Un inhibidor del hdac millora l'activitat antitumoral d'una vacuna d'ADN impulsada per un promotor de cmv | teràpia gènica del càncer

Un inhibidor del hdac millora l'activitat antitumoral d'una vacuna d'ADN impulsada per un promotor de cmv | teràpia gènica del càncer

Anonim

Resum

Es considera que el promotor del citomegalovirus (CMV) és un dels promotors més forts per impulsar l’expressió in vivo de gens codificats per vacunes d’ADN. No obstant això, l'eficàcia de les vacunes d'ADN ha estat fins ara decebedora (particularment en humans), i això es podria explicar en part per la condensació de cromatina modificada per l'histona deacetilasa (HDAC). Per tant, hem intentat investigar si augmentar l'expressió d'antígens de vacuna d'ADN amb l'inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 milloraria l'eficàcia de les vacunes d'ADN in vivo . Es va utilitzar un assaig de luciferasa per determinar els efectes de l'OSU-HDAC42 sobre els plasmides d'ADN impulsats per promotors de CMV in vitro i in vivo . Tres inhibidors de HDAC van poder activar l'expressió del promotor de CMV a les cèl·lules NIH3T3 i les cèl·lules canceroses de la bufeta MBT-2. L’expressió de luciferasa es va millorar significativament mitjançant la coadministració de pCMV-luciferasa i OSU-HDAC42 en ratolins. Per explorar si OSU-HDAC42 pot millorar l'activitat antitumoral específica d'una vacuna contra l'ADN neu impulsada pel promotor CMV, es van avaluar els efectes terapèutics i les respostes immunes en un tumor de ratolí que originàriament sobreexpressa HER2 / neu. Els ratolins que rebien OSU-HDAC42 en combinació amb la vacuna de l'ADN neu del promotor del CMV mostraven efectes antitumorals més forts que els ratolins que només es donava la vacuna ADN. A més, es va observar una correlació entre els efectes antitumorals i les respostes específiques d’immunitat cel·lular en els ratolins que van rebre la vacuna del DNA i OSU-HDAC42.

Introducció

Les vacunes d'ADN ofereixen un enfocament nou i potent per a generar vacunes i immunoteràpies contra el càncer específics de l'antigen. L’ADN del plasmidi nu és rendible, termostable, de fàcil construcció i es pot preparar fàcilment a gran escala amb alta puresa. 1, 2 S'han desenvolupat dues vies comunes d'immunització per a l'entrega de vacunes d'ADN per a la immunització genètica: la injecció intramuscular d'agulla d'ADN 3 i el bombardeig de pistola de gen epidèrmica amb partícules d'or recobertes d'ADN. 4 Molts estudis han demostrat que la immunització mediada per pistola gènica és molt més eficient que la injecció intramuscular, ja que genera nivells similars d’anticossos i respostes cel·lulars amb menys ADN. 5

Es considera que el promotor del citomegalovirus (CMV) és un dels promotors més forts per impulsar l’expressió de gens codificats per vacunes d’ADN in vivo . 6 Molts estudis han demostrat l'eficàcia terapèutica de les vacunes d'ADN impulsades per promotors antivirus en models animals preclínics. Per exemple, el nostre estudi anterior va demostrar que l'ADNc ADN impulsat pel promotor CMV que codifica el domini extracel·lular del gen humà HER-2 / neu tenia un efecte terapèutic en els tumors establerts amb expressió de HER-2 / neu. Tanmateix, l’eficàcia terapèutica de les vacunes d’ADN impulsades per promotors antivirus fins ara ha estat decebedora majoritàriament en models animals grans i en assajos clínics humans. 8, 9, 10 Una possible causa d'aquests resultats decebedors pot ser la inactivació del promotor del virus mitjançant la cromatinització per histona deacetilasa (HDAC) del procés de transcripció. Els HDAC són enzims que catalitzen l'eliminació de grups acetil del grup ɛ-amino de residus específics de lisina presents a les cues d'histona. En la desacetilació d'histones, es produeix un embalatge ajustat de l'ADN a causa de la condensació de la cromatina 12, que disminueix la unió dels factors de transcripció als promotors i en última instància provoca un silenciament gènic.

