Akt i mtor medien necrosi programada en neurones | mort i malaltia cel·lular

Akt i mtor medien necrosi programada en neurones | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Senyalització cel·lular
  • Necroptosi
  • Trastorns neurològics

Resum

La necroptosi és una forma recentment descrita de necrosi regulada que contribueix a la mort neuronal en models experimentals d’ictus i traumatismes cerebrals. Tot i que s’ha treballat per dilucidar els mecanismes d’inici, els esdeveniments de senyalització que governen la necroptosi romanen en gran mesura inexplorats. Akt és conegut per inhibir la mort de les cèl·lules neuronals apoptòtiques. L’objectiu mecanicista de la rapamicina (mTOR) és un efectiu a l’aigua de Akt que controla la síntesi de proteïnes. Abans vam informar que la doble inhibició d’Akt i mTOR reduïa la mort de cèl·lules agudes i millorava els dèficits cognitius a llarg termini després de l’impacte cortical controlat en els ratolins. Aquests descobriments van plantejar la possibilitat que Akt / mTOR pugui regular la necroptosi. Per provar aquesta hipòtesi, vam induir necroptosi a la línia cel·lular neuronal hipocampal HT22 mitjançant un tractament concomitant amb el factor de necrosi tumoral α (TNF α ) i l'inhibidor de pan-caspasa N-benziloxicarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona. El tractament amb TNF α / zVAD va induir la mort cel·lular a les 4 h. La mort cel·lular va estar precedida pel muntatge RIPK1 – RIPK3 – pAkt, i la fosforilació de Thr-308 i Thr473 d’AKT i el seu substrat directe glicogen sintasa quinasa-3 β , així com mTOR i el seu substrat directe S6 proteïna ribosomal (S6), cosa que suggereix l’activació. de rutes Akt / mTOR. El pretractament amb viii inhibidor d'Ak i la rapamicina van inhibir els esdeveniments de fosforilació d'Ak i S6, la producció d'espècies reactives de l'oxigen mitocondrial i la necroptosi per sobre del 50% sense afectar el conjunt del complex RIPK1-RIPK3. Aquestes dades es van confirmar mitjançant la derrota de AKT1 / 2 i mTOR per mitjà de l'àcid ribonucleic inhibit per petits. Tots els esdeveniments bioquímics esmentats van ser inhibits per la necrostatina-1, inclosa la fosforilació Akt i mTOR, la generació d'estrès oxidatiu i el conjunt del complex RIPK1 – RIPK3-pAkt. Les dades suggereixen un nou paper inesperat per a Akt i mTOR aigües avall de l'activació de RIPK1 en la mort de cèl·lules neuronals.

Principal

La necroptosi és una forma de necrosi programada regulada per l'activitat de la cinasa de la proteïna cinasa 1 que interactua amb el receptor (RIP1; també coneguda com RIPK1) i RIP3 (també coneguda com RIPK3). Els estímuls necroptòtics indueixen un conjunt complex del receptor TNF 1 que inclou proteïna del domini de la mort associada al TNFR, proteïna del domini de la mort associada a Fas, caspasa-8, RIPK1, RIPK3 i diverses molècules reguladores com ara l'enzim conversor beta entre interleukin-1 (FLICE) - com la proteïna inhibidora i la proteïna cilindromatosi, entre d’altres. El complex format per RIPK1 – RIPK3 defineix el necrosoma, que és necessari per iniciar la mort de cèl·lules necroptòtiques. 1 La necroptosi contribueix a la mort neuronal en models experimentals d’ictus i lesions cerebrals traumàtiques. 2, 3 Recentment, un intens esforç de recerca s'ha dirigit cap a dilucidar mecanismes que contribueixen a l'execució de la necroptosi, revelant els papers crítics per a l'activitat de la cinasa de la RIP1 i la RIP3, així com la presència de la proteïna mixta del domini de la cinasa cinasa. el regulador de proteïnes de la fisió mitocondrial relacionada amb la proteïna-1 6 relacionada amb la dinamina i les espècies reactives d’oxigen (ROS). L'activitat RIPK1 i el conjunt complex del necrosoma està regulada per reaccions d'ubiquiplatació i desubiquitatació mediades per la proteïna 7 de la cilindromatosi i d'altres. Tot i que diversos informes han dilucidat mecanismes d’iniciació de la necroptosi, se sap ben poc sobre els mecanismes de senyalització i execució aigües avall del necrosoma, i de la manera com es guia la necroptosi a les cèl·lules neuronals. 8, 9, 10

