Les cèl·lules mare del càncer de mama es basen en la glicòlisi fermentativa i són sensibles al tractament amb 2-desoxiglucosa | mort i malaltia cel·lular

Les cèl·lules mare del càncer de mama es basen en la glicòlisi fermentativa i són sensibles al tractament amb 2-desoxiglucosa | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Càncer de pulmó
  • Metabolisme del càncer
  • Cèl·lules mare càncer
  • Teràpia combinada amb fàrmacs

Resum

Diversos estudis suggereixen que les cèl·lules mare del càncer són essencials per al creixement del tumor, i que el no objectiu d’aquestes cèl·lules pot produir una recaiguda del tumor. Com que s'ha demostrat que aquesta població de cèl·lules és resistent a la radiació i a la quimioteràpia, és fonamental comprendre la seva biologia i identificar nous enfocaments terapèutics. Orientar el metabolisme del càncer és una estratègia alternativa alternativa per contrarestar el creixement i la recurrència del tumor. Aquí es va aplicar una anàlisi proteòmica i metabolòmica dirigida per assenyalar les principals diferències metabòliques entre les cèl·lules de càncer de mama cultivades com a esferes i així enriquir-se en cèl·lules mare de càncer, es van comparar amb les mateixes cèl·lules cultivades en condicions diferenciadores adherides. Aquest enfocament integrat ens va permetre identificar un fenotip metabòlic associat a la condició semblant a la tija i demostra que les cèl·lules mare del càncer de mama (BCSCs) passen de la fosforilació oxidativa mitocondrial cap a la glicòlisi fermentativa. La validació funcional de les dades metabòliques i metabòliques proporciona evidències per a l’augment d’activitats d’enzims clau de la sort de la glucosa anaeròbica com ara la pirofin kinasa M2, la lactato deshidrogenasa i la glucosa 6-fosfat deshidrogenasa en les cèl·lules mare del càncer, així com un estat redox diferent. A més, es demostra que el tractament amb 2-desoxiglucosa, un conegut inhibidor de la glicòlisi, inhibeix la proliferació de BCSC quan s’utilitza sol i mostra un efecte sinèrgic quan s’utilitza en combinació amb doxorubicina. En conclusió, suggerim que la inhibició de la glicòlisi pot ser una estratègia potencialment eficaç per orientar els BCSC.

Principal

Un dels principals problemes en la teràpia del tumor de mama és la recaiguda a llarg termini. Això es pot explicar en part per l’erradicació d’un subconjunt de cèl·lules del tumor que aleshores són capaces de sostenir el creixement del tumor. Aquestes cèl·lules comparteixen diverses característiques amb les cèl·lules mare i per això s’han anomenat cèl·lules mare del càncer (CSCs). Els CSC s’han aïllat d’una varietat de tumors sòlids, inclòs el càncer de mama 1 i semblen tenir un paper tant en la resistència al tractament com en la formació de metàstasi. 2 De fet, els CSC presenten diversos mecanismes intrínsecs de resistència a fàrmacs antitumorals convencionals i radioteràpia, com la sobreexpressió de transportadors de medicaments adenosins trifosfat (ATP) que uneixen transportadors de cassettes (ABC), l’activació de les vies de supervivència, l’augment de la producció de factors antipoptòtics, les defenses més elevades. contra l'estrès oxidatiu i la reparació eficient del dany de l'ADN. Per tant, el desenvolupament i la validació de noves estratègies terapèutiques dirigides a les CSC són urgentment necessàries per millorar els resultats clínics.

Recentment, l’interès per estudiar el metabolisme del càncer i l’anomenat efecte Warburg ha crescut ja que l’orientació de vies metabòliques específiques pot ser un enfoc prometedor de la teràpia contra el càncer. L’ efecte Warburg 4, 5 defineix la dependència del càncer de la glicòlisi fermentativa permetent el desviament de metabòlits clau cap a vies biosintètiques cel·lulars en cèl·lules canceroses en proliferació, 6 inclosa CSC, i s’ha suggerit que es pot explotar per desenvolupar nous tractaments farmacològics que puguin contrarestar els quimioresistència d’aquestes cèl·lules. 7, 8

També s'ha suggerit que els canvis metabòlics poden tenir un paper causant en induir diferents estats fenotípics de cèl·lules canceroses. Com a exemple, Dong et al. 9 han demostrat que el silenciament de l’enzim gluconeogènic fructosa-1, 6-bifosfatasa que activa la glicòlisi fermentativa resulta en un fenotip semblant a una tija. Malgrat la seva importància, encara es desconeixen en gran mesura les característiques metabòliques dels CSC. Recentment, s'ha demostrat que els CSC aïllats de diversos tumors sòlids mostren una alteració significativa del metabolisme energètic i són més glicolítics en comparació amb cèl·lules tumorals més diferenciades 10, 11, 12, 13 o cèl·lules mare normals. 14 Tot i això, aquest és encara un tema controvertit ja que estudis anteriors han demostrat que els CSC són menys glicolítics que els diferenciats. 15

Aquí, mitjançant un enfocament proteòmic integrat i metabolòmic dirigit, mostrem que el metabolisme de les cèl·lules mare de càncer de mama (BCSC) cultivades com a esferes està fortament lligat a la glicòlisi fermentativa en comparació amb les mateixes cèl·lules cultivades en condicions diferenciadores adherides (cèl·lules adherides derivades de esferoides ( SDACs)). A partir d’aquestes evidències, es va intentar provar l’efecte d’un inhibidor glicolític ben caracteritzat, 2-desoxi-D-glucosa (2-DG), 16, 17 sol o en combinació amb la doxorubicina quimioterapèutica àmpliament utilitzada (Doxo) sobre el creixement i la proliferació de BCSCs. Els nostres resultats indiquen que els BCSC són altament sensibles als 2-DG que també mostren un efecte sinèrgic amb el tractament amb Doxo.

Resultats

L’anàlisi de proteòmica diferencial indica un canvi cap al metabolisme fermentatiu de la glucosa a les esferes BCSC

En aquest estudi, hem analitzat els perfils d’expressió de proteïnes diferencials de BCSCs i SDACs. Com es va informar anteriorment, 18, el model in vitro adoptat per a cèl·lules diferenciades, convencionalment informat com a SDAC, es basa en cèl·lules esfèriques cultivades en el medi d'àguila modificat (DMEM) de Dulbecco complementat amb un sèrum boví fetal (FBS) del 10% en condicions adherides. Aquestes cèl·lules expressen nivells més elevats de cluster de diferenciació 24 (CD24) tal com s’esperava per als SDAC (figura suplementària S1). 19, 20

En comparació amb l'enfocament proteòmic en electroforesi de gel (GC-MS) de gel, l'espectrometria de massa en tàndem de cromatografia líquida sense etiquetes (LC-MS / MS) proporciona un alt i baix mètode analític costós per a la caracterització de barreges complexes de proteïnes amb una sensibilitat adequada i repetibilitat. Es va avaluar la identificació, quantificació i qualitat de les proteïnes dels clústers de temps de retenció de massa exactes (EMRTs), que són les espècies de masses registrades associades a les seves masses exactes i als seus temps de retenció. Es van determinar un total de 39 379 i 39 379 EMRT per a la comparació de BCSC cultivats com a esferes enfront de SDAC durant 3, 5 i 7 dies, respectivament. Per a cada condició de rèplica, la distribució de l’error de massa va ser inferior a 15 ppm (les figures 1a, d i g per a BCSCs i SDAC recollides després de 3, 5 dies i 7 dies, respectivament), el coeficient d’intensitat de variació expressat en percentatge (% CV intensitat) tenia una distribució gaussiana amb tots els valors <4, 5% (figures 1b, e i h per a BCSCs i SDAC recollits després de 3, 5 dies i 7 dies, respectivament) i el coeficient de variació del temps de retenció expressat en percentatge (% CV RT) va ser <10% ( Les figures 1c, f i i de BCSCs, SDAC recollides després de 3, 5 dies i 7 dies, respectivament) amb la majoria de les espècies <5%. Aplicant els criteris més estrictes d’identificació i quantificació de proteïnes descrits en els Materials i Mètodes, es van identificar 54 i 28 proteïnes expressades diferencialment en BCSCs en comparació amb les SDAC recollides després de 3, 5 i 7 dies en condicions de diferenciació. Les llistes de proteïnes diferencials es mostren a les taules suplementàries S1 i S2, mentre que els detalls de les identificacions de pèptids es troben a les taules suplementàries S3 i S4.