S’han desenvolupat i caracteritzat molts compostos que inhibeixen l’activitat del HDAC. A partir de les seves estructures químiques, els principals inhibidors del HDAC es poden classificar en quatre categories: àcids grassos de cadena curta, pèptids cíclics, derivats de benzamida i àcids hidroxàmics. 13 La disponibilitat d’inhibidors de HDAC compta en gran part per a la identificació i la caracterització dels HDAC i els ràpids avenços en la nostra comprensió sobre com els HDAC reprimeixen la transcripció gènica. 14 Recentment, diversos estudis també han demostrat que els inhibidors del HDAC poden influir en les unitats de transcripció de l'ADN impulsades pel promotor del virus introduïdes a cèl·lules o ratolins de mamífers. Per exemple, el butacrat i la tricostatina A inhibeixen la HDAC, tant la glicosiltransferasa controlada pel promotor, com la β-galactosidasa glicogènes. 15 A més, l'activitat inhibidora de HDAC trichostatin A (TSA) va regular l'activitat de promotor SV40 i CMV en ratolins. 16 L’inhibidor de HDAC FR901228 i TSA van millorar molt l’activitat transcripcional del promotor SV40 de manera dependent de potenciador. Per tant, la regregació mediada per l'inhibidor de HDAC de l'expressió gènica impulsada pel promotor del virus pot ser aplicable en molts camps de recerca.

En aquest estudi, es va plantejar la hipòtesi que l’addició d’un inhibidor de HDAC podria millorar l’expressió de la vacuna de l’ADN neu impulsada pel promotor CMV i millorar així els seus efectes terapèutics en un model de tumor animal. Per avaluar els efectes d'un inhibidor de HDAC en la inducció de respostes immunes antitumorals per vacunació per ADN, es va avaluar la injecció subcutània local de l'inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 en combinació amb la vacunació d'ADN neu contra un tumor de ratolí que sobreexpressa HER-2 / neu. OSU-HDAC42 és un inhibidor del HDAC derivat de fenilbutirats relacionat amb hidroxamat i posseeix una citotoxicitat potent per a cèl·lules de càncer de pròstata i hepatocarcinoma. 18, 19 Els resultats indiquen que OSU-HDAC42 va augmentar l'expressió de la vacuna contra l'ADN neu i va millorar els seus efectes antitumorals, que es van associar amb augment de la infiltració de limfòcits i cèl·lules T citotòxiques específiques.

Materials i mètodes

Cultiu de teixits i compostos químics

Els fibroblasts NIH 3T3 (American Type Culture Collection, Manassas, VA) i les cèl·lules MBT-2 (una línia cel·lular de carcinoma de cèl·lules de transició del ratolí) es van cultivar en el medi de Eagle modificat de Dulbecco complementat amb un 10% sèrum fetge i 1% penicil·lina-estreptomicina. El butirat de sodi i la TSA es van comprar a la Sigma Chemical Company (St Louis, MO). OSU-HDAC42 (NSC 736012) és un regal del doctor Ching-Shih Chen, i és un nou derivat de fenilbutirats relacionat amb hidroxamat que ha rebut aprovació IND de la FDA, i està previst que entri en assaigs clínics a finals d’aquest any. 18, 19

NIH3T3 i transfecció de cèl·lules MBT-2

Les cèl·lules NIH3T3 i MBT-2 van ser transfectades amb 0, 5 μg de pCMV-luciferasa en presència de Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Quaranta-vuit hores després de la transfecció (24 h després del tractament amb inhibidor de HDAC), les cèl·lules es van recollir per a assaigs de luciferasa.

