a la graella vermella.

Imatge a mida completa

Per revelar com les molècules d’aigua ubicades dins del receptor es distribueixen espacialment i temporalment i com s’uneixen a les fluctuacions estructurals de la proteïna durant l’activació de GPCR, vam realitzar simulacions de MD a llarg termini d’àtoms a partir d’estructures cristal·lines particulars de la A 2A R: (a ) Antagonista ZMA lligat a A 2A R (ZMA / A 2A R) que representa un GPCR inactivat, (b) agonista NECA atracat a inactiu A 2A R I (NECA / A 2A R I ) i estructures de cristall A 2A R II activades (NECA / A 2A R II ) que representa un GPCR en estat meta entre un receptor inactivat i activat, i (c) NECA lligat a A 2A R en presència d’un fragment d’hèlix C-terminal de la subunitat α de la proteïna G s ( G α ) al costat citoplasmàtic (NECA / A 2A R / G α ) que representa un complex GPCR / proteïna G activat 7 . Es van realitzar dues simulacions de MD paral·leles de 1, 6 μs de durada per a cadascun dels casos esmentats anteriorment (Taula suplementària 1).

Tot i que es van trobar moltes molècules d’aigua dins del receptor durant les nostres simulacions de MD en el cas de ZMA / A 2A R, es van resoldre dues capes diferents lliures d’aigua de cadenes laterals d’aminoàcid hidrofòbic basades en mapes de densitat d’aigua (Fig. 2a). Aquests també es van revelar a partir de la distribució de molècules d’aigua en l’estructura de cristall (Fig. 1a). La primera capa hidrofòbica (HL1) es va localitzar entre els llocs ortostèrics i al·lostèrics i tenia un gruix de ~ 7 Å (Fig. 2a). Curiosament, les molècules d'aigua del gruix al costat del NECA agonista enllaçat només rarament es difonen a la butxaca profunda del receptor. La segona capa hidròfoba (HL2) de ~ 12 Å de gruix es va localitzar a prop del motiu NPxxY molt conservat a TM7. En aquesta zona hidrofòbica, tres molècules d’aigua interconnectades (Fig. 1a) unides a residus entre Y288 7.53 i Y197 5.58 a l’estructura del cristall, es van trencar en les simulacions de MD i només es va quedar connectada una molècula d’aigua a Y197 5.58 . Això coincideix amb l’elevada mobilitat de les aigües indicada pels seus elevats factors b i la mala localització en els mapes de densitat de les estructures de cristall.

Image

Es mostren detalls estructurals de MD final de la capa hidròfoba i la densitat mitjana d’aigua per ( a ) ZMA / A 2A R, ( b ) NECA / A 2A R I, ( c ) NECA / A 2A R II i ( d ) NECA / A 2A R / G α .

Imatge a mida completa

Per al GPCR activat al complex NECA / A 2A R I, es van localitzar moltes més molècules d’aigua dins del receptor (Fig. 2b) que no pas pel GPCR inactiu del complex ZMA / A 2A R. En ZMA / A 2A R, les molècules d’aigua del gruix van accedir directament a HL1, i a NECA / A 2A R I, l’agonista NECA es va connectar al motiu NPxxY a través d’una xarxa de molècules d’aigua contínua que comportaven un ió de sodi dins del receptor. A més, la conformació de Y288 7.53 va experimentar una transició única durant les simulacions de MD en l'interval de temps de 0, 3–0, 6 μs (Fig. 3c, d). Superposant l'estructura final de NECA / A 2A R I de simulacions de MD (després d'un rebuig de residus) amb l'estructura de cristall NECA / A 2A R 12, vam trobar que el residu Y288 7.53 adoptava conformacions idèntiques (figura suplementària Fig. 1a). A més, es va mantenir la HL2 observada en el complex ZMA / A 2A R al complex NECA / A 2A R I, però el gruix es va reduir a ~ 10 Å (Fig. 2b). El HL2 també es va observar en dues simulacions addicionals de 1, 6 μs MD independents, a partir de l'estructura 13 NECA / A 2A R II (Fig. 2c).

Image

( a ) Superfície d’energia lliure del NECA agonista unida a A 2A R en absència de G α . ( b ) Superfície d’energia lliure del NECA agonista unida a A 2A R en presència de G α al lloc citoplasmàtic. ( c ) Dependència de l'angle χ 1 de Y288 7.53 durant simulacions MD de ZMA / A 2A R, NECA / A 2A R i NECA / A 2A R / G α . ( d ) Dependència de l'angle χ 2 de Y288 7.53 per als mateixos complexos.