Image

Avaluació de la qualitat de les dades, anàlisi de Venn i proporcions d'expressió per a proteïnes regulades significativament en BCSCs en comparació amb SDACs. Es va valorar la reproductibilitat analítica dels espectres de masses en BCSCs i es va permetre que les cèl·lules es diferencien com a SDAC durant 3, 5 i 7 dies. Els gràfics de barres mostren la desviació estàndard de massa relativa (RSD) i els coeficients d’intensitat i temps de retenció de variació (% CV) dels clústers de temps de retenció de massa exactes detectats en BCSCs ( a, b, c ) i SDACs recollits a 3, 5 dies ( d, e, f ) i 7 dies ( g, h, i ) post-diferenciació (pd). ( j ) L'anàlisi del diagrama de Venn a quatre bandes de proteïnes expressades de manera diferent identifica 15 loci. Els nombres entre parèntesis representen el nombre total de proteïnes identificades agrupades en cada lloc. Les BCSC en comparació amb les SDAC de 3, 5 dies pd mostren 25 i 5 proteïnes específicament regulades i baixades, respectivament; Els BCSC mostren 4 proteïnes regulades en comparació amb les SDACs 7 dies pd; Els BCSC mostren 19 i 5 proteïnes regulades i baixades, respectivament en comparació amb les SDAC, independentment del temps de diferenciació. A la taula es mostren els números d’adhesió Swiss-Prot (vegeu les taules suplementàries S1 i S2 per a una descripció detallada). L'anàlisi es va realitzar mitjançant el generador de quatre diagrames de Venn, lliurement disponible a //www.pangloss.com/seidel/Protocols/venn4.cgi. ( k ) El gràfic de barres mostra les relacions de nivell d'expressió de proteïnes mitjanes ( n = 3) de 19 i 5 proteïnes regulades amunt i baixades, respectivament en BCSCs en comparació amb les SDAC, independentment del temps de diferenciació. La línia vermella indica la relació d'expressió = 1

Imatge a mida completa

L'anàlisi de Venn (Figura 1j) demostra que es van regular a 19 proteïnes en les esferes en comparació amb els dos punts de diferenciació, mentre que 5 es van regular en les mateixes condicions experimentals. Curiosament, els nivells d’expressió d’aquestes proteïnes no van canviar entre 3, 5 i 7 dies en condicions adherides (figura 1k), cosa que suggereix que les diferències estaven estrictament relacionades amb la condició semblant a la tija. Per tant, vam decidir utilitzar els SDAC recollits després de 3, 5 dies en condicions adherides per a tots els estudis posteriors, centrant-nos així en els primers canvis entre la condició de BCSC i SDAC.

L’anàlisi bioinformàtica d’aquestes proteïnes expressades de manera diferenciada va identificar dues xarxes proteïnes superposades importants relacionades amb les malalties hematològiques, immunològiques i inflamatòries (puntuació = 62) i la via d’excavació i càncer de radicals lliures (puntuació = 3) (figures 2a i b). L'anàlisi funcional basada en termes de GO va indicar que diverses de les proteïnes expressades de manera diferent estan estrictament relacionades amb la glicòlisi ( P = 3 × 10 −13 ) i la gluconeogènesi ( P = 2 × 10 −8 ) (figura 2c). En particular, l’augment dels nivells d’expressió d’enzims clau de la glicòlisi fermentativa com ara el piruvat quinasa M2 (PKM2) i la lactat deshidrogenasa A (LDH-A) en esferes en comparació amb les SDAC poden indicar que les esferes metabolitzen essencialment la glucosa per una via no oxidativa fins i tot condicions normòxiques. Aquesta hipòtesi està en línia amb la subregulació reportada del factor 1 α inductible per la hipòxia (HIF-1 α ) en CSC 12, 21 i amb l'activació prevista de la via depenent de HIF-1 α segons es suggereix (sc- z = 2.791) per la més alta expressió en BCSC en comparació amb les SDAC de diverses proteïnes implicades en aquesta via com ara la triosa-fosfat isomerasa 1, el fosfoglicerrat quinasa 1, la galectina 1, la LDH-A, la proteïna de xoc tèrmic 70-kDa, la gliceraldeida 3-fosfat deshidrogenasa, l'enolasa 1, i aldolasa A. De fet, una anàlisi de Western blotting (WB) confirma que els BCSCs expressen nivells més alts de HIF-1 α en comparació amb SDACs (Figura 2d).

Image

L’anàlisi funcional i proteïna de la xarxa indica una major activitat glicolítica i l’activació de la via HIF-1 α en BCSCs. Ruta de la ingenuïtat L’anàlisi de proteïnes expressades de manera diferenciada en BCSCs en comparació amb els SDACs produeix dues xarxes d’interacció relacionades amb ( a ) les malalties hematològiques, immunològiques i inflamatòries i ( b ) la via d’excavació i càncer de radicals lliures. Els diagrames mostren gens enfocats (les proteïnes expressades de manera diferent) que es mostren en verd (regulat per sota) o en vermell (regulat). Les línies sòlides i guionades indiquen les interaccions directes i indirectes, respectivament, i les fletxes indiquen el rol modulador de les proteïnes o productes químics endògens. ( c ) Les vies canòniques associades als BCSCs són la glicòlisi, la gluconeogènesi i la degradació de radicals superòxid. L'anàlisi de la via funcional es va realitzar mitjançant l'eina Angenuity Pathway Analysis per a les proteïnes regulades significativament en BCSCs en comparació amb les SDAC. El gràfic de barres mostra les puntuacions (−log 10 P ) associades a les vies enriquides amb proteïnes regulades segons es determina mitjançant la prova exacta de Fisher de cua dreta amb el llindar <0, 050. La línia groga indica la relació calculada com el nombre de proteïnes d'una ruta determinada que compleixen els criteris de tall ( P = 0, 050) dividits pel nombre total de molècules que formen aquesta via. ( d ) Els BCSC regulen el HIF-1 α normòxic. WB es va avaluar els extractes nuclears de WIF-1 α i laminina β per WB. El WB demostra que el nivell d’expressió HIF-1 α disminueix significativament en les cèl·lules que es permeten diferenciar-se com a SDAC durant 3, 5 dies.

Imatge a mida completa

La metabolòmica dirigida mostra una taxa de fermentació làctica més gran i la inhibició de l’oxidació beta de l’àcid gras (FA) en BCSCs

Per tal de verificar si els BCSC eren més glicolítics quan es cultivaven com esferoides que quan es cultiven com a SDACs, es va realitzar una anàlisi metabòmica dirigida dels intermedis de glicòlisi. Vam trobar que els nivells de fructosa 1, 6-difosfat, piruvat, àcid làctic i 5-fosfat de ribosa eren significativament més elevats en els BCSC (figura 3a, taula complementària S5). A més, no hem trobat diferències significatives en les concentracions d’intermedis del cicle de Krebs amb l’excepció de l’àcid succínic, que era significativament superior en els BCSC (figura 3a, taula suplementària S5) i l’àcid fumàric, que era més elevat en els BCSC, però la diferència amb Els SDAC no eren estadísticament significatius (mitjana ± SD = 1995 ± 257 i 1233 ± 638 ng / mg 1 en BCSCs i cèl·lules diferenciades, respectivament; P = 0, 204).

