Els mirnas induïts pel bortezomib dirigeixen un silenciament epigenètic dels gens del locus i desencadenen l’apoptosi en la leucèmia | mort i malaltia cel·lular

Els mirnas induïts pel bortezomib dirigeixen un silenciament epigenètic dels gens del locus i desencadenen l’apoptosi en la leucèmia | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Leucèmia
  • Farmacogenètica

Resum

S'ha suggerit que els microRNAs (miRNAs) reprimeixen la transcripció mitjançant la unió de les regions 3 'no traduïdes d'ARNm. No obstant això, la participació i els detalls de la regulació epigenètica mediada per miRNA, especialment en l’orientació de l’ADN genòmic i la mediació de la regulació epigenètica, romanen en gran part no investigats. En el present estudi, el factor de transcripció CCAAT / potenciador delta de proteïna vinculant (CEBPD) va ser sensible al fàrmac anticancerigen bortezomib, un medicament clínic i altament selectiu per al tractament de la leucèmia i va contribuir a la mort cel·lular induïda per bortezomib. Curiosament, després de la identificació de miRNAs induïts per CEBPD, vam trobar que miR-744, miR-3154 i miR-3162 podrien apuntar-se a les illes CpG a la regió de flanqueig 5 del gen CEBPD . Prèviament vam demostrar que el complex proteïna Yin Yang 1 (YY1) / grup de poliacomb (PcG) / complex de metiltransferasa d’ADN (DNMT) és important per a la inactivació del gen del CCAAT / protein boosting delta (CEBPD); vam descobrir que Argonaute 2 (Ago2) interactua amb YY1 i s’uneix al promotor CEBPD . El complex proteïna / DNMT del grup miRNA / Ago2 / YY1 / PcG va unir la inactivació de CEBPD i gens adjacents a la seva regió de flanqueig 5', incloent el polipèptid catalític activat per ADN de la proteïna quinasa ( PRKDC ), un deficient manteniment del minichromosoma 4 ( MCM4 ) i Enzim conjugant amb ubiquitina, variant E2 2 ( UBE2V2 ), després del tractament amb bortezomib. A més, vam revelar que la unió amb miRNA és necessària per silenciar el gen epigenètic mediada pel complex YY1 / PcG / DNMT i està associada amb la metilació induïda per bortezomib en el DNA genòmic. El present estudi va caracteritzar amb èxit les interaccions del complex proteïna / DNMT del grup miRNA / Ago2 / YY1 / PcG i va proporcionar nous coneixements sobre la regulació epigenètica mediada per miRNA en la detenció de la cèl·lula leucèmica induïda per bortezomib i la mort cel·lular.

Principal

Els microARN (miRNAs) es componen de nucleòtids de 21-24 ARN que regulen múltiples gens i funcions cel·lulars en la progressió del tumor. 1, 2 En interaccionar amb membres de la subfamília de proteïnes Argonaute (Ago), els miRNA es dirigeixen principalment a llocs homòlegs de les regions no traduïdes (UTRs) dels ARNm, contribuint així a la inhibició de la traducció o la degradació de l'ARNm. 3, 4 A partir de les troballes de l'anàlisi del transcriptoma, més del 70% dels promotors gènics es van solapar amb transcripcions d'ARN no codificants, que podrien servir de llocs miRNAs objectiu. 5, 6 Tot i que els miRNAs medien principalment el silenciament gènic post-transcripcional (PTGS) en el citoplasma, estudis recents han demostrat que els miRNAs també es traslladen al nucli i interaccionen amb el DNA promotor, inactivant així l’expressió gènica. 7 A més, els petits ARN exògens han estat implicats en la modificació de la histona mediada per Ago i en la metilació de l'ADN de les transcripcions gèniques 8, 9, 10 i són coneguts pel silenciament transcripcional del gen (TGS). Argonaute 2 (Ago2) té el paper més ben establert en RNAi com a motor catalític que condueix la divisió de mARN. 11 Ago1 i Ago2 tenen superfícies carregades positivament i són adequades per unir RNA i alinear-lo amb un àcid nucleic complementari. Estudis anteriors han demostrat que Importin 8 media el transport nuclear de miRNAs i les proteïnes Ago associades, que regulen la modificació de la cromatina. 12, 13 Tanmateix, els efectes i mecanismes consegüents en resposta a la regulació epigenètica mediada per miRNA encara no són investigats.

S’ha suggerit que els factors de transcripció regulen la biogènesi dels miRNAs. 14, 15 delta de proteïnes que uneix CCAAT / potenciador (CEBPD) és un factor de transcripció que contribueix a la diferenciació cel·lular, la motilitat i la mort. 16, 17 L’abundància de CEBPD és típicament baixa en la majoria de cèl·lules en condicions fisiològiques normals, però s’indueix ràpidament a través d’estímuls externs. 18, 19 Tanmateix, la biologia dels miRNAs en resposta a l’activació del CEBPD i els efectes consegüents continuen sent en gran mesura desconeguts. Prèviament vam demostrar que la CEBPD podria servir com a supressor de tumors mitjançant l’activació de l’apoptosi i la detenció del creixement en càncers de pròstata, de coll uterí i de mama. 18, 20, 21, 22 També hem demostrat que la regulació epigenètica mediada per Yin Yang 1 (YY1) / grup de polícomb (PcG) / ADN metiltransferasa (DNMT) es pot atenuar a les cèl·lules cancerígenes en les cèl·lules cancerígenes. 20, 22 En la leucèmia, la CEBPD es va suprimir en la fase de crisi explosiva de les leucèmies mieloides cròniques 23 i els pacients amb leucèmia mieloide aguda (AML). 24 Tanmateix, la leucèmia continua sent una pregunta oberta, regulada amb detall i la regulació detallada del CEBPD, especialment en resposta a fàrmacs anticancerígenes.