Imatge a mida completa

Sobretot, durant una simulació del complex NECA / A 2A R / G α amb G α present al lloc d’unió a la proteïna G citoplasmàtica, ambdues HL ja no es van detectar al receptor. En lloc d'això, es va formar un canal d'aigua continuat des del lloc d'unió ortostèric del lligam fins a la zona d'interacció G-proteïna (Fig. 2d). Y288 7.53 també va realitzar una transició de flip-rotation durant el curs de simulacions MD de NECA / A 2A R / G α (Figs 2d i 3c, d), però va adoptar una conformació diferent de les de les estructures de cristall de ZMA / A 2A R i NECA / A 2A R. Superposicionant l’estructura NECA / A 2A R / G α final amb la de β 2 AR completament activada en complex amb proteïna G (PDB 3SN6) 5 va revelar que Y288 7.53 compartia la mateixa conformació (Fig. 1b complementària) .

HLs a Rho i la β 2 AR

Per provar més els nostres resultats sobre HLs en A 2A R, les simulacions de MD també es van realitzar per a dos receptors addicionals, Rho i β 2A R. Com abans, es van realitzar simulacions de tot àtom de 2 × 1, 6 μs per a tres formes diferents de cada receptor. Per a Rho, hem simulat l'estructura del receptor inactiu 14 que comprèn l'11 cis- retinal unit covalentment (PDB 1U19; cRET / Rho), així com l'estructura del receptor activat amb la recta- 15 15 (PDB 2X72) en presència ( tRET / Rho / G α ) i absència de G α (tRET / Rho). De la mateixa manera, a la β 2 AR, es va investigar l'estructura del complex (PDB 2RH1) entre l'agonista carazolol invers invers parcial i β 2 AR 16 (CAR / β 2 AR) i entre l'agonista complet BI-167107 i β 2 AR ( PDB 3SN6) 17 amb G α (BIA / β 2 AR / G α ) i sense G α (BIA / β 2 AR) (Taula suplementària 1).

Com que els HL van canviar durant les simulacions de MD, vam prendre instantànies de les simulacions finals de 0, 3 μs per a anàlisi estadística. A Rho inactiu (figura suplementària 2a), també es van identificar dos HLs prop del lloc ortostèric i el motiu NPxxY que mostren un gruix de ~ 5 Å i ~ 10 Å, respectivament. No obstant això, en Rho activat sense G α al lloc citoplasmàtic (figura suplementària Fig. 2b), la HL1 va augmentar a ~ 7 Å mentre que HL2 va desaparèixer i va ser substituïda per molècules d'aigua de la regió intracel·lular. Curiosament, es va trobar un canal d’aigua continu en l’estructura del complex tRET / Rho / G α (figura suplementària Fig. 2c), on es podia accedir per aigua tant a HL1 com a HL2 durant simulacions de MD.

De la mateixa manera, es van observar dues capes de residus d'aminoàcid hidrofòbic al complex amb antagonista CAR / β 2 AR (figura suplementària 2d), amb un gruix de ~ 5 Å i ~ 12 Å, respectivament. Diferents tant a A 2A R com a Rho, la manca de la protecció G α en la β 2 AR activada va provocar una afluència de molècules d'aigua des del costat citoplasmàtic del receptor, formant finalment una via d'aigua contínua. A més, la reorganització de les molècules d’aigua també va induir Y326 7.53 al motiu β 2 AR NPxxY per tornar a la conformació inactiva (Figs 2e i 3 complementàries). Aquestes observacions coincideixen amb les troballes anteriors de Dror et al. 17 per restablir el β 2A R completament activat a l'estat inactivat requereix dècimes de microsegona.

La HL com a característica habitual dels GPCRs

Per investigar més si l’existència de la segona capa de residus hidrofòbics en el motiu NPxxY molt conservat és una característica comuna dels GPCRs de la família A, vam utilitzar un alineament de seqüències tridimensional basat en les 20 estructures alliberades de diferents membres de la GPCR de la família A. Tal com es mostra a la figura 4, els residus d'aquesta segona capa eren principalment hidrofòbics (Val, Leu, Ile, Phe i Pro). Els petits residus polars (Thr, Ser, Tyr i Met) també es van trobar algunes vegades en aquesta regió lligats a altres residus hidrofòbics pels seus fragments no polars. Només hi va haver una excepció, amb un Arg en el receptor de quimiocines tipus 4 (CXCR4) a la posició 2.43 a l’hèlix transmembrana 2 (TM2) 17 . Però fins i tot en aquest cas concret, la part hidròfoba de la cadena lateral d’Arg en l’estructura de cristall encara es trobava en una conformació apuntant cap a la zona hidrofòbia, deixant la part carregada positivament dirigida cap a la regió citoplasmàtica. L'estructura de cristall DOR d'alta resolució de 1, 8 Å (recentment llançada) (Fig. 1b) també s'inclou en les troballes anteriors 12 .