Image

La metabolòmica dirigida revela alteracions significatives d’intermedis glicolítics, aminoàcids no essencials derivats de la glucosa, carnitina lliure i AcCs, cosa que suggereix un augment de la fermentació làctica i la inhibició de la FAoxidació en BCSCs. Els gràfics de barres mostren les concentracions mitjanes de ( a ) intermedis glicolítics i del cicle Krebs i ( b ) aminoàcids i carnitina lliure en BCSCs i SDACs. A la taula complementària S5 es troben els resultats de l’anàlisi metabolòmica dirigida. Les diferències que es mostren en els gràfics de barres són totes significatives (test t de dues cues, P <0, 050). Les concentracions s’expressen en ng / mg (pes humit). Les barres mostren el valor mitjà ± SD ( n = 6)

Imatge a mida completa

Les dades també indiquen alteracions rellevants de perfils d’acilcarnitines (AcCs) i aminoàcids (AA) en BCSCs. Les concentracions de valina (Val), ornitina, fenilalanina, arginina (Arg), tirosina, serina, histidina (His), prolina, glicina (Gly) i lisina / glutamina van augmentar en BCSCs en comparació amb SDACs (Figura 3b; Taula complementària S5). Tant Lys com Gln són indistinguibles per LC-MS / MS i hem pogut valorar la seva concentració global. En canvi, l’alanina (Ala) va disminuir significativament en els BCSC comparat amb els SDAC (Figura 3b; Taula suplementària S5).

Cal destacar un nivell inferior significatiu de carnitina lliure a les esferes en comparació amb els SDAC (Figura 3b, Taula suplementària S5), cosa que suggereix la inhibició de la síntesi dels AcCs i finalment de l’oxidació beta de FA. Consistentment amb aquesta hipòtesi, els ACC de cadena curta, mitjana i llarga eren indetectables als BCSC. En canvi, els ACC eren tots quantificables en SDACs (taula suplementària S5).

Els BCSC mostren una major activitat dels enzims clau del metabolisme anaeròbic de la glucosa

També vam validar el nivell d’expressió de PKM2 i LDH-A, enzim clau de la glicòlisi aeròbica, mitjançant l’anàlisi de WB d’extractes proteics recollits de BCSCs i SDACs. Vam confirmar que el PKM2 i el LDH-A estaven regulats significativament en els BCSC comparat amb els SDAC (Figura 4a, P = 0, 008 i 0, 034, respectivament; n = 3). A més, els BCSC van mostrar un augment de PK (mitjana ± SD = 2, 5 ± 0, 7 i 1, 0 ± 0, 2 μ mol / mg Proteïna / min en BCSCs i SDACs, respectivament; P = 0, 0001; n = 6) i LDH-A (mitjana ± SD = 2, 0 ± 0, 8 i 1, 3 ± 0, 1 μ mol / mg Proteïna / min en BCSCs i SDACs, respectivament; activitat P = 0, 044; n = 6) (figures 4b i c).

Image

Els nivells d’expressió i les activitats dels enzims glicolítics s’incrementen en BCSCs i es correlacionen amb l’energia alterada i l’estat redox dels BCSCs. ( a ) WB que mostra l'expressió PKM2, LDH-A i G6PDH en BCSC comparat amb els SDAC. La β- L’actina s’utilitza com a control de càrrega de proteïnes. Es mostra un WB representatiu de tres experiments independents. ( b ) PK i ( c ) LDH, i activitats enzimàtiques avaluades en esferes (BCSCs) en comparació amb cèl·lules diferenciades (SDACs). Els gràfics de barres mostren l’activitat mitjana ( n = 6) expressada en μ mol / mg Proteïna / min, i les barres representen el SEM ( d ) WB que mostra l’expressió de PKM2 i LDH-A en cèl·lules ordenades per a l’expressió CD24. β- L’actina s’utilitza com a control de càrrega. ( e ) PK i ( f ) activitat LDH en CD24 - / cèl·lules baixes en comparació amb CD24 + BCSCs. Els gràfics de barres mostren l’activitat mitjana ( n = 6) expressada en μ mol / mg Proteïna / min, i les barres representen l’activitat enzimàtica S6 ( g ) G6PDH avaluada en esferes (BCSCs) en comparació amb cèl·lules diferenciades (SDACs). Els gràfics de barres mostren l’activitat mitjana ( n = 6) expressada en μ mol / mg Proteïna / min, i les barres representen la SEM ( h ) NADP + / NADPH, ( i ) NAD + / NADH i ( j ) les proporcions ADP / ATP. a BCSC comparat amb els SDAC. El tractament amb rotenona no afecta la producció d’ATP en BCSC, mentre que augmenta fortament la relació ADP / ATP i inhibeix la producció d’ATP mitocondrial en SDACs. No s’observen canvis en la relació ADP / ATP als BCSCs i SDACs després de l’addició del dimetilsulfosxid (DMSO) utilitzat solament com a control del vehicle. Les barres mostren el valor mitjà ± SD ( n = 3). * P <0, 050 (test de dos cues no aparellat o ANOVA de dos factors)

Imatge a mida completa

Per tal de confirmar que les diferències metabòliques observades es deuen, efectivament, a diferències entre CSCs i cèl·lules canceroses més diferenciades, vam ordenar cèl·lules baixes CD24 - / dins del cultiu de l’esfera, que se suposa que són les cèl·lules més diferenciades de tipus mare, i les vam comparar amb una població més diferenciada que expressa nivells més alts de CD24. Es van avaluar els nivells d’expressió i les activitats enzimàtiques de LDH i PK a CD24 - / low i CD24 + BCSCs. D'acord amb un fenotip més glicolític, les cèl·lules CD24 - / baixes mostren nivells més alts (figura 4d) i activitats de PK (mitjana ± SD = 19, 2 ± 0, 3 i 2, 0 ± 0, 4 μ mol / mg proteïna / min en CD24 - / baixa i CD24 + cèl·lules, respectivament; P = 6 × 10 -13 ; n = 6) i LDH (mitjana ± SD = 3, 6 ± 0, 3 i 2, 5 ± 0, 5 μ mol / mg Proteïna / min en cèl·lules CD24 - / baixa i CD24 +, respectivament; P = 0, 002; n = 6) (figures 4e i f) en comparació amb les cèl·lules CD24 + .

La glucosa 6-fosfat deshidrogenasa (G6PDH) és l’enzim clau de la via de fosfat de pentosa, el procés metabòlic que proporciona NADPH a les cèl·lules necessàries per a vies anabòliques. Les nostres dades proteòmiques també mostren que G6PDH està més expressat en BCSCs, tot i que la diferència amb els SDAC no és estadísticament significativa (dades no mostrades). De fet, mitjançant l'anàlisi de WB, es demostra que G6PDH està regulat en esferes en comparació amb SDACs ( P = 0, 036; n = 3; Figura 4a), i la seva activitat augmenta significativament (mitjana ± SD = 2, 3 ± 0, 8 i 1, 2 ± 0, 3 μ mol / mg Proteïna / min en BCSCs i cèl·lules diferenciades, respectivament; P = 0, 004; n = 6; Figura 4g). Segons l'increment de l'expressió i l'activitat de G6PDH, es va trobar una disminució de la proporció NADP + / NADPH en esferes (mitjana ± SD = 0, 94 ± 0, 05 i 1, 063 ± 0, 004 en BCSCs i SDACs, respectivament; P = 0, 013, figura 4h). Aquests resultats suggereixen un augment de la biosíntesi de NADPH per la via del fosfat de pentosa en BCSCs en comparació amb els SDAC.