Bortezomib, el primer inhibidor selectiu del proteasoma en arribar a assaigs clínics, provoca l’aturada i l’apoptosi del cicle cel·lular G2-M bloquejant l’acció del proteasoma 26S. S'ha demostrat que 25 Bortezomib tenen activitat in vitro i in vivo contra una gran varietat de malalties malignes, incloent mieloma múltiple, 26 leucèmies limfòcites cròniques, 27 càncer de pròstata, 28 càncer de pàncrees 29 i càncer de colon. 30 Un estudi recent va demostrar que el bortezomib millora l'eficàcia de la detenció mitòtica induïda per volasertib en AML in vitro i perllonga la supervivència in vivo . 31 Tot i que s'ha suggerit l'activació apoptòtica associada a la transcripció en resposta a bortezomib, 32, 33 els mecanismes i les noves visions, especialment en la regulació mediada per PTGS, romanen en gran part no investigats.

En aquest estudi, es van identificar miRNAs sensibles al CEBPD a les cèl·lules leucèmiques. A més, són importants els polipèptids catalítics activats per DNA ( PRKDC ), el manteniment del minichromosoma deficient 4 ( MCM4 ) i els gens de l'enzim variant E2 variant 2 ( UBE2V2 ), que es troben a la regió de 5 'aigües amunt del gen CEBPD . Reparació d’ADN i regulació del cicle cel·lular. 34, 35, 36 Hem trobat que miR-744, miR-3154 i miR-3162 que responen a CEBPD podrien unir-se a les regions promotores de CEBPD i els seus gens de 5 'aigües amunt PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . En certs tipus de càncer, l’activitat CEBPD és silenciada pels reguladors epigenètics YY1, complex PcG i DNMT mitjançant la metilació de l’ADN millorada. 20, 37 A més, vam demostrar a més que els ARNm, en resposta a CEBPD, podrien interactuar amb Ago2 i contribuir a la histona i la metilació de l'ADN mitjançant la reclutament de la unió del complex proteïna YY1 / PcG / DNMT. Aquesta unió va, en conseqüència, inhibir CEBPD i els seus gens ′ 5 a més PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . La nova regulació mediada per miRNA / Ago2 proporcionava una nova visió de la mort de cèl·lules induïdes per bortezomib a les cèl·lules leucèmiques.

Resultats

CEBPD està activat per bortezomib i contribueix a l'apoptosi de cèl·lules leucèmiques induïda per bortezomib

Es va suggerir a CEBPD que respongués a molts medicaments anticancerígenes i que contribuís a l’apoptosi induïda per aquests medicaments anticancerígens. 38, 39 Es va suggerir que el medicament anticancerigen bortezomib servia com a inhibidor del proteasoma i com a fàrmac terapèutic comú de la leucèmia. Després de l'observació que el CEBPD era sensible al tractament amb bortezomib en cèl·lules leucèmiques (Figura 1a i Figura Suplementària S1a), es va examinar més l'efecte del bortezomib en la inducció d'apoptosi i es va provar la implicació de CEBPD en la mort induïda per bortezomib de cèl·lules leucèmiques. Es va realitzar un assaig i una citometria de flux (3- (4, 5-dimetilthiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazolium) (MTT) per examinar la supervivència cel·lular i valorar la població cel·lular sub-G1, respectivament. Es va observar una viabilitat cel·lular reduïda i una major població sub-G1 i apoptosi de cèl·lules THP-1 i U937 després del tractament amb bortezomib (Figures 1b i c i Figura Suplementària S2). A més, es va observar un efecte apoptòtic atenuat després de l'esgotament de CEBPD en cèl·lules THP-1 tractades amb bortezomib (figura 1d). A continuació, vam verificar la implicació de CEBPD en la inducció de l’apoptosi de cèl·lules leucèmiques. Es va realitzar un assaig de viabilitat cel·lular a través d’un sistema d’expressió CEBPD de doxycycline (Dox) per verificar el paper proapoptòtic del CEBPD en les cèl·lules leucèmiques. Com era d’esperar, la inducció de CEBPD podria atenuar la viabilitat de les cèl·lules THP-1 (figures 2a i b). Aquestes dades suggereixen que la CEBPD té un paper proapoptòtic en l’apoptosi induïda per bortezomib de les cèl·lules leucèmiques.

Image

El CEBPD, que contribueix a l’apoptosi cel·lular leucèmica, és sensible al bortezomib. ( a ) Bortezomib augmenta l'expressió de la CEBPD. Després del tractament amb bortezomib (50 nM) durant 6 h en cèl·lules THP-1, es van collir i analitzar ARN total i lisats proteics mitjançant qPCR i Western blot analysis. ( b ) El bortezomib inhibeix la viabilitat cel·lular. Després del tractament amb bortezomib (50 nM) durant 24 hores, es va mesurar la viabilitat de les cèl·lules leucèmiques (THP-1 i U937) mitjançant un assaig MTT. ( c ) El bortezomib indueix la detenció del creixement de cèl·lules leucèmiques. Després de tractar amb bortezomib (50 nM) durant 24 h, es va analitzar la fase sub-G1 de les cèl·lules THP-1 i U937 mitjançant citometria de flux. ( d ) El CEBPD atenuat inverteix la viabilitat cel·lular reduïda en bortezomib a les cèl·lules THP-1. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema de derrota CEBPD induïble per IPTG es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h. Després del tractament amb bortezomib (50 nM) durant 24 hores, es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant un assaig MTT. Les dades es presenten com l’error mitjà ± normal d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, test de t de l’alumne). NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

Image

El CEBPD inhibeix les taxes de supervivència de les cèl·lules THP-1. ( a ) Dox indueix amb èxit l'expressió CEBPD a les cèl·lules THP-1 del sistema d'expressió CEBPD de Dox-inducible. Les cèl·lules THP-1 es van tractar amb Dox (1 μ g / ml) durant 6 h, seguida de qPCR per analitzar l’expressió de CEBPD. ( b ) CEBPD redueix la viabilitat de les cèl·lules THP-1. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema d’expressió CEBPD induïble de Dox es van tractar amb Dox (1 μ g / ml), i es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant un assaig MTT. Les dades es presenten com l’error mitjà ± normal d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, test de t de l’alumne). NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

CEBPD autoregula negativament i inactiva de manera coordinada els gens situats a la regió de 5 'aigües amunt del gen CEBPD