Image

A l'esquerra: alineació de residus d'aminoàcids (mostrats en codi de colors i mida segons la freqüència) a la capa hidrofòbica HL2 a prop del motiu NPxxY de GPCRs de classe A de 20. A la dreta, a la part superior: ubicació de l’HL2 dins d’un GPCR de classe A no activat. Els residus es coloreen segons el seu tipus. A la dreta, a la part inferior: els residus més conservats, P 7.50 i Y 7.53 són de color taronja a la imatge de l'estructura GPCR.

Imatge a mida completa

Tres conformacions diferents de Y 7.53

A partir de simulacions de MD a escala a llarg termini en A 2A R, Rho i β 2 AR, vam observar que Y 7.53, un residu altament conservat en GPCRs de classe A (Fig. 4), va patir diverses transicions conformacionals definides (Fig. 3). En les estructures cristal·lines dels receptors analitzats, es van observar tres configuracions úniques de rotamer de Y 7.53, a saber, Y I, Y II i Y III (Fig. 3), que es correlacionen amb l’estat funcional dels GPCRs (Taula 1). La conformació Y I es troba en moltes estructures GPCR enllaçades amb antagonistes com ZMA / A 2A R (ref. 7) o en receptors invertits agonistes com CAR / β 2 AR (ref. 16). El rotamer Y II està present en receptors units a agonistes, com ara BIA / β 2 AR / G α, amb G α unit al lloc citoplasmàtic. La conformació Y III apareix en receptors lligats a agonistes sense estabilització per G α com NECA / A 2A R, o receptors units per lligands amb arrestina com en l'estructura de cristall de 5-HT 2B R (ref. 18). Les tres conformacions s’han distingit en les nostres simulacions, incloent tant les simulacions clàssiques de MD a escala llarga i imparcials com les simulacions de metadinàmica (esbiaixades). En les clàssiques simulacions de MD imparcials (Fig. 3c, d), a partir de l'estructura de cristall unida per antagonistes 7, el residu Y288 7, 53 es va estabilitzar a la conformació Y I durant tota la simulació de 1, 6 μs MD de ZMA / A 2A R. Tanmateix, en les simulacions de NECA / A 2A R, es va produir una transició de rotació cap a la conformació Y III en el rang de temps de 0, 3–0, 6 μs i aquest estat rotàmer es va mantenir fins al final de les simulacions. La conformació Y III que es troba a les simulacions de MD és idèntica a la de l’estructura de cristall resolta prèviament d’A2A R (PDB 2YDV) 13 . Curiosament, quan tant l’agonista NECA com la proteïna Gα estaven presents, es va produir una transició de l’estat Y I a Y II en el interval de temps de 0, 3–0, 5 μs i aquest estat rotàmer es va mantenir estable fins al final d’aquestes simulacions.

Taula completa

Per investigar les diferències d’energia lliure entre les diferents conformacions de Y 7.53, es va realitzar una simulació de metadinàmica ben temperada per estimar la superfície d’energia lliure (FES). Es va fer per al receptor agonista A 2A R lligat a NECA, en absència (Fig. 3a) i presència (Fig. 3b) de G α en el seu lloc d’unió al receptor. En les simulacions de metadànica, es van mostrejar dues conformacions Y III diferents, Y IIIa i Y IIIb, que difereixen en l'angle χ 1 . En absència de G α, Y I, Y II i Y IIIa van mostrar valors FES similars de −33, −38 i −37 kJ mol −1, respectivament, cosa que implica que en aquestes condicions poden coexistir diversos estats en el receptor. És important tenir en compte que també es va fer un mostreig amb una conformació Y IIIb alternativa Y, amb un valor FES de -22 kJ mol 1 . I IIIb mostrava un angle χ 1 diferent amb l'anell aromàtic voltejat cap a TM1 i TM2. Curiosament, en la presència de G α, la FES de tots els estats, excepte Y IIIa, va disminuir en -15 kJ mol −1 i finalment es va estabilitzar als valors de −34, −47 i −28 kJ mol −1 per a Y I, Y II i Y IIIb, respectivament. En comparació amb estructures sense G α, els valors FES indiquen que l'estat Y II és substancialment més estable que qualsevol altra configuració del rotamer. Els nostres resultats també es recolzen en les observacions de Nygaard et al. 19 que les proteïnes G poden estabilitzar l'estat completament actiu dels GPCRs, evitant que el receptor canviï cap a diferents estats. Aquestes observacions ens van temptar d’investigar com les correlacions Y 7.53 es correlacionen amb una via d’aigua contínua i l’activació de GPCRs. Les molècules d'aigua internes i estructurades tenen un paper crític en l'activació dels receptors; algunes d’aquestes aigües connecten dues hélices TM i algunes formen una xarxa d’enllaç H entre el receptor i el lligand 20 . Un examen més ampli va revelar que aquestes molècules d'aigua són mòbils.