Recentment vam informar que, sorprenentment, la inhibició farmacològica combinada de Akt i l'objectiu mecanicista de la rapamicina (mTOR) va reduir la mort de cèl·lules necrotiques a les regions de l'hipocamp CA3 i CA1 i va millorar el resultat funcional després d'un impacte controlat cortical (CCI) en ratolins. 11 Aquestes observacions, juntament amb les nostres dades anteriors que suggereixen la contribució de la necroptosi depenent de la cinasa RIP1 a la ICC, 3 van suggerir un possible paper per a la senyalització d’Akt / mTOR en la necrosi programada en cèl·lules neuronals. Aquests estudis in vivo en el model de CCI sobre ratolí ens van impulsar a examinar directament si Akt i mTOR medien necrosi programada en cèl·lules neuronals. Per a això, es van utilitzar cèl·lules hipocampals HT22 per provar la hipòtesi que la necroptosi mediada per RIPKI-RIPK3 està regulada aigües avall del conjunt del necrosoma per Akt i mTOR. A continuació, s'informa de l'activació de vies de senyalització d'Akt / mTOR i la mort de cèl·lules neuronals que són inhibides per inhibició farmacològica o genètica de Akt i mTOR juntes. La inhibició d'Akt / mTOR no va afectar el conjunt complex del necrosoma, però va inhibir l'estrès oxidatiu i la mort cel·lular. Les dades suggereixen un paper inesperat per Akt / mTOR en la regulació de la necrosi neuronal. Tenint en compte un gran nombre d’inhibidors d’Akt i mTOR actualment en desenvolupament, aquest mecanisme de mort aguda de cèl·lules neuronals podria ser altament susceptible d’intervencions terapèutiques.

Resultats

El TNF α / zVAD indueix necrosi a les cèl·lules HT22

Per avaluar les vies de senyalització que podrien mediar la necroptosi aigües avall de RIPK1, vam començar establint condicions que indueixen necroptosi a les cèl·lules HT22 mitjançant l'administració de factor de necrosi tumoral (TNF α ) i administració de zVAD. Els estudis de resposta a dosi de TNF α i zVAD van determinar per separat les concentracions òptimes de cada reactiu que juntament afavoreixen la necroptosi (figura 1). Vam trobar que 1 ng / ml TNF α i 50 μ M zVAD van induir eficientment la mort cel·lular i, per tant, aquestes condicions es van utilitzar posteriorment en tots els experiments (Figures 1a – c). El tractament amb TNF α / zVAD va induir la permeabilitat de la membrana al iodur de propidi (PI) (figura 1c), així com la translocació precoç de la proteïna del grup 1 de la caixa alta mobilitat (HMGB1) del nucli al citosol (figura 1d), cosa que suggereix la necrosi. La microscòpia electrònica va confirmar les característiques ultraestructurals de la necrosi incloent mitocondries inflades, desbrossament citoplasmàtic, danys a les membranes i canvis nuclears característics (figura 1e). Així, les cèl·lules HT22 moren per necrosi en resposta a TNF α / zVAD.

Image

El TNF α / zVAD indueix necrosi a les cèl·lules HT22. ( a, b ) Corbes de resposta a dosis TNF α i zVAD. La mort cel·lular es va avaluar mitjançant iodur de propidi (PI) i tinció de Hoechst. ( c ) Imatges representatives de cèl·lules HT22 tractades amb DMSO o TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μ M) durant 4 hores. ( d ) Es va detectar una translocació de HMGB1 a les cèl·lules (blau: colorant Hoechst; verd: anticòs HMGB1) i en medis de cultiu per western blot. ( e ) La microscòpia electrònica de transmissió de cèl·lules HT22 tractades amb TNF α / zVAD durant 4 o 24 h mostra morfologia necròtica incloent mitocondries inflades, desbrossament citoplasmàtic, danys a la membrana i cromatinòlisi. M, mitocondri; N, nucli. (Totes les dades es presenten com a mitjana ± SEM de 3-5 experiments independents. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 vers el grup DMSO.) Barres d’escala: c, 100 μ m; d, 10 μ m; e, 1 μ m

Imatge a mida completa

La mort de cèl·lules induïdes pel TNF α / zVAD a les cèl·lules HT22 és necroptosi

