Un factor neurotròfic derivat del cervell (bdnf) haplotip està associat amb el resultat del tractament antidepressiu en trastorns de l'estat d'ànim | la revista farmacogenòmica

Un factor neurotròfic derivat del cervell (bdnf) haplotip està associat amb el resultat del tractament antidepressiu en trastorns de l'estat d'ànim | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

El factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) s’ha estudiat àmpliament en relació amb la susceptibilitat als trastorns d’ànim (MD), tot i que queda per aclarir si BDNF és un lloc de susceptibilitat per als fenotips MD, inclosa la resposta terapèutica als antidepressius. Hem realitzat un estudi d’associació d’un marcador i haplotip de vuit polimorfismes TagSNPs a la regió genòmica que conté el gen BDNF en 342 subjectes de control i 374 pacients amb MD, i hem provat l’associació amb el resultat del tractament antidepressiu. Cap dels vuit polimorfismes nucleòtids únics (TagSNPs) no es va associar significativament amb el fenotip MD després de la correcció de Bonferroni. En l’anàlisi d’un marcador únic, es va trobar un SNP associat a l’estat de ‘remissor’ del pacient després d’un assaig adequat amb un fenotip antidepressiu únic (proporció odds (OR) = 2, 95; P = 0, 0025). També hem identificat un haplotip associat a aquest fenotip. Aquest estudi recolza la implicació de BDNF en el resultat del tractament antidepressiu en MD, amb associació específica amb la regió de 5 'aigües endavant del gen BDNF.

Introducció

Els trastorns de l'estat d'ànim (MD) com el trastorn de depressió major (MDD) i el trastorn bipolar (BD) són malalties psiquiàtriques greus, severes i cròniques, sovint causant discapacitat, deteriorament funcional important i de vegades poden posar en perill la vida. De fet, aquests trastorns es troben entre les principals causes de discapacitat a nivell mundial. 1

La farmacoteràpia antidepressiva és una opció de tractament essencial per a episodis depressius majors, però, malauradament, almenys un terç dels pacients que realitzen un assaig adequat amb un antidepressiu aprovat no mostren una resposta acceptable. Per tant, la resistència als medicaments continua sent una font de morbiditat i mortalitat per als pacients amb MD. S'han reportat diversos factors que poden contribuir, tant individualment com en combinació, a la resposta al tractament antidepressiu: no adherència al pacient, diagnòstic errònic, tractaments subòptims, sexe, edat a l'inici de la malaltia, nombre d'episodis anteriors, gravetat de depressió, episodis depressius principals. amb trets psicòtics, depressió bipolar o unipolar i una sèrie de condicions comòrbides (psiquiàtrics, personalitat, trastorns mèdics generals, factors de risc vascular (VRF) i canvis cerebrals estructurals com la malaltia de la substància blanca profunda). 2, 3, 4, 5 i 6 A més, es creu que els factors genètics tenen un paper fonamental en resposta als antidepressius i avui dia hi ha una gran quantitat d’estudis farmacogenètics. Un dels gens més estudiats ha estat el transportador de 5 hidroxitriptriptamina (SLC6A4), que ha estat implicat en el mecanisme d’acció de molts fàrmacs antidepressius. Estudis independents han informat que els pacients que porten la variant llarga del polimorfisme in / del regió reguladora amunt del gen SLC6A4 mostren una millor resposta als inhibidors selectius de la recaptació de serotonina (SSRIs) (revisada a 7 ). També es va associar que altres codis per a vies serotonèrgiques i noradrenèrgiques, receptors glucocorticoides i enzims metabolitzadors de medicaments estan relacionats amb la resposta antidepressiva. 8

Els trastorns depressius es consideren trets genètics complexos, que són o bé poligènics o multifactorials, amb múltiples gens interactuant amb el medi. Malgrat els avenços notables en aquest camp i diversos gens que han estat implicats en el desenvolupament del trastorn, els mecanismes moleculars subjacents a la susceptibilitat a la depressió continuen sent revelats (revisat al 9 ). Les evidències recents han suggerit que la deterioració de la neuroplasticitat i la resiliència cel·lular podria estar a la base de la fisiopatologia de la MDD i que alguns tractaments antidepressius poden tenir efectes importants en les vies de senyalització que regulen la neuroplasticitat i la supervivència cel·lular. Aquesta forma s'ha concretat en la formulació d'una hipòtesi neurotròfica de la depressió, afirmant que la reducció dels nivells de factor neurotròfic derivats del cervell (BDNF) augmenta la vulnerabilitat a la depressió. 10

La BDNF pertany a les neurotrofines, una família de pèptids estretament relacionats que també inclouen el factor de creixement nerviós (NGF), la neurotrofina-3 (NT-3) i la neurotrofina-4/5 (NT-4/5). 11, 12 Aquesta neurotrofina proporciona suport tròfic a les neurones 13, 14, 15 i 16 que contenen colinèrgica, dopaminèrgica i 5-hidroxitriptamina i està àmpliament distribuïda al sistema nerviós central (SNC), incloent hipocamp, neocòrtex, amígdala, cerebel i hipotàlem, clau. regions en la regulació de l'estat d'ànim i el comportament.

