L’expressió cerebral dels gens implicats en la resposta inflamatòria, el ribosoma i l’aprenentatge i la memòria es veu alterada per lipopolisacàrid injectat centralment en els ratolins | la revista farmacogenòmica

L’expressió cerebral dels gens implicats en la resposta inflamatòria, el ribosoma i l’aprenentatge i la memòria es veu alterada per lipopolisacàrid injectat centralment en els ratolins | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

La neuroinflamació té un paper important en la progressió de diversos trastorns neurodegeneratius. Es va utilitzar un model de neuroinflamació per lipopolisacàrid (LPS) per caracteritzar els canvis d’expressió gènica subjacents als efectes inflamatoris i de comportament de la neuroinflamació. Es va administrar una sola injecció intracerebroventricular de LPS (5 μg) al ventricle lateral dels ratolins i, 24 hores després, es va examinar l'expressió gènica a l'escorça cerebral i a l'hipocamp mitjançant la tecnologia microarray. Els termes d’Ontologia gènica (GO) per a la inflamació i el ribosoma es van enriquir significativament amb LPS, mentre que els termes de GO associats a l’aprenentatge i la memòria havien disminuït l’expressió. Es van detectar 224 transcripcions canviades a l'escorça cerebral i 170 a l'hipocamp. L’expressió d’ Egr1 (també coneguda com Zif268 ) i Arc , dos gens associats a l’aprenentatge i a la memòria, era significativament menor a l’escorça, però no a l’hipocamp, d’animals tractats amb LPS. En general, l'expressió alterada d'aquests gens pot estar sota alguns dels efectes inflamatoris i del comportament de la neuroinflamació.

Introducció

La inflamació té un paper important en la defensa de l’organisme contra la infecció, però la sobreactivació de la cascada inflamatòria pot tenir efectes perjudicials. Al sistema nerviós central, es creu que la inflamació s’associa a l’envelliment normal 1 i que contribueix a la progressió de diverses malalties patològiques, inclosa la malaltia d’Alzheimer, la malaltia 2 de Parkinson 3 i l’esclerosi lateral amiotròfica. 4

El lipopolisacàrid (LPS) és un component de la membrana exterior dels bacteris Gram-negatius, i s'utilitza habitualment per induir inflamacions a la perifèria i al sistema nerviós central. Estimula el sistema immune innat a través de les interaccions amb el CD14 i el receptor similar al Toll (TLR4), 5, 6 que s’expressen per la microglia, les cèl·lules immunocompetents primàries del cervell. A l'exposició a LPS, les microglies s'activen i comencen a produir mediadors proinflamatoris com ara citocines, quimiocines, prostanoides i espècies reactives d'oxigen. 7

Tot i que la LPS no és directament tòxica per a les neurones madures, que no expressen TLR4, 8 neurones poden ser danyades indirectament per la microglia activada per LPS. Diversos estudis in vitro han demostrat que exposar cultius mixtos de neurona / glia primària a LPS condueix a la mort neuronal, mentre que no es detecta pèrdua cel·lular significativa en cultius enriquits amb neurones. 9, 10 L’administració aguda de LPS directament al cervell recapitula aquests resultats i condueix a la mort de les neurones a l’hipocamp. D'altra banda, estudis de comportament han demostrat que el reconeixement d'objectes 12 i la memòria espacial 13 es veuen afectats en animals tractats amb dosis úniques de LPS. En línia amb aquests dèficits cognitius, la potenciació a llarg termini (LTP) queda en gran mesura bloquejada després d’injeccions agudes de LPS. 12, 14

En un esforç per caracteritzar els canvis transcripcionals que fonamenten aquests efectes fisiològics i conductuals, es van examinar canvis en l’expressió gènica a l’hipocamp del ratolí i a la còrtex cerebral 24 hores després d’una sola injecció intracerebroventricular (icv) de LPS mitjançant la tecnologia microarray.