La CEBPD és un factor de transcripció molt conegut i se li ha suggerit que fomenti l’apoptosi mitjançant l’activació de gens apoptòtics. 21, 22 Tanmateix, la implicació del CEBPD en la regulació del miRNA i la seva associació amb les conseqüents respostes cel·lulars, especialment en el seu paper proapoptòtic, continuen mal enteses. Primer es va realitzar anàlisi de microtaies de miRNA i ARNm en cèl·lules THP-1 per explorar el vincle entre miRNAs i ARNm regulats per CEBPD. Utilitzant el programa d'accés públic miRTar, es va explorar la correlació entre l'ARNm regulat per l'ARNm regulat pel CEBPD (Taula suplementària 1) i els perfils de miRNA regulats (Taula suplementària 2). Curiosament, entre els 490 ARNm regulats per la CEBPD, 407 (83%) els ARNm amb resposta al CEBPD no eren objectius dels miRNAs sensibles al CEBPD en els seus UTR (Figura 3a i Taula Suplementària 3). Aquests descobriments van implicar que els ARNm regulats a la baixa que responen a l’activació del CEBPD es podrien regular mitjançant altres mecanismes independents de UTR. Recentment, es va suggerir que els ARNm van estar involucrats en la regulació epigenètica mitjançant l'orientació directa de l'ADN. 40, 41 Hem trobat que diversos miRNAs amb resposta al CEBPD amb 10 millors classificats mostraven un potencial vinculant a la regió de flanqueig 5 del gen CEBPD . Com s'ha esmentat anteriorment, els gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 , que es troben a la regió de 5 aigües amunt del gen CEBPD , tenen un paper potent en la promoció de l'entrada en fase S del cicle cel·lular o en la inhibició de l'apoptosi. 34, 35, 36 És important veure que l’expressió exògena de CEBPD podria atenuar les transcripcions endogènies de CEBPD (figura suplementària S3). A més, tot i que la transcripció dels gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 no va respondre immediatament al tractament amb bortezomib, la seva transcripció es va atenuar coordinadament amb la inactivació de CEBPD en el tractament a llarg termini amb bortezomib (figura suplementària S4). Aquestes observacions van suscitar el nostre interès per comprovar si el CEBPD activat podria regular els miRNAs per inactivar la transcripció del propi CEBPD i els gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 en cèl·lules leucèmiques tractades amb bortezomib.

Image

CEBPD i miRNA sensibles contribueixen a la inactivació dels gens circumdants. ( a ) Els ARNm 3'-UTR de la majoria dels ARNm regulats per la CEBPD no són objectius dels miRNAs regulats per CEBPD. Es va analitzar el perfil de micromecenatge dels ARNm regulats per CEBPD i els perfils de micromecenatge dels ARNm regulats amb el CEBPD mitjançant el programa de predicció de miRTar. El gràfic gràfic presenta el percentatge d'ARNm regulats per CEBPD al 3'-UTR, que conté les seqüències de llavors de miRNA regulades amb CEBPD. ( b ) CEBPD participa en la inactivació dels gens circumdants. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema d’expressió CEBPD induïble de Dox es van tractar amb Dox (1 μ g / ml) durant 18 h; es va collir ARN total per realitzar qPCR (panell esquerre), i es va collir proteïna total per realitzar anàlisis de taquilla occidental (quadre dret). ( c ) El Bortezomib reprimeix l'expressió de PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Després de tractar amb bortezomib (50 nM) durant 16 h, es va collir ARN total per realitzar qPCR (panell esquerre) i es va collir proteïna total per realitzar l’anàlisi del blot occidental (quadre dret). ( d ) Representació esquemàtica que mostra la localització de gens i motius vinculants al miRNA. ( e ) miR-744, miR-3154 i miR-3162 redueixen els gens que envolten CEBPD. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema d’expressió dox-induïble miR-744, miR-3154 i miR-3162 es van tractar amb Dox (1 μ g / ml) durant 18 h. Es va recol·lectar ARN total per realitzar qPCR (panell esquerre), i es va collir proteïna total per realitzar l'anàlisi de taquilla occidental (quadre dret). ( f ) El CEBPD atenuat inverteix l'expressió gènica inhibida pel bortezomib a les cèl·lules THP-1. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema de derrota CEBPD induïble per IPTG es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h. Després del tractament amb bortezomib (50 nM) durant 16 h, es va collir ARN total per realitzar qPCR (panell esquerre) i es va collir proteïna total per realitzar l'anàlisi del blot occidental (quadre dret). Les dades es presenten com a mitjana ± error normal d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, test de t de l’alumne)

Imatge a mida completa

Els resultats quantitatius de PCR van demostrar que les transcripcions de PRKDC , MCM4 i UBE2V2 es van atenuar després de la inducció de CEBPD després d’expressar exògenament el tractament CEBPD o bortezomib en cèl·lules THP-1 o U937 (figures 3b i c i figura suplementària S1b). Mentrestant, mitjançant l'anàlisi amb el programa miRTar, no es va predir cap seqüència de llavors miRNA sensibles a CEBPD en les UTRs dels ARNm CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Sorprenentment, es va preveure que les seqüències de llavors complementàries dels miR-744, CERPD-responsive miR-744, miR-3154 i miR-3162 (taula complementària 2) unien les regions promotores dels gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (Figura 3d). Per tant, vam provar si els ARNm PRKDC , MCM4 i UBE2V2 podrien ser regulats per aquests tres miRNAs. Els resultats van mostrar que les transcripcions de PRKDC , MCM4 i UBE2V2 estaven regulades després de l'augment d'aquests tres miRNAs (Figura 3e i Figura Suplementària S8a). Curiosament, a més d’aquests tres gens, l’expressió exògena del CEBPD també va atenuar les transcripcions endogènies del CEBPD (figura suplementària S3a). El resultat va implicar que la inducció de CEBPD podria autoregular negativament la transcripció de CEBPD en cèl·lules leucèmiques. A més, la pèrdua de CEBPD va augmentar l'expressió de PRKDC , MCM4 i UBE2V2 després del tractament amb bortezomib (figura 3f). Els resultats van plantejar una especulació que la CEBPD podria ser el primer gen responsiu després del tractament amb bortezomib; a més, la inducció de CEBPD va augmentar l'expressió de miR-744, miR-3154 i miR-3162. Posteriorment, aquests miRNAs podrien retroalimentar per suprimir la transcripció del propi CEBPD i dels gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 .