Els BCSC mostren un augment de consum de dinucleòtids (NADH) de nicotinamida reduïda i producció de ATP citosòlic

Els índexs d’adenosina difosfat (ADP) / ATP i NAD + / NADH són índexs de metabolisme energètic aeròbic o anaerobi, facturació d’energia cel·lular i estat cel·lular redox. Vam trobar que les proporcions NAD + / NADH són significativament més elevades en BCSCs en comparació amb SDAC (mitjana ± SD = 11, 9 ± 0, 6 i 6, 7 ± 0, 3 en BCSCs i cèl·lules diferenciades, respectivament; P = 2 × 10 −4, figura 4i). Això està associat a l’augment del consum de NADH i la disminució de la producció de NAD + a BCSCs. De fet, les concentracions de NADH (mitjana ± SD = 0, 06 ± 0, 04 i 0, 13 ± 0, 02 μ mol / l en BCSCs i SDACs, respectivament; P = 0, 050), així com els nivells de NAD + (mitjana ± SD = 0, 73 ± 0, 04 i 0, 88 ± 0, 07 μ mol / l en BCSCs i SDAC, respectivament; P = 0, 045) disminució significativa en BCSCs en comparació amb SDACs.

Els BCSC també mostren un augment de la relació ADP / ATP (mitjana ± SD = 0, 23 ± 0, 03 i 0, 15 ± 0, 06 en BCSCs i cèl·lules diferenciades, respectivament; P = 0, 016, figura 4j).

Cal destacar que el tractament amb rotenona, agent de desconnexió de la cadena de transport d’electrons (ETC), augmenta la relació ADP / ATP en SDACs (mitjana ± SD = 0, 13 ± 0, 02 i 0, 247 ± 0, 006 per al control i SDAC tractats amb rotenona, respectivament; P = 0, 001), mentre que no té cap efecte sobre la producció d’ATP en BCSCs (mitjana ± SD = 0, 21 ± 0, 02 i 0, 20 ± 0, 01 per al control i BCSC tractats amb rotenona, respectivament; P = 0, 732). Aquests descobriments suggereixen que el desacoblament de ETC inhibeix notablement la producció d’ATP en SDACs, però no en BCSCs que es basen en la fermentació làctica (Figura 4j).

El 2-desoxiglucosa (2-DG) inhibeix el creixement i la supervivència dels BCSC

En general, les nostres dades indiquen que els BCSC mostren un fenotip metabòlic anaeròbic en comparació amb els SDAC. Per tant, vam provar l'efecte, en el creixement i la supervivència dels BCSC, del 2-DG, un compost conegut per inhibir la primera fase de la glicòlisi, sol o en combinació amb Doxo, un agent quimioterapèutic utilitzat per al tractament del càncer de mama.

Els nostres resultats mostren que Doxo exerceix un efecte citostàtic sobre els BCSC, però un efecte tòxic molt modest, si n’hi ha, (figures 5a i b). Sobretot, els BCSC es van bloquejar substancialment en la fase G2 del cicle cel·lular (dades no mostrades). En canvi, 2-DG proporciona un efecte citotòxic depenent del temps significatiu que indueix fins a un 44% d'apoptosi després de 48 h de tractament (figura 5b).

Image

El 2-DG indueix l’apoptosi de BCSCs i el seu efecte s’incrementa amb la combinació amb doxorubicina. ( a ) Els BCSC es tracten amb doxorubicina (Doxo) i 2-desoxiglicosa (2-DG) sols o amb la combinació de Doxo i 2-DG (Doxo + 2-DG). El tractament amb Doxo proporciona efectes citostàtics, però el recompte de cèl·lules no varia significativament les 24 i les 48 h després de l'administració de Doxo (test post-hoc LSD de Fischer, P = 0, 768). En canvi, el tractament amb 2-DG solament disminueix el nombre de BCSC comparat amb el control, 24 h (test post-hoc de Fischer, P = 0, 055) i 48 h ( P = 8 × 10 −4 ) tractament amb Doxo. El tractament amb Doxo + 2-DG disminueix significativament el nombre de cèl·lules en comparació amb les 24 h ( P = 0, 0009) i les 48 h ( P = 1 × 10 −6 ) El tractament amb Doxo i el tractament amb 48 hores només amb 2-DG (test post-hoc de Fischer, P = 0, 002). Valoració de l’apoptosi en ( b ) BCSCs i ( c ) SDAC tractats durant 48 h amb 2-DG, Doxo, o una combinació dels dos. Es mostra el percentatge d’esdeveniments hipo-diploides avaluats per Citometria de Flux després de la tinció de iòdur de propidi

Imatge a mida completa

Curiosament, la combinació de 2-DG amb Doxo dóna lloc a un efecte citotòxic més elevat en comparació amb el tractament amb Doxo sol o amb 2-DG sols després de 2 dies assolint el 80% d’apoptosi després de 48 hores (Figura 5b). Com era d'esperar, les cèl·lules més diferenciades tenen una resposta més a Doxo; tot i així semblen menys sensibles a les 2-DG que les BCSC (figura 5c). Això està en línia amb un metabolisme menys glicolític. Una vegada més, el tractament combinat dóna lloc a una resposta molt més alta també en SDACs (Figura 5c).

Discussió

Les proves creixents mostren que un conjunt de cèl·lules canceroses, conegudes com CSC, són els motors clau de la progressió del tumor, sent la població clonogènica que suporta el creixement del tumor. Segons el model CSC, la no erradicació d’aquestes cèl·lules amb teràpies actuals pot provocar la recurrència del tumor. Com que aquestes cèl·lules són en general altament resistents a la quimioterapia i a la ràdio, hi ha una necessitat urgent d’agents terapèutics per orientar selectivament aquesta població. 2, 3 S'ha demostrat que diverses vies de transducció del senyal contribueixen al fenotip de la tija i s'han proposat com a dianes terapèutiques potencials; a més, estudis recents indiquen que l’orientació del metabolisme del CSC en combinació amb agents quimioterapèutics clàssics pot proporcionar una estratègia valuosa per eradicar els CSC. La nostra anàlisi proteòmica integrada i metabolòmica orientada suggereix que les BCSC són més dependents del metabolisme de la glucosa anaeròbica que les cèl·lules tumorals més diferenciades.

L’augment del flux glicolític i la producció de lactat fins i tot en presència d’oxigen suggereixen un canvi del metabolisme BCSC des de la fosforilació oxidativa a la glicòlisi aeròbica, fenomen conegut com a efecte Warburg. A més, s'ha demostrat que la regulació de la glicòlisi aeròbica correlaciona amb la major agressivitat del tumor i el desenvolupament de la resistència a diversos medicaments. 22, 23

L’efecte Warburg s’ha considerat una resposta cel·lular a condicions hipòxiques en el microambient tumoral i la sobreexpressió adaptativa del factor de transcripció HIF-1 α que pot afavorir la supervivència de les cèl·lules canceroses. Els nivells més alts de HIF-1 α en esferes, previstos en silico i observats eficaçment en BCSCs fins i tot en condicions normòxiques, tenen com a resultat l’augment dels nivells d’expressió de proteïnes implicades en el transport i metabolisme de la glucosa, així com la producció de lactat mitjançant la inducció de LDH-A, l’enzim clau de la fermentació de la glucosa. 24 S'ha demostrat que el lactat i el piruvat, que es van trobar augmentats significativament en els BCSC, regulen els gens inductibles de l'hipòxia independentment de la hipòxia estimulant l'acumulació de HIF-1 α . 25 És interessant observar que els BCSC estan enriquits en el succinat intermedi del cicle de Krebs i mostren una tendència cap a la concentració de fumarat augmentada. El succinat i el fumarat promouen l’acumulació de HIF-1 α mitjançant la inhibició dels enzims del domini de la prolil hidroxilasa dependents de l’oxigen que catalitzen la degradació de HIF-1 α , proporcionant així evidències de l’augment de HIF-1 α en BCSCs en condicions normògiques.

