El trastorn de l’espectre autista està relacionat amb l’estrès del reticle endoplasmàtic induït per mutacions a la molècula d’adhesió sinàptica de les cèl·lules, cadm1 | mort i malaltia cel·lular

El trastorn de l’espectre autista està relacionat amb l’estrès del reticle endoplasmàtic induït per mutacions a la molècula d’adhesió sinàptica de les cèl·lules, cadm1 | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Trastorns de l’espectre de l’autisme
  • Genètica de malalties
  • Mutació

Resum

El trastorn de l’espectre de l’autisme (TEA) és un trastorn neurodesenvolupat amb una patogènesi molecular desconeguda. Un focus molecular recent ha estat la neuroligina 3 mutada, la neuroligina 3 (R451C), en estudis de guany de funció i pel seu paper en la deterioració induïda de la funció sinàptica, però també mereix una investigació l’estrès del reticle endoplasmàtic (ER) induït per molècules mutades. Abans hem trobat dues mutacions de missense, H246N i Y251S, en la molècula d’adhesió sinàptica de cèl·lules sinàptiques de codificació gènica (CADM1) en pacients amb TEA, incloent-ne la divisió del CADM1 mutat i la seva acumulació intracel·lular. En aquest estudi, vam trobar que la CADM1 mutada mostrava interaccions homòfiles lleugerament reduïdes in vitro però que la majoria de les seves interaccions persisteixen. El CADM1 mutat també va mostrar anormalitats morfològiques, incloses dendrites més curtes i una sinaptogènesi deteriorada en les neurones. CADM1 de tipus salvatge es va localitzar parcialment a la ER de cèl·lules C2C5, mentre que CADM1 mutat es va acumular principalment a la ER malgrat diferents sensibilitats cap a l’àcid 4-fenil butíric amb activitat de chaperona química i rapamicina amb activitat de promoció per a la degradació de la proteïna agregada. L’anàlisi del modelat va suggerir una relació directa entre les mutacions i l’alteració de la conformació. Tant la mutació CADM1 com la neuroligina 3 (R451C) van induir la subregulació de la proteïna homòloga C / EBP (CHOP), un marcador d'estrès ER, cosa que suggereix que, a més del deteriorament del tràfic, aquesta regulació CHOP també podria estar implicada en la patogènesi d'ASD.

Principal

El trastorn de l’espectre de l’autisme (TEA) és el trastorn neurodesenvolupament hereditari més comú, caracteritzat per interaccions socials deteriorades, deficiències de comunicació i conductes restringides i repetitives; Actualment es calcula més de 15 llocs de susceptibilitat, 1, encara que es desconeix el principal mode d'herència. Les proves genètiques en individus amb TEA han identificat mutacions en els gens que codifiquen diverses molècules d’adhesió de les cèl·lules sinàptiques, inclosa la neuroligina (NLGN) 3 i 4, la molècula d’adhesió cel·lular-1 (CADM1) i la proteïna associada a la proteïna com 2. 2, 3, 4 NLGNs són proteïnes d'adhesió de cèl·lules postsinàptiques que interaccionen amb les neurexines de la membrana presinàptica, 5 i són necessàries per a la maduració de la sinapsi. 6 Les interaccions Neurexina-NLGN indueixen la diferenciació d’àcid γ -aminobutíric (GABA) i d’especialitzacions postsinàptiques del glutamat. El mutant relacionat amb ASD, NLGN3 (R451C), es conserva intracel·lularment, la qual cosa limita les seves interaccions sinàptiques pre-post. Alguns dels NLGN4 mutats també no aconsegueixen transportar-se a la superfície cel·lular i es mantenen en el reticle endoplasmàtic (ER). 9