El gen BDNF humà assigna el cromosoma humà 11p13 17 i està compost per sis exons de 5 ′ que es diferencien de manera diferent a un únic exó terminal de 3 ′ (exó 7) que codifica tota la seqüència de BDNF madur (accessió GenBank AF411339). Diversos ARNm parcials que s’han seqüenciat indiquen que la regulació transcripcional de BDNF és complexa i implica l’ús de promotors alternatius, llocs de donants d’explicació i acceptadors alternatius que produeixen patrons d’explotació entre i dins d’exon, i l’ús de llocs de poliadenilació alternatius. . 18

A nivell bioquímic, la primera evidència d’una possible afectació de BDNF en MD va provenir d’un informe inicial de reducció de la BDNF sèrica en pacients amb depressió, 19 que ha estat confirmat repetidament per estudis independents que també van trobar que els nivells de proteïnes reverteixen a la normalitat després d’un tractament antidepressiu. . 20, 21, 22, 23, 24 i 25 Recentment, també s’ha notificat disminució dels nivells de BDNF sèrica en BD durant els episodis depressius i maníacs. 26

A nivell molecular, els estudis sobre el paper de la BDNF en MD han abarcat diferents variants genètiques localitzades al llarg de la regió genòmica de BDNF i han utilitzat diferents enfocaments, mitjançant estudis de casos o control d’associacions basats en famílies, però no s’han aconseguit resultats concloents. Entre totes les variants, la més estudiada és un polimorfisme de nucleòtids únic (SNP), transició G a A al nucleòtid 196, que dóna lloc a un canvi Val66-to-Met (V66M; 11350.0002; dbSNP rs6265), que es troba en el 5 ′ Seqüència pro-BDNF. En el cas de la BD, dos informes inicials i independents basats en la família van trobar evidències d’haplotips que contenien rs6265 associats al trastorn. 27, 28 Aquests resultats s’han replicat en trios de nens amb prepubertal BD 29 i en un estudi addicional de control de casos realitzat en adults. 30 Recentment, també s'ha trobat que una regió polimòrfica funcional a prop del lloc d'inici de la traducció està associada a la BD. 31 Malgrat aquesta evidència, altres investigadors no han estat capaços de replicar aquestes troballes en estudis d'associació de control de casos. 32, 33, 34, 35, 36, 37 i 38 En el cas de la MDD, alguns estudis van informar d’una associació negativa del polimorfisme Val66Met BDNF, 33, 39, 40, mentre que altres estudis han trobat un haplotip que conté aquesta variant que s’associa positivament. al fenotip MDD. 41, 42 A més, es va associar que associacions positives d’aquest SNP únic i un haplotip que el conté van estar relacionades amb trastorn d’ànim 41, 43 d’inici de la infància , així com depressió geriàtrica. 44

Els estudis sobre models animals proporcionen un fort suport a la hipòtesi que la BDNF contribueix a l’acció terapèutica dels antidepressius i la teràpia electroconvulsiva (ECT). Tant els antidepressius com l'ECT ​​augmenten l'expressió i la senyalització de BDNF a l'hipocamp i a la còrtex, 45, 46, 47, 48, 49 i 50 i la injecció de BDNF al cervell o la sobreexpressió dels seus receptors en ratolins transgènics produeixen respostes comportamentals similars a les típicament observat després del tractament amb antidepressius. 51, 52 D'altra banda, recentment, s'ha informat que la pèrdua de BDNF a les regions prèvies del cervell en ratolins condicionals BDNF atenuant l'eficàcia dels antidepressius. 53

Malgrat la gran quantitat de dades recollides sobre la implicació de BDNF en MD, hi ha poca informació sobre el paper de les variants de BDNF en la resposta de la MD als tractaments antidepressius. Segons el que sabem, dos estudis en població asiàtica han avaluat la relació entre el polimorfisme de Val66Met i la resposta antidepressiva en MDD, no registrant cap associació, sinó una tendència a millorar la resposta antidepressiva fluoxetina de 4 setmanes per a pacients heterozigots en un estudi 39 i associació amb eficàcia de citalopram, amb Els portadors d'al·lel M responen millor al tractament citalopram 54 de 8 setmanes en l'altra.

Per aprofundir sobre aquest tema, es va realitzar un estudi genètic de control de casos per a aquest gen candidat, inclòs 342 subjectes de control i 374 pacients amb MD. Hem genotipat un conjunt de vuit polimorfismes de nucleotides marcats (TagSNPs) que representen els patrons de variació comuna identificats a la població europea de la regió genòmica que conté el gen BDNF. Com que BDNF ha estat involucrat en l’acció terapèutica dels antidepressius, vam provar més les hipòtesis que les variants del gen BDNF humà poden estar relacionades amb el resultat del tractament antidepressiu en episodis depressius principals, tenint en compte altres factors clínics que poden influir en aquest tret.

Resultats

Estratificació de la població

Hem provat els conjunts de control de casos per a l'estratificació de la població, tal i com es descriu a Materials i mètodes. El conjunt de marcadors no vinculats anoimosos no mostraven cap evidència d’estratificació, ja que les freqüències al·lèliques eren similars i la millor solució per a cada mostra era una sola població.

Anàlisis d'associació d'un sol SNP de BDNF

Hem realitzat un estudi de control de casos amb TagSNPs que cobreixen tota la regió genòmica de BDNF. Hem genotipat els vuit TagSNP seleccionats en 374 adults espanyols reclutats com a pacients MD i 342 controls. La taula demogràfica i les característiques clíniques es proporcionen a la taula 1.