Resultats

Comencem la nostra anàlisi filtrant les dades per incloure només sondes amb un senyal fiable. Un total de 9557 gens anotats, seqüències RIKEN i etiquetes de seqüència expressada van passar pel pas de filtració. A continuació, es van normalitzar els valors d’intensitat en brut d’aquest conjunt de dades amb una transformació Z. 15 El fitxer de dades original i els resultats normalitzats filtrats estan disponibles en línia a l'Obn Expression Omnibus (GEO Accession GSE12284). Utilitzant els coeficients Z calculats, es va realitzar una anàlisi de components principals per reduir la dimensionalitat de les dades i permetre la visualització de les relacions entre els perfils d'expressió gènica, tal com es mostra a la figura 1a. El primer component principal (PC1) va separar les mostres per regió cerebral i el segon (PC2) ho va fer a partir del tractament. El primer i el segon components principals van representar el 53, 2 i el 16, 1% de la variació total, respectivament, cosa que indica que la regió cerebral i el tractament són els responsables de la majoria de les diferències d’expressions gèniques entre les mostres. Per quantificar els canvis d’expressió per a cada sonda, vam comparar els coeficients de Z entre el vehicle i els grups de tractament LPS mitjançant l’estadística Z- ratio. 15 Els rajos Z positius indiquen una major expressió respecte al control, i els rajos Z negatius indiquen una expressió reduïda. Una trama que compara hipocamp i còrtex Z- ratios va revelar una correlació significativa entre els canvis en cada regió cerebral ( r 2 = 0, 42, P <0, 0001; Figura 1b).

Image

Patrons d'expressió gènica global. ( a ) L’anàlisi del component principal separa les mostres individuals en quatre grups diferents mitjançant el perfil d’expressió gènica de cada mostra. L’hipocamp i el còrtex mostren patrons únics d’expressió gènica a la línia de base (vehicle) i en resposta al lipopolisacàrid (LPS). El primer component principal (PC1) separa les mostres per regió cerebral i el segon (PC2) ho fa en funció del tractament. Cada punt representa una mostra de teixit independent; vuit animals (LPS, n = 4; vehicle, n = 4) estan representats per dos punts cadascun, un de còrtex i un d’hipocamp. ( b ) La injecció de LPS provoca canvis transcripcionals similars a les dues regions cerebrals. Els canvis d’expressió de totes les 9557 transcripcions que van passar l’etapa de filtració es representen com a criteris Z tant per a l’hipocamp com per a l’escorça cerebral. Hi ha una correlació significativa entre regions ( r 2 = 0, 411, P <0, 0001).

Imatge a mida completa

Per a proporcionar una interpretació funcional d’aquests efectes, vam realitzar una anàlisi de conjunt de gens amb l’anàlisi paramètrica de l’algoritme d’enriquiment de conjunts genètics (PAGE) mitjançant termes de gen Ontology (GO) i conjunts de genes de base de dades moleculars curats (MSigDB). Els termes 16, 17, 18 de GO són ​​llistes de gens classificades per localització cel·lular, rols funcionals i processos biològics 16 que no estan necessàriament codregulades. Per contra, els conjunts de gens MSigDB curats són llistes de gens que s'han demostrat afectats habitualment per malalties humanes o per diverses condicions experimentals. Els nostres resultats van revelar que diversos grups genètics proinflamatoris es van enriquir a les dues regions després de l'administració de LPS (taula 1). Altres conjunts de gens amb una major expressió van incloure Termes de GO per a proteïnes ribosòmiques i reorganització de citoesqueletes d'actina, així com un conjunt de MSigDB que s'havia mostrat anteriorment augmentat en el neocòrtex de ratolí envellit. Un nombre de termes de GO associats amb la funció del sistema nerviós mostraven una expressió reduïda significativament en animals tractats amb LPS. A més, vam trobar que la LPS va provocar la descrelació d’un conjunt de gens que s’ha demostrat que disminueix l’expressió a l’hipocamp de pacients amb malaltia d’Alzheimer. 20

Taula completa

A continuació, vam intentar identificar gens gens afectats per LPS. Utilitzant criteris estrictes, incloent un tall de Z- ració de ± 1, 5 i un valor P <0, 05, es van detectar canvis significatius per a 170 i 224 transcripcions a l’hipocamp i a la còrtex cerebral, respectivament (Taules 2 i 3). Les llistes completes de gens afectats estan disponibles com a dades complementàries (Taules complementàries S1 i S2). Seixanta-quatre es van canviar significativament en ambdues regions cerebrals i totes elles van canviar en la mateixa direcció a la microarray.