CEBPD activa la transcripció de miR-744, miR-3154 i miR-3162

Per revelar els descobriments descrits anteriorment, primer es va examinar si CEBPD podria induir la transcripció de miR-744, miR-3154 i miR-3162 activant directament els seus promotors. Els resultats van mostrar que el tractament amb HA / CEBPD i bortezomib exògens podria activar la transcripció de miR-744, miR-3154 i miR-3162 en cèl·lules THP-1 i U937 (figures 4a i b i figura suplementària S5). D'altra banda, la inactivació de transcripcions de CEBPD atenuava miR-744, miR-3154 i miR-3162 després de l'estimulació de bortezomib (figura 4c). A més, miR-3154 és un miRNA intergènic que té el seu propi promotor. Intragenic miR-744 i miR-3162 pertanyen a dos gens individuals, MAP2K4 i SNHG11 , i el CEBPD sobreexpressat podria activar les expressions MAP2K4 i SNHG11 (figura suplementària S7). A continuació, vam investigar si CEBPD podia activar directament els promotors dels gens que codificaven miR-744, miR-3154 i miR-3162. Vam clonar i generar tres reporters que porten les regions promotores d’aquestes tres ubicacions de miRNA (figura 4d, panell superior). Els resultats de l’assaig reporter van mostrar que l’expressió exògena de CEBPD podria induir l’activitat promotora de gens que codifiquen els tres miRNAs individuals (Figura 4d, quadre inferior). D'altra banda, un assaig d'unió a l'ADN in vivo va demostrar que CEBPD es podia unir directament a les regions promotores dels gens que codifiquen miR-744, miR-3154 i miR-3162 (figura 4e). Aquests resultats van suggerir que el CEBPD era sensible al bortezomib i activà directament la transcripció de miR-744, miR-3154 i miR-3162.

Image

miR-744, miR-3154 i miR-3162 són miRNAs que responen al CEBPD. ( a ) CEBPD indueix l'expressió miR-744, miR-3154 i miR-3162. Les cèl·lules THP-1 es van transfectar amb HA-CEBPD durant 18 hores. Es va recol·lectar ARN total, i els nivells de miRNAs (miR-744, miR-3154 i miR-3162) van ser confirmats per qPCR. ( b ) El Bortezomib augmenta l'expressió miR-744, miR-3154 i miR-3162. qPCR es va realitzar mitjançant ARN total recollit a partir de cèl·lules THP-1 tractades amb bortezomib (50 nM) durant 6 hores. ( c ) La pèrdua de CEBPD va reduir miR-744, miR-3154 i miR-3162 induïts per bortezomib. Les cèl·lules THP-1 amb sistema de derrota CEBPD induïble per IPTG es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h. Després del tractament amb bortezomib (50 nM) durant 6 h, es van mesurar els nivells d’expressió de miR-744, miR-3154 i miR-3162 mitjançant qPCR. ( d ) CEBPD activa l’activitat promotora dels miRNAs. Representació esquemàtica de les construccions del reporter amb els promotors miR-744, miR-3154 i miR-3162. La ubicació aproximada dels motius putative d’unió CEBPD s’indica amb un oval. L'activitat de luciferasa es va avaluar després de co-transfectar reporters i vectors d'expressió en cèl·lules THP-1 tal com es va indicar. ( e ) CEBPD s'uneix directament als promotors miR-744, miR-3154 i miR-3162 in vivo . Es va realitzar un assaig ChIP en cèl·lules THP-1 amb el sistema d’expressió CEBPD inductible de Dox. La cromatina sonada va ser sotmesa a anàlisi ChIP-qPCR mitjançant CEBPD o anticossos IgG control. Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, test de l’estudiant)

Imatge a mida completa

Ago2 interacciona amb YY1 i s’uneix a les regions promotores amb el complex PcG i HP-1

Els miRNA madurs guien els complexos que contenen amgo per orientar seqüències de llavors parcialment complementàries sobre els ARNm i induir la repressió de l’expressió gènica al nivell d’estabilitat o translació d’ARNm. CEBPD activa l'expressió de miR-744, miR-3154 i miR-3162 en cèl·lules THP-1. A més, els nostres resultats actuals van mostrar que l'augment d'aquests miRNAs podria inactivar la transcripció del propi CEBPD i els gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . A continuació, es va disseccionar el potent mecanisme subjacent a la silenciació transcripcional mediada per miRNA sobre l'ADN genòmic (gDNA). Els resultats de l’assaig d’immunoprecipitació van mostrar que Ago2, però no Ago1, podia associar-se específicament amb YY1 a les cèl·lules 293T i THP-1 amb o sense tractament amb bortezomib (figures 5a i b). A més, el nostre estudi anterior va demostrar que el complex YY1 / PcG / DNMT es pot reclutar a les illes CpG de la regió promotora del gen CEBPD , i que és fonamental per mediar el silenciament epigenètic del gen CEBPD . A més, els motius de la unió YY1 putatiu també es podrien preveure en les regions promotores dels gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . Així, es va comprovar si Ago2, YY1, el complex PcG i DNMT1 es poden reclutar a les regions promotores dels gens CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 mitjançant un assaig de PCR (qPCR) qualificat amb Chromatina. Es va observar la unió elevada de Ago2, YY1, SUZ12, EZH2 i DNMT1 a les regions dels primers corresponents per als promotors indicats en el tractament amb bortezomib (figura 5c). A més, la unió de HP-1, que va conduir a la formació d’heterochromatina i inactivació de gens, també va ser detectable a les regions promotores dels gens CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (Figura 5c). Aquests resultats suggereixen que Ago2 interacciona amb proteïnes que interaccionen amb YY1 i YY1, incloses les proteïnes PcG, DNMT1 i HP1, després del tractament amb bortezomib.