Test de Luciferasa

Les cèl·lules es van recollir 24 hores després del tractament amb inhibidor de HDAC i es va determinar l’activitat luciferasa del lisat cel·lular mitjançant un kit d’assaig Promega luciferasa (Promega, Madison, WI). Es van comptabilitzar les mostres durant 10 s i es van normalitzar els valors d’activitat de la luciferasa per unitat (unitat de llum relativa per segon) de proteïna total.

Ratolins

Els ratolins BALB / c i C3H / He (entre 6 i 8 setmanes d’edat) van ser obtinguts de la Universitat Nacional Cheng Kung i aprovats pel comitè de benestar animal de la Universitat Cheng Kung de la Universitat.

Administració d’ADN per arma genètica amb ADN no recobert

El dispositiu de protocol i lliurament per a l'administració de plàmids d'ADN per arma genètica s'han descrit anteriorment. 20 Breument, per a la vacunació d’ADN nu, es va afegir 1 μg de plasmidi d’ADN dissolt en 20 µl d’aigua de doble destil·lació autoclavada al forat de càrrega que hi havia a prop de la boquilla i després es va lliurar a la regió abdominal rapada de ratolins a una pressió de descàrrega de 60 psi. utilitzant una pistola gènica de baixa pressió accelerada (GDS-80) (Wealtec Technologies Co. Ltd, Taipei, Taiwan).

Imatge de reporters de bioluminescència

Els ratolins BALB / c es van administrar pCMV-luciferasa i van rebre l’inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 per injecció subcutània intraperitoneal local un dia després de l’administració de plasmidi d’ADN. L’activitat de luciferasa a la pell dels ratolins es va mesurar a 48 i 72 h després del bombardeig amb pCMV-luciferasa. La distribució de l'activitat de la luciferasa en ratolins tractats es va visualitzar mitjançant una unitat d'imatge de mussols nocturns (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanya) que consistia en una càmera de càmera lenta CCD refrigerada pel pelatier muntada en una càmera de mostreig hermètica. Les imatges van ser generades pel programari WinLight (Berthold Technologies). Per a la detecció de la bioluminescència, els ratolins van rebre 100 μl D -luciferina en solució salina a dosis de 100 mg kg −1 (Synchem OHG, Altenburg, Alemanya). Els ratolins es van col·locar a la cambra estreta i es va fer una foto a escala de grisos amb llum enfosquida. L’emissió de fotons es va integrar després en un període de 5 min. Les mesures de luminiscència s’expressen com la integració de la unitat de píxel mitjana de brillantor expressada com a recompte de fotons emesos per segon.

Detecció de cèl·lules dendrítiques positives en proteïnes fluorescents verdes (GFP) en ganglis limfàtics inguinals de ratolins

Aquest protocol es va modificar d'un informe anterior. 20 En resum, els ratolins C3H / He van ser inoculats amb 1 μg de plasmidi d'ADN pCMV-EGFP (pEGFR-N1; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) amb l'inhibidor de HDAC OSU-HDAC42. Els ganglis limfàtics inguinals es van recollir 48 h després de l'administració de plasmidi d'ADN. La població de cèl·lules dendrítiques (DC) es va determinar mitjançant una tinció amb anticossos monoclonals anti-DC-PE (eBiosciencia). La citometria de flux de FACSCalibur (BD Bioscience, Mountain View, CA) es va utilitzar per determinar el percentatge de DC positius de GFP en una població obtinguda per DC.