Taula completa

Hi havia disponibles genotips complets per al 98, 4% dels pacients amb MD i el 95, 5% dels subjectes control. Els genotips per a tots els SNP eren consistents amb l'equilibri de Hardy-Weinberg (HWE; P <0, 01 per χ 2 ) en subjectes control. A la taula 2 es proporcionen genotips i freqüències d’al·lels.

Taula completa

Les freqüències de l’anàlisi d’associació d’un control de casos d’un mateix lloc per als vuit SNP van demostrar que només el SNP rs908867 estava associat moderat al fenotip MD ajustat per sexe covariable ( P = 0, 02). Com TagSNPs també es pot considerar com un conjunt de marcadors relativament independents, vam aplicar la correcció de Bonferroni per a vuit proves independents i l'associació rs908867 no va romandre significativa.

A més, es van realitzar anàlisis exploratòries de control de casos d’un sol lloc, considerant separativament depressius unipolars i bipolars sense detectar associació significativa amb genotips BDNF (dades no mostrades); així mateix, els pacients amb trastorn depressiu recurrent i episodi depressiu únic s’han analitzat per separat i no hem detectat associacions significatives amb cap dels TagSNP (dades no mostrades); degut a la naturalesa exploratòria de les dues darreres anàlisis, no les hem incloses en la correcció de comparacions múltiples.

Com que els medicaments antidepressius i ECT s’han vist constantment per regular els nivells de transcripció de BDNF, hem investigat més l’associació d’aquest SNP modestament positiu (rs908867) amb l’estat de “remissor” i “no remissor” després d’un assaig adequat amb un únic tractament antidepressiu. . L’estudi d’associació no ajustat va revelar valors significatius per a tots, tret del model recesiu d’herència dels cinc models genètics provats, sent el model additiu el que millor s’ajusta a les dades. Així, els pacients heterozigots per l’al·lel A tenen gairebé tres vegades la probabilitat d’aconseguir una remissió clínica completa i gairebé sis vegades si són homozigots (proporció odds (OR) = 2, 95; interval de confiança (CI) 95% = 1, 48–5, 88; P) = 0, 0152). El model ajustat per covariaments clínics va romandre significatiu per a tots els models d’herència testats, tret del model recessiu. Novament, el model additiu va ser el més fort (OR = 2, 95; CI 95% = 1, 48–5, 88; P = 0, 0025) (taula 3). També es va provar, de manera exploratòria, el SNP funcional rs6265 amb aquest fenotip per replicar les troballes anteriors d’altres estudis. 39, 54 No s'ha pogut trobar una implicació significativa d'aquesta variant en el resultat del tractament (dades no mostrades).

Taula completa

Estudi d'associació haplotip BDNF

No hem pogut trobar evidències que un haplotip de TagSNPs BDNF comú estava associat a MD (dades no mostrades). També es va estudiar el mateix fenotip que va donar resultats positius en l’anàlisi d’associació d’un SNP únic (“remitters” vs “no remitters”). Els vuit TagSNP van resoldre set haplotips que es van produir a freqüències de l’1% o més. La distribució general dels haplotips no va ser significativament diferent entre els "remitents" del tractament i els "no remitents" (dades no mostrades). Per perfeccionar la construcció de l’haplotip i identificar una regió central causant, hem utilitzat un mètode de finestra corredissa imparcial per construir haplotips successius i adjacents a través de BDNF en finestres de dos, tres i quatre SNP adjacents. Els resultats de les anàlisis de les finestres corredisses van revelar haplotips marcadors significatius de dos, tres i quatre, que van superar els nivells de significació dels marcadors individuals (taula suplementària 1) i els SNP implicats rs12273363, rs908867 i rs1491850.

A més, es va calcular la regressió del fenotip del resultat del tractament antidepressiu en la combinació d’haplotips d’aquests tres SNP més significatius ajustats per les covariades clíniques esmentades en els mètodes. L'haplotip TAT associat (rs12273363, rs908867 i rs1491850) es va mantenir significatiu després de tots els ajustaments aplicats i els pacients que el porten tenen més de tres probabilitats que els que tenen l'haplotip referent de ser 'remitents' (OR = 2, 71; CI 95% = 1, 30–5, 63) ; P = 0.0078) (Taula 4).

Taula completa

La variant que hem trobat associada significativament al fenotip (rs908867) es troba a 2, 2 kb d'una transversalitat C a A que es produeix a 281 pb aigües amunt del lloc d'inici de transcripció proposat per a l'exó 1. S'ha demostrat l'al·lel de baixa activitat -281. per ser protector contra l’ansietat i la morbilitat psiquiàtrica. 55 Com que aquest SNP no estava genotipat en el projecte HapMap, no es va considerar en la selecció de TagSNPs, però a causa tant del seu efecte funcional com de la proximitat al nostre SNP associat, vam realitzar un assaig pirosecuencial per genotipar aquesta variant (rs28383487) i es va reanalitzar. les nostres dades La freqüència de l’al·lel rar va ser de 0, 8, que és superior a la 0, 03 anteriorment reportada a la població caucàsica. No hem trobat cap evidència d'associació en les anàlisis d'un SNP únic ni tenint en compte el fenotip MD ( P = 0.4) ni considerant els remitents i els fenotips no remissors ( P = 0.1). Pel que fa a les anàlisis de l’haplotip, la finestra important després de la reanàlisi va ser de nou la que contenia els tres SNP anteriors rs12273363, rs908867 i rs1491850 (dades no mostrades).