CADM1 (també conegut com RA175 / SynCAM1) és una glicoproteïna de membrana pertanyent a la superfamília d'immunoglobulina (Ig) i està localitzada a banda i banda de la fenda sinàptica. El seu domini extracel·lular mostra l’activitat d’adhesió trans- cèl·lula homofílica independent del calci, 10, 11 i el seu domini intracel·lular s’associa a la serina / treonina quinasa associada a la calmodulina a través de diferents dominis d’unió a PDZ (PDZ: proteïna post-sinàptica de densitat / disc de Drosophila supressor de tumors / proteïna zonula occludens-1). 10 Recentment, hem identificat dues mutacions de missense, C739A (aminoàcid: H246N) i A755C (Y251S), en el gen CADM1 de pacients caucàsics masculins amb TEA i els seus familiars. 3 Ambdues mutacions es troben al tercer domini Ig (Ig3) del CADM1, fonamental per a les interaccions transactives. Aquestes mutacions relacionades amb l’ASD estimulen la divisió de CADM1 i indueixen el tràfic defectuós a la superfície cel·lular. 3 Aquests resultats suggereixen una associació entre sinaptogènesi deteriorada i patogènesi de TEA.

Tot i això, els ratolins deficients de nlgn3 no mostren els símptomes fonamentals observats en pacients amb TEA. En canvi, els ratolins que expressen NLGN3 (R451C), una mutació implicada en la TSA, 12 mostren conductes anàlogues als símptomes bàsics de TEA, inclòs un comportament social deteriorat. 12, 13 Aquesta troballa suggereix que tant una pèrdua de funció com una mutació de guany de funció estan implicades en la patogènesi de la MAS. L’estrès ER és un guany de funció associat a la proteïna mutada.

El sistema de control de qualitat ER reconeix proteïnes desplegades o mal completades i activa vies de senyalització d’estrès anomenades resposta de proteïna desplegada (UPR), a través de sensors d’estrès ER. 14, 15, 16 La quinasa ER de tipus PKR, un dels sensors d’estrès de l’ER, regula específicament la traducció de la proteïna homòloga (COP / Gadd153) de CAAT / potenciador d’unió (CH / EBP) 17 mitjançant la fosforilació de Factor d'iniciació eucariota-2 α (eIF2 α ). És d'interès que CHOP reguli la funció sinàptica mitjançant la regulació del tràfic de membranes 18 i que una cinasa eIF2, GCN2, controli la plasticitat, l'aprenentatge i la memòria sinàptics. 19, 20 Tot i això, se sap molt poc sobre l’associació entre molècules mutades relacionades amb l’ASD i l’estrès ER.

En aquest estudi, demostrem que les mutacions CADM1 relacionades amb ASD, H246N i Y251S i la mutació NLGN3, R451C, causen una resposta UPR amb la regulació de CHOP com a guany de funció.

Resultats

Al principi, es va examinar la interacció trans entre molècules CADM1 de tipus salvatge i mutades in vitro mitjançant l’anàlisi desplegable i western blot (Figura 1a). Es van comparar les interaccions trans entre proteïnes CADM1-His-tag recombinants conjugades de perles que mancaven del domini transmembrana i bé CADM1 de tipus salvatge o proteïnes CADM1 mutades (Figura 1a). En comparació de la interacció entre el tipus salvatge i el tipus salvatge, es van reduir lleugerament les interaccions entre les proteïnes mutants i les de tipus salvatge i es va mantenir la major part de la seva interacció, el 83, 5% de CADM1 (H246N) i el 74, 6% de CADM1 (Y251S). Per avaluar quantitativament aquesta interacció homofílica, es van preparar dominis extracel·lulars recombinants de proteïnes CADM1 de tipus salvatge i mutats i es van examinar les seves interaccions mitjançant espectroscòpia de correlació fluorescent (figura 1b). L’activitat d’interacció homofílica CADM1 mutada era aproximadament un 20 ± 5% més feble que la del CADM1 de tipus salvatge.