Es creu que el LDH-A és un important mediador molecular de l'efecte Warburg. Els gens LDH-A i LDH-B codifiquen per a dues proteïnes, a saber, M i H, respectivament, que es combinen per donar cinc isoenzims, que difereixen en la mobilitat electroforètica i les constants de Michaelis-Menten per al lactat i el piruvat. El LDH-A, sobreexpressat en BCSCs, està associat a la conversió del piruvat a lactat, cosa que suggereix un augment de la fermentació làctica en aquestes cèl·lules. Aquesta hipòtesi es recolzava en l’augment de l’activitat de LDH PyrLac i l’àcid làctic que es troba a les esferes. La major concentració local de l’àcid làctic tòxic i la disminució del pH extracel·lular s’han associat recentment a l’efecte Warburg i semblen avantatjoses per a la invasió i la tumourigenesi. 26, 27, 28

PKM2 és una isoforma d’activitat baixa de PK que promou la glicòlisi aeròbica i contribueix al metabolisme anabòlic. 17, 29 Se sap que PKM2 substitueix l’enzim PK normal en proliferació i cèl·lules tumorals, 30 i un interruptor d’isoforma PKM1 altament actiu a PKM2 s’ha associat amb un augment del metabolisme fermentatiu, augment de la producció de piruvat i lactat i una reducció consum d’oxigen. 17 Notablement, l’activitat PKM2 es basa en l’activació al·lostèrica per fructosa 1, 6-difosfat 31 i serina. 32 L’augment d’activitat PK als BCSCs és coherent amb les nostres dades que mostren un augment significatiu d’aquests dos efectors al·lostèrics en BCSCs en comparació amb els SDAC. A més, la PK té un paper regulador global en el metabolisme dels AA biosintètics i afecta la concentració d'AA lliures. En particular, s'ha demostrat que la regulació del PKM2 estimula la biosíntesi de serines de nou 34, que a la vegada pot activar al·lòricament PKM2, de forma coherent amb els nivells de serina més alts que trobem en BCSCs. La regulació de PKM2 i l'augment de l'activitat de PK també poden correlacionar amb l'augment de Arg, Val i His que ja s'han informat anteriorment. 33 La taxa de biosíntesi més elevada de AA no essencials derivades de glucosa lligada a l’augment de l’activitat PK suggereix que els BCSCs desvien el carboni derivat de la glucosa cap a vies que no produeixen ATP que donin suport a l’augment de biomassa cel·lular.

L'augment dels nivells d'expressió i l'activitat de G6PDH i l'augment de ribosí 5-fosfat als BCSCs indiquen clarament l'activació de la via del fosfat pentós. Aquests resultats recolzen la idea que els BCSC passen del metabolisme catabòlic dirigit a la producció d’energia cap a un estat anabòlic dirigit al subministrament de precursors de biosíntesi, com NADPH. Segons aquesta hipòtesi, la proporció NADP / NADPH disminueix significativament en les esferes, cosa que indica un augment dels nivells de NADPH intracel·lular.

Els BCSC també mostren una elevada proporció ADP / ATP que pot indicar una disminució de la producció d’ATP mitocondrial derivada oxidativament i, per tant, vies alternatives que generen ATP a BCSCs i un augment dels nivells d’ADP citosòlics, necessaris per mantenir l’elevada taxa de glicòlisi. Cal destacar que el tractament amb rotenona, un inhibidor del complex I mitocondrial, deteriora significativament la producció de ATP de cèl·lules en diferenciar-se sense efectes significatius sobre els BCSC. Per tant, els BCSC són menys dependents de l’activitat mitocondrial que les cèl·lules canceroses normals i depenen de la glicòlisi aeròbica per a la producció d’ATP.

S'ha informat que les cèl·lules glicolítiques mostren baixes proporcions citosòliques i mitocondrials NAD + / NADH que inhibeixen el cicle d'àcids tricarboxílics (TCA) afavorint la glicòlisi anaeròbia. 35 A més, la millora dels nivells de NAD + / NADH inhibeix la tumourigènesi i la metàstasi en el càncer de mama. 36 Inesperadament, els BCSC es caracteritzen per un nivell NAD + / NADH més alt que els SDAC. Sembla que contrasta amb el fenotip agressiu d’aquestes cèl·lules i la seva capacitat de formació de tumors. Tot i això, les nostres dades són coherents amb la hipòtesi que els BCSCs puguin consumir NADH sense produir ATP del transport d’electrons mitocondrials. La disminució dels nivells de NADH i l’increment corresponent de la proporció NAD + / NADH en BCSCs podrien estar relacionats amb l’augment de la taxa de fermentació homolactica per regenerar una piscina NAD + suficient i mantenir les altes taxes de glicòlisi, augmentant el consum de NADH o amb la inhibició de el cicle TCA. De fet, se sap que una major concentració d’intermedis del cicle TCA inhibeix el cicle. L’augment de la concentració de succina i la tendència a l’augment significatiu de fumarat en BCSC poden explicar en part l’augment de la relació NAD + / NADH mitjançant la inhibició del cicle TCA. La forta inhibició de l’oxidació beta de FA que hem observat en els BCSC proporciona evidències posteriors de silenciament de l’activitat mitocondrial. Tot i que el paper exacte de la inhibició del catabolisme oxidatiu de la FA encara no està clar, aquests resultats preliminar justifiquen investigacions posteriors.

Cal destacar que l’efecte Warburg s’ha relacionat amb l’estabilitat mitocondrial i l’equilibri redox cel·lular de les cèl·lules canceroses. 37 Promoure la glicòlisi i limitar l’activitat mitocondrial pot inhibir la producció d’espècies reactives d’oxigen mitocondrials (ROS). S'ha demostrat recentment que els baixos nivells de generació de ROS mitjançant el canvi glicolític contribueixen a mantenir un fenotip CSC. 9 Vam trobar que els BCSC no només es basen en la glicòlisi aeròbica, sinó que també sobreexpressen fortament diversos enzims antioxidants com ara el superòxid de superòxid mitocondrial i sintetitzen més NADPH que les cèl·lules diferenciades. La biosíntesi augmentada de NADPH pot indicar una font creixent d’equivalents reductors i una millora de la defensa anti-oxidants a través dels sistemes de proxiredoxina, tioredoxina i glutatió. Cal destacar, recentment, s’ha demostrat que el regulador clau de la glicòlisi aeròbica PKM2 té un paper rellevant en el manteniment de l’homeòstasi redox cel·lular, permetent un major desviament d’intermedis glicolítics cap a la via del fosfat de pentosa i la biosíntesi NADPH en resposta a l’estrès oxidatiu. 38 Per tant, és possible que els BCSC posin en marxa aquests mecanismes per contrarestar ROS.

L’orientació farmacològica de la glicòlisi aeròbica supera la resistència als fàrmacs dels CSC aïllats de diversos tumors sòlids. En particular, s’ha demostrat que la inhibició de la glicòlisi restableix la sensibilitat als medicaments en cèl·lules tumorals malignes altes mitjançant la inactivació de transportadors ABC que proporcionen el mecanisme d’eflux per a fàrmacs quimioterapèutics en CSCs. 39 L'anàlisi de la glucosa sintètica, 2-DG, és un dels inhibidors de la glicòlisi que s'ha demostrat que inhibeix el creixement del tumor sòlid i actualment es troba en assaigs clínics de Fase I / II. 40, 41 Cal destacar, recentment, s'ha suggerit que la combinació de 2-DG amb quimioterapéutics àmpliament usats com el trastuzumab pot ser una estratègia valuosa per superar els BCSC resistents als fàrmacs. 42 Aquí mostrem que el tractament agut amb 2-DG té un efecte citotòxic significatiu i indueix l’apoptosi de BCSCs. Aquests resultats són consistents amb dades que mostren que 2-DG afecta significativament la capacitat dels CSC de formar esferoides. 14 L’efecte citotòxic de 2-DG s’ha explicat prèviament no només per la inhibició de la glicòlisi i el següent estrès metabòlic, sinó també per efectes indirectes en diverses vies de senyalització com la inhibició de l’objectiu de mamífers de la senyalització de rapamicina 43 o efectes directes sobre proteïnes pro-apoptòtiques., com ara un antagonista / assassí homòleg de Bcl-2. 44

