Expressió d’al·lel i metilació gènica en el control del nivell de mrna de cyp1a2 en els fetges humans | la revista farmacogenòmica

Expressió d’al·lel i metilació gènica en el control del nivell de mrna de cyp1a2 en els fetges humans | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

La base per a una variació interindividual en l'expressió gènica CYP1A2 no s'entén del tot i els polimorfismes genètics coneguts del gen no ofereixen cap explicació. Hem investigat si l'expressió gènica CYP1A2 està regulada per metilació d'ADN i mostra l'expressió al·lel-específica (ASE) mitjançant 65 fetges humanes. El 40% dels fetges no van mostrar ASE associats als nivells d'ARNm CYP1A2 . L’extensió de la metilació d’ADN d’una illa CpG que inclou 17 llocs CpG, propers al lloc d’inici de la traducció, inversament correlacionada amb els nivells d’ARNm hepàtic de CYP1A2 ( P = 0, 018). La metilació de dos llocs CpG centrals separats es va associar fortament amb els nivells d'ARNm CYP1A2 ( P = 0.005) i el fenotip ASE ( P = 0.01), respectivament. L’expressió CYP1A2 a les cèl·lules de l’hepatoma B16A2 va ser fortament induïda pel tractament amb 5-aza-2’-desoxicitidina. En conclusió, l’expressió gènica CYP1A2 està influenciada per l’extensió de la metilació de l’ADN i mostra ASE, mecanismes que contribueixen a les grans diferències interindividuals en l’expressió gènica CYP1A2 .

Introducció

L’enzim del citocrom P450 1A2 (CYP1A2) s’expressa principalment al fetge i representa aproximadament el 13% del contingut total de P450 al fetge. 1 Té una funció important en el metabolisme de la cafeïna i també de diversos fàrmacs clínicament importants com la clozapina, 2 fenacetin, 3 verapmil, 4 substrats endògens com la melatonina, 5 estradiol, 6 i substàncies procarcinogèniques incloses amines heterocícliques, arilamines i aflatoxina B1. 7, 8

El gen CYP1A2 mostra grans diferències interindividuals i interètniques tant en el nivell d’expressió de l’ARNm com en l’activitat enzimàtica. 8, 9, 10 Les causes subjacents a aquesta variació no es coneixen i poden ser causades per factors genètics, epigenètics o ambientals. De fet, CYP1A2 és genèticament polimòrfic amb més de 16 al·lels variants descrits fins ara (//www.cypalleles.ki.se/cyp1a2.htm). No obstant això, la baixa freqüència dels al·lels variant funcionalment diferents en les poblacions i els resultats de diversos estudis d'associació genotip-fenotip indiquen una funció limitada del polimorfisme genètic CYP1A2 com a causa de variació interindividual en l'expressió o activitat del gen CYP1A2 . 11, 12 En línia d'aquesta investigació, hem trobat un al·lel CYP1A2 * 1K causant una menor expressió del gen, però està present en etíops 13 i gairebé absent en blancs i asiàtics. 11, 12 Les diferències interètniques en l’activitat de CYP1A2 són importants i controlant els efectes del tabaquisme, l’ús de anticonceptius orals i el genotip, recentment, vam informar de la presència de diferències significatives en l’activitat enzimàtica entre poblacions sueques, coreanes i sèrbies, diferències que no expliquen les polimorfismes (SNPs) / haplotips d'un nucleòtid únic CYP1A2 coneguts. 12, 14

A banda dels polimorfismes genètics, les variacions fenotípiques es regeixen per altres factors que afecten l'expressió gènica, com ara el gen cis i components transcripcionals transactius, el splicing alternatiu, l'estabilitat de l'ARN, l'expressió dels ARN reguladors i l'epigenètica com les modificacions d'histones i la metilació de l'ADN. 15 gens impresos (expressió gènica específica de l'origen en cèl·lules somàtiques) i gens subjectes a la inactivació del cromosoma X mostren expressió monoal·lèlica. L’expressió gènica diferencial entre els dos al·lels o expressió específica d’al·lel (ASE) en gens no impresos també és freqüent en el genoma humà. 16, 17, 18, 19 El grau de diferències en l’expressió entre els dos al·lels varia d’individu a individu provocant una variabilitat fenotípica. L’ASE reflecteix la presència de factors putatius cis específics d’al·lel d’origen genètic o epigenètic. En conseqüència, ASE es pot utilitzar com a prometedor mètode de fenotipat quantitatiu per identificar els factors de cis , així com la variació epigenètica que influeix en l'expressió gènica, ja que els individus heterozigots per al polimorfisme de cis mostren un nivell diferent d'expressió d'ARNm provinent d'un al·lel en comparació amb l'altre. 16, 17, 20