Image

El bortezomib indueix la formació del complex Ago2 / YY1 i la unió del complex PcG. ( a i b ) El bortezomib indueix la interacció Ago2 i YY1. Les cèl·lules 293T es van transfectar amb Flag-YY1 i es van tractar amb bortezomib (50 nM) durant 5 hores. Es van recopilar i analitzar total els lisats mitjançant immunoprecipitació mitjançant un anticòs anti-flag ( a ). Les cèl·lules THP-1 es van tractar amb bortezomib (50 nM) durant 12 hores. Els lisats totals es van recollir i analitzar mitjançant immunoprecipitació mitjançant un anticòs anti-YY1 ( b, panell superior) i els resultats quantitats van mostrar la intensitat d'interacció entre YY1 i Ago2 ( b, panell inferior). ( c ) El complex Ago2-PcG (SUZ12, DNMT, EZH2) i HP-1 s'uneixen directament a la regió amunt del CEBPD i els gens circumdants. Es va realitzar un assaig ChIP utilitzant cèl·lules THP-1 tractades amb bortezomib (50 nM). La cromatina sonica de les cèl·lules THP-1 va ser immunoprecipitada per separat mitjançant anticossos específics contra Ago2, SUZ12, DNMT, EZH2, HP-1 i IgG control. L’ADN immunoprecipitat es va amplificar per QPCR utilitzant diferents primers com s’indica al panell superior. Les dades es presenten com a mitjana ± error estàndard d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, test de l’estudiant)

Imatge a mida completa

miR-744, miR-3154 i miR-3162 medien TGF en unir directament l'ADNNA

Les seqüències complementàries parcials complementàries de miR-744, miR-3154 i miR-3162 i els motius d'unió YY1 de consens es van observar a la regió promotora del gen CEBPD . Per disseccionar l'escenari d'unió de miRNAs i YY1 en el silenciament genic mediat per l'epigenètica, es van construir diversos reporters heteròlegs CEBPD (Figura 6, panell superior) per avaluar la seva contribució i regulació individuals. Els resultats de l’assaig reporter van mostrar que el bortezomib no tenia cap efecte en el periodista del promotor pGL3-CEBPD (PC) (1938 / −590 promotor CEBPD que contenia motius vinculants a YY1), però va reprimir significativament l’activitat del PC amb llocs d’unió a miRNA ( PCmi) reporter (regió promotora del CEBPD de 1938 / −590 que conté motius d’unió YY1 i fusionada amb seqüències de llavors complementàries de miR-744, miR-3154 i miR-3162). És important destacar que l’activitat del PCmi amb llocs d’enllaç YY1 mutats (PCmiMY) mutats (−1938 / −590 regió promotora CEBPD que contenen motius d’unió YY1 mutants i fusionats amb seqüències de llavors complementàries de miR-744, miR-3154 i miR-3162) es va invertir després del tractament amb bortezomib (figura 6a). A més, el nostre estudi anterior va demostrar que YY1 podia reclutar DNMTs i metil·lar les illes CpG al promotor del CEBPD . 20 A continuació, per investigar si els ARNm podrien afectar l’estat de metilació de l’ADN, vam recuperar els reporters transfectats i es van tractar mostres amb bisulfit, seguit d’una PCR específica de metilació. Vam trobar que el bortezomib millorava la metilació de l'ADN a la regió promotora del PCmi -1938 / −9090 del PCmi, però que l'efecte de metilació es va reduir significativament a la regió promotora del PCB i PCmiMY del −1938 / −590 (Figura 6b).

Image

miR-744, miR-3154 i miR-3162 medien un TGS mitjançant una unió directa a gDNA. ( a ) La unió de miRNAs i YY1 està associada amb el silenciament i metilació del gen epigenètic induït per bortezomib. miR-744, miR-3154 i miR-3162 són necessaris per silenciar el gen epigenètic mediat pel complex YY1 / PcG. Representació esquemàtica de construccions de reporters només amb el promotor CEBPD (PC), promotor CEBPD construït amb llocs d’unió de miRNAs (PCmi) i PCmi amb llocs d’unió YY1 mutats (PCmiMY). L’activitat de luciferasa es va avaluar després de transfectar diverses construccions, tal com s’ha indicat, en cèl·lules 293T i posteriorment tractar les cèl·lules amb bortezomib (50 nM). ( b ) La unió de miRNAs i YY1 augmenten els nivells de metilació de les illes CpG sobre els promotors CEBPD . Després de transfectar construccions en 293T amb o sense tractament amb bortezomib (50 nM), el nivell de metilació de les illes CpG als reporters (PC, PCmi i PCmiMY) es va obtenir mitjançant PCR específica de metilació. ( c ) miR-744, miR-3154 i miR-3162 són crítics per a la metilació de l'ADN induïda per bortezomib. Després de transfectar construccions a 293T amb el sistema de silenciament IPRG-induïble miR-744/3154/3162, les cèl·lules es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h i es van tractar amb bortezomib (50 nM) durant 16 h. El nivell de metilació de les illes CpG del reporter (PCmi) es va obtenir mitjançant PCR específica de metilació. ( d ) La inhibició de miR-744, miR-3154 i miR-3162 reverteix la viabilitat cel·lular reduïda en bortezomib a les cèl·lules THP-1. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema de silenciament miRNA-744/3154/3162 induïble per IPTG es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h. Després de tractar amb bortezomib (50 nM) durant 24 hores, es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant el test MTT. ( e ) Atenuats miR-744, miR-3154 i miR-3162 reverteixen les expressions PRKDC , MCM4 i UBE2V2 reduïdes en bortezomib. Les cèl·lules THP-1 amb el sistema de silenci miR-744/3154/3162 induïble per IPTG es van pretractar amb IPTG (500 μ M) durant 3 h. Després de tractar amb bortezomib (50 nM) durant 16 h, els nivells d’expressió de PRKDC , MCM4 i UBE2V2 es van mesurar per qPCR. Les dades es presenten com a mitjana ± error normal d’experiments realitzats per triplicat (* P <0.05, ** P <0.01, test de t de l’alumne)

Imatge a mida completa

En conjunt, aquests resultats suggereixen que els miRNAs actuen com a iniciadors i les funcions YY1 com a proteïnes efectores del silenciament mediat per l’ADN de la transcripció del gen CEBPD. Per confirmar encara més la importància d'aquests miRNAs, vam introduir els vectors silenciadors IPRG-induïbles miR-744-, miR-3154- i miR-3162 a les cèl·lules THP-1. Després de la inducció d'antagomirs de miR-744, miR-3154 i miR-3162, es va perdre la metilació de l'ADN induïda per bortezomib a la regió de −1938 / −590 CEBPD del reporter PCmi (Figura 6c i Figura Suplementària S8b). Mentrestant, la viabilitat cel·lular reduïda en bortezomib i l’expressió dels potents oncogens, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 , també es van atenuar significativament (figures 6d i e). Els resultats van suggerir la importància de l’autoregulació mediada per miR-744, miR-3154 i miR-3162 del gen CEBPD i la inactivació dels gens PRKDC, MCM4 i UBE2V2 per a la viabilitat cel·lular induïda per bortezomib.