Finalment, per provar la probabilitat que es repliquin els resultats, es va utilitzar una estratègia de “bootstrap” i es va examinar l’estabilitat dels resultats en nombroses configuracions dels subjectes. Després de 300 conjunts de dades de arrencaments generats a partir de la mostra original, es va seleccionar rs908867 (estadísticament significatiu al nivell significatiu de Bonferroni) amb la freqüència més alta (242 sobre 300).

Discussió

El primer descobriment d’aquest estudi és que cap de les vuit TagSNP, inclosa la variant funcional Val66Met, no estava associada significativament amb el fenotip MD. De fet, la distribució global dels haplotips no va ser significativament diferent entre casos i controls. Això s’està d’acord amb els informes anteriors que no han estat capaços de detectar una associació positiva de BDNF amb pacients amb TDM o MDD. 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 i 40 És interessant destacar que els estudis que han informat associacions positives amb MD han reclutat pacients amb un alt component genètic, com ara antecedents familiars positius de trastorn afectiu 30. o aparició precoç de la malaltia. 29, 41, 43 A més, altres resultats controvertits també es podrien explicar per altres factors com ara els efectes que depenen l'ètnia, la manca de poder estadístic a causa de la mida limitada de la mostra o l'heterogeneïtat clínica.

La principal conclusió d’aquest estudi és que un SNP situat a la regió amunt BDNF 5 ′ està fortament associat a un fenotip que consisteix a aconseguir la remissió clínica completa d’un episodi depressiu major després d’un assaig adequat amb un sol antidepressiu. Dos estudis realitzats en població asiàtica han valorat l'associació d'una variant del gen BDNF (Val66Met; rs6265) i la resposta terapèutica als antidepressius. Un va informar d’una tendència però no va trobar evidència d’una associació significativa, 39 i l’altre va trobar una associació amb eficàcia del citalopram. 54 Les diferències en les freqüències al·lèliques del polimorfisme BDNF Val66Met entre poblacions de diferents orígens ètnics han estat prèviament informades; 56 igualment, les diferències ètniques en la distribució de polimorfismes genètics són molt freqüents i han estat conegudes en el camp farmacogenètic, afectant gens que codifiquen els enzims, els objectius, els receptors i els transportadors de metabolització de fàrmacs. 57 Resulta molt probable, segons els nostres resultats, que la variant Val66Met no estigui directament relacionada amb aquest fenotip a la població caucàsica i que el genotip de variants addicionals properes a l'extrem 5 ′ del gen hauria portat a la detecció de l'associació amb El SNP de rs908867 es presenta aquí a la població caucàsica. Pel que fa a aquest SNP associat, dues idees fan que sigui poc probable que tingui un efecte funcional. D'una banda, el nucleòtid no variant (G) de la seqüència humana no es conserva ni a la rata ni al ratolí. D'altra banda, rs908867 està situat a 229 pb aigües amunt del lloc inicial de transcripció de l'exon 1. Tenint en compte que el promotor putatiu de l'exó 1 està situat a uns 500 pb aigües amunt del lloc inicial d'iniciació, 58, 59, no és probable que això SNP té conseqüències funcionals directes. Malgrat això, i per respondre parcialment a aquesta pregunta, hem utilitzat una eina interactiva d’anàlisi SNP basada en la web (//pupasuite.bioinfo.cipf.es) per predir si el canvi interromp els llocs d’unió de transcripció potencials. El programa no preveia que el lloc rs908867 estés dins d'aquests motius i no es considera que tingués un efecte fenotípic posatiu en l'expressió del gen, indicant així que aquesta variant és representativa de la regió i correlacionada realment amb la veritable variant funcional. . En aquesta línia, hem genotipat un SNP aigües amunt del lloc inicial d’inici de transcripció proposat per a l’exó 1, o en el promotor BDNF que s’ha demostrat que disminueix l’activitat transcripcional del gen. No hem trobat cap prova d'associació a aquest SNP, que indiqui que cal correlacionar amb el fenotip una altra variant causativa encara desconeguda a la regió.

També hem identificat un haplotip associat a aquest fenotip particular (TAT) mitjançant un enfocament de finestra corredissa, que evidencia una associació en una regió compresa entre rs12273363, rs908867 i rs1491850, amb 4, 8 kb i assenyalant una regió situada a 1, 56 i 1 kb de els exons no codificadors BDNF i 1 i 2, respectivament.

Hem de considerar que l’estimació de la freqüència d’haplotips és sempre propensa a un error i, com hem hagut d’inferir haplotips a causa de la incertesa fase, aquests no són veritables haplotips. Primer, l’ús de TagSNPs és un enfocament útil per reduir el nombre de variants a genotipar, però a mesura que optem per estudiar els marcadors més polimòrfics, es descarten aquelles variants que tenen un al·lel poc freqüent, mentre que en realitat poden ser les funcionals. . En segon lloc, malgrat que l’exclusió d’haplotips a baixa freqüència redueix substancialment la probabilitat de falsos positius, els haplotips que falten són més probables per al·lels SNP rars i, per tant, no podem excloure que les mutacions funcionals en haplotips més rares s’associen a aquest fenotip.