Els dos principals mecanismes per a les modificacions epigenètiques són la metilació de l'ADN i la desacetilació d'histones, i les variacions interindividuals en el grau d'aquests mecanismes poden constituir una base per a diferències interindividuals en l'expressió gènica. Les modificacions epigenètiques i ASE en gens relacionats amb farmacogenètiques s'han demostrat que afecten l'expressió i l'activitat. L’ASE dels gens MDR1 , CYP2D6 i CYP2C9 s’ha informat recentment. 21 Hirota et al. 22 es va informar de l'ocurrència d'ASE en l'expressió gènica CYP3A4 que es va correlacionar amb els nivells d'ARNm total de CYP3A4 al fetge, però no es va trobar una associació clara entre la metilació gènica i els nivells d'ARNm total. Nakajima et al. 23 van indicar una funció de la desacetilació de l'histona i la metilació de l'ADN en la inductibilitat específica de les cèl·lules de la família de CYP1 humana. La variació específica del teixit en el grau de metilació gènica del gen CYP2E1 està associada als nivells d'ARNm de CYP2E1 i a l'activitat enzimàtica que s'ha informat anteriorment. 24 A més, Hammons et al. El 25 mostrava una associació entre la variació interindividual en l'expressió hepàtica humana CYP1A2 i el grau de metilació d'un lloc CpG (bp −2759) a la regió de flanqueig 5 del gen CYP1A2 , amb la hipermetil·lació correlacionada amb l'expressió de CYP1A2 disminuïda. Tot i això, el lloc de CpG investigat per Hammons et al. no es troba dins d'una illa CYP1A2 CpG i està situat molt lluny del lloc d'inici de la transcripció. De fet, les illes CpG funcionals es produeixen típicament al lloc d’inici de transcripció o a prop del gen 26 provocant una repressió transcripcional per inhibició de la unió del factor de transcripció.

Si bé s'aprecia l'existència d'una àmplia variació interindividual en l'expressió ARNm i l'activitat de l'enzim CYP1A2 constitutives, les causes subjacents encara no són clares. És generalment acceptat que la majoria dels SNP coneguts al gen CYP1A2 i a les regions de flanqueig 5 'no determinen la gran variabilitat interindividual observada en l'expressió de l'ARNm i l'activitat dels enzims hepàtics CYP1A2 . 11 La identificació del mecanisme molecular darrere de la variació en l'activitat de l'enzim CYP1A2 pot tenir implicacions importants en la seguretat / l'eficàcia i la susceptibilitat del càncer. Com que els factors epigenètics i ASE poden conduir a una variabilitat fenotípica en els resultats farmacodinàmics i farmacocinètics de la teràpia farmacològica, hem considerat d'interès investigar la funció de la metilació de l'ADN i l'expressió al·lèlica diferencial en la regulació del gen CYP1A2 com a determinants de la variació interindividual en l'ARNm total CYP1A2. expressió i activitat enzimàtica. Els resultats indiquen la importància de dos llocs CpG de metilació bàsics situats a prop del lloc d’inici de la transcripció per associar-se amb variacions en el nivell de transcripció CYP1A2 total i el fenotip d’expressió al·lèlica diferencial (Figura 1).

Image

Vista esquemàtica de la regió del gen CYP1A2 analitzada en aquest estudi indicant el lloc d’inici de la transcripció a l’exó 1 (−832) i la ubicació de l’illa CpG en relació amb el lloc de codificació d’inici de traducció ATG a l’exó 2.

Imatge a mida completa

Resultats

Detecció d'ASE en C Y P1A2

Es van genotipar un total de 65 mostres de fetge humà per al marcador SNP rs2470890 i, entre elles, 23 heterozigots per aquest SNP. Les regions que abasten el rs2470890 es van amplificar per PCR tant a partir d’ADN genòmic (gDNA) com d’ARNm (després de la conversió a ADNc), seguit d’un anàlisi de miniconqüenciació de cada al·lel. Les proves de PCR per mostres d’ADN-ADN i d’ADNc es van dur a terme utilitzant les mateixes condicions per a tots els fragments i es va verificar la mida d’amplicó mitjançant electroforesi en gel d’agarosa. Les mitjanes de la fracció de senyal (S Allele1 / (S Allele1 + S Allele2 )) de l'ADNc es van comparar amb la fracció de senyal del gDNA respectiu com a referència per determinar la presència d'expressió al·lèlica diferencial. De les 23 mostres de fetge heterozigot, 11 (47, 8%) van mostrar diferències significatives en la seva expressió al·lèlica ( P <0, 05, figura 2). No hi va haver cap correlació en aquestes mostres entre el nivell d’expressió d’ARNm total i la relació d’expressió al·lèlica o el fenotip ASE.

Image

Comparació de fraccions de senyal de fluorescència (S Allele1 / (S Allele1 + S Allele2 )) entre l'ADNc i el respectiu ADN genòmic en fetges humanes heterozigots per al marcador que codifica els polimorfismes d'un nucleòtid únic (SNP) (rs2470890C / T). Les mostres de fetge humà que mostren una expressió al·lèlica deferent de manera significativa desviada d’expressió molar igual o d’expressió específica d’al·lel ( P <0.05) s’indiquen a sobre i a sota amb les línies discontinents arbitràries. El nombre de mostres de fetge humà es descriu en nombre.