Eficàcia terapèutica de la vacuna del DNA

Els ratolins C3 / HeN es van injectar per via subcutània al flanc amb cèl·lules 1 × 10 6 MBT-2 en PBS de 0, 5 ml. Al dia 10, 1 μg de vacuna d’ADN nu en 20 µl d’aigua autoclavada de doble destil·lació es va administrar una pistola gènica a la pell tres vegades a intervals setmanals. S'han injectat ratolins de control amb 1 μg de pRc / CMV en 20 μl d'aigua de doble destil·lació autoclavada. Els ratolins van ser tractats amb OSU-HDAC42 un dia després de la vacunació per ADN. La mida del tumor es va determinar mitjançant un calibre a intervals de 3 dies i es va calcular mitjançant la fórmula d’una el·lipse racional: ( m 1 2 × m 2 × 0, 5236), on m 1 representa l’eix curt i m 2 l’eix més llarg. Els ratolins van morir quan el diàmetre mitjà del tumor superava els 2000 mm 3 o el ratolí es trobava en mal estat i esperava que es morís a poc temps. L'anàlisi de la supervivència de Kaplan-Meier va revelar diferències estadísticament significatives.

Mesura de títols d'anticossos antineu

ELISA va determinar el nivell d'anticossos reactius creuats neu mitjançant proves ELISA amb ratolins immunitzats per ELISA amb pous recoberts amb erbB2 humans (R&D, Minneapolis, MN), tal com es descriu en altres llocs. 20 La resposta anticorp d'immunoglobulina sèrica (Ig) G es va dur a terme amb anticossos secundaris conjugats amb rata fosfatasa alcalina antigasa IgG (Calbiochem, Darmstadt, Alemanya). Es va facilitar el desenvolupament del color mitjançant 3, 3 ′, 5, 5′-tetrametilbenzidina (Sigma). Després d'una incubació de 15 minuts, la reacció es va aturar mitjançant l'addició de 100 μl de 2 NH 2 SO 4 i es va determinar la DO 450 nm en un lector de plaques micro ELISA (lector de plaques Dynatech MR5000, Dynatech Lab Inc., Chantilly, VA).

Inducció i activitat de limfòcits T citotòxics in vitro

Aquest protocol es va modificar d'un informe anterior. 20 ratolins vacunats per l'ADN van ser assassinats una setmana després de l'última vacunació per ADN, i es va aïllar la melsa i es van eliminar els RBC de suspensions d'esplenòcits d'una sola cèl·lula utilitzant un tampó de lisi de NH 4 Cl-KCl. Es van estimular un total de 7 × 10 6 esplenòcits rentats amb 20 μg ml 1 proteïna ErbB2 recombinant humana en un medi RPMI 1640 que conté un 10% de FBS, 20 μg ml −1 estreptomicina, 20 U ml −1 penicil·lina i 50 μ M 2 -ME (Life Technologies, Rockville, MD). El dia 5, es van recollir els esplenòcits (cèl·lules efectores) i es van incubar amb cèl·lules MBT-2-luciferasa (cèl·lules diana) a diverses proporcions efector: diana en una placa amb fons de U de 96 pous. Després d'una incubació de 12 hores, es van recollir 100 µl de sobrenadant de cada pou i es va analitzar l'activitat de luciferasa amb luciferina mitjançant un luminòmetre (EG&G, Berthold, MiniLumat LB9506 luminòmetre, Bad Wildbad, Alemanya).

Immunohistoquímica

La infiltració de tumors per cèl·lules T en ratolins vacunats es va analitzar mitjançant immunohistoquímica utilitzant anticossos anti-CD8 (53-6.7, Pharmingen, San Diego, CA) o anticorp anti-CD4 (GK1.5; BD PharMingen, San Diego, CA) com descrit anteriorment. 21 El nombre mitjà de cèl·lules T infiltrants es va quantificar per microscòpia lleugera amb un ocular × 10 i una lent objectiva × 40. Es va comptabilitzar el nombre total de cèl·lules en cinc camps d’alta potència. Es van analitzar tres mostres de tres ratolins.