Image

Efectes de les mutacions sobre l’activitat d’interacció. ( a ) Interacció entre CADM1 de tipus salvatge (WT) marcat amb His i marcat amb myc o WT o CADM1 mutat. (panell esquerre) Anàlisi d’immunoblot. Myc-WT i CADM1 mutats (H246N- o Y251S-) que interaccionaven amb His-WT CADM1 es van detectar mitjançant anàlisi Western blot mitjançant anticossos anti-myc. En comparació amb el WT, el CADM1 mutat no estava associat amb el seu etiquetat CADM1. (panell dret) Anàlisi densitomètrica. Es van escanejar dades de tres experiments. La intensitat de la banda del CADM1 enquadernat (H246N) i (Y251S) es va normalitzar al CADM1 de tipus salvatge enllaçat i es va presentar com a mitjana ± sd Tots els experiments es van realitzar tres vegades, i es mostren les dades típiques. P <0, 05 en comparació amb el tipus salvatge. ( b ) Anàlisi FCS de la interacció proteïna-proteïna entre proteïnes recombinants de WT CADM1 o les de CADM1 mutada. La interacció va ser detectada per FCS mitjançant molècules marcades amb TAMRA. Es va examinar la interacció entre TAMRA marcada i no marcada WT-CADM1, TAMRA marcada i no marcada CADM1 (H246N) i TAMRA marcada i no marcada CADM1 (Y251S). Tots els experiments es van realitzar tres vegades. Els resultats són la mitjana ± sd de tres determinacions diferents. P <0, 05 en comparació amb el tipus salvatge

Imatge a mida completa

També es va modelar l'estructura química de CADM1 (figura 2a) amb un model en el qual els residus H246 i Y251 es troben a la regió que correspon a la cadena terminal NH2 del domini Ig3 (seqüència d'aminoàcids 160-3324). El model va demostrar que les mutacions H246N i Y251S representaven reduccions de la mida de les cadenes laterals de la cadena terminal NH2. Les mutacions també van induir un canvi conformacional (figura 2b), i en comparació amb H246N, la mutació Y251S va induir un canvi conformacional més gran a la regió.

Image

L'estructura modelada de CADM1 mutada. ( a ) El domini Ig3 de CADM1, creat a partir del domini Ig3 de NCAM com a plantilla i registrat a MODBASE. 39 Les cadenes terminals NH 2 - i COOH del model són de color vermell i groc, respectivament. Els residus que es mostren com a pals estan possiblement implicats en la interacció trans . Els residus mutants, H246 i Y251, es troben en cian. ( b ) Els models superposats del mutant de tipus salvatge (negre), mutant H246N (verd) i mutant Y251S (blau) CADM1 utilitzant MOLMOL. 40 La seqüència d'aminoàcids, PQVHIQMTYP, mostra la regió alterada en el mutant Y251S en comparació amb el tipus salvatge

Imatge a mida completa

Per examinar la relació entre un CADM1 mutat i la patogènesi de l’ASD, vam transfectar seqüències CADM1 de tipus salvatge de tipus CADM1 marcades amb M24 i H246N o Y251S mutades en neurones i vam examinar la seva colocalització amb sinaptofisina, un marcador de sinapsi. Hem exclòs les influències del Cadm1 endògena mitjançant l'ús de neurones aïllades dels embrions de ratolí amb deficiència de Cadm1 el dia embrionari (E) 16. Dendrites de les neurones transfectades mostren principalment tres tipus de morfologia (Figura 3, Taula 1): la majoria de les neurones que expressaven CADM1 de tipus salvatge tenien dendrites llargues (> 100 μ m) amb columnes positives sinaptofisines; les neurones que expressaven CADM1 mutades o bé tenien dendrites curtes (<100 μ m) sense sinaptofisina o tampoc dendrites. Així, les neurones que expressaven CADM1 mutades mostraven dendrites anormals i una sinaptogènesi deteriorada.

Image

Localització de CADM1 de tipus salvatge i mutada a les neurones. Les neurones aïllades dels embrions de ratolins deficients amb cadm1 (E16) van ser transfectades amb CADM1 de tipus salvatge i mutat CADM1 (H246N o Y251S). La seva localització a la sinapsi es va examinar mitjançant la immunoconstrucció amb anti-SynCAM (Cadm1; vermell), anti-sinaptofisina (verd) i Hoechst (blau). Caps de fletxa tancats: CADM1 sense sinaptofisina; fletxes, neurones amb dendrites curtes o sense. Barres d’escala: 25 μ m