L’activació de GPCRs es caracteritza per un moviment d’hèlixs TM, que obre un gran espai a la regió citoplasmàtica per unir una proteïna G 21, 22 . Per tant, l’estat activat d’un GPCR es pot caracteritzar pel canvi de volum al lloc d’unió a la proteïna G. Segons les nostres simulacions, el complex ZMA / A 2A R lligat als antagonistes (Fig. 5), que representa un receptor inactiu, mostra un volum mitjà relativament reduït de la regió d’unió a la proteïna G de VG ~ 700 Å 3 . A NECA / A 2A R I i NECA / A 2A R, II el A 2A R roman en el estat meta 18, que es troba entre un estat inactiu i actiu, mostrant valors de VG de ~ 1.100 Å 3 . És interessant que en les estructures de cristall GPCR en estat meta de NECA / A 2A R i arrestin / 5-HT 2B R, el Y 7.53 adopti la conformació Y III 20, 22 . És més, se sap que, en unir-se a NECA, el receptor d’adenosina també senyala per arrestin 23 . Aquestes troballes impliquen que el GPR rotador Y III presenta els GPCR activats esbiaixats amb arrestina. Suggerim que el nostre estat final d’1, 6 μs MD simulació de NECA / A 2A R / G α representa l’etapa d’activació inicial de A 2A R amb un receptor parcialment activat. Per a NECA / A 2A R / G α, el volum del receptor de la regió d’unió de la proteïna G és VG ~ 1600 Å 3, que és considerablement més gran que per ZMA / A 2A R i NECA / A 2A R.

Image

No activat, meta estat i A 2A R activat es caracteritzen per diferents volums. Els estats inactius mostren els valors més baixos de VG, els receptors activats tenen els valors més grans de VG i els valors VG dels estats meta es troben entre els estats GPCR inactius i activats.

Imatge a mida completa

A Rho, la VG de l'estat inactiu també és petita (figura suplementària Fig. 4), adoptant un valor de ~ 800 Å 3 . Curiosament, els volums VG de tRET / Rho actiu i tRET / Rho / G α se situen entre ~ 1.300 Å 3 . La comparació del valor VG del complex CAR / β 2 AR amb els valors VG en A 2A R i Rho, demostren que aquest volum en estat inactiu del receptor és molt menor que en actiu. Cal dir que la VG de BIA / β 2 AR és comparable amb la VG de BIA / β 2 AR / G α, encara que no hi ha G α a la regió citoplasmàtica de BIA / β 2 AR. Això està d’acord amb la conclusió anterior 24 que β 2 AR requereix desenes de microsegons per restablir els estats inactius des d’una estructura totalment activada. Tot i això, encara vam observar que la VG de BIA / β 2 AR ja s’ha reduït a ~ 700 Å 3 en comparació amb la BIA / β 2 AR / G α totalment activada (figura suplementària Fig. 4).

G α estabilitza l'estat Y II de Y 7.53 en diversos GPCR

Per investigar com la proteïna G estabilitza la conformació Y II en estat receptor totalment activat, hem simulat 2 × 1, 6 μs per a Rho, β 2 AR i A 2A R, amb i sense G α (Fig. 6). A l'estat del receptor lligat a G α, Y 7, 53 es va estabilitzar estrictament per residus de la proteïna G. Concretament, el rotamer Y306 7, 53 Y II a Rho (Fig. 6a) es va unir a R135 3, 50 i L349 a partir de la proteïna G α, Y326 7, 53 en estat Y II a β 2A R (Fig. 6b) es va estabilitzar per R131 3, 50 i Y391 de G α, i el residu Y288 7, 53 (Y II ) de la A 2A R (Fig. 6c) es van estabilitzar per I292 7, 57 i Y391 de G α . Anàlogament, l'estat Y II també es va veure en dues estructures cristal·lines de GPCR publicades recentment amb agonistes lligats, el 5-HT 1B R (ref. 25) i el β 2 AR (ref. 16) (figura suplementària Fig. 5): La conformació Y II en aquestes estructures es va estabilitzar mitjançant L1048 a partir de la proteïna de fusió i per R147 3, 50, que està present al lloc d’unió a la proteïna G de 5-HT 1B R. A la β 2A R, el residu I104 del nanobodi Nb80 i el residu R131 3, 50 va estabilitzar l'estat actiu Y II del receptor. Quan G α estava absent en Rho lligat a agonistes (Fig. 6d), Y306 7.53 encara es va retenir per part hidrofòbica de tres residus de metionina incloent M257 6.40, M253 6.36 i M309 7.56, que han estat mostrats per experiments de mutagènesi de 26, 27 a jugar un paper en l’activació de Rho. Els nostres resultats de MD també estan d’acord amb una estructura de cristall de recent publicació de Rho solubilitzat amb octilglucosid sense proteïna G 28, que revela que l’estat actiu de Rho no necessita estabilitzar-se per una proteïna G. En A 2A R i β 2A R, que s’activen parcialment fins i tot en estat basal, l’estat Y II no es va mantenir i finalment es va estabilitzar en conformacions Y I (Fig. 6e) i Y III (Fig. 6f) en complexos amb lligats agonistes i en absència de G α .