En canvi, el medicament quimioterapèutic àmpliament utilitzat Doxo proporciona només un efecte citostàtic sobre els CSC i s’ha demostrat que condueix a l’enriquiment de cèl·lules amb característiques de CSC a la població, augmentant així la resistència i el risc de repetir-se. 45 Curiosament, hem trobat que la combinació de Doxo amb 2-DG mostra un efecte sinèrgic, millorant significativament la mort dels BCSC de forma dependent del temps. A més, el tractament combinat té un efecte important també en cèl·lules canceroses més diferenciades, cosa que suggereix que aquesta combinació pot orientar-se a diferents poblacions de cèl·lules canceroses. Se sap que Doxo augmenta la producció de ROS, que pot mediar danys i apoptosi mitocondrials de manera independent de la p53. 46, 47 També se sap que el tractament amb 2DG produeix un augment de ROS. 48, 49 Això pot proporcionar una raó per a la millora de l'efecte de Doxo per part de 2-DG. D'altra banda, combinar 2-DG amb altres fàrmacs pot augmentar la baixa citotoxicitat in vivo de 2-DG 40 i superar també l'efecte citostàtic dels agents quimioterapèutics clàssics. De fet, l’orientació de la glicòlisi aeròbica amb 2-DG supera notablement la resistència a Doxo dels BCSCs, proporcionant així una prometedora aplicació farmacològica contra els BCSC.

Materials i mètodes

Productes químics

Tots els productes químics han estat subministrats per Sigma-Aldrich (Shnelldorf, Alemanya) i Fluka (Shnelldorf, Alemanya), tret que s'indiqui el contrari.

Recollida de teixits, aïllament i cultiu de cèl·lules canceroses

Els teixits de càncer de mama humà es van obtenir de pacients sotmesos a cirurgia d’acord amb les normes ètiques del Comitè institucional d’experimentació humana (autorització núm. CE-ISS 09/282). Els teixits tumorals es van digerir mecànicament i enzimàticament amb colagenasa (1, 5 mg / ml; Gibco Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) i hialuronidasa (20 mg / ml) a DMEM (Gibco), agitant durant 1 h a 37 ° C. La suspensió cel·lular resultant es va xapar en matràs de fixació ultra baixa (Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) en un medi lliure de sèrum complementat amb un factor bàsic de creixement de fibroblast (10 ng / ml) i un factor de creixement epidèrmic (20 ng / ml) com a anteriorment descrit. 50 Aquest procediment va produir línies BCSC sotmeses a genotipat per validar la individualitat de cada línia cel·lular i es va fer una prova posterior de la seva capacitat de generar xenografts tumorals que van replicar la histologia del tumor parental. Per aconseguir la diferenciació in vitro de BCSCs, es van cultivar cèl·lules esfera dissociades en DMEM per als temps indicats (3, 5 o 7 dies) complementades amb un sèrum boví fetal (FBS) del 10% en condicions adherides. Convencionalment, aquestes cèl·lules eren SDAC. 18

Assaig de proliferació cel·lular

La viabilitat de les cèl·lules es va determinar a les 24 i 48 h mitjançant un assaig d’exclusió de colorant blau trypan després del tractament de BCSCs amb 35 mmol / l 2-DG com es va informar anteriorment, 14 clorhidrat de doxorubicina (1 μ mol / l) i una combinació dels dos fàrmacs. a les mateixes concentracions. Les mostres de control es van realitzar en solució tampó fosfat (PBS).

Anàlisi citofluorimètrica

L'avaluació de contingut d'ADN cel·lular citomètric de flux es va realitzar segons Nicoletti et al. 51 Breument, les cèl·lules es van recollir mitjançant trypsinització, es van fer pellets a 800 × g durant 10 min i es van fixar en un 70% d’etanol durant la nit a -20 ºC. Després es van rentar les mostres en PBS i es van incubar a 37 ° C, durant 15 min amb una solució RNAse A de 13 unitats de Kunitz i durant 20 min amb 50 μ g / ml de iòdur de propidi. Es van adquirir vint mil esdeveniments (FACSCanto II Instrument, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) i es van analitzar mitjançant el programa BD FACSDIVA (BD Biosciences).

Es va realitzar una anàlisi citomètrica de flux dels marcadors de superfície CD24 i de la diferenciació 44 (CD44) en 2 × 10 5 cèl·lules per mostra. Les cèl·lules es van rentar en PBS, es van suspendre en 100 μ l d'anticòs específic (anticorp CD24-R-fitcoerythrin-cyanine colorant7 (anti-CD24-PE-Cy7), 561646, BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ, EUA); anticorp- Allibococianina CD44 (anti-CD44-APC), 559942, BD Pharmingen) es va diluir en una albumina sèrica bovina al 0, 5% i es va incubar durant 20 min a temperatura ambient a les fosques. Cell viability solution (555815, BD Biosciences) was used for detection of non-viable cells according to manufacturer's protocol. Samples were then washed and stored at 4 °C in the dark until acquisition. A FACSCantoII flow cytometer, running with FACSDiVa software (BD Biosciences), was used for sample acquisition and analysis.

Cell sorting of CD44 + /CD24 + and CD44 +/ CD24 −/low sub-populations was performed on single cell suspension from BCSC double stained with anti-CD24-PE-Cy7 antibody and anti-CD44-APC antibody. Cells were sorted with fluorescence-activated cell sorting Aria III cell sorter (BD Biosciences). Sub-populations of cells co-expressing CD44 and CD24 at higher levels or CD24 weak/absent were collected, and a small amount of cells were re-analysed to check for purity.

Immunoblotting

Cells grown as BCSCs and SDACs were collected by centrifugation at 1200 revolutions/min. Cell pellets were washed twice with ice-cold PBS, resuspended in a 50 mmol/l tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)/HCl (pH 7.5), 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 1 mmol/l NaF, 10% Glycerol (V/V), 1 mmol/l MgCl, 1% Triton X-100 (V/V) ice-cold buffer containing proteinase inhibitor cocktail and incubated for 30 min on ice. Sample lysates were centrifugated at 10 000 × g for 10 min, and supernatants were collected. Equal amounts of whole proteins extracts and nuclear extract (B-625 Sigma N-XTRACT, Shnelldorf, Germany) for HIF-1 α immunodetection were resolved on 10% sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis gel using a mini-gel apparatus (GmbH Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA), transferred onto polyvinylidene fluoride membranes and subsequently blocked with 5% non-fat dry milk in PBS/0.1% (V/V) Tween 20. Immunodetection was performed by incubating the membranes with the different primary antibodies diluted in blocking buffer for 2 h at room temperature or overnight at 4 °C. The following antibodies were used: anti-LDH (PA5-27406, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), anti-PKM2 (PA-23034, Thermo Scientific), anti-G6PD (PA5-27359, Thermo Scientific), anti-HIF-1 α (NB100-449, Novus Biologicals, Cambridge, UK), anti-Actin (clone AC-15, A5441 Sigma-Aldrich), and anti-Laminin β (M-20) (sc-6217, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA). Immunoreactive bands were visualized with SuperSignal West Dura Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA).