Imatge a mida completa

Taula completa

En comparació amb les molècules de tipus salvatge, el CADM1 mutat mostrava més freqüentment una acumulació intracel·lular. Es va examinar la localització intracel·lular de proteïnes de tipus salvatge CADM1 i CADM1 (Y251S) en cèl·lules i neurones C2C5 transfectades (figura 4a). CADM1 de tipus salvatge va ser parcialment colocalitzat amb anti-KDEL, un marcador per ER, mentre que CADM1 (Y251S) es va acumular predominantment a la ER. CADM1 de tipus salvatge també va ser parcialment colocalitzat amb beclina, que es localitza en els diversos orgànuls incloent -Golgi trans , mitocondris i ER, 21 mentre que el CADM1 acumulat (Y251S) es va colocalitzar amb beclina localitzada en ER (figura 4b). La beclina es va localitzar principalment a la ER sota estrès ER (figura 4c), cosa que suggereix que l’acumulació de CADM1 (Y251S) a la ER va provocar l’estrès ER.

Image

La localització de CADM1 de tipus salvatge i mutada. ( a ) Les cèl·lules i les neurones C2C5 van ser transfectades amb CADM1 de tipus salvatge i mutades CADM1 (Y251S) durant 26 hores. Després de la fixació, les cèl·lules es van immunostenir amb anti-SynCAM (Cadm1, verd), anti-KDEL (vermell). ( b ) Les cèl·lules C2C5 transfectades es van immunostenir amb anti-SynCAM (verd), anti-beclina (vermell) i Hoechst (blau). ( c ) Les cèl·lules C2C5 també van ser tractades amb o sense taskigargina (Thap, 1 μ M) durant 24 hores i van ser detectades per anti-KDEL (verd), anti-beclina (vermell) i Hoechst (blau). Barres d’escala: 20 μ m

Imatge a mida completa

Les cèl·lules que expressaven CADM1 (Y251S) mostraven freqüentment una morfologia de cèl·lules rodones anormals (figures 4 i 5a). L’àcid 4-fenil butíric (4-PBA), una potencial chaperona química a l’ER 22 va reduir l’acumulació intracel·lular i la morfologia anormal de les cèl·lules que expressen el CADM1 mutat (Y251S) (figura 5a i b). La beclina localitzada en ER té un paper important en la regulació de l’autofàgia. La Rapamicina, que estimula la degradació de la proteïna acumulada mitjançant l’activació de l’autofagosoma, 23 va inhibir l’acumulació intracel·lular de CADM1 (Y251S) (figura 5a i b).

Image

Els efectes de l’àcid 4-fenil butíric (4-PBA) o la rapamicina sobre l’acumulació intracel·lular de la CADM1 mutada a les cèl·lules C2C5. ( a ) L’acumulació del CADM1 mutat (Y251S) en presència o absència de 4-PBA (7, 5 mM) o de rapamicina (10 μ g / ml). Les cèl·lules C2C5 es van transfectar amb tipus salvatge i CADM1 (Y251S) durant 28 h i després es van fixar amb paraformaldehid i es van inmunitzar amb anti-SynCAM (Cadm1). Barres d’escala: 50 μ m. ( b ) La població cel·lular que mostra una acumulació de CADM1 de tipus salvatge i mutada (Y251S) en presència o absència de 4-PBA o de rapamicina. Es van fer tres experiments. Les barres indiquen sd

Imatge a mida completa

També es va examinar la regulació CHOP induïda per CADM1 mutada aigües avall de l'estrès ER. 24, 25 Tant CADM1 (H246N) com CADM1 (Y251S) van induir la regulació CHOP (figura 6a), i les cèl·lules positives CHOP es van detectar amb més freqüència en cèl·lules que expressaven CADM1 (H246) i (Y251S) (figura 6b). A les cèl·lules que expressen NLGN3 (R451C), també es detecten més freqüentment cèl·lules positives CHOP en comparació amb les cèl·lules que expressen NLGN3 de tipus salvatge (figura 6c). Així, les proteïnes CADM1 mutades (H246) i (Y251S), així com la proteïna NLGN3 (R451C) van estimular molt probablement l'estrès ER, provocant la regulació CHOP.