Resultats

Un inhibidor del HDAC millora l'activitat transcripcional del promotor de CMV in vitro i in vivo

Com que el promotor / potenciador de CMV humà immediat i primerenc és un dels promotors més forts de mamífers, primer vam determinar si els inhibidors de la HDAC millorarien l’activitat del promotor de CMV in vitro . Les cèl·lules MBT-2 i cèl·lules NIH3T3 van ser co-transfectades amb un plasmidi de luciferasa impulsat per un promotor CMV i tres inhibidors de HDAC diferents, TSA, OSU-HDAC42 i butirat de sodi i es va avaluar l'activitat de luciferasa. L’activitat del promotor de CMV es va veure fortament millorada a les cèl·lules MBT-2 (Figura 1a) i NIH3T3 (Figura 1b) per cadascun d’aquests tres inhibidors diferents del HDAC de forma dependent de la dosi. Per tant, hem investigat més si un inhibidor del HDAC augmentaria l'expressió de proteïnes d'un plasmidi d'ADN sota control del promotor de CMV in vivo . La luciferasa es va utilitzar com a gen reporter per supervisar l'expressió del plasmidi vacunat per l'ADN. L’inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 es va injectar per via subcutània al lloc de la vacunació per l’ADN un dia després de l’administració d’ADN CMV-luciferasa i es va registrar l’activitat de la luciferasa amb imatges in vivo a les 48 i 72 h després de l’administració d’ADN. Els ratolins que van rebre tant OSN-HDAC42 com ADN plasmídic CMV-luciferasa van mostrar una activitat luciferasa més forta que els ratolins que van rebre només ADN plasmídic (Figura 2a). La quantitat de l'expressió luciferasa es mostra a la figura 2b. La força de la resposta immune induïda per una vacuna per l'ADN sol correspondre amb el nombre de DC migrats als ganglis inguinals. Un major percentatge de cèl·lules DC positives de GFP van estar presents en els ganglis limfàtics procedents de ratolins injectats amb pCMV-EGFP i OSU-HDAC42 (Figura 3a). A la figura 3b es representa una representació gràfica del nombre de cèl·lules DC positives de GFP. A més, la diferència entre ratolins donats 10 μg davant 100 μg OSU-HDAC42 en combinació amb el plasmidi d'ADN CMV-EGFP també era estadísticament significativa ( P <0.05).

Image

Activació del promotor CMV per tres inhibidors de HDAC diferents in vitro . ( a ) Cèl·lules MBT-2 o ( b ) Cèl·lules NIH3T3 es van transfectar amb ADN plasmidi que contenia un plasmidi reporter impulsat per la promotora de la luciferasa CMV i es van complementar amb dosis creixents de tres inhibidors de HDAC diferents: TSA, OSU-HDAC42 o butirat de sodi. Es va determinar l’activitat de luciferasa. El carril 1 mostra la transfecció de plàmids d'ADN bàsic (control) de pGL3. Els experiments es van realitzar per triplicat i es van repetir dues vegades amb resultats similars.

Imatge a mida completa

Image

L’inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 va millorar l’expressió de gens controlats pel promotor CMV en ratolins. ( a ) Expressió de luciferasa a la pell. Els ratolins van ser inoculats amb 1 μg d'ADN pCMV-luciferasa sols o amb dosis diferents de OSU-HDAC42. Imatges in vivo que mostren activitat de luciferasa a les 48 i 72 h després de la inoculació (preses amb una unitat d'imatge de Night Owl). ( b ) Histograma que mostra la quantificació de l'activitat de la luciferasa. El símbol * indica una diferència estadísticament significativa quan es compara amb el grup d’ADN CMV-luciferasa nua d’1 μg ( P <0.05). Les dades provenen d’un experiment representatiu de dos experiments independents.