Imatge a mida completa

Freqüència de metilació del DNA en fetges humanes i expressió hepàtica de ARNm de CYP1A2

La regió que cobreix l'illa CpG (figura 3) es va amplificar per PCR a partir de gDNA després del tractament amb bisulfit. La freqüència de metilació de l'ADN es va determinar per pirosolució mitjançant sis primers primers de seqüenciació interns que cobreixen regions superposades. Es van obtenir dades completes sobre les freqüències de metilació de l’ADN i la quantificació de l’ARNm a partir de 48 fetges humanes. L'anàlisi del patró de metilació va revelar dos dominis amb diferències específiques a la regió en la distribució i el nivell de metilació de CpG. El primer domini (domini 1) contenia els llocs CpG 5, 6, 7, 13, 17, 18 i 19 i el segon domini (domini 2) constava de llocs CpG 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17 i 21. El lloc 17 de CpG era comú per a tots dos dominis (figura 3).

Image

Seqüència del fragment que inclou les illes CYP1A2 CpG de l'exó 2 (+72 a 494 pb) investigades en el present estudi abans del tractament amb bisulfit de sodi. Cada lloc CpG amb la numeració respectiva en el text superior s'indica amb la lletra Y. Es subratlla el lloc d’unió del receptor d’hidrocarburs d’aril (AhR). L'anàlisi del patró de metilació va revelar dos dominis amb diferències específiques a la regió en la distribució i el nivell de metilació de CpG. El primer domini (domini 1) contenia els llocs CpG 5, 6, 7, 13, 17, 18 i 19 i el segon domini (domini 2) constava de llocs CpG 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17 i 21. El lloc 17 CpG era comú per a tots dos dominis.

Imatge a mida completa

La distribució del patró de freqüència de metilació i el nivell de variació a tota l'illa de CpG, el domini 1, el domini 2 i els llocs CpG 14 i 16 en relació amb l'expressió de l'ARNm hepàtic CYP1A2 es mostra a la taula 1. Hem trobat una correlació negativa significativa entre la freqüència mitjana de metilació mitjana dels 17 llocs CpG i expressió total de mRNA de CYP1A2 ( P = 0.018); així, una menor extensió de metilació associada a un nivell més alt d’expressió d’ARNm CYP1A2 . Les freqüències mitjanes de metilació del domini 2 es van correlacionar significativament amb els nivells totals d'ARNm CYP1A2 ( P = 0, 02), però no hi va haver cap correlació entre els nivells d'ARNm i la metilació del domini 1 ( P = 0, 18). També vam comparar els nivells de mRNA de CYP1A2 amb la freqüència mitjana de metilació de cada lloc CpG dins del domini 2. La major correlació negativa es va trobar per als llocs CpG 14 ( P = 0.006) i 16 ( P = 0.009), situats al centre del domini 2, mentre que no s'ha trobat cap correlació amb els altres llocs CpG.

Taula completa

Associació de freqüència de metilació amb ASE

No hi va haver cap correlació significativa entre la freqüència mitjana general de metilació dels 17 llocs CpG amb el fenotip ASE en les 23 fetges humanes utilitzades en aquest estudi ( P = 0.11). Tenint en compte la freqüència de metilació dels dos dominis per separat, no es va trobar cap correlació amb el domini 1, però es va observar una correlació límit amb la freqüència mitjana de metilació del domini 2 ( P = 0.054). També es van analitzar les associacions entre les freqüències mitjanes de metilació de cada lloc de CpG individual situat al domini 2 amb el fenotip ASE. El resultat va indicar una correlació significativa entre la freqüència mitjana de metilació dels llocs CpG 9 ( r 2 = 0, 21, P = 0, 04) i 11 ( r 2 = 0, 33, P = 0, 006) situats a la regió superior del domini 2 amb el fenotip ASE en aquest una freqüència de metilació inferior va predir una variació més alta en el nivell de transcripció relativa derivat dels dos al·lels. Ni la freqüència de metilació als llocs 9 i 11 de CpG ni el fenotip ASE no es correlacionen amb els nivells de ARNm hepàtic total de CYP1A2 .

Hipometilació del DNA i nivell de mRNA de CYP1A2 a cèl·lules de l’hepatoma B16A2

Per aclarir si la desmetilació d’ADN augmenta l’expressió gènica CYP1A2, es va tractar cèl·lules d’hepatoma B16A2 humans amb diferents concentracions d’un agent hipometil·lant 5-aza-2’-desoxicitidina (AzaC). El nivell d’expressió d’ARNm CYP1A2 , determinat per transcriptasa inversa (RT) –PCR, va augmentar linealment ( r 2 = 0, 82, P <0, 01) amb la quantitat d’AzaC utilitzada, cosa que indica que el gen es silencia per metilació a les cèl·lules (figura 4) .

Image

Expressió de mRNA relatiu de CYP1A2 en cèl·lules de l’hepatoma B16A2 humà tractades amb diverses concentracions de l’agent hipometilant 5-aza-2’-desoxicitidina (AzaC) durant 5 dies. L’ expressió gènica CYP1A2 va augmentar linealment amb la concentració d’AzaC.