Per determinar si el TNF α indueix necroptosi, per exemple, la necrosi programada depenent de la RIPK1 / RIPK3, les cèl·lules HT22 van ser tractades amb TNF α / zVAD en presència o absència del potent i específic inhibidor de RIPK1 7-Cl-O-necrostatin-1 ( es coneix com a Nec-1 en endavant), un analògic optimitzat de necrostatina-1 que no va mostrar cap activitat inhibidora fora de la destinació en una pantalla de més de 400 quinases humanes. 12, 13, 14 la dosi de Nec-1 va inhibir la mort cel·lular de forma dependent en resposta a TNF α / zVAD (Figures 2a i b). Per validar encara més el paper de Nec-1, es va utilitzar un analògic inactiu de N- metil de 7-Cl-O-necrostatina-1 que manca d’activitat inhibidora 12 i va demostrar que la mort cel·lular ja no estava inhibida, cosa que suggereix fortament que la mort de cèl·lules HT22 era necroptosi. Per perseguir la necroptosi com a mode específic de mort, es va fer un knockdown genètic de RIPK3 utilitzant específics petits àcids ribonucleics inhibidors (siRNA). La figura 2 mostra una reducció robusta de la proteïna RIPK3 després del tractament de 72 h amb siRNA específic de RIPK3 i una potent inhibició de la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD, cosa que suggereix fortament la participació de RIPK1 i RIPK3 junts en la necrosi HT22 (Figures 2c i d). La necroptosi en cèl·lules no neuronals requereix la formació d’un complex de necrosomes RIPK1 – RIPK3 que depèn de l’activitat cinasa de RIPK1 i RIPK3. 15, 16, 17 Per valorar el muntatge del necrosoma, es van realitzar experiments d’immunoprecipitació (IP) que van confirmar la interacció entre RIPK1-RIPK3. La formació del complex RIPK1 / RIPK3 va ser inhibida pel Nec-1, com es va informar anteriorment en les línies cel·lulars no neuronals. 15 La inhibició de la interacció RIPK1 / RIPK3 per Nec-1 no es va explicar per una reducció del nivell de proteïnes, tal com es mostra en Western blot dels homogenats de mostres d’entrada (figura 2e). A partir d’aquests experiments, arribem a la conclusió que la mort de cèl·lules HT22 en resposta al TNF α / zVAD és necroptosi, en aquest cas depèn tant de RIPK1 com de RIPK3, i que almenys una part dels efectes protectors de la necrostatina-1 implica la inhibició del complex RIPK1 / RIPK3. muntatge.

Image

La mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD a les cèl·lules HT22 és la necroptosi. ( a ) Inhibició de la dosi de la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD per necrostatina-1. Les dades són mitjanes ± SEM de tres experiments independents. * P <0, 01; ** P <0, 001 enfront del TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 uM) (TZ) sols. ( b ) L'inhibidor específic de la cinasa RIPK1, 7-Cl-O-necrostatina-1 (Nec-1), però no analògic inactiu (7-Cl-O-Nec-1; Nec-1i) va impedir la mort cel·lular induïda pel TNF α i zVAD. p = ns TZ versus TZ Nec-1i. ( c ) Assumpció de RIPK3 mitjançant la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD suprimida per siRNA. * P <0, 001 vers siRNA negatiu tractat amb TNF α / zVAD. ( d ) Anàlisi de Western Blot de la derrota de RIPK3. ( e ) Experiment representatiu d'immunoprecipitació ( n = 3) que mostra el conjunt complex RIPK1 – RIPK3 en cèl·lules HT22 tractades amb TNF α / zVAD. El muntatge complex va ser inhibit per Nec-1. T, TNFa (1 ng / ml); TZN, TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μ M) / Nec-1 (30 μ M). Les dades són mitja i SEM de tres experiments independents

Imatge a mida completa

La necroptosi en cèl·lules HT22 depèn de ROS

S'ha demostrat que la necroptosi en algunes, però no en totes, les línies cel·lulars depenen de la generació de ROS. 2, 16, 18 Per determinar si la generació de ROS té un paper en la necrosi induïda per TNF α / zVAD a les cèl·lules HT22, hem utilitzat Mitosox red, que detecta ROS mitocondrials i una sèrie d’altres espècies ROS potencials. 19 les cèl·lules mitoso positives es van incrementar amb tractament TNF α / zVAD i aquest augment va ser fortament inhibit per Nec-1, cosa que indica que es generen ROS aigües avall de RIPK1 (figures 3a i b). La generació de ROS també va ser inhibida per Akt viii / rapamicina, cosa que suggereix que Akt i la senyalització mTOR es troba aigües amunt de la producció de ROS (figures 3a i b). La generació de ROS (no mostrada) i la mort de cèl·lules HT22 (figura 3c) van ser inhibides de manera determinada per la dosi antioxidant del betahidroxianisol, i la mort cel·lular va ser bloquejada per diversos antioxidants inclosa la rotenona (un inhibidor del complex mitocondrial I) i l'inhibidor de la lipoxigenasa baicaleina (Bai ; Figura 3c) Un altre inhibidor de la lipoxigenasa que no té activitat antioxidant en sí, però se sap que redueix la mort de cèl·lules relacionades amb l'estrès oxidatiu a les cèl·lules HT22, LOXBlock-1 (LOX-1), 20, 21 també protegit contra TNFa / ZVAD en la mateixa mesura que bai i rotenona. Per tant, la generació de ROS és necessària per a la necroptosi en cèl·lules HT22.

