La calumenina-15 facilita la formació de filopodia promovent la transcripció de superfamília de citocines gdf-15 per superfamília | mort i malaltia cel·lular

La calumenina-15 facilita la formació de filopodia promovent la transcripció de superfamília de citocines gdf-15 per superfamília | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Filopodia
  • Metàstasi
  • Transcripció

Resum

Les filopodia, que són protuberàncies de membrana similars a dits rics en actines, tenen un paper important en la migració cel·lular i la metàstasi del tumor. Aquí identifiquem 13 noves isoformes de calumenina (Calu) (Calu 3-15) produïdes per empalme alternatiu, i trobem que Calu-15 promou la formació de filopodia i la migració cel·lular. Les llançaments de Calu-15 entre el nucli i el citoplasma mitjançant la interacció amb importina α , Ran GTPase i Crm1. La fosforilació de la treonina en la posició 73 (Thr-73) per la caseïna cinasa 2 (CK2) és essencial per a la importació nuclear de Calu-15, i la mutació Thr-73 o la inhibició de CK2 interrompen la seva localització nuclear. Al nucli, Calu-15 augmenta la transcripció del factor de diferenciació de creixement-15 (GDF-15), un membre de la superfamília del factor de creixement transformant- β (TGF- β ), via unió a la seva regió promotora. A més, Calu-15 indueix la formació de filopodia mediada per GDF-15. Junts, identifiquem que Calu-15, una nova isoforma de Calu amb localització nuclear depenent de la fosforilació, té un paper crític en la promoció de la formació de filopodia i la migració cel·lular mitjançant la regulació de la transcripció del GDF-15.

Principal

Les filopòdies, que són projeccions semblants a dits, recolzades per actines filamentoses enllaçades en paral·lel, participen en molts processos fisiològics i patològics clau, 1, 2, 3, mentre que les filopòdies abundants es consideren fortament correlacionades amb la migració cel·lular millorada i la metàstasi del tumor. 3, 4, 5 La filopodia conté receptors per a diversos senyals extracel·lulars, inclosos citocines i factors de creixement, per intuir l’entorn de la cèl·lula durant la migració cel·lular, i després desencadenar la formació de llocs d’adhesió inicials, el reclutament de components d’adhesió focal i finalment la reorganització de la xarxa d’actina. 3, 6, 7, 8 El factor de creixement transformant β (TGF- β ), una citocina, s'ha informat que indueix l'expressió de paxillina, un component focal d'adhesió del complex, i de fascina, una proteïna que uneix filaments amb actina, que al seu torn afavoreix la formació de filopodia i la migració cel·lular. 4, 7 Per tant, el TGF- β i el fascí afloren com a dianes potencials per a teràpies contra el càncer. 4, 9

El factor de diferenciació de creixement-15 (GDF-15) és un membre de les proteïnes de superfamília TGF- β . 10, 11 També es coneix com a citocina-1 inhibidora dels macròfags, factor derivat de la pròstata, proteïna morfogenètica òssica placentària, gen-1 activat per fàrmacs anti-inflamatoris no esteroides i TGF- β placentària. 10, 11 De forma similar a altres membres de la superfamília TGF- β , GDF-15 es sintetitza primer com a proteïna pro, i després es clive i se segrega en la seva forma madura activa. 12 S’ha informat que tenia papers en tipus de processos cel·lulars com la proliferació cel·lular, la migració, la diferenciació i l’apoptosi. 13, 14, 15, 16, 17 GDF-15 té funcions tant anti-com pro-tumorigèniques segons diferents tipus de cèl·lules i diferents etapes de desenvolupament del tumor. 13, 17, 18 Un nivell elevat de GDF-15 en sèrum està associat a una mala supervivència del pacient en carcinoma colorectal i de pròstata, 19, 20 i el nivell de GDF-15 també ha estat augmentat durant la transició de lesions colòniques a iniciació del càncer. Tanmateix, també hi ha proves que la sobreexpressió de GDF-15 indueix l’apoptosi de cèl·lules canceroses de mama i inhibeix la tumorigenicitat de la línia cel·lular de glioblastoma LN-Z308. 21, 22 Per tant, desvelar els mecanismes moleculars que regulen el GDF-15 és el punt clau per a la comprensió i el tractament del tumor maligne.

La calumenina (Calu) pertany a la família de proteïnes CREC, que està composta per Cab45, reticulocalbin-1, reticulocalbin-2 (també coneguda com ERC-55), reticulocalbin-3 i Calu. 23, 24 Aquestes proteïnes contenen tots els dominis de les mans EF i són codificats respectivament per cinc gens. 23, 24 Curiosament, la majoria d’aquests gens produeixen isoformes mitjançant el splicing alternatiu d’ARNm i aquestes isoformes solen tenir diferents localitzacions subcel·lulars i funcions fisiològiques. 23, 24 S’ha informat que el gen CALU produeix dues isoformes, Calu-1 i Calu-2 (també conegudes com a crocalbin), 25, 26 de longitud igual (315 aminoàcids (aa)) amb només els exons 3 i 4 intercanviats. Recentment, el test estàndard de degradació d'Edman va revelar que tant Calu-1 com Calu-2 posseeixen un pèptid del senyal N-terminal (19 aa), 27 que condueix a les seves translocacions al lumen ER o Golgi. 28 Funcionalment, Calu-1 i Calu-2 regulen l’activitat de γ- carboxilació 29 depenent de la vitamina K i participen en el ciclisme de calci en interactuar amb el receptor de rianodina-1 i ER Ca 2+ -ATPase SERCA2. 30, 31

Aquí es va proposar determinar si hi ha altres isoformes de Calu i identificar que el gen CALU produeix 13 noves isoformes (anomenades Calu 3-15) mitjançant empalmes alternatius, amb només una d’elles, Calu-15, que posseeix una localització nuclear. Les llançaments de Calu-15 entre el nucli i el citoplasma, i aquest procés està regulat per la seva fosforilació. Funcionalment, Calu-15 augmenta el nivell de transcripció de GDF-15 al nucli, que al seu torn indueix la formació de filopodia i afavoreix la migració cel·lular.