Imatge a mida completa

Correlacions entre l'expressió d'ARNm CYP1A2 , contingut en proteïnes i activitat enzimàtica

L’activitat enzimàtica CYP1A2 es va mesurar en els 21 fetges humans mitjançant 3 sondes diferents, cafeïna, fenacetina i 7-etoxiresorufin (EROD). Hi va haver correlacions significatives en la determinació de l'activitat de l'enzim CYP1A2 entre les tres sondes: cafeïna i EROD ( P <0.0001, r 2 = 0.75), cafeïna i fenacetina ( P = 0.0001, r 2 = 0.86) i fenacetina i EROD ( P <0.0001, r 2 = 0, 86). L’activitat enzimàtica amb cafeïna, EROD i fenacetina es va correlacionar significativament amb el nivell d’ARNm mitjà de CYP1A2 ( P = 0.035, P = 0.015 i P = 0.029, respectivament) i el contingut de proteïna ( P <0.0001 per a les tres sondes). No hi va haver correlacions significatives entre el nivell d'ARNm i el contingut de proteïnes ( P = 0, 16, potència estadística = 28, 0%, utilitzant un test a dues cares i α fixat en 0, 05).

Correlacions del genotip CYP1A2 amb el fenotip CYP1A2, ASE i freqüència de metilació de l'ADN

Per investigar l'enllaç del marcador SNP rs2470890 amb altres SNP CYP1A2 coneguts que poden influir en l'expressió de mRNA, hem genotipat els fetges per a les variants conegudes CYP1A2 (−3858 G> A, −2467 delT, −739T> G, −729 C > T i −163 C> A). Les freqüències SNP de −3860G> A, −2467delT, −163C> A i rs2470890 eren 5, 0, 5, 0, 67, 5 i 62, 5%, respectivament. No es va detectar CYP1A2 * 1K (−729C> T i −739T> G). L'anàlisi de l'enllaç mitjançant un programari de genètica de població Arlequin va indicar una vinculació significativa de rs2470890 amb −163C> A que es va produir a una freqüència del 62, 5%, però no amb la resta de SNP. Tot i això, cap dels SNP / haplotips CYP1A2 individuals inclosos l'haplotip que comprèn el marcador SNP rs2470890 i −163C> A no va mostrar cap correlació significativa amb el nivell d'expressió d'ARNm CYP1A2 , contingut proteic, activitat enzimàtica determinada per tres sondes diferents (cafeïna, EROD i fenacetina) ), ASE o variacions en les freqüències de metilació de l'ADN en els fetges humans.

Discussió

Hem investigat la funció de la metilació gènica i de l’expressió al·lèlica diferencial en la regulació del gen CYP1A2 amb l’objectiu d’entendre la base molecular que hi ha darrere de la gran variació observada en l’expressió gènica CYP1A2 al fetge humà. Els resultats van indicar ASE del gen CYP1A2 que és independent de l'expressió ARNm total de CYP1A2 . També vam poder identificar dos llocs de metilació de nucli independents situats a prop del lloc d’inici de la traducció com a determinants de la variació interindividual en els nivells de mRNA de CYP1A2 i el fenotip ASE, respectivament, presentant una visió addicional de la regulació del gen CYP1A2 per provocar l’expressió i l’enzim alterats. activitat en humans.

Hem investigat si el marcador SNP (rs2470890) utilitzat en l’anàlisi de metilació ASE i ADN està en un desequilibri d’enllaç amb altres SNP CYP1A2 coneguts que podrien influir en l’expressió de l’ARNm i l’activitat enzimàtica. De fet, el rs2470890 estava vinculat a −163C> A. Tot i això, cap dels SNP / haplotips individuals inclosos el marcador SNP més −163C> Un haplotip va tenir influències significatives en l'expressió de mARN, contingut en proteïnes, activitat enzimàtica, expressió diferencial dels al·lels o variacions en les freqüències de metilació d'ADN en els fetges humans. Recentment, es va informar que cap dels SNP / haplotips CYP1A2 investigats per l'activitat de l'enzim afectada utilitzant cafeïna com a sonda en poblacions sueces i coreanes. 12 En conseqüència, la seqüenciació del lloc CYP1A1_CYP1A2 dels subjectes CYP1A2 més alts i més baixos del món, que prèviament han estat fenotipats CYP1A2, va revelar que encara no s’ha identificat cap SNP ni haplotip del gen CYP1A2 que pugui utilitzar-se inequívocament per predir el fenotip metabòlic. La manca de CYP1A2 la relació observada genotip-fenotip va ser efectivament la base del present estudi; és a dir, cercar factors addicionals com l’epigenètic que poden influir en variacions interindividuals del nivell d’expressió CYP1A2 en els fetges humans.

El gen CYP1A2 s’expressa específicament al fetge per què es va analitzar l’ASE i la metilació gènica en 65 mostres de fetge humà diferents. Aproximadament la meitat dels fetges investigats pel test ASE mostraven una variació significativa en els nivells de transcripció derivats dels dos al·lels. Alguns gens que presenten ASE estan presents en cromosomes que contenen altres gens impresos, 16 que també és justificant per al gen CYP1A2 del cromosoma 15 on hi ha altres gens impresos a la regió. 27, 28, 29

No es va trobar cap correlació significativa entre l'ASE i l'expressió genètica CYP1A2 total a nivell d'ARNm. L'expressió al·lèlica diferencial està influïda principalment per mecanismes de cis que afecten la regulació gènica i / o el processament de l'ARNm, mentre que l'expressió gènica total està influenciada tant per factors cis com de transacció . La mesura del nivell d’expressió de l’ARNm al·lèlic relatiu detecta selectivament factors de cis i / o factors epigenètics. 30, 31 En conseqüència, les diferències observades entre els nivells d’expressió del gen ASE i CYP1A2 indiquen que el gen CYP1A2 també està regulat per mecanismes transactius que difereixen entre individus.