Taula completa

Taula completa

Alguns d'aquests gens significativament significatius recapitulen els resultats de la nostra anàlisi de conjunts de gens; els gens que codifiquen les proteïnes ribosòmiques, les proteïnes de fase aguda i les proteïnes de resposta a l'estrès van mostrar una augment significativa de l'expressió, mentre que els associats amb la funció del sistema nerviós, i en particular la neurotransmissió, l'aprenentatge i la memòria, mostraven una expressió reduïda significativament en ambdues regions cerebrals. Són d’interès particular els gens per a la proteïna associada al citoesquelet regulat per l’activitat ( Arc ) i la resposta primerenca al creixement ( Egr1 , també coneguda com Zif268 ), que estan íntimament involucrats en l’aprenentatge i la memòria. 21, 22 Les dades de microarray van indicar que l'expressió de l' arc es va reduir significativament tant en l'hipocamp ( Z -rati = -1, 84) com en l'escorça cerebral ( Z- ració = -5, 52), mentre que Egr1 només es va afectar a la còrtex ( Z- ració = −5.27).

A continuació, vam validar els resultats de microarray amb PCR en temps real utilitzant primers i sondes per a un subconjunt de gens que es van trobar individualment significatius. Aquests gens es van triar en funció de la seva rellevància biològica i pel seu ampli ventall de racions Z positives i negatives. Els canvis d’expressió per al 77% dels gens seleccionats del còrtex es van confirmar amb resultats de PCR i el 54% eren reproduïbles a l’hipocamp (taula 4). Una trama del canvi de plecs que es va avaluar per PCR enfront de la microarray Z -ratio va revelar una relació fortament lineal per a ambdues regions cerebrals (figures 2a i b). Tanmateix, es va demostrar que per PCR un gen, Cxcl12 , es va incrementar un 34% a l'hipocamp tot i tenir un -Rio negatiu ( Z- ratio = −3, 54). La PCR va mostrar una reducció significativa de l’ARNm d’ arc després del LPS a la còrtex, però no hi va haver cap diferència estadísticament significativa en l’hipocamp (Figures 3a i b). De la mateixa manera, l'expressió Egr1 es va reduir significativament a l'escorça, però no a l'hipocamp (Figures 3c i d).

Taula completa

Image

Validació quantitativa de PCR en temps real de les dades de microarray. ( a, b ) Els canvis d’expressió gènica mesurats per PCR en temps real es correlacionen fortament amb els canvis trobats per l’anàlisi de microarrays tant en el còrtex cerebral ( r 2 = 0, 949, P <0, 0001) com en l’hipocamp ( r 2 = 0, 955, P <0, 0001). Com que l'estadística Z -ratio incorpora coeficients de Z normalitzats en log, el logaritme del canvi de plecs, valorat per PCR, s'ha d'utilitzar per calcular la regressió lineal. La forta correlació entre resultats de PCR i dades de microarray indica que els canvis d’expressió observats mitjançant el microarray són reals i reproduïbles amb mètodes més sensibles.

Imatge a mida completa

Image

Canvis d’expressió per a Arc i Egr1 determinats per PCR quantitativa en temps real. ( a - d ) La PCR en temps real va confirmar una baixada significativa de les transcripcions d’ Arc i Egr1 a l’escorça cerebral de ratolins tractats amb lipopolisacàrids (LPS) ( n = 8) en comparació amb el control del vehicle ( n = 7), però no es va produir cap canvi significatiu. que es troba a l’hipocamp. * P <0, 05, ** P <0, 01.