Image

L’expressió de CHOP a les cèl·lules que expressen el CADM1 mutat i la neuroligina mutada 3. ( a ) La subregulació de CHOP induïda per CADM1 mutada. Les cèl·lules C2C5 es van transfectar amb ADNc de tipus salvatge, CADM1 (H246N), o (Y251S) i es van incubar durant 24 hores. La regulació de CHOP es va analitzar mitjançant anàlisi immunoblot mitjançant anti-CHOP. ( b ) El percentatge de cèl·lules positives CHOP de les cèl·lules que expressen CADM1s de tipus salvatge o mutades. ( c ) El percentatge de cèl·lules positives CHOP a les cèl·lules que expressen neuroligina de tipus salvatge o R451C mutada (NLGN) 3. Barres d’escala: 5 μ m. Les barres indiquen sd

Imatge a mida completa

Discussió

Estrès ER i CADM1 mutat

El CADM1 mutat mostrava l’activitat d’interrelació més in vitro però acumulada a l’ER i presentava un trànsit deteriorat, cosa que suggereix que la funció sinàptica deteriorada causada pel tràfic defectuós del CADM1 mutada podria estar relacionada amb la patogènesi de l’ASD. Tanmateix, els ratolins deficients 26 de cadm1 i els ratolins deficients 6 de nlgn3 no van mostrar tots els símptomes fonamentals de TEA (Takayanagi et al. , Presentats en un altre lloc); a més de la infertilitat, 26 ratolins deficients en cadm1 manifestaven ansietats anormals i deteriorada vocalització d'ultrasons, però no mostraven la interacció social deteriorada i els comportaments estereotipats restringits. En contrast amb el cadm1 dels testicles, la pèrdua de la funció sinàptica de cadm1 en els ratolins deficients cadm1 podria ser compensada parcialment per altres membres de la família Cadm. Aquesta possibilitat suggereix que la pèrdua de funció de CADM1 o NLGN3 és un dels factors, però no un factor suficient només per provocar TEA. El guany de funció de les seves molècules mutades podria ser una altra característica relacionada amb la patogènesi de l’ASD. 27

L’estrès ER és un guany de funció associat a les proteïnes mutades. 25 Les proteïnes desplegades i desplegades es revisen sota la vigilància del sistema de control de qualitat ER a l’ER, seguit d’un processament pel sistema de degradació associat a ER (ERAD), però si la degradació no és suficient, s’acumulen i provoquen estrès ER amb UPR. La tensió ER és el senyal obtingut pel sistema de control de qualitat a les etapes inicials de la UPR. La rapamicina inhibeix l'estrès ER estimulant l'activació de la formació d'autofagosomes, 25, 28, que també contribueix a la degradació de les proteïnes mutades acumulades a la membrana ER en cooperació amb ERAD mediada per ubiquitina / proteasoma. 23, 29 La sensibilitat de CADM1 (Y251S) a la rapamicina suggereix que la ERAD mediada per ubiquitina / proteasoma no és suficient per a la seva degradació. Aquesta inferència també és compatible amb la conformació alterada i la sensibilitat al 4-PBA. A més, el CADM1 mutat així com NLGN3 (R451C) van provocar la regulació CHOP, cosa que suggereix que el CADM1 mutat, així com NLGN3 (R451C), es van mantenir en la ER, provocant l'estrès ER amb la regulació CHOP com la UPR. Aquesta serà una de les qüestions importants en el futur.

Relació entre l’estrès d’ER i la patogènesi de l’ASD

L’estrès d’ER i crònic condueix a la mort de les cèl·lules neuronals i pot estar relacionat amb la patogènesi de malalties neurodegeneratives. Tanmateix, se sap molt poc sobre la relació entre l’estrès ER i la patogènesi de l’ASD. Altres estudis han demostrat que el complex d’esclerosi tuberosa (TSC), un trastorn neurogenètic causat per una mutació en pèrdua de funció tant en els gens TSC-1 com en els TSC-2 , també pot estar relacionat amb l’estrès ER. El TSC produeix freqüentment manifestacions destacades del sistema nerviós central, incloses l’epilepsia, el retard mental i el TEA. 31, 32 cèl·lules amb deficiència de TSC han demostrat l'activació constitutiva de la diana de mamífers de la rapamicina i han demostrat ser molt susceptibles a l'estrès ER. Així, una gran varietat de mutacions que causen estrès ER poden estar relacionades amb la patogènesi de la TEA.