Image

( a ) A Rho, Y306 7, 53 està estabilitzat en estat actiu Y II mitjançant R135 3, 50 de TM3 i L349 de G α . ( b ) A la β 2 AR, Y326 7, 53 està estabilitzat en estat actiu Y II mitjançant R131 3, 50 de TM3 i Y391 de G α . ( c ) A la A 2A R, Y288 7.53 està estabilitzat en estat actiu Y II per I292 7.57 de TM7 i Y391 de G α . ( d ) En absència de G α, Y306 7, 53 està estabilitzat en la configuració activa Y II mitjançant els tres residus Met: M257 6, 40, M253 6, 36 i M309 7, 56 . ( e ) En absència de G α, Y326 7, 53 va tornar a la configuració Y I inactiva. ( f ) En absència de G α, Y288 7, 53 va canviar a la configuració alternativa Y III .

Imatge a mida completa

El mecanisme de penetració de l'aigua en GPCRs

En el nostre treball actual hem descobert que els GPCR en el seu estat activat comprenen un canal intern continu d'aigua TM. En els nostres projectes anteriors vam investigar com les molècules d’aigua entren a l’interior del receptor 8, 29 . Per als receptors 1 de pèptids de formil (FPR 1 ) i els receptors opioides (ORs), mitjançant simulacions de microsegones MD, vam demostrar que l’afluència de molècules d’aigua es produeix cap al lloc al·lostèric, que és diferent al del receptor esfingosina-1-fosfat humà 1 (S1PR 1 ) 30 . Jastrzebska et al. 3 va informar que les molècules d’aigua poden arribar a la regió d’unió d’opsina des del costat intracel·lular durant la isomerització de la retina a Rho, que també es veu en les nostres simulacions de MD de Rho. Aquestes observacions impliquen que hi ha dues possibles vies de penetració d’aigua. En alguns receptors, com Rho i S1PR 1, la penetració intracel·lular d’aigua es produeix quan s’activen els receptors, mentre que per a altres receptors, com ara ORs i A 2A R, la penetració extracel·lular d’aigua es produeix durant el procés d’activació.

La nostra anàlisi de 20 estructures cristal·lines de diferents GPCRs va demostrar que les regions al·lòctriques d’unió de lligands de Rho i S1PR 1 estan totalment cobertes per grans bucles N-terminals i ECL2 (NEL; Fig. 7a, esfera blava esquerra), evitant que les molècules d’aigua massiva es puguin moure. cap a l’espai interior central del receptor. Tot i això, per a la resta de receptors, els NELs són molt més petits, deixant el lloc ortostèric àmpliament obert (Fig. 7a, esfera blava dreta). Una inspecció més àmplia de la superfície d'interacció (ISA) entre NEL i la resta de GPCR (Fig. 7a) confirma encara més aquestes diferències: Rho i S1PR 1 mostren valors ISA de 3.500-4.300 Å 2, molt més grans que els valors ISA. de la resta de receptors que oscil·len entre els 1.200 i els 2.400 Å 2 . A més, les capes d’unió de lligands a Rho i S1PR 1 són més hidrofòbiques que les d’altres GPCR (Fig. 7b). Aquesta forta propietat hidrofòbica de Rho i S1PR 1 podria bloquejar encara més l’afluència d’aigua del medi extracel·lular a granel. Notablement, molts GPCRs utilitzats en la cristal·lografia de raigs X van ser fortament modificats per permetre la cristal·lització, per exemple, de vegades es va tallar el N-extrem flexible o es van inserir seqüències de proteïnes addicionals en determinats bucles del receptor. No obstant això, encara és acceptable comparar les àrees de contacte ISA en les estructures de cristall, ja que les regions modificades flexibles potser no contribueixen gaire a la zona de contacte, ja que podrien estar desordenades en condicions fisiològiques.