Som conscients que l’extensió de la regió que assenyala l’haplotip no és d’avantguarda. La regió genòmica de BDNF està composta per dos blocs de desequilibri d’enllaç (LD). Els SNP que hi ha a la finestra d'associació significativa que mostren la propietat es troben en un LD estret amb altres SNP. Aquests inclouen la variant funcional Val66Met i un polimorfisme de microsatèl·lits situat aproximadament a 1 kb aigües amunt del lloc d’iniciació a la traducció de BDNF, que recentment s’ha demostrat que afecta l’activitat transcripcional. 31 Quan els marcadors estan en perfecte LD, no hi ha cap mitjà estadístic per distingir quin marcador és el veritable funcional. Malgrat això, la finestra corredissa s’assembla a mètodes de cartografia de malalties fines, perquè els haplotips parcials es prediuen amb més precisió per la majoria dels algorismes i donen un suggeriment quantitatiu del senyal observat en un segon pla. Per tant, té un millor poder per detectar associació entre malalties i haplotips curts que els haplotips de tota la regió. D’aquí que, segons els nostres resultats, la regió implicada positivament en la resposta a la teràpia sembla ser estreta i situada a la regió dels 5 ′ del gen. Encara queda clarificar la forma en què l'haplotip identificat a la regió 5 'de BDNF amb la disminució de l'activitat funcional de BDNF, possiblement a través d'una transcripció alterada del promotor 1 de BDNF i que afecti potencialment a l'expressió del pro-BDNF. El requeriment de la regió BDNF de 5 ′ seria necessari per desvincular el substrat genètic del fenotip del resultat del tractament antidepressiu.

Hipòtesis recents han implicat la BDNF en la resposta al tractament antidepressiu. El retard de la resposta terapèutica ha portat a pensar que les adaptacions cel·lulars a les accions agudes dels antidepressius poden produir-se a molts nivells, com ara la regulació dels receptors de neurotransmissors, les cascades de transducció del senyal i la transcripció gènica. 60 Estudis anteriors han informat que el tractament crònic amb grans classes d’antidepressius augmenta l’expressió de BDNF en estructures cerebrals de rata pertanyents a la via meso-cortico-límbica i neurogènesi en l’hipocamp adult; 61, 62 i 63 Curiosament, aquestes regions cerebrals poden ser crucials per a la regulació de l'estat d'ànim. 64 El resultat del nostre estudi se suma a un conjunt de dades creixent que suggereix que BDNF exerceix una activitat antidepressiva. Aquesta visió es mostra fortament recolzada per un informe recent sobre l'eficàcia antidepressiva disminuïda en ratolins condicionals BDNF. 53 Així doncs, les nostres troballes podrien indicar indirectament que el paper de la BDNF en l’eficàcia dels antidepressius es facilitaria en aquells individus que portessin l’haplotip TAT.

No obstant això, a causa de la complexitat de l'MD, és probable que les variants d'un sol gen siguin responsables de la gran variabilitat observada en la resposta a fàrmacs. S'ha demostrat que l'expressió de BDNF podria veure's afectada per alteracions en la producció de cortisol. 65 La hiperactivitat de l'eix hipotalàmic-hipofisari-suprarenal, amb una secreció elevada del factor alliberador de corticotrofina i, posteriorment, cortisol, juntament amb una disminució de la sensibilitat del receptor glucocorticoide i mecanismes de retroaliment pertorbats, s'ha observat de forma fiable en pacients amb MD. 66 D'altra banda, també s'han informat interaccions funcionals entre sistemes serotonèrgics i neurotròfics, tant implicades en la patogènesi com en el tractament de la MD, 67 . 68 A més, s'ha demostrat que els polimorfismes dels receptors corticoides estan relacionats amb el resultat del tractament antidepressiu. 69, 70 A més, en aquest tret han participat variants en els codificadors de gens per a les vies en sistemes monoaminèrgics. 8 Així, pot ser d'interès explorar les interaccions de BDNF, receptors glucocorticoides i polimorfismes de vies monoaminèrgiques en el resultat del tractament antidepressiu.

La força del nostre estudi consisteix en l’ús d’una gran mostra clínicament ben definida i caracteritzada de pacients amb MD, sense cap altra condició psiquiàtrica comòrbida. Les diferències en resposta als fàrmacs antidepressius en episodis depressius principals poden ser degudes a sèries de variables confuses, per la qual cosa hem considerat una àmplia gamma de factors clínics que poden influir en la resposta al tractament (com ara sexe, edat actual, edat al principi, subtipus de depressió en funció del trastorn. polaritat (unipolar vs bipolar), aparició de trets psicòtics durant episodis depressius, gravetat de depressió, nombre d’episodis depressius anteriors i VRF) juntament amb genotips en una anàlisi de regressió, per tal d’estimar al màxim l’efecte ajustat dels SNP. L’estratificació de la població podria ser un factor confús en estudis genètics de control de casos. A causa d’això, vam provar aquesta possibilitat i no es van detectar proves d’estratificació, cosa que suggereix que l’estratificació de la població no introdueix biaix significatiu en les nostres anàlisis.