Image

La mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD està associada a l’estrès oxidatiu. ( a ) Representant × 200 fotomicrografies que mostren fluorescència MitoSox Red i Hoechst en cèl·lules HT22 4 hores després del tractament amb vehicle dimetilsulfoxid (DMSO), TNF α / zVAD (TZ), o tractament TNF α / zVAD en presència o absència de Akt / mTOR inhibidors (TZAR, TZ + Akt inhibidor VIII (10 uM) + rapamicina (100 nM)) o necrostatina-1 (30 uM; TZN). ( b ) Les cèl·lules MitoSox positives es van quantificar mitjançant microscòpia de fluorescència. ANOVA P <0.0001. * P <0, 05 vers TZ per a tots els grups. Les dades provenen de quatre experiments independents. ( c ) Efectes de protecció de betahidroxianisol (BHA), inhibidor de LOXBlock-1 (LOX-1), baicaleina i rotenona sobre la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD. Les dades provenen de tres experiments independents. * P <0, 05; ** P <0, 01 versus grup TNF α / zVAD (TZ). TZN, TNF α / zVAD / Nec-1 (30 μ M)

Imatge a mida completa

TNF α / zVAD activa vies de senyalització Akt i mTOR a les cèl·lules HT22

Curiosament, estudis anteriors en cèl·lules cancerígenes van suggerir que l’activitat Akt pot promoure, en lloc d’inhibir la mort de cèl·lules induïda per ROS a causa de la regulació transcripcional de defenses antioxidants. El nostre recent estudi va suggerir que en un cas específic de fibresarcoma de ratolí la línia cel·lular L929 Akt i l’activació mTOR contribueixen a la necroptosi. 22, 23, 24 Tanmateix, això no es va observar en diverses altres línies cel·lulars, en què Akt estava vinculada a la síntesi del TNF α però no a la mort cel·lular, cosa que suggereix que la senyalització pronecroptòtica pot limitar-se a cèl·lules L929. Tanmateix, tenint en compte les nostres dades anteriors sobre els papers d’Akt i mTOR en CCI, es va avaluar l’activació de vies d’Akt i mTOR en cèl·lules HT22 tractades amb TNF α / zVAD a 2 h. Hem escollit aquest moment primerenc perquè és anterior a l'aparició de la mort cel·lular detectable en el nostre sistema model. En resposta a TNF α / zVAD, Akt es va fosforilar als llocs 473 i 308 juntament amb glicogen sintasa cinasa (GSK) -3 β (Ser9), un substrat directe d'Akt, i mTOR i el seu substrat directe S-6 (Figures 4a i c). En contraposició a les cèl·lules L929 induïdes a la necroptosi per TNF α solament en les quals la fosforilació Akt va ser transitòria precoçment però es va mantenir diverses hores després, la fosforilació de 23 Akt i mTOR a les cèl·lules HT22 va ser detectable tan aviat com 30 minuts després de l'addició de TNF α / zVAD i va ser mantinguts durant tot el període experimental (figures 4a i c i dades no mostrades). La fosforilació d'Akt i mTOR i dels seus substrats relacionats no va ser induïda per TNF α o zVAD sols, però va requerir una senyalització necroptòtica específica per TNF α / zVAD junts (Figures 4b i d). El pretractament de Necrostatin-1 va inhibir l'augment de Akt-308 i -473, així com el de mTOR i Akt i substrats mTOR aigües avall, confirmant que la fosforilació i l'activació d'Akt / mTOR en resposta a TNF α / zVAD depèn de RIPK1 i representen seqüeles. de senyalització de necroptosi aigües avall de RIPK1 (figures 5b i c). Notablement, el tractament de les cèl·lules HT22 amb TNF / ciclohexamida (CHX) va induir la mort generalitzada de 18 h, però no va induir fosforilació per Akt a 2 h (Figura 4e) o 18 h (dades no mostrades), cosa que suggereix que l’activació Akt en cèl·lules HT22 tractades amb El TNF / zVAD és específic per a la necroptosi.

Image

Activació de Akt / mTOR després del tractament TNF α / zVAD. Els resultats d'immunoblots ( a, b ) i densitometria representatius ( c, d ) de l'activació de Akt / mTOR a les cèl·lules HT22 després del tractament TNF α / zVAD o del dimetilssulfòxid del vehicle. ( a ) Període d’esdeveniments de fosforilació a l’aigua de Akt / mTOR ( n = 3 experiments independents). ( c ) Densitometria de a . ( b ) L'efecte sinèrgic de TNF α i ZVAD és necessari per activar la senyalització Akt / mTOR a les cèl·lules HT22. ( d ) Densitometria de b . ( e ) Anàlisi representativa de Western blot de fosforilació Akt 2h després del tractament amb TNF / ciclohexamida per induir la mort de les cèl·lules apoptòtiques. No es va observar cap canvi en pAkt-473 ni en Akt total mitjançant estímuls apoptòtics. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001 enfront del grup DMSO. Les dades provenen de n = 3 experiments independents. Abreviacions: fosfo-Ser-473-Akt (p-Akt-473), fosfo-Ser308-Akt (p-Akt-308), fosfo-Ser9-GSK-3 β (p-GSK-3 β ), fosfo-Ser2448 -mTOR (p-mTOR) i fosfo-Ser235 / 236 S6 (p-S6)