Discussió

L'abundància de CEBPD es podria regular mitjançant l'activació transcripcional 21 regulada per la ruta P38 / CREB i l'ARNm CEBPD estabilitzada en HuR de la proteïna que uneix l'ARN. 42, 43 Un estudi anterior va demostrar que el bortezomib afavoreix la transferència de proteïnes HuR al citoplasma i augmenta l’eficiència de traducció dels seus gens objectiu a l’interior de les cèl·lules cancerígenes. 44 A més, un estudi recent va demostrar que la tirosina quinasa Src podria revalorar l'estabilitat de la proteïna CEBPD mitjançant l'activació de la ubiquitina llasa SIAH2 E3. A més, l'activació de la Src kinasa és inhibida per l'oncoproteïna BCR-ABL en cèl·lules leucèmiques. 46 No obstant això, el mecanisme (s) subjacent a l’expressió CEBPD induïda per bortezomib a les cèl·lules leucèmiques segueixen sent una pregunta oberta i requereixen un examen addicional.

En aquest estudi, hem trobat que el potent CEBPD supressor de tumors respon al bortezomib anticancerigen de les cèl·lules leucèmiques (Figura 1a). Curiosament, la inactivació dels gens PRKDC , MCM4 i UBE2V2 es va produir en paral·lel amb una disminució de la transcripció de CEBPD (figura suplementària S4). És important destacar que la inactivació d’aquests quatre gens va seguir a l’augment de l’expressió miR-744, miR-3154 i miR-3162 sensible a CEBPD (figura 3f i figura suplementària S6). Aquí, vam proposar un escenari que CEBPD, que és induït de forma transitòria per bortezomib, active la transcripció de miR-744, miR-3154 i miR-3162. Ago2 podria traslladar encara més aquests tres miRNA al nucli i orientar-se a les regions promotores dels gens que porten les seqüències de llavors complementàries a aquests miRNAs. D'altra banda, el complex miRNAs / Ago2 iniciador interactua amb YY1 i recluta els reguladors epigenètics, complex PcG / DNMTs, per inactivar la transcripció de gens, inclosos CEBPD , PRKDC , MCM4 i UBE2V2 (figura 7).

Image

El model esquemàtic de CEBPD va desactivar els gens del locus i va provocar la mort de cèl·lules leucèmiques mitjançant un silenciament epigenètic dirigit al complex de proteïnes / DNMT del grup miRNA / Ago2 / YY1 / PcG / DNMT. En resposta al bortezomib anticancerigen, el factor de transcripció CEBPD s’activa i l’activa transcripcionalment miR-744, miR-3154 i miR-3162. Aquests miRNAs formen un complex amb Ago2 i es traslladen al nucli per orientar els seus llocs complementaris d’unió de seqüència d’ADN a les regions promotores de CEBPD, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 . El complex iniciador de miRNAs / Ago2 interacciona amb YY1 i recluta els reguladors epigenètics, el complex PcG / DNMTs, per silenciar els quatre loci gènics, inclòs el propi CEBPD. La inactivació d'aquests potents oncogens, PRKDC , MCM4 i UBE2V2 donen lloc a la mort de cèl·lules leucèmiques mitjançant un silenciament epigenètic mediat per miRNA amb resposta al CEBPD.

Imatge a mida completa

El MCM4 és un marcador de proliferació i un membre de les sis proteïnes de manteniment de 47 minichromosomes 47 i és essencial per als orígens de la replicació d’ADN abans de la fase S. 48, 49 Les proves acumulades suggereixen que la MCM4 contribueix a la proliferació de cèl·lules no canceroses de pulmó de cèl·lules petites. 50 El gen PRKDC és adjacent al gen MCM4 del cromosoma i té un paper clau en la unió final no homòloga. 51, 52 El nivell d’expressió de PRKDC va ser elevat en pacients amb neuroblastoma, associats a un pronòstic deficient i un grau de tumor avançat. 53 A més, el gen reparador d'ADN UBE2V2 actua com a marcador pronòstic en el càncer de mama. 54 Un estudi anterior va suggerir que l'UBE2V2 atenuat augmenta els efectes citotòxics del dany d'ADN induït per la UV. 55 Els resultats acumulats han indicat que els ARNm podrien funcionar com a supressors tumorals en la leucèmia. Combinat amb les observacions que el CEBPD desencadena una aturada de creixement, participa en la mort de cèl·lules induïdes per bortezomib (Figures 1d i 2b) i activa miR-744, miR-3154 i miR-3162, vam proporcionar un mecanisme nou que els miRNAs serveixen de supressors tumorals. en provocar la metilació de l'ADN sobre gDNA en cèl·lules leucèmiques. Aquest estudi també demostra per primera vegada que l’activació del CEBPD indueix la mort de cèl·lules leucèmiques suprimint un cúmul d’oncogens potents mitjançant un silenciament epigenètic mediat per miRNA. A més de miR-744, miR-3154 i miR-3162, es va suggerir que diversos ARNm regulats per CEBPD, inclosos miR-150, miR-142 i miR-29a / b, previnguessin la progressió de la leucèmia. 56, 57, 58 Additionally, another CEBPD-responsive miR-744 was suggested to act as a tumor suppressor in various cancers, resulting in chromosomal instability and oncogene inactivation. 59, 60 Consistently, these CEBPD-responsive miRNAs further agree with the involvement of CEBPD in promoting cell differentiation and apoptosis.