Imatge a mida completa

Discussió

L’objectiu d’aquest estudi era caracteritzar els canvis d’expressió gènica que es produeixen a l’hipocamp i al còrtex cerebral del ratolí en resposta a l’activació directa de la immunitat innata mitjançant LPS injectat centralment. Tot i que estudis anteriors han descrit els efectes de l’administració de LPS perifèrics en el transcriptoma del cervell del ratolí, 23, 24 i un ha descrit els canvis d’expressió gènica que es produeixen a l’hipocamp després d’una injecció central de LPS, 25 nostres són els primers a comparar el gen. perfils d’expressió d’aquestes dues regions cerebrals durant la neuroinflamació aguda. Els nostres resultats revelen que tot i que les dues regions cerebrals tenen perfils d'expressió gènica únics a la línia de base, els canvis d'expressió induïts per LPS són similars tant a l'hipocamp com a l'escorça cerebral. Aquesta conclusió suggereix que, en conjunt, ambdues regions responen de manera similar a la neuroinflamació aguda.

Una interpretació funcional d'aquestes respostes es va proporcionar enquestant els efectes del LPS sobre conjunts de gens predefinits del projecte GO i MSigDB. 16, 17 Diversos termes de GO associats a la inflamació, incloent la resposta inflamatòria, l'activitat de la quimiocina, l'activitat de la citocina, la quimiotaxi dels neutròfils i la quimiotaxi del leucòcit, van ser altament regulats tant en l'hipocamp com en la còrtex després del tractament amb LPS. En ambdues regions, també es va detectar un enriquiment significatiu d'un conjunt de gens que anteriorment es va demostrar que havien augmentat l'expressió en el neocòrtex del ratolí envellit, 19 donant suport a la idea que la inflamació cerebral augmenta durant l'envelliment normal. En general, els resultats de l’anàlisi del conjunt de gens a l’hipocamp i a la còrtex van ser sorprenentment semblants i són indicatius d’una resposta inflamatòria marcada.

També es va augmentar l'expressió de mRNA que codifica proteïnes ribosòmiques a les dues regions a nivell de conjunts de gens i gens individus, cosa que suggereix que el cervell treballa per augmentar la seva capacitat de síntesi de proteïnes. En suport d'aquesta observació, un estudi previ en rates va informar que la infusió crònica de LPS provocava canvis ultraestructurals en neurones d'acord amb la síntesi de proteïna citosòlica deteriorada. Els autors també van assenyalar invaginacions profundes en membranes nuclears que estaven farcides de poliribosomes, que van interpretar com un intent de neurones per compensar la traducció citosòlica deteriorada. La major transcripció de proteïnes ribosòmiques que hem observat donaria suport a aquesta conclusió. Tot i això, com que es coneix que la microglia activada conté reticle endoplasmàtic ric en ribosomes, 26, 27, és possible que l’augment que trobem sigui almenys en part a causa dels canvis transcripcionals que es produeixen a la microglia a mesura que s’activen. Es requerirà més treball per determinar les contribucions individuals de neurones i glia a aquest efecte.

Es van disminuir els termes d’aprenentatge i / o memòria, transmissió sinàptica i migració de neurones tant a l’hipocamp com a l’escorça cerebral, cosa que suggereix que la disfunció neural es produeix a les dues regions com a conseqüència d’una neuroinflamació aguda. De fet, s'ha demostrat que la neuroinflamació induïda per LPS afecta negativament a la neurogènesi, el desnivell de la neurita i la LTP. 12, 28, 29, 30 Són processos importants en el sistema nerviós adult i la seva interrupció probablement contribueix al deteriorament del rendiment cognitiu dels rosegadors tractats amb LPS.

El receptor de l’efrina B1 ( EphB1 ) està implicat en la diferenciació i migració de precursors neuronals a l’hipocamp adult i en la morfogènesi de neurites i espines dendrítiques. 31, 32 Hem observat una expressió reduïda significativament d'aquesta transcripció a les dues regions cerebrals (còrtex cerebral: Z- ració = -2, 45, canvi de plec de PCR = -1, 31; Hipocamp: Z- ració = −2, 53, canvi de plec PCR = -1, 41), i això pot contribuir a la deteriorada neurogènesi i al nombre reduït d'espines dendrítiques observades durant la neuroinflamació. 28, 30, 33