Image

( a ) La inspecció d’estructures de cristall de 20 GPCR diferents mostra dos grups de receptors: Els receptors similars a Rho i S1PR 1 tenen una àrea de contacte alta de 3.500-4.300 Å 2 . La resta de receptors tenen una àrea de contacte baixa de 1.200–2.400 Å 2 . ( b ) Perfil d'hidrofobicitat del lloc d'unió de lligands en rodopsina (superior) i en μ-OR (inferior); colors: taronja, superfície hidrofòbica; superfície polar, blau.

Imatge a mida completa

Discussió

Més de 800 GPCR humans permeten a les cèl·lules reconèixer diversos estímuls extracel·lulars i transduir senyals a la membrana plasmàtica per regular els processos fisiològics centrals. Actualment, > 20 estructures de cristall GPCR s'han resolt, però encara no es coneixen del tot els detalls de la seva activació. A partir d'un total de simulacions de MD de tots els àtoms de 32 μs, aquí es va analitzar l'activació de tres receptors diferents de GPCRs de classe A. Hem descobert una característica comuna específica dels receptors: una via d’aigua intrínseca, que en estat de repòs dels receptors és interrompuda per una HL de residus d’aminoàcids i després d’unió agonista, oberta a un canal d’aigua intrínsec continu (Fig. 8). L’aigua de la massa pot entrar al receptor durant l’activació des de dues direccions diferents: des de l’extracel·lular (Fig. 8a) i des del costat intracel·lular (Fig. 8b) segons el tipus de receptor. Tres conformacions rotamer diferents, a saber, Y I, Y II i Y III, d’un residu Tyr (Y 7.53 ) molt conservat en el motiu NPxxY es correlacionen amb la formació de la via interna d’aigua i l’estat funcional dels GPCR. L’estat Y I representa l’estat inactiu del receptor amb la primera capa de residus d’aminoàcids hidrofòbics situats a prop del motiu NPxxY, la segona capa d’aminoàcids hidrofòbics al costat de Y 7, 53 i una via d’aigua s’interromp (Fig. 8c). L’estat Y II indica un estat GPCR totalment activat amb una proteïna G lligada i una via d’aigua contínua que connecta Y 7.53 amb el costat extracel·lular o intracel·lular (Fig. 8a, b). L’estat Y III correspon al meta estat del receptor que conté una HL al costat de Y 7.53 (Fig. 8d). Aquests resultats contribueixen a una millor comprensió del paper de les aigües internes en el procés d'activació dels GPCRs i proporcionen noves indicacions importants per al disseny basat en MD de compostos dirigits a GPCRs.

Image

( a ) La conformació Y II és preferida en els GPCR activats; durant la formació s’accedeix a molècules d’aigua extracel·lulars formant una xarxa interna continu d’aigua. ( b ) Per a receptors similars a Rho i S1PR 1, l'estat Y II està associat a l'afluència d'aigua citoplasmàtica. Els GPCR es mostren en gris i les subunitats de proteïna G es mostren de diferents colors. ( c ) La conformació Y I és preferida en GPCR inactius amb dues capes hidrofòbiques que bloquegen una via d’aigua contínua. ( d ) La conformació Y III és preferida en els estats meta GPCR amb una capa hidrofòbica situada al costat del motiu NPxxY i que bloqueja la formació d'una via continuada d'aigua.

Imatge a mida completa

Mètodes

Emplenament i perfeccionaments de bucles

Atès que faltava el bucle intracel·lular ICL2 per a cada receptor a causa de la inserció d'una proteïna de fusió en aquesta regió, es va utilitzar el protocol de perfeccionament del bucle en Modeller V9.10 per complir i perfeccionar aquesta àrea 31 . Es van generar un total de 20.000 bucles per a cada receptor i es va seleccionar una conformació amb la puntuació d’energia proteica optimitzada discreta (DOPE) més baixa per a la construcció del receptor. Els models reparats es van enviar a Rosetta V3.4 per perfeccionar el bucle amb mètodes cinemàtics de modelatge de llaços 32 . El tancament cinemàtic (KIC) és un càlcul analític inspirat en tècniques de robòtica per determinar ràpidament les possibles conformacions d'objectes enllaçats sotmesos a restriccions. En la implementació de Rosetta KIC, les torsions vertebrals 2N-6 d'un segment de pèptid de residu N (anomenades torsions no pivotants) s'estableixen en valors extrets aleatòriament a partir de l'espai Ramachandran de cada tipus de residu, i les sis torsions restants φ / φ (anomenades Torsions de pivot) es resolen analíticament per KIC.