CEBPD has been suggested to positively regulated peroxisome proliferator-activated receptor- γ (PPAR γ ) transcription and protein expression in vascular smooth muscle cells and cancer cells. 37, 61, 62 Moreover, the activation of PPAR γ could suppress protein expression and transcription of CEBPD via the inactivation of signal transducer and activator of transcription 3 in vascular smooth muscle cells. 61 These findings implied that CEBPD could be negatively autoregulated following PPAR γ activation. In this study, we provide support for a novel feedback regulation of the CEBPD gene via miRNA-mediated autoregulation. However, the issue whether this feedback regulation occurs in tissue cells or other cancer cell needs to be examined in the future. Furthermore, significantly higher PPARγ mRNA was observed in primary AML patients. 63 Therefore, in addition to revealing the contribution of epigenetic- and PPAR γ -mediated inactivation of CEBPD in leukemic cells, the issue of how to efficiently activate CEBPD for executing its tumor suppressor role in leukemia remains an open question.

The highly evolutionarily conserved Ago proteins bind to non-coding RNA and have an essential role in miRNA-mediated post-transcriptional regulation. 12 Accumulating evidence has demonstrated that Ago proteins are present in the nuclear fraction of human cells. Several reports have shown that Ago proteins form a complex with lnRNA and bind to genomic DNA, thereby inducing direct TGS. 64, 65, 66, 67 Additionally, Ago1 has been implicated in the YY1/Suz12/Dicer1 complex-mediated repression of the NFI-A gene via competing RNA polymerase II binding. 68 Ago2 was also suggested to interact with the transcriptional repressor, SETDB1, for the repression of gene activation. 69 In the present study, we provided the first evidence that Ago2, but not Ago1, Ago3 or Ago4, interacts with YY1 and binds to gDNA, and that these interactions further recruit the epigenetic regulators PcG proteins and DNMTs to direct TGS (Figure 5). The results also implied that Ago1 and Ago2 have distinct roles, at least in part, to independently contribute to PcG protein- and DNMT-mediated epigenetic regulation.

Furthermore, the PcG complex and HP-1 interact and contribute to the silencing effects at the nuclear periphery. 70, 71 Our results showed the binding of HP-1 and the PcG complex on the promoter regions of CEBPD and its 5′ upstream genes (Figure 5c). A previous study showed that Ago1 is dispersed throughout the nuclear interior, whereas Ago2 is localized in the inner nuclear periphery, implying that this area is a transcriptionally repressive compartment. 72 Our study raised several important issues: (1) the location of HP-1 associates with Ago1 and Ago2 distribution in the cell nucleus, (2) the location of miRNAs on gDNA associates with Ago1 and Ago2 and (3) the annotation of miRNAs associated with the cell functions in response to the epigenetic regulation. In addition to providing in vivo evidence associated with the physiological phenomenon, these results are consistent with those of a previous study showing that the loss of Ago2 abrogates TGS. 73 Taken together, Ago2 not only serves as a post-transcriptional regulator via miRNA binding in the 3′-UTR but might also, at least in part, be involved in epigenetic regulation by recruiting PcG proteins and DNMT1.

Materials i mètodes

Materials

The TRIsure RNA extraction reagent, Opti-MEM medium, SuperScript III, Dulbecco's modified Eagle's medium and Roswell Park Memorial Institute medium were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fetal bovine serum (FBS) was purchased from HyClone Laboratories (Logan, UT, USA). SensiFAST SYBR was purchased from Bioline (Taunton, MA, USA). A luciferase assay system was purchased from Promega (Madison, WI, USA). The α -tubulin antibody (T6199) was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA), and antibodies against CEBPD (SC-636), Ago2 (sc-32877), Ago3 (sc-32662), Ago4 (sc-374220) and YY1 were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). The anti-Ago1 antibody (no. 07-599) was purchased from Millipore (Billerica, MA, USA). The anti-SUZ12 antibody was purchased from Abcam (Cambridge, UK). The anti-DNMT1 antibody was purchased from IMGENEX (San Diego, CA, USA). All oligonucleotides were synthesized at MDBio Inc. (Taipei, Taiwan).

Cultiu cel·lular

The human monocytic leukemic cell line THP-1 and the human myeloid cell line U937 were maintained in Roswell Park Memorial Institute medium supplemented with 10% FBS, 100 μ g/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin. The human embryonic kidney cell line 293T and human epithelial cells Ampho were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% FBS, 100 μ g/ml streptomycin and 100 U/ml penicillin.

Reverse transcription-polymerase chain reaction

THP-1 cells were treated with Dox or bortezomib. Total RNA was extracted using TRIsure. The isolated RNA was subjected to reverse transcription using SuperScript III for cDNA synthesis. The following oligonucleotide primers were used in the qPCR analysis: GAPDH (F): 5′-CCACCCAGAAGACTGTGGAT-3′ and GAPDH (R): 5′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT-3′; CEBPD (F): 5′-GCCATGTACGACGACGAGAG-3′ and CEBPD (R): 5′-TGTGATTGCTGTTGAAGAGGTC-3′; PRKDC (F): 5′-CATGGAAGAAGATCCCCAGA-3′ and PRKDC (R): 5′-TGGGCACACCACTTTAACAA-3′; MCM4 (F): 5′-GGCTCTCATCGAGGCTTATG-3′ and MCM4 (R): 5′-TTCCACATCAATGGCTTCAA-3′; UBE2V2 (F): 5′-AAGGAGTAGGCGACGGTACA-3′ and UBE2V2 (R): 5′-ACGGAGGAGCTTCTGGGTAT-3′.

Viabilitat cel·lular

For the cell survival assay, THP-1 cells were cultured on 12-well plates. The cells were grown for 24 and 48 h after treatment with bortezomib. Next, the experimental cells were incubated with diluted MTT reagent for 3 h. Subsequently, the samples were spectrophotometrically measured at 595 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader.

TaqMan reverse transcription-PCR for miRNA quantification

Total RNA was isolated using TRIzol according to the manufacturer's instructions, reverse transcribed using the TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit and subjected to real-time PCR using the TaqMan microRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA).