Malgrat les similituds generals dels canvis transcripcionals en l'hipocamp i l'escorça cerebral, els gens de Arc i Egr1 associats a la plasticitat, immediatament primerencs, es van trobar reduïts només en l'escorça cerebral per validació de la PCR. S'ha demostrat que la proteïna de l'arc regula la polimerització d'actina i el tràfic de receptors AMPA a les sinapsis, i Egr1 és un factor de transcripció que regula l'expressió de diversos gens objectiu associats a la plasticitat, inclòs Arc . 21, 34, 35, 36, 37 Ambdós gens es transcriuen ràpidament postsinàpticament seguint estímuls que produeixen aprenentatge comportamental o LTP, i els animals transgènics que no tenen gen presenten memòria deteriorada i LTP debilitats. 21, 22, 38, 39, 40 Tenint en compte la importància de Arc i Egr1 en la memòria, és plausible que la seva expressió reduïda estigui basada en els dèficits de memòria observats en la neuroinflamació. Com a suport d'aquest concepte, s'ha demostrat que un derroc de la traducció de proteïnes d'Arc mediada per antisens afecta el manteniment de la LTP, però no afecta la seva inducció. 41 Hennigan et al. 12 van obtenir resultats similars mitjançant una injecció perifèrica aguda de LPS per induir neuroinflamacions; els autors van observar un deteriorament significatiu en el manteniment del LTP, però no va haver-hi cap canvi en la inducció del LTP. En ambdós estudis, els dèficits en LTP van ser evidents en una hora d'inducció. L' expressió Egr1 reduïda també pot contribuir a deteriorar la memòria induïda per la inflamació; tant les rates tractades amb LPS com els ratolins Egr1 - / - realitzen proves similars en proves de reconeixement d'objectes i no mostren preferència per a objectes nous 24 hores després de l'entrenament. 12, 38 Aquestes sorprenents similituds suggereixen que l'expressió Arc i Egr1 deteriorades poden contribuir als problemes de memòria que es produeixen a conseqüència d'una neuroinflamació. Tanmateix, els gens immediatament primerencs com Arc i Egr1 poden servir de marcadors per a l’activitat neuronal, 21, 40, 42, per la qual cosa també és plausible que la reducció que observem sigui conseqüència d’una disminució de l’activitat neuronal a l’escorça cerebral. De fet, un estudi de Vereker et al. , 14 utilitzant el mateix paradigma que Hennigan, però amb el doble de dosi de LPS, van caracteritzar dèficits importants tant en la inducció com en el manteniment de LTP, que van atribuir a una disminució de l’alliberament de glutamat. Aquests resultats apunten a una disminució de la neurotransmissió excitatòria, cosa que també produiria les reduccions de la transcripció d’ Arc i Egr1 que vam observar. Com que aquests models de neuroinflamació van utilitzar injeccions perifèriques de LPS en rates i vam utilitzar LPS injectat centralment en ratolins, és difícil comparar directament els règims de dosificació; més estudis seran necessaris per determinar si l’alliberament de glutamat també està afectat en el nostre model. També s’hauria de considerar un possible efecte de l’anestèsic utilitzat abans de matar els animals, ja que s’ha demostrat que l’anestèsia general interfereix amb l’expressió de gens neuronals immediatament precoç. 43, 44, 45, 46 S’hauria de realitzar un treball addicional per abordar aquesta possibilitat.

Rosi et al. 47 van relacionar prèviament la inflamació crònica a l’augment de l’expressió de l’ arc a l’hipocamp de rata dorsal després de la infusió de icv crònica de dosis baixes de LPS. Tot i que la tècnica combinada d’ hibridació in situ i de recompte de cèl·lules emprada en el seu estudi és notablement diferent de l’enfocament de microarray i PCR en temps real que vam utilitzar, el contrast entre els seus resultats i els nostres suggereix que la neuroinflamació aguda i crònica pot tenir efectes divergents en Arc , i possiblement Egr1 , transcripció. L'expressió d'aquests dos gens s'ha demostrat reduïda en associació amb plaques β-amiloides en pacients amb AD, models animals de TDA i ratolins envellits. 48, 49 Els nostres resultats indiquen que el component inflamatori de l’Alzheimer i l’envelliment normal poden ser responsables d’aquest efecte. D'acord amb aquesta hipòtesi, el tractament amb la indometacina antiinflamatòria no esteroide restableix el rendiment de la memòria i la LTP en models animals de TDA. No obstant això, no se sap si el tractament antiinflamatori també restableix l'expressió Arc i Egr1 a nivells normals. Els futurs estudis haurien d’investigar aquesta possibilitat.