Differential proteomic analysis

Sample preparation, data acquisition and data processing were performed as previously described. 52, 53, 54 A total of 100 μ g of protein extracts from the different conditions in separate experiments were precipitated with a mix of ethanol, methanol, and acetone (ratio 2 : 1 : 1, V/V) and then dissolved in 100 mmol/l Tris/HCl pH 7.9 containing 6 M urea and 0.1% 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate and sonicated. The reduction of proteins was performed by adding 100 mmol/l dithiothreitol (DTT) (1 h at 36 °C) and 200 mmol/l iodoacetamide (1 h at room temperature). Protein samples at a final concentration of 2 μ g/ μ l were digested with 1 : 20 (w/w) sequence-grade trypsin (Promega, Madison, WI, USA) at 36 °C overnight. The reactions were stopped by adding 1 μ l of 10% (V/V) trifluoroacetic acid. A total of 0.25 μ g of the protein digestion was loaded onto the nanoACQUITY UPLC System (Waters Corporation, Milford, MA, USA) coupled to a quadrupole-time of flight (Q-Tof) Premier mass spectrometer (Waters Corporation). Before loading, a digested enolase from Saccharomyces cerevisiae (Waters Corporation) was added to the sample as internal standard at a final concentration of 200 fmol/l. Samples were injected onto a Symmetry C18 5 μ m, 180 μ m × 20 mm precolumn (Waters Corporation) for preconcetration and desalting and were subsequently separated using a NanoEase BEH C18 1.7 μ m, 75 μ m × 25 cm nanoscale LC column (Waters Corporation) maintained at 35 °C. Mobile phase A was water with 0.1% formic acid, and mobile phase B was 0.1% formic acid in acetonitrile. Peptides were eluted by a gradient of 3–40% mobile phase B over 150 min at a flow rate of 250 nl/min followed by a gradient of 40–90% mobile phase B over 5-min and a 15-min rinse with 90% mobile phase B. The Q-Tof Premier mass spectrometer (Waters Corporation) was programmed to step between low (4 eV) and high (15–40 eV) collision energies using a scan time of 1.5 s over 50–1990 m / z . Samples from each condition were run at least in triplicate. The best replica for each condition was used for the subsequent analysis. The Continuum LC-MS data were processed and searched using ProteinLynx GlobalServer v2.3 (PLGS) (Waters Corporation). Protein identification was performed using the embedded ion accounting algorithm of the software and by searching a Uniprot/SWISSProt human database release 2011_02 (20253 entries), to which the sequence from the enolase of S. cerevisiae was appended. The parameters for the database search were as follows: automatic tolerance for precursor ions, automatic tolerance for product ions, minimum of three fragment ions matched per peptide, minimum of seven fragment ions matched per protein, minimum of two peptides matched per protein, one missed cleavage, and carbamidomethylation and oxidation of methionine as modifications. The false positive rate of the identification algorithm is typically 3–4% with a randomized database appended to the original one, which is five times the size of the original utilized database. 55, 56 The identified proteins displayed in the protein table were normalized against the P00924 entry (Enolase S. cerevisiae ), and peptides from Enolase S. cerevisiae digestion that were the most reproducible for retention time and intensity deriving ( m / z 807.42, m / z 814.49, m / z 1286.71, m / z 1288.70, m / z 1755.94, m / z 1789.83, m / z 1840.89) were used to normalize the EMRT table, the list of paired peptide exact masses and retention time. The list of normalized proteins was screened according to the following criteria: proteins that were identified in at least two out of the three injections of the same conditions; proteins with 0< P <0.05 or 0.95< P 1.3 on decimal scale. If 0< P 95%, and if 0.95< P 95%. Setting the threshold of ratio at 1.3 on a decimal scale allowed us to consider the average relative fold change ±0.30 on a natural log scale. This setting is typically 2–3 times higher than the estimated error of the intensity measurements. 56

Targeted metabolomic analysis by GC–MS

GC–MS analysis of cell lysates was performed as previously described. 57 Briefly, cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of ethanol/water (50 μ l, 80 : 20, V:V), and cell homogenate (50 μ l) were precipitated with 100 μ l of cold 0.1% (V/V) methanolic trichloroacetic acid immediately after homogenization. Internal standards ( 13 C 4 malic acid, 13 C 4 succinic acid, 13 C 6 glucose; IS) were then added to give a final concentration of 10 μ g/ml. Samples were centrifuged at 10 000 × g for 30 min, and supernatants were collected and dried in a SpeedVac system (ThermoSavant, Waltham, MA, USA). The dried extracts were derivatized with 20 μ l of 20 mg/ml of methoxyamine hydrochloride solution in pyridine for 60 min at 70 °C followed by reaction with 20 μ l of N, O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% of trimethylchlorosilane for 60 min at 70 °C. GC–MS analysis was performed using a 6890N gas-chromatograph equipped with a 7863 Series auto-sampler and coupled with a 5973N mass spectrometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) operating in electron impact ionization mode. Three microlitres were injected in pulsed-splitless mode by applying a pressure of 80 psi. The injector temperature was kept at 250 °C. Chromatographic separations were obtained using a fused silica capillary column HP-5MS (30 mx 0.25 mm, Agilent Technologies). Helium was used as carrier gas at a constant flow rate of 1 ml/min. The GC oven was programmed as follows: start at 70 °C (hold time 1 min), which was raised at 4 °C/min to 300 °C (hold time 5 min). The mass spectrometer was automatically calibrated using per-fluoro tributylamine as calibration standard. For quantification, the mass spectrometer was used in the selective ion monitoring mode, and mass spectra were recorded in positive modes by monitoring the following ions: m / z 174 (pyruvic acid; IS: 13 C 3 pyruvic acid, m / z 177), m / z 147 (lactic acid; IS: 13 C 4 succinic acid, m / z 251), m / z 247 (succinic acid; IS: 13 C 4 succinate, m / z 251), m / z 245 (fumaric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 233 (malic acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236); m / z 328 (glyceraldheyde 3-phosphate; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 357 (3-phosphoglyceric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 375 (citric acid; IS: 13 C 4 malic acid, m / z 236), m / z 319 (glucose; IS: 13 C 6 glucose, m / z 323), m / z 387 (glucose 6-phosphate; IS: 13 C 6 glucose, m/z 323), and m / z 459 (fructose 1, 6-diphosphate; IS: 13 C 6 fructose 1, 6-diphosphate, m / z 462). Mass spectrometer operating parameters were: interface temperature 300 °C, ion source 250 °C, and quadrupole 150 °C. The external standard method and internal standard correction were applied for quantification of target metabolites. Data acquisition was performed using the G1701CA ChemStation software (Agilent Technologies).

Determination AAs and AcCs

AA and AcCs analysis was performed by LC-MS/MS as previously described. 58, 59 Cell samples (approximately 1.5 × 10 6 cells) were extracted with a solution of Ethanol/Water (50 μ l, 80 : 20, V:V). The samples were then sonicated and centrifuged (15 600 rpm at 4 °C for 20 min), and the supernatant was recovered. The lysate (7 μ l) were added to 100 μ l of the stable isotope-labeled IS obtained from the NeoBase Non-derivatized MSMS Kit (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Turku, Finland). The sample were analysed by direct infusion mass spectrometry using a LC-MS/MS system consisting of an Alliance HT 2795 HPLC Separation Module coupled to a Quattro Ultima Pt ESI tandem quadrupole mass spectrometer (Waters Corporation). The instrument was operated in positive electrospray ionization mode using MassLynx V4.0 Software (Waters Corporation). A detailed description of electrospray ionization mass spectrometry acquisition parameters are available in Supplementary Table S6. Auto data processing was performed using the NeoLynx (Waters Corporation) software.

Pyruvate kinase activity

PK activity was measured by converting the product pyruvate into lactate using LDH, with a concomitant conversion of NADH to NAD +, resulting in a decrease in absorbance at 340 nm. 60 In all, 7 × 10 6 cells were lysed in 200 μ l of buffer containing 10 mmol/l Tris–HCl (pH 7.5), 1.5 mmol/l MgCl 2, 20 mmol/l NaCl, 1 mmol/l DTT, 1 mmol/l phenylmethylsulfonyl fluoride, and protease inhibitor cocktail. After two centrifugations at 17 000 × g for 30 min each, PK activity was measured in the supernatant by a LDH-coupled assay. The 200- μ l reaction mixture was prepared on ice containing 100 mmol/l Tris–HCl (pH 8.0), 100 mmol/l KCl, 10 mmol/l MgCl2, 0.5 mmol/l EDTA, 0.2 mmol/l NADH, 1.5 mmol/l ADP, 5 mm phosphoenolpyruvate, and 200 units/ml LDH. The reaction was initiated by the addition of 0.7 μ g of total cell extract. PK activity was calculated at 37 °C by monitoring the absorbance at 340 nm every 30 s for 5 min in an microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). A unit of PK activity is defined here as the amount of enzyme required to oxidize 1 μ mol of NADH per minute under these experimental conditions.