Imatge a mida completa

Image

L’inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 va millorar l’allotjament de cèl·lules dendrítiques (DC) als ganglis limfàtics mitjançant vacunació d’ADN. ( a ) Els ratolins van rebre 1 μg d'ADN pCMV-EGFP i OSU-HDAC42, 1 μg de pCMV-EGFP sols, o 1 μg de plasmidi d'ADN pRc / CMV. Els ganglis limfàtics inguinals es van eliminar 48 hores més tard, i es va mesurar la proporció de GFP positiu amb el DC total mitjançant la citometria de flux. ( b ) Histograma que mostra la quantificació de la relació de la PFP positiva al CC continu. El símbol * indica una diferència estadísticament significativa quan es compara amb els ratolins que es van administrar 1 μg de plasmidi pCMV-EGFP només amb μg ( P <0.05). Les dades presentades en aquesta figura provenen d’un experiment representatiu de dos que es van realitzar.

Imatge a mida completa

Eficàcia terapèutica de la vacuna d’ADN HER-2 / neu nua amb o sense un inhibidor del HDAC en tumors establerts en ratolins sindinèics

OSU-HDAC42 és un fenilbutirat relacionat amb hidroxamat relacionat amb un IC 50 nanomolar baix per a la inhibició del HDAC. A més, s’ha provat en un model d’animal de càncer de pròstata i va mostrar una activitat antitumoral prometedora. 18 Per tant, vam provar encara més els efectes de l’OSU-HDAC42 sobre l’efecte terapèutic de la vacunació d’ADN HER-2 / neu contra cèl·lules tumorals de la bufeta MBT-2 en ratolins C3H / HeN. Els ratolins que van rebre 100 μg OSU-HDAC42 en combinació amb una vacuna d’ADN nua HER-2 / neu humana presentaven un retard de creixement de tumors MBT-2 (Figura 4a) i tenien temps de supervivència allargats respecte als ratolins donats només la vacuna ADN (Figura 4b ). A més, els ratolins que van rebre 100 μg OSU-HDAC42 i el vacun ADN van tenir vides de vida significativament més llargues que els ratolins que van rebre 10 μg OSU-HDAC42 i el vacun ADN ( P <0.05).

Image

L’inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 va millorar l’eficàcia antitumoral d’una vacuna d’ADN HER-2 / neu impulsada pel promotor CMV. ( a ) El volum del tumor es va mesurar en els moments indicats. El volum mitjà de tumor representa la mitjana dels tumors de cada grup fins que els animals van morir a causa de l'excés de càrrega del tumor. ( b ) Durada de vida dels ratolins C3H / HeN després del repte subcutani amb cèl·lules MBT-2. Les dades de supervivència es van sotmetre a l'anàlisi de Kaplan-Meier. El nombre de ratolins de cada experiment és entre parèntesis. El símbol ( * ) indica una diferència estadística significativa quan es compara amb el grup de control ( P <0, 01). El símbol ( ** ) indica una diferència estadísticament significativa quan es compara amb els ratolins que se'ls va administrar només la vacuna d'ADN HER-2 / neu ( P <0, 05). Els experiments es van repetir dues vegades amb resultats similars.

Imatge a mida completa

La inhibició del HDAC va millorar la resposta immune cel·lular específica de HER2 induïda per la vacuna del DNA de neu