TEA pot ser el resultat d’un tràfic anormal de membrana de les molècules funcionals sinàptiques induïdes per l’estrès ER. CHOP interacciona amb els receptors heterodimèrics GABA B1a R / GABA B2 R i inhibeix la formació de complexos heterodimèrics; es tradueix en una acumulació intracel·lular i una expressió reduïda de la superfície cel·lular dels receptors. 18 En pacients amb TEA, el nivell de GABA B1 R disminueix significativament a l’àrea 9 de Brodmann i l’àrea 40 de Brodmann del cerebro i cerebel, mentre que el nivell GABA B2 R es redueix significativament en el cerebel. Per tant, és possible que nivells relativament baixos d’estrès ER puguin alterar el transport intracel·lular de GABA B R a la superfície cel·lular mitjançant la regulació de CHOP sense afectar la mort cel·lular de les neurones del cervell.

La morfologia anormal de les neurones que expressen molècules mutades pot ser deguda a l’estrès ER i a l’estrès ER relacionat amb el tràfic anormal de membranes. Actualment, però, no està clar si l'estrès ER mediat per molècules mutades està relacionat amb l'activació autofagosoma mediada en l'estrès ER en la patogènesi de l'ASD. La regulació de la tensió ER mediada per molècules mutada serà un altre tema important en el futur. Els ratolins integrats que expressen el cadm1 mutat relacionat amb el CADM1 humà (H246N) o (Y251S) proporcionaran una visió més àmplia de la relació entre l’estrès ER i la patogènesi de l’ASD.

Materials i mètodes

Anàlisi d’interacció proteïna-proteïna

Es va preparar mitjançant proteïnes recombinants de tipus salvatge tipus CADM1 (48-334 aa que incloïen tres dominis Ig) que mancaven del domini transmembrana mitjançant cèl·lules de cuc de seda (Katakura Industries Co., Tòquio, Japó). El seu etiquetat CADM1 (48-334 aa) va ser purificat per columna Ni segons el protocol del fabricant (Qiagen Science, Germantown, MD, EUA).

CADM1 de tipus salvatge o mutat en un vector pcDNA va ser transfectat en cèl·lules COS mitjançant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Després de la incubació durant 28 h, les cèl·lules es van lisar amb PBS que contenia 1% de Tritó X-100, i després es va centrifugar a 12 000 rpm durant 20 min, extractes de cèl·lules COS. La seva proteïna Cadm1 recombinant (48–334) recombinant (2 μ g de proteïna) es va incubar amb els extractes (500 μ g de proteïna) de cèl·lules COS que expressaven Cadm1 de tipus silvestre, H246N- o Y251S-48-334 - mic a 4 ° C durant la nit. Els complexos es van aïllar de la barreja d’incubació mitjançant la unió amb la columna Ni i es van detectar mitjançant anàlisis d’immunoblot mitjançant anti-myc (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EUA) i es van avaluar mitjançant anàlisi densitomètrica. Les dades de tres experiments es van analitzar i analitzar per quantificar-les amb el programari Image J (Instituts Nacionals de Salut).

Espectroscòpia de correlació de fluorescència (FCS)