L’estudi realitzat aquí té, però, algunes limitacions. Primer, la mostra de control no es va seleccionar per a trastorns mentals, però com que els subjectes eren donants de sang als quals no se’ls permet prendre medicació psicotròpica, és poc probable que s’incloguin casos de depressió a la mostra de control. En segon lloc, atès que els individus control són una mostra de donants sanguinis saludables de la població general, no coincideixen en relació amb el sexe i l'edat amb els pacients. Com que la depressió és més freqüent en les dones que en els homes, hem introduït el sexe com a covariada en anàlisis multivariants per evitar aquest factor confús en les anàlisis de control de casos. L’edat de la distribució de la col·lecció diferia entre els casos i els controls, i l’edat mitjana dels controls era substancialment inferior; així, pot ser possible que alguns individus del grup de control desenvolupin trastorns depressius més tard de la vida; tanmateix, no hi ha diferències significatives entre l'edat mitjana dels controls i l'edat mitjana d'inici de la malaltia en els pacients. En tercer lloc, la mostra conté depressius amb episodis recurrents i únics i la barreja d’aquestes condicions pot introduir un biaix en dissenys de control de casos sobre la interpretació del paper d’un factor genètic en l’aparició de malaltia amb el paper en la durada de la malaltia o la tendència a recurrències; no obstant això, hem analitzat tots dos grups per separat a la nostra mostra, sense trobar associació amb genotips BDNF. Finalment, es van obtenir de forma retrospectiva algunes dades clíniques, com l’edat a l’inici del primer episodi afectiu, els episodis anteriors, l’historial de tractaments anteriors i la presència o absència de VRF mitjançant una entrevista directa basada en dades d’autoreportatge i registres mèdics, per la qual cosa un record de biaix. no es pot descartar.

En resum, els resultats aquí reportats no admeten un paper directe de les variants de BDNF en la vulnerabilitat de la MD, però sí que donen suport a la implicació del BDNF en la resposta terapèutica als antidepressius. Els nostres resultats subratllen la importància de realitzar assajos terapèutics farmacogenètics de gran potencial per comprovar el paper de les neurotrofines en la resposta terapèutica en MD i les seves interaccions amb altres gens implicats en l’eficàcia antidepressiva dels medicaments.

Materials i mètodes

Assignatures i avaluació clínica

Per a una avaluació de l’associació entre BDNF i MD, es va fer servir una mostra de pacients no relacionats reclutats consecutivament de la Unitat de Recerca Clínica i Trastorns de l’estat d’ànim del departament de psiquiatria de l’Hospital Universitari de Bellvitge, que tenien un seguiment, amb visites generalment cada 2 mesos. Tots els pacients eren caucasoides d'origen espanyol durant almenys dues generacions. En total, es van investigar 374 pacients i 342 subjectes de control. Els pacients van ser diagnosticats per psiquiatres experimentats mitjançant una entrevista estructurada 71 segons el manual de diagnòstic i estadística de trastorns mentals IV criteris 72 per a trastorns d’ànim (226 trastorn depressiu major unipolar, 148 BD). Els individus de control es van emparellar per grups d’etnicitat procedents de donants de sang contractats al Banc de Sang i Teixits del Servei Català de la Salut.

Els criteris d’inclusió eren haver d’haver requerit tractament antidepressiu per a un episodi depressiu major amb una puntuació mínima de 18 en l’escala de qualificació de Hamilton per a la depressió (HAM-D) i no tenir cap diagnòstic psiquiàtric de tota la vida que no fos el MD. Dos psiquiatres amb experiència que van examinar de forma independent tot el material clínic realitzat amb el reclutament de pacients. En cas de dubte o desacord, un tercer psiquiatre es va implicar en la decisió, que es va aconseguir per consens. Els casos es van reclutar en seccions ambulatòries (42, 5%) i hospitalitzades (57, 5%) de la nostra clínica, que es van fer amb un seguiment a la secció ambulatòria després de l'alta. Es va valorar la gravetat de la depressió mitjançant el 21 ítem HAM-D, 73 i el primer episodi tractat a la nostra clínica, que complia els criteris d’inclusió es va considerar com a índex de l’estudi. Es van obtenir altres variables clíniques com l’edat a l’inici, els episodis anteriors i els tractaments i la presència de VRF mitjançant una entrevista realitzada en persona amb suport de la informació mèdica disponible.

A partir d’estudis anteriors, es van resumir 74 dades sobre la presència o absència d’hipertensió, diabetis mellitus, hipercoleste-rolèmia, fumar cigarretes, fibril·lació auricular i evidència de malaltia vascular en un compost de VRF; la presència de dos o més VRF es va designar com a risc vascular alt i la resta es va caracteritzar com a risc vascular baix.

Es tracta d’un estudi farmacogenètic naturalista i tots els individus van ser tractats segons l’opció del seu psiquiatre. Les persones que van ser ingressades en un medicament antidepressiu únic es van continuar, optimitzant la dosificació si fos necessari, fins a completar almenys 6 setmanes. Els primers pacients van rebre els primers antidepressius al primer intent: fluoxetina 20-40 mg / dia ( n = 130; 34, 8%), paroxetina 20–40 mg / dia ( n = 123; 32, 9%), sertralina 100-200 mg / dia ( n = 39; 10, 4%), citalopram 20-40 mg / dia ( n = 35; 9, 4%) i venlafaxina 150–300 mg / dia ( n = 47; 12, 5%). Els pacients que no van remetre o van empitjorar després de 6 setmanes de tractament van ser tractats segons els requeriments clínics (per exemple, van passar a una altra classe antidepressiva, estratègies d’augment o ECT).

El fenotip del resultat del tractament es va definir segons l'esquema de estadització Thase i Rush que s'ha desenvolupat per avaluar la resistència del tractament antidepressiu. 2, 75 L' avaluació de la resposta al tractament amb aquest mètode ja s'ha utilitzat en estudis anteriors. 76, 77 pacients es van destinar a un dels dos grups següents: els de l’etapa ‘0’ (pacients amb antecedents de remissió clínica sostinguda considerats com HAM-D21 <7 almenys durant 2 mesos després d’episodi depressiu major tractats amb un assaig adequat d’una un antidepressiu únic al primer intent) es van considerar "remeses" i la resta (etapes 1-5) es van considerar "no remeses".