Tal com s’indica a la figura 2, l’al·lel CYP1A2 expressat preferentment variava entre els fetges i aquest ASE bidireccional podria derivar en una heterogeneïtat al·lèlica d’un o més polimorfismes reguladors que actuen en cis presents en codificacions, seqüències reguladores intòniques i / o no codificants, 32 o procedents d’ADN., acetilació d'histona i altres factors epigenètics. 16, 33 Alternativament, el marcador SNP usat a la pantalla ASE podria estar en un desequilibri d’enllaç amb un altre SNP responsable de l’expressió diferencial de les transcripcions al·lèliques, però que no mostra ASE unidireccional a causa d’un desequilibri d’enllaç no complet amb el marcador SNP.

Hem utilitzat la tecnologia pirosegúncia que s’adapta idealment a l’anàlisi i quantificació simultània del grau de metilació de diverses posicions CpG a proximitat. Els resultats indiquen que la freqüència general de metilació d’ADN dels 17 llocs CpG de l’illa CpG situada a prop del lloc d’inici de la traducció a l’exó 2 determinarà molt probablement la variació individual dels nivells d’expressió ARNm total de CYP1A2 en els fetges humans.

Estudis anteriors van indicar que un grup d'illes CpG promotores de bona fe no relacionades amb X estan densament metilades en teixits somàtics normals i que la metilació d'ADN té una funció important en silenciar els gens específics de les cèl·lules germinals en cèl·lules somàtiques. Així doncs, es va avaluar l'efecte de la metilació de l'ADN sobre l'expressió del gen CYP1A2 i es va investigar si la desmetilació alleuja la pressió silenciadora per augmentar l'expressió gènica en les línies cel·lulars B16A2 humanes. Les cèl·lules de l'hepatoma B1A2 es van tractar amb concentracions creixents d'un agent hipometilant AzaC i la quantificació relativa del mRNA CYP1A2 per RT-PCR va revelar un augment lineal en l'expressió del gen CYP1A2 amb una concentració creixent de AzaC, que il·lustra que la metilació del DNA està implicada en la repressió de CYP1A2 (Figura 4).

La comparació de la freqüència mitjana de metilació de cada lloc de CpG dins del domini 2, on la metilació es va relacionar principalment amb els nivells de mRNA de CYP1A2 , va indicar una correlació significativa amb els llocs CpG 14 i 16 (situats al centre del domini 2), mentre que no es va trobar cap associació amb altres llocs CpG. Això pot indicar que els llocs CpG 14 i 16, com a llocs reguladors de metilació bàsics, són importants en la determinació de variacions en l’expressió gènica CYP1A2 . Curiosament, el nivell i la variació de la freqüència de metilació entre els fetges humans va ser el més alt per als llocs CpG 14 i 16 en comparació amb els altres llocs CpG de l'illa (Taula 2).

Taula completa

Estudis anteriors van presentar proves de variació del grau de metilació com a causa de l’expressió al·lèlica diferencial. 16, 17, 20, 31 En el present estudi, tot i que el fenotip ASE no es va correlacionar significativament amb la freqüència general de metilació de l’illa CpG, la comparació específica de la regió de les freqüències de metilació va indicar una correlació significativa entre la freqüència de metilació dels llocs 9 i 11 de CpG. (situat a la regió amunt del domini 2) amb el fenotip ASE. Així, una freqüència de metilació més baixa indicava un fenotip ASE més elevat. Això indica que, en absència d'una pressió silenciadora de la metilació gènica, el factor de cis responsable del fenotip ASE exerceix el seu efecte. És interessant assenyalar que similar al fenotip ASE, la freqüència de metilació dels llocs CpG 9 i 11 tampoc no estava associada amb el nivell total d’expressió de mRNA de CYP1A2 . Això indica que tot i que la freqüència de metilació als llocs 9 i 11 de CpG pot contribuir a la presència d'expressió al·lèlica diferencial, els nivells d'expressió d'ARNm CYP1A2 probablement estan influenciats en gran mesura pel grau de metilació de tota l'illa de CpG, principalment als llocs CpG 14 i 16. Hammons et al. 25 van informar de la funció d'un estat de metilació de l'ADN específic del lloc del lloc CCGG (bp-2759) situat al costat d'un lloc AP-1 per ser responsable de la variació interindividual de CYP1A2 . No obstant això, aquest lloc, no cap altre lloc de 5 kb aigües amunt del gen, podria ser identificat per nosaltres com a lloc de CpG en una illa de CpG. En lloc d'això, hem trobat una illa CpG que conté 17 llocs CpG, situada a prop del lloc d'inici de la traducció, i hem considerat que és important investigar més.