Els resultats d’aquest estudi indiquen que, en general, els perfils d’expressió gènica de l’hipocamp i de la còrtex cerebral es veuen afectats de manera similar per una neuroinflamació aguda. Tot i això, malgrat la similitud general entre les dues regions cerebrals, es va observar una transcripció reduïda de gens associats a la plasticitat a l'escorça cerebral, però no a l'hipocamp. Els canvis d’expressió gènica que hem caracteritzat contribueixen a la comprensió de la inflamació cerebral i poden ajudar a desenvolupar noves teràpies per a malalties amb un component neuroinflamatori.

Materials i mètodes

Tractament d’animals i teixits

Tots els procediments amb animals es van realitzar sota un protocol d'animals aprovat pel NICHD, de conformitat amb les directrius de NIH per a la cura i l'ús d'animals de laboratori. Els ratolins (de 12 a 15 setmanes d'edat) criats en un fons genètic C57BL / 6 i SV129 / Ola van ser anestesiats amb una ketamina intraperitoneal (ip) (100 mg kg −1 ) i xilazina (10 mg kg −1 ) i es van col·locar sobre una taula estereotàctica (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EUA). Utilitzant una agulla de calibre 33 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, EUA) adherida a una bomba de microsirringa (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA), un vehicle salí esterilitzat (PBS) amb tampó fosfat (5 µl) o LPS ( E) .Serotip 127: B8; 5 μg en 5 μl PBS estèril) es van injectar al ventricle lateral (-2, 3 mm dorsal / ventral, -1, 0 mm lateral i –0, 5 mm anterior / posterior de bregma) a una velocitat d’1, 0 μl min −1, tal com s'ha descrit anteriorment. 11, 33, 51 Vint-i-quatre hores després de la cirurgia, els animals van ser assassinats amb una sobredosi de pentobarbital sòdic (100 mg kg- 1, ip) i immediatament decapitats. Tot i que altres estudis han mostrat un pic en marcadors inflamatoris com interleucina-1β o iNOS a 6 hores després de la injecció sistèmica de LPS, la 52, 53 de dosis de LPS utilitzades en el nostre estudi, quan s’injectaven intracerebroventricularment, van produir un pic en la majoria de marcadors inflamatoris examinats a 24 h en un estudi pilot de temps previ. Aquest punt de temps ens ha demostrat que nosaltres i altres produeixen nivells significatius de marcadors d’estrès neuroinflamatoris i oxidatius quan es mesuren a les 24 h després de la injecció de LPS per icv. 11, 51, 55, 56 L’hipocamp i la còrtex cerebral dels dos hemisferis es van disseccionar ràpidament, es van congelar ràpidament en 2-metilbutà a -60 ° C i es van emmagatzemar a -80 ° C. L’ARN total s’ha extret de mostres d’hipocamp i còrtex mitjançant kits Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini i Midi, respectivament (Qiagen, Valencia, CA, EUA). Es va avaluar la qualitat de l’ARN mitjançant la mesura de la relació A 260/280 . La integritat de l'ARN es va verificar mitjançant la visualització de bandes rRNA ribosomals 28S i 18S, sense presència de frotis, utilitzant un gel d'agarosa desnaturalitzant.