Els grups de revisió ètics dels centres de contractació corresponents van aprovar l’estudi. Tots els subjectes, tant els casos com els controls, van proporcionar el consentiment informat i per escrit.

Càlcul de potència de la mostra

Els càlculs de potència van utilitzar Quanto Version 1.1 78, 79 per determinar que la mostra de control de casos tenia un 92% de potència per detectar un al·lel de risc amb un 10% de freqüència, amb un genotip additiu de risc relatiu de 2, 0.

Selecció TagSNP

A partir del conjunt de dades del projecte HapMap, es van utilitzar genotips de la versió pública 16 (fase I congelació de dades; dbSNP b124) corresponents a les 60 persones del CEPH-30 - tros d’origen europeu (//www.hapmap.org). Per a aquesta fase, en una regió de 87, 2 kb que conté el gen BDNF, el projecte HapMap va genotipar 27 SNP; Només es va considerar per a més anàlisis els SNP amb una ubicació de mapeig única al conjunt NCBI B34 i una freqüència d'al·lel menor (MAF) superior al 10% ( n = 21; una mitjana espacial de 4, 36 kb). En aquest conjunt de dades es van identificar caixes de SNP comuns en LD fort, tal com es defineix per r 2 superior a 0, 85, mitjançant HapMap-LDSelect-Processor, que utilitza el mètode 'LD Select' 80 per processar les dades de format de dump genotip HapMap corresponents al regió locus. Es van seleccionar vuit TagSNP per a la cobertura de totes les papereres: quatre SNP es van localitzar a la regió de 5 aigües amunt (rs12273363, rs908867, rs1491850 i rs1491851), un a la regió de codificació (rs6265, corresponent a la variant funcional Val66Met) i tres a la 3 Regió aigües avall (rs11030096, rs925946 i rs10501087) (figura 1).

Image

El desequilibri d’enllaç (LD) a la regió del gen neurotròfic del factor derivat del cervell (BDNF) obtingut a partir de polimorfismes de nucleòtids únics genotipats de trios CEU disponibles a la publicació pública de HapMap 21 (congelació de dades de fase II; dbSNP b125), segons es determina i visualitzat mitjançant el programa Haploview (//www.broad.mit.edu/mpg/haploview). Les ubicacions de tots els SNP d'etiquetes utilitzats en aquest estudi respecte a l'estructura exònica de BDNF estan indicades i marcades dins de les caselles. Les caselles de color negre indiquen els blocs alts en LD, amb el parell D ′> 0, 8. La mida del bloc i les distàncies de bloqueig estan indicades. BDNF, factor neurotròfic derivat del cervell; LD, desequilibri d’enllaç; SNPs, polimorfismes d’un nucleòtid únic.

Imatge a mida completa

Genotipat

Disseny i mètode SNPlex

Els TagSNPs es van genotipar mitjançant el sistema de genotipat SNPlex. Es van seleccionar els SNP que van aprovar les regles de disseny per al desenvolupament de bons assajos. En el cas del sistema SNPlex, que és un format d’assaig multiplexat, aquests SNP es van barrejar amb altres SNP corresponents a diferents gens que s’estan estudiant al nostre laboratori però no es van considerar en aquesta anàlisi particular. Per al procés de genotipat, hem seguit el protocol del fabricant per a sistemes SNPlex Multiplex Genotyping Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA): 12 μ l de cada mostra d’ADN a 75 ng / μ l es fragmenten bullint a 99 ° C per Es pot deshidratar 10 min i 2 μ l (150 ng) en una placa de 384 pous. Per utilitzar piscines de múltiplex personalitzades (actualment fins a 48 plexes), dissenyades, sintetitzades i formulades pel fabricant, les especificacions del fabricant se segueixen mitjançant fosforilació, lligada d’oligonucleòtids, neteja d’exonucleases, PCR i passos d’hibridació (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Totes les reaccions s'estableixen en un format de 384 pous amb diversos sistemes robòtics. Els assajos de genotipat d'alt rendiment es realitzen a les instal·lacions de genotipat de CeGen, al Node de Barcelona ('Centro Nacional de Genotipado, Genoma España').

Genotipat per a barreges poblacionals

Per detectar l’admissió de la població, es va utilitzar un mètode d’associació estructurat per provar encara més cada conjunt de mostres d’estratificació entre casos i controls. Hem seleccionat 48 SNP anònims sense enllaç derivats d’un panell de 52 SNP informats que eren polimòrfics a les poblacions europees, asiàtiques i africanes, 81 que van ser genotipats pel mètode SNPlex (tal com es descriu a la secció anterior). De les nostres dades, vam retenir per a l'anàlisi només els SNP de HWE amb una taxa de genotipat> 90% i amb un r 2 <0.1. Així, es van utilitzar un total de 45 SNP per a aquestes anàlisis. Hem utilitzat el programa informàtic Structure 82 per intentar identificar grups de persones similars genèticament. Aquest programari implementa un mètode de clusterització basat en models mitjançant marcadors no enllaçats, on s'assumeixen poblacions K , cadascun caracteritzat per un conjunt de freqüències al·lèliques. Després, basant-se en el procés de simulació, s’obté una estimació de la probabilitat de K. Per minimitzar els efectes de biaix a partir de la configuració inicial, establim la longitud de gravació per al procés de simulació inicial a 10 6 i una durada de 10 6 per obtenir estimacions de paràmetres precises. Es va fer servir un model de barreja amb freqüències correlacionades amb cinc valors putatius K (1–5). L'anàlisi es va realitzar tant amb sense informació prèvia de població.