Imatge a mida completa

Image

La inhibició doble d'Akt i mTOR inhibeix la necroptosi induïda per TNF α / zVAD. ( a ) Els inhibidors de Akt i mTOR van reduir la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD detectada pel iodur de propidi (PI) i la tinció de Hoechst. ( b, c ) Immunoblots i densitometria representatius per Akt fosforilats, GSK-3 β , FoxO1, mTOR i S6 en cèl·lules HT22 després de TNF α / zVAD en presència o absència de l'inhibidor de Akt VIII (10 uM) i rapamicina (100 nM) ) (les dades són tres experiments independents, * P <0, 01; ** P <0, 001 en comparació amb el grup TZ). Abreviacions: TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μ M) / Akt inhibidor VIII (10 μ M) (TZA), TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μ M) / rapamicina (100 nM) ) (TZR), TNF α (1 ng / ml) / zVAD (50 μ M) / Akt inhibidor VIII (10 μ M) / rapamicina (100 nM) (TZAR)

Imatge a mida completa

Per provar la funcionalitat de l'activació d'Akt i mTOR, es van utilitzar dos enfocaments diferents. Primer, es van tractar cèl·lules HT22 amb inhibidor d’Aksi viii, rapamicina o ambdós i es va valorar la mort de les cèl·lules mitjançant la tinció de PI i la inhibició de la via per Western blot. L’administració d’inhibidors d’Akt i mTOR junts va reduir la mort cel·lular HT22 en una mesura més gran que els inhibidors d’Akt o mTOR sols, cosa que suggereix que ambdues vies participen en la senyalització de necroptosi (Figura 5a). La mort cel·lular també es va reduir mitjançant el tractament amb l’inhibidor d’Akt viii i la torina II, un inhibidor més específic del mTOR que la rapamicina (dades no mostrades). Les anàlisis Western blot i densitomètriques van confirmar la inhibició de la fosforilació d'Akt i mTOR i els seus substrats mitjançant l'inhibidor de Akt viii i la rapamicina, respectivament (figures 5b i c).

En un segon enfocament per mitigar el potencial problema d’efectes fora de la destinació que podrien confondre la interpretació d’experiments farmacològics, es va utilitzar siRNA específic per a la derrota de Akt 1 i 2 (Akt 3 no es va detectar a les cèl·lules HT22; Figura 6a) i mTOR (Figures 6b i c), i es va avaluar l'efecte de la inhibició genètica de cadascuna en la mort cel·lular induïda per TNF α / zVAD. En cada cas es va obtenir una derrota robusta de proteïnes i les cèl·lules HT22 administrades siRNA contra Akt1 / 2 i mTOR tenien junts una reducció de la mort induïda per TNF α / zVAD similar en magnitud al tractament amb inhibidors químics de Akt i mTOR (figura 6d). Així doncs, els enfocaments químics i genètics van suggerir cadascun un paper per a l’activació d’Akt i mTOR en la necrosi programada de cèl·lules HT22.

Image

La derrota d'Akt i mTOR inhibeix la necroptosi induïda per TNF α / zVAD. ( a ) Cèl·lules HT22 expressades Akt1 i Akt2 però no Akt3 determinades per immunoblot. Els fibroblasts pulmonars de ratolí es van utilitzar com a control positiu de Akt3. ( b, c ) La derrota mediada per siRNA de mTOR, Akt1 i Akt2 a les cèl·lules HT22 es va confirmar per immunoblot mitjançant reactius que identificaven Akt total i mTOR. ( d ) La mort cel·lular es va determinar a les cèl·lules de control i en cèl·lules amb knockdown de Akt1 / 2, mTOR, o triple knockdown de mTOR i Akt1 / Akt2 junts. Les dades són representatives de tres experiments independents, * P <0.05 versus siRNA de control (CTL)

Imatge a mida completa

La inhibició de Akt / mTOR no afecta el conjunt del complex RIPK1 – RIPK3 a les cèl·lules HT22 tractades amb TNF α / zVAD

Estudis anteriors han demostrat un paper essencial per a l’activitat de la cinasa de RIPK1 / RIPK3 en l’assemblea del complex del necrosoma. 4, 15, 16, 17 Per determinar si l’activació d’Akt / mTOR també podria tenir un paper en el conjunt complex RIPK1 / RIPK3, les cèl·lules HT22 van ser tractades amb TNF α / zVAD en presència o absència d’inhibidor de Akt viii i rapamicina, i RIPK1– La interacció RIPK3 es va avaluar mitjançant IP. La inhibició de Akt / mTOR no va afectar la interacció RIPK1-RIPK3 (figura 7a), cosa que suggereix que l'activació d'Akt / mTOR es produeix aigües avall del conjunt complex RIPK1 – RIPK3 i abans dels passos de necroptosi que produeixen estrès oxidatiu. Aquestes dades també van plantejar la possibilitat d’interacció directa d’Akt amb el necrosoma i la regulació de la seva fosforilació i l’activació per part de RIPK1. De fet, es van detectar Akt total, així com fosfós-Akt-473, en immunoprecipitants RIPK1 en cèl·lules HT22 estimulades per TNF / ZVAD, i la interacció de fosfo-Akt-473 amb RIPK1 no va ser detectable amb el pretractament de cèl·lules amb necrostatina-1 (Figures 7b i c ). La inhibició de la interacció pAkt-RIPK1 per Nec-1 no va ser deguda a la manca de proteïna RIPK1 tal com es confirma per IP (Figura 7c). Aquestes dades suggereixen que els complexos Akt amb RIPK1 i RIPK3 i que la seva activitat durant la necroptosi pot estar regulada per una activitat necrosoma.