El silenciament d’un dels cromosomes X en les dones i la impressió al·lèlica o l’expressió monoal·lèlica, segons l’origen parental, està molt regulat mitjançant una reprogramació de metilacions gèniques que es pot produir en cèl·lules germinals i durant la gametogènesi. 35, 36 Tanmateix, la funció de la metilació de CpG en els gens que no expressen i que no expressen les expressions monoalèliques encara no està explorada del tot. Els dos llocs de metilació del nucli identificats es troben en un mateix domini proper entre ells, però aparentment tenen dues funcions diferents: la regió superior determina el fenotip ASE i la regió mitjana determina l'expressió d'ARNm total CYP1A2 . Buscant llocs d’unió de transcripció a l’illa CpG, vam descobrir que els dos llocs de metilació bàsics estan envoltats de llocs d’unió de transcripció per a factors de transcripció com ara BRAC1, TFAP3A, SP1, SPI1, GATA-2 i GATA-3. Tenint en compte que CYP1A2 és un P450 hepàtic, vam trobar que la variació en la freqüència de metilació dels llocs d’unió i, per tant, bloquejar l’accés als factors de transcripció pot ser important en el control del nivell d’expressió gènica CYP1A2 hepàtica. També és interessant assenyalar que el lloc d’unió del receptor d’hidrocarburs d’aril (AhR) està situat a prop de l’illa CpG (figura 3) i, per tant, la variació del grau de metilació gènica també podria donar lloc a una inductibilitat diferencial de CYP1A2.

Els patrons de metilació poden ser específics de tipus cel·lular i / o teixit i canvien lentament amb l’edat i en resposta a efectes ambientals com la dieta. 37, 38 La variació en la freqüència de metilació deguda a factors relacionats amb la dieta o ambiental pot ser important per determinar la variació ètnica àmplia observada en l'activitat de l'enzim CYP1A2 entre els blancs i els asiàtics. 12 A més, estudis anteriors de pedigrí van demostrar que l'herència de ASE es transmetia per herència mendeliana. 17, 39 Els patrons de metilació gènica en cèl·lules diferenciades somàtiques també són generalment estables i heretables. 35 S'ha informat anteriorment de l'herència d'ASE en l'expressió gènica CYP3A4 . 22 D’acord amb l’ASE observada en l’expressió del gen CYP1A2 es pot heretar per provocar una variació en l’activitat de l’enzim similar als polimorfismes genètics. Diversos estudis van informar de la falta de relació genotip-fenotip en CYP1A2. El nostre estudi explica el mecanisme molecular que hi ha darrere de les variacions en l’expressió gènica CYP1A2 i la concordança genotip-fenotip fins a cert punt. La magnitud d'ASE, així com la freqüència de metilació, varia entre els individus i possiblement afecta l'activitat de l'enzim i la resposta al tractament.

En conclusió, el nostre estudi demostra que l'expressió gènica CYP1A2 mostra ASE i està influenciada per la metilació de l'ADN. Vam demostrar que només uns quants llocs CpG i regions força petites de l’illa CpG proporcionen informació rellevant per a l’anàlisi de metilació diferencial. El present estudi ha donat una nova visió de la regulació de CYP1A2 . Tot i això, calen investigacions posteriors per explorar els mecanismes exactes implicats en l'ASE, els mecanismes transreguladors i la metilació de l'ADN per explicar la variabilitat interindividual i ètnica en l'expressió CYP1A2 . El descobriment d'AS, unit a l'elucidació dels mecanismes subjacents, pot proporcionar una visió integral de la regulació transcripcional, així com dels marcadors funcionals per a gens metabolitzadors de medicaments (per exemple, CYP1A2 i CYP3A4 ), on els polimorfismes genètics tenen una funció menor en explicar la variabilitat ètnica i àmplia observada. en l’activitat enzimàtica.

Materials i mètodes

Mostres d’estudi

Un total de 65 fetges humanes sanes no relacionades d'origen escandinau pertanyents a un banc bancari de fetge donant, establert a la Divisió de Farmacologia Clínica de l'Hospital Universitari Karolinska Huddinge, Suècia, van ser utilitzades per a aquest estudi després de l'aprovació del comitè d'ètica del Karolinska Institutet. El teixit per a la preparació de microsomes només estava disponible en 21 fetges humanes.

Preparació d'ADN genòmic i d'ADNc

L’ADN genòmic i l’ARN total es van aïllar de les mostres de fetge mitjançant QIAamp DNA Mini Kit i RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanya), respectivament. L’ARN total es va tractar amb DNasa lliure de RNasa (Promega, Madison, WI, EUA) per eliminar qualsevol contaminació del gDNA durant la preparació total de l’ARN. l'ADNc es va sintetitzar utilitzant el Kit de síntesi de cDNA First Strand (Fermentas, Burlington, Ontario, Canadà), seguint les instruccions del fabricant mitjançant 2 μg d'ARN total. Es va preparar ADNc de cada fetge mitjançant un primer hexàmer i oligo (dT) 18 .