Per examinar les respostes immunològiques induïdes per la combinació de la vacuna OSU-HDAC42 i la vacuna ADN HER-2 / neu, es va mesurar la total IgG anti-p185 neu en el sèrum de ratolí. Es va detectar IgG anti-p185 neu a tots els ratolins que van rebre vacuna d’ADN HER-2 / neu humana amb o sense OSU-HDAC42. Es va observar un augment menor de l’anticòs p185 neu quan es va tractar a ratolins amb la vacuna d’ADN HER-2 / neu i OSU-HDAC42 (10 o 100 μg), però la diferència no va ser estadísticament significativa en comparació amb l’ADN HER-2 / neu. el tractament de la vacuna només (Figura 5). Com el nostre estudi anterior va indicar que les respostes immunològiques citotòxiques mediades per cèl·lules van tenir un paper important en la lluita contra les cèl·lules MBT-2 en el model animal C3H, 21 vam examinar més si OSU-HDAC42 millorava la immunitat cel·lular específica per HER2. Els tumors formen el grup de ratolins que reben la vacuna contra l’ADN neu més 100 μg OSU-HDAC42 mostraven una major infiltració de limfòcits CD4 + i CD8 + en comparació amb tumors dels altres grups de tractament o del grup control (Taula 1). Per tant, es va suggerir una correlació entre l’efecte antitumoral de la vacuna d’ADN HER-2 / neu exposada a OSU-HDAC42 i les respostes immunes cel·lulars específiques per a ErbB2. A continuació, vam examinar si l’inhibidor de HDAC milloraria les respostes immunes citotòxiques. A la setmana següent de la darrera vacunació, es van observar respostes immunològiques citotòxiques més mediades per cèl·lules a MBT-2 en ratolins amb 100 μg de vacuna OSU-HDAC42 i ADN HER-2 / neu en comparació amb els ratolins només administrat amb vacuna ADN HER-2 / neu. (Figura 6). Per tant, la inhibició del HDAC pot augmentar l'efecte terapèutic de la vacuna de l'ADN neu millorant l'expressió del producte gènic codificat i induint una immunitat cel·lular més forta.

Image

Anticorpi sèric contra l’antigen antic2 recombinant humà Her2 / neu en ratolins. Una setmana després de la darrera vacunació per ADN, ELISA va determinar els títols d'anticossos específics per IgG p185 neu (± se). Les dades representen el títol mitjà de tres ratolins.

Imatge a mida completa

Taula completa

Image

L'inhibidor del HDAC va millorar les respostes immunes a les cellules induïdes per la vacuna de l'ADN. La citotoxicitat mediada per cèl·lules de l'esplegament es va determinar en els ratolins una setmana després de la seva última vacunació per ADN. Les cèl·lules diana van ser cèl·lules MBT-2-luciferasa cultivades in vitro . Les cèl·lules efectores eren limfòcits de ratolins vacunats amb vacuna ADN HER-2 / neu amb o sense OSU-HDAC42. Les cèl·lules efectores van ser incubades amb dilucions en sèrie de cèl·lules diana, i la citotoxicitat es va determinar mitjançant l’alliberament de luciferasa. Cada punt representa la mitjana de pous triplicats.

Imatge a mida completa

Discussió

Per millorar l'expressió d'antígens codificats per la vacuna d'ADN com neu, normalment es millora la transcripció amb el promotor CMV o es fa més eficient la traducció millorant la preferència del codó d'aminoàcids. La vacuna d’ADN HER-2 / neu impulsada per un promotor CMV 8 en combinació amb OSU-HDAC42 va causar retards importants en la progressió del tumor i la vida útil més gran del nostre model de ratolí. L’anàlisi d’infiltració immunològica va revelar que l’inhibidor de HDAC millorava els efectes antitumorals de la vacuna d’ADN HER-2 / neu almenys en part augmentant les respostes immunes cel·lulars antitumorals. Els nostres resultats mostren un mètode nou per millorar l'eficàcia terapèutica de les vacunes d'ADN expressades pel promotor CMV. La combinació de l’inhibidor de HDAC i la vacuna de l’ADN va millorar significativament l’eficàcia terapèutica. Com que els inhibidors del HDAC són fàrmacs clínics anticancerosos nous, clàssicament, les vacunes d'ADN seran una prometedora teràpia contra el càncer.