Preparatius d’estructura de proteïnes

Tots els models de proteïnes es van preparar en el programari de suite Schrodinger sota el camp de força OPLS_2005. Els àtoms d’hidrogen s’han afegit a les estructures de cristall reparades a pH fisiològic (7.0) amb l’eina PROPKA (ref. 33) de l’eina de preparació de proteïnes a Maestro 33, 34, 35 per optimitzar la xarxa d’enllaç d’hidrogen. Es van realitzar minimitzacions energètiques restringides en els models completament atòmics, amb una cobertura àtona pesada fins a 0, 4 Å. Es van preparar models del complex receptor / G α tal com es va informar anteriorment 21 .

Preparatius per a l'estructura de Ligand

Totes les estructures de lligand es van obtenir a partir de la base de dades en línia de PubChem 36 . El mòdul LigPrep del programa de suite de Schrodinger 2012 es va introduir per a l’optimització geomètrica mitjançant l’ús del camp de força OPLS_2005. Els estats d’ionització dels lligands es van calcular amb l’eina Epik 37 utilitzant mètodes Hammett i Taft conjuntament amb eines d’ionització i tautomerització.

Atracament de proteïnes i lligands

El procediment d'ancoratge va ser realitzat per Glide 38, 39 . Les molècules de lligand es van col·locar inicialment a la butxaca d’unió en una postura similar a la que s’observa a l’estructura de cristall enllaçat amb el lligand. Les caixes cúbiques centrades en el centre de la massa dels lligands amb un radi de 8 Å per a tots els lligands van definir les regions d'unió a l'atracament. Es va executar un atrac flexible de lligands per a totes les estructures. Una vintena de posicions per cada lligand de 20.000 es van incloure en la minimització energètica post-atracament. La proposta més ben valorada per a cada lligand es va escollir com a estructura inicial per a les simulacions de MD.

Simulacions de MD

El sistema de membrana va ser construït per l’eina g_membed 40 a Gromacs 41 V4.6.3 amb l’estructura de cristall del receptor prèviament alineada a la base de dades d’Orientacions de Proteïnes en Membranes (OPM) 42, 43 . Per a la construcció del sistema proteïna / membrana es van utilitzar 132 lípids POPC preequilibrats juntament amb 9.200 molècules d'aigua TIP3P en una caixa ~ 70 Å × 70 Å × 98 Å. Es va modelar la proteïna amb el camp de força Amber99SB-ILD * 44 amb potencials de torsió millorats de la cadena lateral del camp de força Amber99SB. Per als lípids POPC, hem utilitzat el conjunt de paràmetres de camp de força de les lliscaments Amber (lípids d’Estocolm), que en les recents simulacions de MD de bicies de lípids van obtenir un acord excel·lent amb dades experimentals (radiografia i difracció de neutrons; paràmetres d’ordre RMN) 45, 46 . Per modelar el lligand es va utilitzar el camp de força 47 de molècules petites Amber GAFF. A partir d'un informe anterior 48, es van obtenir els paràmetres de l'11-cinal enllaçat covalentment. La geometria del lligam es va sotmetre al programa 49 GAUSSIAN 09 per a una optimització a nivell Hartree-Fock 6-31G *, quan es generen paràmetres de força fitxers. El sistema es va escalfar gradualment de 0 a 310 K seguit d'un equilibri inicial de 1 ns a volum constant i temperatura ajustada a 310 K. A continuació, es va realitzar un equilibri restringit de 40 ns addicionals a pressió i temperatura constants (conjunt NPT; 310 K, 1 bar ), i la constant de força es va atrapar gradualment de 10 a 0 kcal mol −1 . Totes les longituds d'unió als àtoms d'hidrogen es van restringir amb M-SHAKE. Van der Waals i interaccions electrostàtiques de curt abast es van tallar a 10 Å. Les interaccions electrostàtiques de llarg abast es van calcular mitjançant l’esquema de sumació de Particle Mesh Ewald. Els resultats de les simulacions de MD es van analitzar a Gromacs 41 i VMD 50 .