Detecció d'expressions al·lèliques diferencials mitjançant la miniseqüenciació d'ordres d'etiquetes

Disseny d'assaig

Diversos SNP del gen CYP1A2 es van considerar com a marcadors candidats al test ASE. Els criteris de selecció d’un marcador SNP van ser una alta freqüència d’al·lel menor, sense cap efecte significatiu sobre el nivell d’expressió enzimàtica o l’activitat enzimàtica i la ubicació a la regió de codificació transcrita de manera que es pot utilitzar el mateix conjunt d’amorques per a l’amplificació de PCR tant en el gDNA com en l’ARNm. Un SNP silenciós no funcional (5347T> C, rs2470890) situat a l'exó 7 del gen CYP1A2 va ser seleccionat com a marcador. Anteriorment, vam identificar aquest SNP (rs2470890) a etíops i vam informar de falta d'influència sobre l'activitat de l'enzim CYP1A2 utilitzant cafeïna com a sonda. 13 Per examinar la vinculació del marcador SNP amb altres SNP CYP1A2 , hem genotipat fetges per als SNPs de variant CYP1A2 coneguts (−3858G> A, −2467delT, −739T> G, −729C> T, −163C> A) tal com es descriu anteriorment. 12

Els primers i els decomissores de seqüenciatura de PCR amb seqüències de tag 5 ′ que cobreixen el marcador SNP del marcador es van dissenyar mitjançant el programari Autoprimer (//www.autoprimer.com; Beckman Coulter). Els cebadors es van obtenir a partir d'integrades d'ADN Technologies (Coralville, IA, EUA).

Seqüenciació i hibridació per PCR

L’ADN genòmic i l’ADNc es van utilitzar per genotipar el marcador SNP mitjançant l’ADN de 4 ng mitjançant l’anàlisi de miniconqüenciació tal com s’ha descrit anteriorment. 30, 40 En resum, un fragment de PCR de 164-pp que abastava el lloc SNP del marcador es va amplificar per PCR mitjançant un primer imprimant (5′-ATGAAGCACGCCCGCTGT-3 ′) i un primer inicial (5′-TTGGCTAAAGCTGCTATTTTTTA-3 ′) tant de gDNA com de dos gDNA i ADNc. Per eliminar els dNTP i els cebadors restants, vam tractar els productes PCR (7, 2 μl) amb 1 U µl −1 gambereta fosfatasa alcalina i 0, 48 U μl −1 exonucleasa I (USB Corporation, Cleveland, OH, EUA). Els oligonucleòtids complementaris a la seqüència de marques unides a l'extrem 5′ de la ceba de miniseqüenciació (5′-AATACGCTGAATAGAGCCCTAGGCGCGGCTGCGCTTCTCCATCAA-3 ') es van immobilitzar a les diapositives activades CodeLink (GE Healthcare, Uppsala, Suècia) en punts duplicats de cada subarraja. Miniconqüenciació cíclica dels productes PCR tant de gDNA com d'ADNc, la hibridació dels productes de reacció de miniseqüenciació als oligonucleòtids capturats (cTags) a les diapositives i el rentat de les diapositives es va realitzar tal com es descriu anteriorment. 41 Cada mostra (ADN i l’ADNc corresponent) es va executar per triplicat a la mateixa diapositiva.

Detecció de senyal i anàlisi de dades

Els senyals de fluorescència dels microarrays es van mesurar mitjançant un instrument ScanArray Express (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA, EUA). La potència làser es va mantenir constant al 80% i es va ajustar el guany del tub fotomultiplicador per obtenir nivells de senyal iguals dels punts de control de reacció en els quatre canals làser. Els làsers d'excitació van ser Blue Argon 488 nm per a R110, verd HeNe 543, 8 nm per a Tamra, groc HeNe 594 nm per a Texas Red i vermell HeNe 632, 8 nm per a Cy5. La intensitat del senyal es va determinar amb el programari d'anàlisi QuantArray 3.1 (PerkinElmer Life Sciences). El genotip SNP es va assignar mitjançant la versió del programari SNPSnapper 3.0.0.191 (//www.bioinfo.helsinki.fi/SNPsnapper/) basada en trames de dispersió amb el logaritme de la suma dels dos senyals de fluorescència (S Allele1 + S Allele2 ) a la eix vertical i fraccions del senyal de fluorescència (S Allele1 / (S Allele1 + S Allele2 )) a l’eix horitzontal. L'ASE per a cada individu heterozigot es va determinar calculant el senyal de fluorescència entre els dos al·lels (S Allele1 / (S Allele1 + S Allele2 )) tant en ADNc com en el gDNA respectiu com a referència per a cada mostra de fetge heterozigota. La intensitat del senyal mitjana dels punts duplicats correguts per triplicats en una subarraya es va considerar com una prova de rèplica.

Determinació de la freqüència de metilació de l'ADN mitjançant pirosecució

Disseny d'assaig

La recerca de les illes CpG del gen CYP1A2 que abastava fins a la regió ascendent de 5.000 pb a partir del codó inicial de la traducció es va dur a terme mitjançant el programari Methyl Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Hem trobat una illa CpG a prop del lloc d’inici de transcripció a l’exó 2. Disset dels llocs CpG situats al centre de l’illa van ser seleccionats per a l’anàlisi de la freqüència de metilació de l’ADN (Figura 1).