Es va preparar una proteïna recombinant marcada amb TAMRA (Cadm1 mutada o de tipus salvatge (48-334 aa inclosos tres dominis Ig)) que no tenia el domini transmembrana utilitzant el Kit de marcatge fluorescència en punt fluorescència in vitro 543). Es van purificar 36 proteïnes recombinants marcades amb TAMRA i no marcades mitjançant el kit HY RTS 100, E. coli (Roche, Basilea, Suïssa). Les mesures de FCS es van realitzar mitjançant un sistema de detecció de fluorescència d’una sola molècula MF20 (Olympus, Tòquio, Japó). Per a la detecció de proteïnes recombinants marcades amb TAMRA es va utilitzar un làser-neó (543 nm). Cadm1 recombinant de tipus TAMRA o de tipus salvatge Cadm1 (4 nM) es va barrejar amb un Cadm1 recombinant mutat o de tipus salvatge Cadm1 (0–40 nM) i es va afegir a la barreja en PBS amb un 0, 05% de Tween 20. Després que les mescles fossin incubat a 37 ° C durant 1 h, una alícuota (50 μ l) de cada mostra va ser transferida a una microplaca (24 × 16 pous, Olympus). Per obtenir els paràmetres òptics necessaris per a una mesura adequada, es va utilitzar una solució estàndard (MF-D543PX, Olympus). Totes les mesures es van dur a terme de manera més que duplicada i amb 10 exploracions, cadascuna de 10 s a temperatura ambient. Les dades obtingudes es van ajustar segons una funció d'autocorrelació incorporada al programari que els acompanya.

Modelar l'estructura del CADM1 mutat

L'estructura dels dominis Ig2 i Ig3 de tipus salvatge i mutant CADM1 va ser construïda per SWISS-MODEL 37 mitjançant l'estructura de cristall de MuSK (entrada PDB: 2IEP) com a plantilla i la seqüència d'aminoàcids de 163-327 de CADM1. Per al modelat dels mutants H246N i Y251S de CADM1, es van modificar les seqüències d’entrada corresponents a les seves mutacions.

Transfecció de CADM1-myc de tipus salvatge i mutada a neurones

Les neurones es van aïllar del cervell dels ratolins deficients cadm1 el dia 16 embrionari tal com es descriu. Es van cultivar 38 neurones mitjançant un medi Neurobasal amb un suplement del 2% de B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) i L -glutamina (0, 5 mM). Es van incubar els cultius a 37 ° C en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de CO2. Després de 6 dies in vitro (DIV), les neurones van ser transfectades amb un tipus salvatge o mutat (H246N) o (Y251S) amb marc micòric CADM1 mitjançant el mètode de fosfat de calci i incubades per 2 DIV.

Immunostaining

Per a l’assaig immunostaining per a la localització intracel·lular de CADM1 i sinaptofisina a les neurones i a les cèl·lules C2C5, les cèl·lules es van transfectar amb pcDNA mutat amb H246N o Y251S-CADM1 en presència o absència de 4-PBA (7, 5 mM) o rapamicina (10 μ g / ml), i fixat en un 4% de paraformaldehid, rentat amb PBS, i després incubat amb anti-sinaptofisina de ratolí (Sigma, St Louis, MO, EUA), anti-KDEL de ratolí (Stressgen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canadà), anti-beclin de conill (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), ratolí anti-CHOP (Santa Cruz), o pollastre anti-SynCAM1 (Cadm1) (MBL, Nagoya, Japó) durant la nit a 4 ° C . Els anticossos secundaris conjugats Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 568 contra IgG de pollastre i ratolí o conill es van comprar a Molecular Sondes (Eugene, OR, EUA). Es van detectar nuclis mitjançant una tinció de Hoechst 33342 (Molecular Sondes). Es va observar la reactivitat mitjançant un microscopi confocal de rastreig làser (CSU-10, Yokogawa, Yokokawa Electric Co., Tòquio, Japó).

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Figura suplementària S1

Glossari

MAS

trastorn de l’espectre autista

CADM1

molècula d’adhesió cel·lular-1

Ig

immunoglobulina

NLGN

neuroligina

TALLAR

regulació de la proteïna homòloga C / EBP

PDZ

proteïna post-sinàptica de densitat / supressor de tumor gran disc de Drosophila / proteïna de zonula occludens-1

eIF2 α

Factor d'iniciació eucariota-2 α

ER

reticle endoplàsmic

ERAD

Degradació associada a l'ER

UPR

resposta de proteïna desplegada

TSC

complex d’esclerosi tuberosa

GABA

àcid aminobutíric

4-PBA

àcid fenílic butíric

Descens

thapsigargin

La informació complementària acompanya el document del lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)