Càlcul mitjà de densitat d’aigua

La densitat d’aigua es va calcular al complement Volmap a VMD 50 . Volmap crea un mapa de la densitat atòmica ponderada a cada punt de xarxa. Això es fa substituint cada àtom de la selecció per una distribució normalitzada de l'amplada gaussiana (desviació estàndard) igual al seu radi atòmic. La distribució gaussiana per a cada àtom es pondera a partir d'un pes opcional llegit des de les propietats numèriques dels àtoms i per defecte a un pes d'un. Els diferents gaussians es distribueixen additivament en una graella. El significat del mapa final dependrà del pes de la massa. La densitat mitjana d’aigua es va calcular a partir del fotograma final de 0, 3 μs de cada simulació MD d’escala de temps llarg. Els resultats de sortida finals es van visualitzar en VMD.

Càlcul del mapa de contacte

El mapa de contacte dels residus al lloc d’unió a la proteïna G es va fer per g_mdmat a Gromacs, que fa que les matrius de distància consisteixin en les distàncies més petites entre els parells de residus. Per a càlculs de mapes de contacte es van utilitzar fotogrames (0, 3 μs) de cada simulació MD a escala de temps.

Simulacions de metadinàmica

Els perfils d’energia lliure dels sistemes es van calcular mitjançant la metadinàmica ben temperada a Gromacs V4.6.3 (ref. 41) amb els pegats Plumed V1.3 (ref. 51). La metadinàmica afegeix un potencial V (s, t) depenent de la història per accelerar el mostreig de les variables col·lectives específiques (CVs) s (s 1 , s 2 ,

.

, s m ) 52 . V (s, t) normalment es construeix com la suma de gaussians múltiples centrats al llarg de la trajectòria dels CV (equació 1).

Image

Periodically during the simulation, another Gaussian potential, whose location is dictated by the current values of the CVs, is added to V(s, t) (ref. 21). In our simulations, the dihedral angles of Y288 7.53, χ 1 and χ 2, were assigned as the CVs s 1 and s 2, while the width of Gaussians, σ , was set as 5 degrees. The time interval τ was 0.09 ps. Well-tempered metadynamics involves adjusting the height, w j , in a manner that depended on V(s, t) , where the initial height of Gaussians w was 0.03 kcal mol −1, the simulation temperature was 310 K and the sampling temperature Δ T was 298 K. The convergence of our simulations was judged by using the free-energy difference between states X and A at 10-ns intervals. Once the results stopped changing over time, the simulation was considered as converged 53 . Each metadynamics simulation lasted for 140 ns, and the results were analyzed upon convergence.

Reweighting algorithm

From a converged metadynamics run we can calculate directly the canonical probability distribution of the CVs at a given temperature. On the contrary, the statistics of other degrees of freedom is somehow distorted by the application, during the simulation, of a time-dependent external potential on the CVs. In well-tempered metadynamics, the reconstruction of the distribution of variables different from the CVs is particularly simple since for long time periods the amount of bias added decreases to zero and the system approaches equilibrium. The algorithm described by Bonomi et al. 54 consists of three different steps: (1) Accumulate the histogram of the CVs plus the other variables of interest between two updates of the bias potential. (2) When a new Gaussian is added, evolve the histogram as equation (2):

Image

where P ( R , t ) is the biased probability distribution, V ( S ( R ), t ) the time derivative of the bias potential and the average in the exponent is calculated in biased ensemble. (3) At the end of the simulation, the unbiased distribution P B ( R ) can be recovered from the histogram collected by using a standard umbrella sampling reweighting as equation (3):

Image

Contact area and binding volume calculations

Contact areas between the ECL2/N-terminal and the left space of receptors were calculated by the contact_surface module in Pymol. It calculates individual or global contact areas between a receptor molecule and a (multimodel) bundle of ligand partner structures. The exact contact surface area values are in Å 2 . If only a single global contact surface is calculated, a selection named 'contact' is created that includes all receptor atoms within 3.9 Å of any ligand atom to illustrate the approximate contact surface. The average G-protein-binding volumes at the cytoplasmic region were carried out in POVME (ref. 55). After filling the defined box with grid points at a 2-Å resolution, the grid points that overlapped with any atom based on van der Waals clashes were removed by ContiguousSeedSphere and ContiguousSeedBox in POVME. A spherical region positioned at the box centre with a 5-Å radius was defined as the core region. Only points that were contiguous with points in the core region were considered. Then the volume was calculated as the summation of the volumes occupied by each remaining point.

Informació adicional

How to cite this article : Yuan, S. et al. Activation of G-protein-coupled receptors correlates with the formation of a continuous internal water pathway. Nat. Comunitari . 5:4733 doi: 10.1038/5733 (2014).

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

    Figures suplementàries 1-6 i taula complementària 1

Comentaris

En enviar un comentari, accepteu complir els nostres Termes i Directrius de la Comunitat. Si trobeu alguna cosa abusiva o que no compleix els nostres termes o directrius, marqueu-la com a inadequada.