Tractament amb bisulfit i PCR

El gDNA aïllat de mostres de fetge humà va ser tractat amb bisulfit de sodi mitjançant el EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, EUA). PCR primers were designed to amplify the CpG island containing 17 CpG sites located in exon 2. A 309-bp region spanning the island was amplified by PCR from bisulfate-treated gDNA samples. The PCR mix contained 2.5 μl 10 × PCR buffer, 0.5 μl 25 m M MgCl 2 solution, 0.125 μl Smart-Taq Hot Thermostable DNA Polymerase (Naxo Ltd., Tartu, Estonia), 0.5 μl 10 m M of forward (5′-TTTGGTATTGTTAAGGATGAGTTAG-3′) and biotinylated reverse (5′-ACATACTCCTCCAAATAACAAAAA-3′) primers (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), and 0.5 μl 10 m M dNTP (GE Healthcare), 1 μl bisulfite-treated DNA and sterile water in a final volume of 25 μl. The PCR conditions were initial activation of the Smart-Taq Hot enzyme at 95 °C for 10 min followed by 50 cycles of 95 °C for 30 s, 53 °C for 1 min, 72 °C for 1 min and a final extension at 72 °C for 7 min on a GeneAmp PCR system 2700 (Applied Biosystems). The PCR products were analyzed on a 1.5% agarose gel for quality assurance and verification before pyrosequencing.

Pyrosequencing

The amplified PCR product was analyzed by pyrosequencing using six internal sequencing primers designed to cover all the 17 CpG sites. Sequencing primers, CpG sites and pyrosequencing dispensation orders including internal control for bisulfite treatment are listed in Table 3. Pyrosequencing was performed on Pyro Q-CpG software (Biotage, Uppsala, Sweden) using the PyroGold SQA Reagent Kit (Biotage) as described previously. 45 The software reports a peak height directly proportional to the number of molecules incorporated into the growing DNA chain.

Taula completa

AzaC treatment and total RNA isolation from cultured cells

The human hepatoma cell lines B16A2 were cultured based on ATCC protocols. All cell culture media and supplements were obtained from Invitrogen (Rockville, MD, USA). Cells were treated with AzaC (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) at varying concentrations (0, 100, 500 and 1000 μ M ) for 5 days. B16A2 cells were allowed to reach total confluence and maintained at such level for 1 week before AzaC treatment was commenced. Subsequent to AzaC treatments, total RNA was isolated using Trizol reagent (Invitrogen) following manufacturer's recommendations. Reverse transcription was carried out from 5 μg total RNA using the SuperScript II (Invitrogen) system in the presence of the ribonuclease inhibitor RNaseOUT (Invitrogen).

PCR quantitativa en temps real

The quantification of the total CYP1A2 mRNA levels from human livers and B16A2 cell lines treated with varying concentrations of AzaC was performed by real-time PCR using 7500 Fast Real-Time PCR system. The quantification mixture contained 7.5 μl of TaqMan 2 × PCR Master Mix, 0.5 μl of cDNA, 0.75 μl of 20 × mix of predesigned TaqMan Gene Expressions Assay contained primers for CYP1A2 mRNA spanning sequence boundary between exons 6 and 7 and probe in a final 15 μl volume of reaction. Each sample was ran in triplicates and human 18S rRNA 20 × was used as endogenous control. The real-time PCR instrument, TaqMan master mix, primers and probe were purchased from Applied Biosystems.

Determination of CYP1A2 enzyme activity in human liver microsomes

Microsomes were prepared from 21 human livers bank as described previously. 46 The pellet containing the microsomal fraction was suspended and homogenized in 50 m M potassium phosphate buffer, pH 7.4, to give a final concentration of 30–50 mg microsomal protein per ml and stored at −80 °C until use. The protein content was determined by Lowry method, 47 and the total cytochrome P450 content was quantified. 48 The CYP1A2 enzyme activity was estimated by the using caffeine, EROD and phenacetin as marker probes (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Assay conditions used for CYP1A2 enzyme activity determination in human liver microsomes using the three different probes are summarized in Table 3. Microsomes were diluted with buffer and preincubated for 3 min at 37 °C before the probe substrate was added. Multiple control incubations were performed with boiled microsomes, without microsomes, without nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) or by adding stop solution before NADPH.

CYP1A2 protein content determination

Determination of CYP1A2 protein content was carried out as described previously. 49 In brief, a total of 5 μg protein was separated by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis using a 10% gel. After transfer, the Hybond-C extra membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) was blocked in Tris-buffered saline containing 0.05% (v/v) Tween 20 and 5% fat-free milk and incubated with 1:2500 dilution of the primary CYP1A1/CYP1A2 polyclonal antibody (Daiichi Pure Chemicals Co. Ltd., Ibaraki, Japan). This was followed by incubation with a 1:2500 diluted goat anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated antibody (Pierce, Rockford, IL, USA). Detection was performed using SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce).

Estadístiques

A two-tailed Student's t -test was used to compare the mean allelic signal (S Allele1 /(S Allele1 +S Allele2 )) between gDNA and cDNA for each heterozygous liver. Analysis of variance was used to analyze association between CYP1A2 genotype, mRNA expression protein content and enzyme activity, using all three marker probes. Haplotype analysis and estimation of expected haplotype frequencies from the raw genotype data were carried out using population genetic software program Arlequin version 2.000. The Spearman's rank correlation test and regression analysis (after converting to log values) were used to analyze association between mean methylation frequency with ASE phenotype and total mRNA level.

Duality of interest

Cap declarat.

Glossari

CYP1A2

cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 2

ASE

allele-specific expression

CpG

cytosine-guanine

SNP

single nucleotide polymorphism

EROD

7-ethoxyresorufin