Microarray

Es van utilitzar quatre mostres de cada regió cerebral i grup de tractament. Es va etiquetar una alícuota de 0, 5 μg d’ARN total de cada mostra mitjançant el kit d’amplificació de l’ARN TotalPrep Illumina (Ambion, Austin, TX, EUA). L’ARN es va convertir primer en ADNc monocatenari mitjançant transcripció inversa amb un primer oligo-dT que contenia el promotor de l’RNA T7 polimerasa, i després es va copiar l’ADNc monocatenari per produir molècules d’ADNc de doble cadena. L’ADNc de doble cadena es va utilitzar en una reacció de transcripció in vitro d’ una nit on es va generar i marcar l’ARN monocatenari (ARNc) i marcar-lo incorporant biotina-16-UTP. Es van hibridar un total de 0, 75 μg d'ARNc marcat amb biotina durant 16 h a Sentrix MouseRef-8 Expression BeadChips d'Illumina (Illumina, San Diego, Califòrnia, EUA). Cada BeadChip té 24 000 transcripcions RefSeq ben anotades per mostra amb una redundància aproximada de 30 vegades. Les matrius es van rentar i bloquejar. Es va detectar ARNc biotinilat amb estreptavidina-Cy3 i es va quantificar mitjançant un escàner de sistemes d’anàlisi genètica BeadStation × 500 d’Illumina. Les dades d'imatge es van extreure amb el programari BeadStudio (Illumina).

Anàlisi de dades

Les dades d’expressió es van filtrar per incloure només sondes amb un senyal consistent a cada xip; el valor de tall es va establir en P <0, 02. El conjunt de dades resultant es va analitzar a continuació amb DIANE 6.0, un programa d’anàlisi de microarrays basat en fulls de càlcul. Podeu trobar una visió general de DIANE en línia a //www.grc.nia.nih.gov/branches/rrb/dna/diane_software.pdf. Mitjançant DIANE, es va restar el fons de la intensitat de senyal bruta de cada gen, i els resultats es van normalitzar amb una transformació a escala Z. A continuació, es van analitzar les dades amb anormalitat Z amb l'anàlisi dels components principals. Per determinar els canvis d’expressió gènica causats pels LPS, es van comparar els recorreguts de Z per al vehicle i els grups de tractament LPS mitjançant l’estadística Z -rato: 15

Image

L'anàlisi del conjunt de gens es va realitzar mitjançant l'algoritme PAGE 18 per detectar els termes 16 de GO i els gens MSigDB curats 17 afectats per LPS. A la nostra anàlisi només es van incloure conjunts de gens MSigDB amb més del 30% de representació del conjunt de dades filtrats. Els canvis d’expressió dels gens individuals es van considerar significatius si van complir quatre criteris: Z- ració superior a 1, 5 o inferior a -1, 5; taxa de detecció falsa 57 de menys de 0, 30; una estadística de valor P per a la replicabilitat de l'escala Z per sota de 0, 05; i una intensitat de senyal de correcció mitjana de fons superior a zero.

Reacció quantitativa en cadena de la polimerasa en temps real

Els resultats de Microarray es van validar mitjançant PCR quantitativa en temps real, tal com s’ha descrit anteriorment. 51, 58 A més de les mostres utilitzades per al microarray, hem afegit 3 i 4 ratolins per al vehicle ( n = 7 total) i el grup de tractament LPS ( n = 8), respectivament. S'han utilitzat els assaigs d'expressió de gen TaqMan següents (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA): Adcy8 (Mm00507722_m1), Apod (Mm00431817_m1), Arc (Mm00479619_g1), Ccl12 (Mm01617100_m1), Cxcl12 (Mm0016m_M1) Ephb1 (Mm00557961_m1), Gabra1 (Mm00439040_m1), Gpx1 (Mm00656767_g1), Grm5 (Mm00690332_m1), Mtap1b (Mm00485261_m1), Neurod2 (Mm004404, Mm1) Es va demostrar que Pgk1 (Mm00435617_m1) no canviava si es comparaven els valors del cicle llindar ( C T ) tant per als grups de tractament del vehicle com per als LPS, i per tant es va utilitzar com a control endogen. L’anàlisi estadística es va realitzar calculant la diferència de cicle llindar (Δ C T ) entre un gen objectiu determinat i Pgk1, i després comparant els valors de Δ C T entre el vehicle ( n = 7) i el grup LPS ( n = 8) de tractament amb T -test de l'alumne. L’expressió relativa dels gens objectiu es va calcular mitjançant el mètode ΔΔ C T. 59

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • GSE12284

Informació complementària

Fitxers Excel

  1. 1.

    Taula suplementària S1

  2. 2

    Taula complementària S2

    Dualitat d’interès

    Cap declarat.

    La informació complementària acompanya el document al lloc web de la revista The Pharmacogenomics (//www.nature.com/tpj)