LDH activity

Direct LDH activity (LDH PyrLac ) was spectrometrically assayed as previously described 61, 62 using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices). Briefly, cell pellets were lysed in 0.010 mol/l PBS (20 ml/g of pellet, wet weight; pH=7.4). Cell lysates were centrifuged at 2000 × g for 3 min at 4 °C to remove cell debris. Supernatants were further centrifuged 8000 × g for 10 min at 4 °C in order to obtain cytosolic fractions. Protein concentration was determined according to the Bradford assay. 63 Therefore, pyruvate (25 μ l, 2.50 g/l) and NADH (100 μ l, 0.3 g/l) were added to the samples (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) and the decrease of absorbance at 340 nm was measured at 37 °C every 30 s for 5 min. LDH PyrLac activity is expressed as μ mol/mg protein /min.

G6PDH activity

G6PDH was assayed using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), according to the spectrophotometric methods previously described 64 with minor modifications. Cell pellets were homogenized, and protein quantification were performed as described for LDH activity assay. To measure G6PDH activity, the sample (10 μ l corresponding to 0.5 μ g of total proteins) was added to a solution containing glucose 6-phosphate (0.2 mmol/l), NADP + (0.1 mmol/l), Tris/HCl buffer (50 mmol/l, pH=8.1), and MgCl 2 (1 mmol/l). The final volume was 150 μ l. The increase of absorbance at 340 nm was measured every 30 s for 5 min at 37 °C. G6PDH activity was expressed as μmol/mg protein/min.

NAD + /NADH and NADP + /NADPH determination

NAD + /NADH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NAD + /NADH Assay Kit (E2ND-100), BioAssay Systems, Hayword, CA, USA) according to the manufacturer's instructions. This assay is based on a LDH cycling reaction. 65 Briefly, cells were lysed with either 100 μ l NAD + extraction buffer for NAD + determination or 100 μ l NADH extraction buffer for NADH determination. After heating at 60 °C for 5 min, 20 μ l of assay buffer and 100 μ l of the opposite extraction buffers (NADH extraction buffer or NAD + extraction buffer, respectively) were added. The samples were then centrifuged at 14 000 rpm for 5 min, and the supernatants (40 μ l) were used for NAD + /NADH assays. The optical density (OD) was read at 565 nm in a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices) for time 0 and after 15 min. NAD + and NADH concentrations were measured as: (ΔOD- b 0)/ b 1, where b 0 and b 1 are the intercept and slope of the external calibration curve.

NADP + /NADPH ratio were measured by a ultrasensitive colorimetric assay (EnzyChrom NADP + /NADPH Assay Kit (ECNP-100), BioAssay Sistems) following the manufacturer's instructions. This assay is based on a glucose dehydrogenase cycling reaction. 65 The absorbance was measured at 565 nm using a tunable microplate reader (Spectra max 190, Molecular Devices), and the same procedure applied for NAD + /NADH determination was performed. All analysis were performed in triplicate.

ADP/ATP ratio determination

ADP/ATP ratio was measured based on luciferin–luciferase reaction using Enzylight ADP/ATP ratio assay kit (ELDY-100) (BioAssay Systems) following the manufacturer's instructions. Briefly, BCSCs cells were seeded in a 96-well flat-bottom plate and incubated for 3 days to allow for cell differentiation and recovery (1 × 10 4 cells at 100 μ l per well). BCSCs (1 × 10 4 cells) were treated with the assay buffer (90 μ l) containing luciferin–luciferase. After 1 min, luminescence (relative light units (RLU) A) was recorded by Lumat LB 9507 Ultra Sensitive Tube Luminometer (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN, USA). The luminescence was read also after 10 min (RLU B). This measurement provided background before measuring ADP. Therefore, 5 ml ADP reagent was added to each well, and after 1 min, luminescence (RLU C) was obtained. ADP/ATP ratio was measured as: (RLU C−RLU B)/RLU A. All analysis were performed in triplicate. The same procedure was applied for the measurement of ADP/ATP ratio in BCSCs and SDACs following treatment with rotenone (50 μ mol/l) for 60 min.

Statistical and bioinformatic analysis

Differences between the protein expression levels, enzymatic activities, and metabolite concentrations in BCSCs and SDACs were assessed by unpaired two-tailed t -test. Two-factor ANOVA followed by Fisher's least significant difference (LSD) post-hoc test was performed in order to assess the significance of the treatment effects. Data were ranked and aligned where Levene test failed to show homoscedasticity. Aligned rank transformation (ART) of data was performed using the ART web software available at //faculty.washington.edu/aimgroup/proj/art/artweb/. 66 Treatment (PBS, Doxo, 2-DG, and Doxo+2-DG) and the treatment time (24 or 48 h) were the independent factors. P -values <0.050 were considered statistically significant. Statistical analysis was performed using the Statistica 6.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OK), XLStat2007.1 (Microsoft, Redmond, WA, USA) and Microsoft Excel software.

Protein network analysis was performed using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) application (Ingenuity System, //www.ingenuity.com). IPA constructs hypothetical protein interaction clusters on the basis of the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Direct and indirect relationships between the identified proteins were shown as networks on the base of all genes, and endogenous chemicals present in the Ingenuity Knowledge Network scores are calculated as −log ( P -value) and indicate the likelihood that focus genes (ie, the identified proteins within a specific network) are clustered together. Biological functions and canonical pathways over-represented among the identified proteins were also assigned to networks stored in the Ingenuity Pathways Knowledge Base. Biological functions and canonical pathways were ranked in accordance to their significance. Significance was evaluated by exact Fisher's test. A P -value of 0.01 corresponding to a score of 2 was considered the cutoff for the analysis.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura complementària Llegenda

  2. 2

    Taula suplementària S1

  3. 3.

    Taula complementària S2

  4. 4.

    Taula complementària S3

  5. 5.

    Taula suplementària S4

  6. 6.

    Taula suplementària S5

  7. 7.

    Taula complementària S6

Glossari

2-DG

2-deoxy-D-glucose

AA

amino acid

ABC

ATP-binding cassette

AcCs

acylcarnitines

ADP

adenosine diphosphate

ATP

adenosina trifosfat

anti-CD24-PE-Cy7

antibody-CD24-R-phycoerythrin-cyanine dye7

anti-CD44-APC

antibody-CD44-allophycocyanin

Arg

Arginine

BCSC

breast cancer stem cell

bFGF

factor bàsic de creixement del fibroblast

CD24

cluster of differentiation 24

CD44

cluster of differentiation 44

CSC

cancer stem cell

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle Medium

Doxo

doxorubicin

TDT

ditiotreitol

FEG

factor de creixement epidèrmic

EMRT

exact mass retention time cluster

ETC

electron transport chain

FA

fatty acid

G6PDH

glucose 6-phosphate dehydrogenase

GC–MS

gas-chromatography mass spectrometry

Gly

glycine

HIF-1α

hypoxia-inducible factor 1α

Seva

histidine

IPA

Ingenuity Pathway Analysis

LC-MS/MS

liquid chromatography tandem mass spectrometry

LDH

lactat deshidrogenasa

LDH-A

lactate dehydrogenase A

NAD

nicotinamide adenine dinucleotide

NADP

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PK

pyruvate kinase

PKM2

pyruvate kinase M2

PMSF

phenylmethylsulfonyl fluoride

RLU

relative light units

ROS

espècies reactives a l'oxígen

SDAC

spheroid-derived adherent cell

TCA

tricarboxylic acids cycle

Val

valine

WB

western blotting

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)