Diversos estudis han demostrat que un tipus de DC a la pell, les cèl·lules de Langerhans, migren ràpidament cap a drenatge dels ganglis limfàtics després de la irritació de la pell, 22 infecció 23 o pintura amb antigen. 24, 25, 26 A més, el plasmidi d’ADN que conté motius CpG va induir la migració cel·lular de Langerhans en fulls de pell, amb un 50% d’esgotament en dues hores. 27 Va ser sorprenent observar que l’administració d’OSU-HDAC42 un dia després de la del plasmidi de proteïnes fluorescents verdes (EGFP) millorada per CMV va augmentar significativament el nombre de GFP + DC en els ganglis limfàtics distals 48 h després de l’administració de plasmidi. El nombre elevat de DCP + DC pot ser degut a la millora de la presentació creuada de GFP en queratinocits. A mesura que OSU-HDAC42 va augmentar l'expressió de proteïna antigen en queratinòcits transfectats, les proteïnes antigèniques van ser secretades a l'entorn circumdant de cèl·lules que presenten antigen i presentades de forma creuada per cèl·lules professionals que presenten antigen, que al seu torn van migrar cap a drenatge dels ganglis i les cèl·lules T induïdes.

L’administració d’OSU-HDAC42 va millorar l’activitat de luciferasa a causa de la luciferasa impulsada pel promotor CMV només per un curt període (figura 4), ja que la millora de plecs va disminuir significativament 48 hores després de la injecció OSU-HDAC42. Un dels possibles motius d’aquest efecte a curt termini és que OSU-HDAC42 presentava una potència apoptogènica i va provocar una reducció més gran del fòsfor-AKT, Bcl-xl i supervivència. La mort de cèl·lules que expressen ADN plasmídic disminuiria l'activitat de luciferasa observada. La coadministració d’ADN que codifica proteïnes anti-apoptòtiques 28, 29, 30 pot evitar aquesta mort cel·lular i pot augmentar encara més l’efecte de l’OSU-HDAC42 en la inducció de l’expressió gènica controlada pel promotor CMV.

Els resultats anteriors van indicar que la combinació d’un inhibidor de l’HSP90 i una vacuna de l’ADN tenia efectes terapèutics additius per al càncer. Tanmateix, l’efecte potenciador només es va observar a dosis baixes d’inhibidor de l’HSP90 geldanamicina, ja que les dosis altes van inhibir la resposta immune. Va ser interessant assenyalar que l’inhibidor de HDAC millora l’efecte terapèutic de la vacuna de l’ADN de forma dependent de la dosi. Abans s’han investigat els efectes de la inhibició del HDAC en les respostes immunes. Es va demostrar que l'acetilació d'histona millorava les cèl·lules T CD8 de memòria. 32, 33 Per tant, la inhibició del HDAC pot millorar les respostes immunes a CD8 mitjançant la regulació immunològica directa, a més d’augmentar l’expressió d’antigen.

Tot i que hem demostrat que la combinació d’un inhibidor de HDAC i una vacuna d’ADN neu és una teràpia eficaç del càncer, els efectes de la inhibició del HDAC sobre el tumor i les cèl·lules immunes justifiquen un estudi detallat. L’inhibidor de HDAC TSA pot descartar la presentació de MHC de classe I d’auto-antígens. A més, HDAC11 regula l'expressió de la interleucina 10, que és important en la tolerància immune. La inactivació de HDAC 11 en cèl·lules que presenten antigen va provocar un deteriorament de les respostes de cèl·lules T. 35 Per tant, la selecció d’inhibidors HDAC adequats específics per a determinats HDAC serà important per al desenvolupament amb èxit de teràpies de combinació de vacunes ADN efectives.

En resum, l’aplicació del inhibidor de HDAC OSU-HDAC42 durant la immunització va millorar significativament l’eficàcia antitumoral de la vacuna augmentant l’expressió d’antigen i la resposta immune cel·lular específica de l’antigen a cèl·lules tumorals MBT-2. La combinació d’inhibidors de HDAC aplicats localment i vacunes d’ADN nu administrades a la pell és factible i serà d’interès tant en la recerca com en la clínica.

Conflicte d'interessos

Actualment, el doctor Chen realitza un assaig clínic sobre OSU-HDAC42.