Genotipat addicional de rs28383487

Per a la determinació de la transversió funcional C a A que es produeix a 281 pb aigües amunt del lloc d’inici de transcripció proposat per a l’exó 1, o al promotor BDNF, 55 rs28383487, es va realitzar un assaig pirosecuencial. La PCR es va realitzar en 50 μ l de PCR que contenia 50 ng d'ADN genòmic, 1 × tampó PCR, 10 nmol dNTP, 1 U AmpliTaq Gold, 0, 1 μm MgCl2, 1 pmol de cada primer imprimant endavant i invers i 29, 8 μ l destil·lats H. 2 O. La PCR va començar amb la incubació a 95 ° C durant 9 min i després a 35 cicles repetits de 95 ° C durant 30 s, 60 ° C durant 30 s, 72 ° C durant 30 s, finalitzant després dels cicles amb 10 min a 72 ° C. Els primers que es van utilitzar a la PCR van ser el primer 5'-TAGTCTGCCGGCGCTGAT-primer 'i el primer invers biotinilat 5'-CTGAATTCGGCTCGGGAGAT-3'. A continuació, PyrosequencingTM es va identificar la seqüència de nucleòtids tal com es va descriure, 83 utilitzant el sistema PSQTM 96 amb el kit de reactiu PSQTM 96 SNP segons les instruccions del fabricant (Pyrosequencing AB, Uppsala, Suècia). L'imprimació usada per a la pirosideqüenciació va ser de 5'-AGCAACAAGTTCCCC-3 '.

Anàlisi estadística

Per determinar millor l'efecte real dels SNP en el resultat del tractament antidepressiu, primer vam realitzar una anàlisi de regressió logística que inclou una àmplia gamma de factors clínics: sexe, edat actual, edat al principi, subtipus de depressió basats en la polaritat del trastorn (unipolar vs bipolar), ocurrència. de trets psicòtics durant els episodis depressius, gravetat de depressió (puntuacions HAM-D), nombre d’episodis depressius anteriors i VRF (risc vascular alt vs baix). Utilitzant un procediment pas a pas, es van obtenir les següents variables estadísticament significatives: edat actual, edat a l’inici, depressió unipolar o bipolar i puntuacions de HAM-D. Hem cercat i provat totes les interaccions entre elles mitjançant proves de relació de probabilitats. La interacció entre el subtipus de depressió basada en la polaritat del trastorn i les puntuacions de HAM-D va quedar significativa. Per tant, aquesta interacció també es va afegir al model final.

Cada polimorfisme es va provar en controls per assegurar l’ajustament amb HWE. Per avaluar l'efecte genètic dels SNPs, es van utilitzar mètodes multivariants basats en anàlisis de regressió logística. Es va estimar l’OR brut i el seu CI al 95%. A continuació, hem estimat l’OR ajustat per aquelles variables clíniques que s’han seleccionat en el procediment pas a pas.

Els efectes SNP es van analitzar sota un model codominant (tres genotips separats). També vam encaixar un model dominant (heterozigots agrupats amb els homozigots per l’al·lel rar), un model recessiu (heterozigots agrupats amb els homozigots per l’al·lel comú), un model sobredominant (homozigots agrupats) i un model additiu (tres genotips com a variable quantitativa) . Es va seleccionar el millor model mitjançant el criteri d’informació Akaike. Aquestes anàlisis es van realitzar mitjançant el paquet SNPassoc R. Es va aplicar una correcció de Bonferroni per a vuit proves independents.

Totes les freqüències de l’haplotip es van estimar utilitzant l’algoritme de màxima expectativa (EM) en haplo.stats en el llenguatge de programació R, 85 un marc de regressió lineal generalitzat que incorpora incertesa en fase haplotip inferint una matriu de probabilitat de probabilitats d’haplotip. A més, es va utilitzar una tècnica de finestra corredissa per afinar els senyals potencials de la regió mitjançant el paquet haplo.stats R. La mida de la finestra variava de dos, tres i quatre SNP per proporcionar una avaluació completa dels subconjunts d'haplotip dins del gen. A més, es va utilitzar el procediment de permutació per estimar la importància del millor resultat de les anàlisis de finestra de deslizament de dos, tres i quatre marcadors i es van realitzar mil permutacions en cada anàlisi de permutació.

La robustesa d'aquestes troballes individuals va ser investigada mitjançant una anàlisi de bootstrap. L’enfocament d’arrencada selecciona mostres aleatòries de mida n ( n 1 casos + n 2 controls) extretes del conjunt de dades original. 86 Mitjançant la repetició del procediment de mostreig, es va determinar l’associació entre cadascun dels polimorfismes i el fenotip del resultat del tractament i es va obtenir informació sobre la variabilitat i la validesa de l’estimació del paràmetre. Vam repetir el procediment de selecció en 300 conjunts de dades de arrencament generats a partir de la mostra original i vam informar del nombre de vegades que una associació particular era estadísticament significativa (a nivell significatiu de Bonferroni) entre cada polimorfisme i el fenotip.

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • AF411339

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Taula suplementària 1

    La informació complementària acompanya el document al lloc web de la revista The Pharmacogenomics (//www.nature.com/tpj)