Image

El conjunt complex RIPK1-RIPK3 es produeix a l’aigua de l’activació Akt / mTOR i de la generació d’espècies reactives d’oxigen (ROS) després del tractament TNF α / zVAD. La interacció entre RIPK1 – RIPK3 ( a ) i RIPK1 – Akt ( b ) es va detectar mitjançant anàlisi d’immunoprecipitació (IP) i western blot. ( c ) La interacció RIPK1 – p-Akt-473 (fletxa) també es va detectar a les 2 h després del tractament TNF / ZVAD (TZ). La detecció de p-Akt-473 es va abolir per pretractament amb necrostatina-1 (TZN, 30 uM). Els experiments de control van mostrar la presència de RIPK1 en immunoprecipitants de tots els grups, excepte en aquells que es van immunoprecipitar amb IgG irrellevant. DMSO, control de dimetilsulfoxids. Les dades són representatives de tres experiments independents

Imatge a mida completa

Discussió

Elucidar mecanismes de necroptosi neuronal és una àrea important d’investigació tenint en compte el nombre creixent d’informes que suggereixen la seva participació en lesions agudes del sistema nerviós central, com ara isquèmia / reperfusió, trauma i hemorràgia intracerebral. 2, 3, 25, 26 Malgrat un important esforç de recerca per caracteritzar la maquinària molecular de la necroptosi, es coneix poc sobre els components de la necroptosi que senyalitza aigües avall del conjunt de necrosomes i no se sap gairebé res sobre la regulació de la necroptosi en cèl·lules neuronals. 8, 9, 10 La necroptosi en cèl·lules HT22 va mostrar totes les característiques cel·lulars i bioquímiques de la necrosi reportada en cèl·lules no neuronals, incloent el muntatge d’un complex de necrosoma RIPK1 – RIPK3, generació de ROS, sensibilitat a Jun-N-kinasa (JNK) i Inhibidors de ROS, 2, 23, 27, 28 pèrdua de potencial de membrana mitocondrial i esgotament d’adenosina trifosfat i característiques ultraestructurals característiques. 2, 15, 16, 17 La protecció per l’inhibidor específic de RIPK1 7-Cl-O-necrostatina-1 i per l’eliminació RIPK3 va confirmar la mort de cèl·lules necroptòtiques en aquest sistema model.

Abans vam informar que la inhibició farmacològica d'Akt i mTOR reduïa la mort precoç de les cèl·lules en CA1 i CA3 després de CCI en ratolins, cosa que suggeria un paper nou per a Akt i mTOR en la patogènesi de la mort traumàtica de cèl·lules cerebrals. 11 Aquestes observacions ens van impulsar a examinar el paper d’Akt i mTOR en la senyalització de necroptosi a les cèl·lules neuronals. Vam trobar que l’administració de TNF α / zVAD (però no només TNF α o zVAD) va induir una fosforilació ràpida i sostinguda d’Akt en Thr-308 i Ser-473 i mTOR, així com la fosforilació de substrats directes d’Akt (GSK-3 β , capsa de forquilla classe O (FOXO) -1) i mTOR (proteïna ribosòmica S6 (S6)). Tots aquests esdeveniments de fosforilació van ser inhibits per la necrostatina-1, un potent i molt específic inhibidor del RIPK1. 12 experiments IP van demostrar que TNF / ZVAD va induir la interacció RIPK1 – Akt i RIPK1-pAkt-473. El tractament amb Necrostatina-1 va fer que la interacció RIPK1-pAkt-473 no fos detectable, consistent amb la inhibició de la fosforilació d'Akt pel necrosoma. De forma alternativa, la necrostatina-1 pot evitar la unió de Akt a RIPK1. Segons el nostre coneixement, les dades són les primeres que mostren una interacció directa de Akt amb RIPK1, i proporcionen un enllaç molecular entre l’assemblatge del necrosoma i l’activació de Akt durant la necroptosi neuronal.

La inhibició de Akt / mTOR no va afectar la interacció RIPK1-RIPK3, però va inhibir la producció de ROS i la mort cel·lular. És important destacar que la inhibició genètica de Akt i mTOR reduïen la mort cel·lular per una magnitud similar a la dels inhibidors farmacològics, cosa que confirma un paper específic per a Akt i mTOR. En conjunt, les dades indiquen que Akt / mTOR media la necroptosi que fa senyalització aigües avall del conjunt del necrosoma i abans de la producció de ROS i l’aparició de danys del plasmalemma. L’observació que la inhibició concomitant d’ Akt i mTOR era necessària per a la protecció màxima és una reminiscència de les nostres troballes en el model CCI i suggereix papers divergents per Akt i mTOR en la senyalització necroptòtica a les cèl·lules neuronals. En canvi, l’activació d’Akt no va estar implicada en l’apoptosi de cèl·lules HT22 tractades amb TNF i CHX (Figura 4e).