Plasmids construction and reporter assays

The 5′-flanking region of CEBPD , MAP2K4 (host gene of intronic miR744), SNHG11 (host gene of intronic miR-3162) and miR-3154 were cloned from THP-1 cells using the DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Düsseldorf, Germany) and PCR. The following primers were used for PCR and cloning the 5′-flanking regions: CEBPD (F) (−1938) Kpn I – 5′-GGTACCTTTGTGCTACAACTTTTTCTGG-3′ and (R) (−589) Nhe I – 5′-GCGAGCGCACCGCACTCGGG-3′; MAP2K4 (F) Kpn I – 5′-GGGGTACCCCGATCACACAATGCTTCTAAAT-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGTGTTGGGAGTGAAGAGC-3′; SNHG11 (F) Kpn I – 5′- GGGGTACCCCAGAACGCATAGCAGAAAATGTTC-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGGAGCCGCCGCCG-3′; miR-3154 (F) Kpn I – 5′- GGGGTACCCCCATTTCCTGACTGCAGAGAC-3′ and (R) Xho I – 5′- CCGCTCGAGCGGTCCATCCAGGCAGT-3′. After verification via sequencing, the PCR products were cloned into the multicloning sites of the pGL3-promoter or pGL3-basic vector. The complete complementary sequences of mature miR744/3154/3162 were cloned into the PC reporter construct via Nhe I/ Hind III restriction enzyme sites to generate PCmi. Furthermore, two YY1 binding sites on PCmi were mutated by site-directed mutagenesis using the QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA), according to the manufacturer's instructions, to generate PCmiMY. These reporter constructs were transfected into 293T cells using TransIT-2020 transfection reagent (Mirus, Madison, WI, USA) according to the manufacturer's instructions. The transfectants were cultured in complete medium supplemented with HA-CEBPD or bortezomib. Luciferase activity was measured in the lysates of the transfectants.

Western blot assay

Cells were harvested and lysed in modified RIPA buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 1 mM DDT, 10 mM NaF, 1 mM PSMF, 1 μ g/ml aprotinin, 1 μ g/ml leupeptin and 1 mM Na 3 VO 4 ). Following lysis, the lysates were resolved by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis using a 12% polyacrylamide gel, and the proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride nylon membrane and probed with primary antibodies for target proteins overnight at 4 °C. The target proteins were after incubation with peroxidase-conjugated secondary antibodies for 1 h at room temperature. The signals were revealed using an Enhanced Chemiluminescence Western Blot System (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Immunoprecipitació amb cromatina

ChIP assay was conducted according to Ju-Ming Wang and co-workers. 74 Briefly, THP-1 cells were treated with 1% formaldehyde for 15 min. The crosslinked chromatin was subsequently prepared and sonicated to an average size of 500–1000 bp. The DNA fragments were immunoprecipitated with antibodies specific for Ago1–4, SUZ12, EZH2, DNMT1, HP-1, CEBPD and control immunoglobulin G 75 at 4 °C for 12–16 h. After the reversal of the crosslinking, the immunoprecipitated chromatin was amplified using primers specific for regions of the genomic locus of the target genes. The primers are as indicated below. MAP2K4 (F): 5′-CTCCTTTGAGGGTGTTCTGTG-3′ and (R): 5′-ACCAGGGAACAGGGCAGTA-3′; miR-3154 (F): 5′-GACTGCAGAGACCAGGAAGG-3′ and (R): 5′-CCGCTCCTACCTAGTGTCCA-3′; SNHG11 (F): 5′-TGTTTCTTTCATTCTCCAAGAATTT-3′ and (R): 5′-AAGTTTACCTGTAAGGAGAAGAACAG-3′; A (F): 5′-AGAAGTTGGTGGAGCTGTCG-3′ and (R): 5′-GGTATGGGTCGTTGCTGAGT-3′; B (F): 5′-GGCGAGACACAACGTTTTCA-3′ and (R): 5′-ATGGGGTGTATTATGGGTGT-3′; C (F): 5′-TATTTCTCTTGCCCTGCCCC-3′ and (R): 5′-GCGCTTCTCTGTGTTTAGATGA-3′; D (F): 5′-CCCCGGTTCAAACGATTCTC-3′ and (R): 5′-ATAAGTTCATGAGGGCCGGG-3′.

Coimmunoprecipitació

The lysates of 293T cells were prepared using an immunoprecipitation lysis buffer (50 mM NaCl, 0.5% NP-40 and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)). The supernatant was collected and incubated with anti-YY1 antibody at 4 °C for at least 4 h. Protein-A/G agarose beads were added to the lysates, and the mixtures were incubated and rotated at 4 °C for 1 h. The beads were collected using centrifugation and washed three times with modified RIPA buffer. The proteins that were bound to the beads were eluted after adding 2 × electrophoresis sample buffer and were subsequently subjected to western blot analysis.

Methylation-specific PCR

After treating the genomic DNA with sodium bisulfite (Zymo Research, Irvine, CA, USA), the DNA was PCR-amplified using primers specific for the methylated sequences. The primers used for the amplification of methylated and unmethylated promoters of CEBPD were designed using the MethPrimer website. The primers used were as follows: methylation (F): 5′-AGGTGTTAGAATATTTTTTTATCGA-3′ and (R): 5′-TTCCATTACACTCCAACCTAAACA-3′; nnmethylation (F): 5′-AGGTGTTAGAATATTTTTTTATTGA-3′ and (R): 5′-TTCCATTACACTCCAACCTAAACA-3′.

Pre-miR-744/3154/3162 and antisense of miR-744/3154/3162-inducible stable cells

Pre-miR-744/3154/3162 were generated by PCR and then inserted into pAS4w.1.Pneo, a tetracycline-inducible system of lentiviral expression vector. The antisense of miR-744/3154/3162 was inserted into pLAS1w.3xLacO, a lentiviral expression vector. Stable THP-1 cells containing pre-miR-744/3154/3162 and the antisense of miR-744/3154/3162 were generated by transfecting pLAS.AS3w.aOn.Pbsd lentiviral-expressing cells and parental THP-1 cells, respectively. Dox (1 μ g/ml) was used to induce miR-744/3154/3162 expression. IPTG (500 μ M) was used to induce antisense of miR-744/3154/3162 expression. The lentiviral expression vectors were obtained from the National RNAi Core Facility located at the Genomic Research Center of Institute of Molecular Biology, Academia Sinica (Taiwan).

Anàlisi estadística

All experiments were repeated at least three times, and the data were analyzed for statistical significance using Student's t -test in the Prism 5 Software (La Jolla, CA, USA). The data were expressed as the means±SEM Differences indicated with asterisks were considered statistically significant.

Publisher's Note

Springer Nature segueix sent neutre pel que fa a reclamacions jurisdiccionals en mapes publicats i afiliacions institucionals.

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)