En l'estudi actual, es va requerir un antagonisme de Akt i mTOR per inhibir al màxim la necroptosi a les cèl·lules HT22. Aquestes troballes estan d’acord amb el nostre estudi anterior in vivo en el qual es va requerir que els inhibidors de Akt i mTOR junts reduïssin la mort de cèl·lules necròtiques i milloressin la funció cognitiva postinjury després de la contusió cerebral en ratolins. Per tant, la regulació de la necroptosi per Akt i mTOR junts pot ser una propietat única de les cèl·lules neuronals o pot dependre de l’estímul exacte utilitzat per iniciar la necroptosi. Akt està activat i és essencial per a la necroptosi en fibroblasts de ratolí L929 estimulats amb TNF α o zVAD, però no per a la necroptosi de proteïnes associades a Fas amb limfòcits Jurkat T deficients de domini mortal tractats amb TNF α . 23 En els fibroblasts i macròfags de pulmó de ratolí, Akt va mostrar control sobre la producció de TNF α associada a la necroptosi, però no va tenir un paper en la mort cel·lular. Així doncs, l’activació Akt media la necroptosi en alguns, però no en tots els tipus de cèl·lules no neuronals, i com a tal no és una característica definidora uniforme de la necroptosi. Aquesta idea es recolza en dades que mostren una inhibició parcial o completa de la mort cel·lular per diversos agents antioxidants i inhibidors dels enzims d’estrès oxidatiu (figura 3c). Akt s'activa durant la necroptosi a les cèl·lules de Jurkat, però no es produeix la producció de ROS i els inhibidors d'Ak bloquegen la producció de TNF, però no la mort cel·lular en aquesta línia. 2, 23 Així, no hi ha una simple relació entre l’activació d’Akt / mTOR, la producció de ROS i la necroptosi en tots els tipus cel·lulars.

Els estudis de propietat intel·lectual realitzats aquí suggereixen que es pot requerir la fosforilació de Akt per a la seva incorporació al complex del necrosoma, ja que el tractament amb la detecció de necrostatina-1 va abolir la detecció de la interacció fosfo-Akt-473-RIPK1. Aquests resultats suggereixen que la fosforilació Akt podria regular la necroptosi al nivell del necrosoma. En el cas de les cèl·lules L929, Akt Ser-473 no va augmentar ni es va implicar en la mort cel·lular; tanmateix, es va requerir la localització de plasmalemma i la fosforilació selectiva d'Akt Thr-308 per unir RIPK1 a la senyalització JNK aigües avall, a la producció autocrina TNF α i a la mort. 23 Tot i que el mecanisme exacte de la fosforilació Thr-308 segueix sent desconegut, la inhibició de la fosfatasa 2A (fosfatasa que es desfosforila Thr-308; 45 MnA) no va tenir cap efecte. 23 RIPK1 recombinant in vitro pot fosforilar Akt a Thr146, 195/197, 435 i Ser381, però no és clar si Akt és un substrat endogen de RIPK1. Es necessiten 23 estudis addicionals per entendre millor com es regula la Akt mitjançant la fosforilació durant la necroptosi.

La saviesa predominant assigna un rol prosurvival a Akt en els paradigmes de lesions del SNC, incloent-hi lesions cerebrals i lesions cerebrals traumàtiques. 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 L’ activitat antiapoptòtica d’Akt ha estat ben documentada a través de diversos mecanismes incloent la inhibició de la caspasa 9, Bad i GSK-3 β i inducció de l'hexokinasa mitocondrial i del factor nuclear l'expressió gènica antiapoptòtica depenent del kappa B. 41, 42, 43 Tot i això, diversos informes recents il·lustren un paper emergent per Akt com una "mort quinasa" i un regulador clau de la necrosi programada, inclosos els tipus de cèl·lules neuronals, 44 segons el context de lesió. L’activació de la fosfatidilinositol 3 kinasa / Akt s’ha relacionat amb la mort de les cèl·lules citotòxiques 45, 46, 47, 48 i s’ha informat que la translocació nuclear de Akt sensibilitza les cèl·lules canceroses a la mort per agents quimioterapèutics. Els inhibidors 49, 50 Akt també protegeixen les neurones cultivades contra la necrosi induïda per la fotografia. 44 Dades de l’estudi actual plantegen la qüestió de quins substrats Akt / mTOR podrien ser els reguladors crítics de la necroptosi a les cèl·lules neuronals. Les nostres dades suggereixen un possible paper per a la regulació dependent de mTOR complex1, tal com va informar anteriorment McNamara et al. , 23, així com els substrats Akt FOXO1, GSK-3 β , entre d'altres. Tot i que es necessiten estudis addicionals per determinar els mediadors específics aigües avall d'Akt i mTOR, les dades actuals i el nostre informe anterior 11 suggereixen que Akt pot promoure la necrosi en els tipus de cèl·lules neuronals després de lesions agudes del SNC.

Com pot Akt es promoure la mort necrotica? Tot i que l’activació limitada d’Ak és antiapoptòtica, l’activitat Akt sostinguda pot promoure la mort cel·lular mitjançant diversos mecanismes diferents. La forta activació d’Akt augmenta el consum d’oxigen augmentant la glicòlisi i la fosforilació oxidativa, donant lloc a la generació de ROS i estrès oxidatiu. 24, 42 L’activació Akt sostinguda també indueix la fosforilació dels factors de transcripció de la subclasse O (FOXO) de cap de forquilla necessaris per a la regulació de defenses antioxidants com el superòxid de manganèsmutasa, la catalasa i la sestrina-3. 51, 52 Els factors de transcripció FOXO fosforilats s’uneixen a la proteïna 14-3-3 i s’exclouen del nucli, per tant, convertits transcriptivament inactius, 53 i una fosforilació sostinguda promou la seva degradació proteosomal. 54, 55 La nostra constatació que la inhibició de Akt / mTOR va inhibir fortament la fosforilació de FOXO1, la generació reduïda de ROS i la mort inhibida en cèl·lules HT22 estimulades a la necroptosi suggereix que l’activació de Akt / mTOR pot augmentar l’estrès oxidatiu letal després de lesions agudes a les cèl·lules neuronals. Finalment, l’activació Akt sostinguda pot activar de manera constitutiva la cinasa 2 depenent de la ciclina que condueix al seu segrest citoplasmàtic, aturada del cicle cel·lular a G2-M i inducció de la mort cel·lular. 56, 57 Els futurs estudis destinats a identificar els mecanismes exactes de la necroptosi induïda per Akt / mTOR estan garantits, ja que Akt i mTOR poden no ser objectius terapèutics òptims per a la neuroprotecció per les seves funcions proteiques a les cèl·lules.

A continuació, mostrem que Akt i mTOR representen junts ∼ 50% de la mort cel·lular en les condicions utilitzades en els assajos de necroptosi. Els altres mecanismes que corresponen a la resta de morts de cèl·lules necroptòtiques han de ser descoberts. Un inhibidor de JNK va reduir la necroptosi a les cèl·lules HT22 en un 50%; tanmateix, no vam observar un efecte additiu dels inhibidors de Akt / mTOR / JNK i cap efecte de la inhibició de la cinasa extracel·lular o de la inhibició de la proteïna quinasa activada amb mitogen P38 (MAPK), coherent amb la manca similar d'un paper per a aquests MAPK en la necroptosi de tipus de cèl·lules no neuronals. 23, 28 Curiosament, vam informar anteriorment que l’administració intracerebroventricular de necrostatina-1 va reduir la mort de cèl·lules necrotiques a gir dentat i còrtex després de CCI en ratolins. Tanmateix, aquestes regions cerebrals no estaven protegides pels inhibidors d'Akt / mTOR en el nostre estudi posterior, 11 consistents en les troballes de l'estudi actual que la necrostatina-1 està totalment i els inhibidors d'Akt / mTOR només parcialment protectors contra la mort de cèl·lules necrotiques en cèl·lules HT22.

En conclusió, demostrem per primera vegada un paper per a la senyalització d’Akt / mTOR que regula la necroptosi en una línia cel·lular neuronal. Les dades són consistents amb la necessitat de la doble inhibició de Akt i mTOR per reduir la mort traumàtica de les cèl·lules cerebrals in vivo . 11 L’ elucidació de mecanismes addicionals de senyalització de necroptosi aigües avall del conjunt del necrosoma serà important per comprendre com es regula la necroptosi a les cèl·lules neuronals. És probable que aquesta informació produeixi nous objectius terapèutics per reduir la mort cel·lular i millorar els resultats funcionals després d'un ictus, una lesió traumàtica cerebral i altres formes de lesió aguda del SNC.

Glossari

mTOR

diana mecanicista de la rapamicina

TNF

factor de necrosi tumoral

GSK

glicogen sintasa quinasa

S6

Proteïna ribosòmica S6

ROS

espècies reactives a l'oxígen

FLIP

Proteïna inhibidora similar a l'enzim de conversió (FLICE) de tipus interleucina-1-beta

CCI

impacte cortical controlat

BHA

hidroxianisol butilat

Nec-1

7-Cl-O-metil-necrostatina-1

LOX-1

LOXBlock-1

Bai

baicalein

HMGB1

proteïna grup 1-caixa de gran mobilitat

CHX

ciclohexamida

Pi

iodur de propidi

siRNA

àcid ribonucleic inhibidor petit

EDTA

àcid etilendiaminetetraacètic

IP

immunoprecipitació

JNK

Jun-N-kinasa

FOXO

Capsa de forquilla classe O

MAPK

proteïna quinasa activada amb mitogen