Resultats

Identificació de les isoformes de Calu i les seves localitzacions subcellulars

Per cercar isoformes d’ esplai més alternatives del gen CALU , vam dissenyar un parell d’amorços localitzats en el primer i últim exó (figura suplementària S1a) i vam realitzar anàlisis de PCR. Diverses bandes es van amplificar a partir de l’ADNc de les cèl·lules HeLa (figura suplementària S1b), i es van identificar 13 variants d’escriptura més mitjançant la seqüenciació. Hem anomenat aquestes 13 noves variants Calu 3–15 (número d’adhesió GenBank: HM002604 – HM002616; figura 1a).

Image

Quinze isoformes de calumenina (Calu) i les seves localitzacions subcel·lulars. ( a ) La imatge esquemàtica mostra l'organització exònica de 15 isoformes de Calu codificades pel gen CALU . El número de la part superior de la imatge és el número exon. Les regions negres representen una seqüència codificant, les regions blanques representen una seqüència d'ARNm no traduïda. ( b ) Localitzacions subcel·lulars de les proteïnes de fusió de proteïnes fluorescents verdes (EGFP) millorades de les isoformes de Calu (verd). GRIP1-mRFP (vermell) marca l’aparell Golgi. Barra, 10 μ m

Imatge a mida completa

Informes anteriors han demostrat que Calu-1 i Calu-2 tenen vuit exons amb longituds d'ARNm de ∼ 3, 4 kb. 25, 26 Quan es va comparar l’organització exònica d’aquestes isoformes, es va trobar que Calu-3 i Calu-4 posseïen un exó nou (exó 2 a la figura 1a), donant lloc a un augment de la longitud d’ARNm fins a ∼ 4.2 kb. A més, Calu-3 i Calu-4 van tenir 8 aa més al terminal N en comparació amb Calu-1 i Calu-2 (figura suplementària S1c). Com que el terminal N aa 19 de Calu-1 i Calu-2 són el pèptid senyal, 27, 28, es va examinar si els 8 aa més interrompen aquest senyal. El test de fluorescència va mostrar que Calu-3 – EGFP i Calu-4 – EGFP també van colocalitzar amb GRIP1-mRFP, un marcador de l’aparell Golgi, similar al de Calu-1 – EGFP i Calu-2 – EGFP (figura 1b). A més, la fusió EGFP amb el terminal N-27 aa (8 + 19 aa) de Calu-3 i Calu-4 també es va colocalitzar amb GRIP1-mRFP (figura suplementària S1d). Aquests resultats suggereixen que el N-terminal 27 aa de Calu-3 i Calu-4 encara funcionen com a pèptid senyal.

També vam determinar les distribucions subcel·lulars de les altres isoformes identificades mitjançant la sobreexpressió de les seves proteïnes de fusió EGFP a les cèl·lules HeLa. Vam trobar que només Calu-15 mancava del pèptid senyal i mostrava acumulació nuclear (figura 1b). En conjunt, el gen CALU codifica 15 isoformes i només Calu-15 manca del pèptid del senyal N-terminal i mostra una localització nuclear.

Les llançaments de Calu-15 entre el nucli i el citoplasma, mediatitzades per importina- α , Ran GTPase i Crm1

Per confirmar que Calu-15 mostra la localització nuclear, ho vam etiquetar amb 2 × EGFP i vam trobar que Calu-15–2 × EGFP també estava localitzat al nucli (Figura 2a). Consistentment, Calu-15 etiquetat amb β -Gal-EGFP també es va localitzar al nucli, mentre que el control β -Gal-EGFP no (figura suplementària S2). Així, Calu-15 és capaç d'arrossegar 2x EGFP i β -Gal-EGFP al nucli.

Image

Calumenina (Calu) -15 llançaments entre el nucli i el citoplasma, mediat per importin- α , Ran GTPase i Crm1. ( a ) Localització subcel·lular de la proteïna de fusió Calu-15–2 × proteïna fluorescent verda (EGFP) reforçada (verda). L’ADN nuclear es va tacar amb DAPI (4 ’, 6-diamidino-2-fenilindol; blau). Barra, 10 μ m. El panell superior mostra l'arquitectura de domini de Calu-15–2 × EGFP. ( b ) Es va realitzar una immunoprecipitació (IP) amb anticossos contra EGFP als lisats de cèl·lules HEK293T que expressen Calu-15 – EGFP, seguida de immunoblot (western blotting (WB)) amb anticòs contra Calu-1/2 (calu). Anticòs contra EGFP (EGFP) com a control positiu. IgG com a control negatiu. ( c ) Immunoblottings (WB) de Calu-15 endògena en la fracció citoplasmàtica i nuclear de les cèl·lules HeLa. Els asteriscs indiquen la banda de Calu-1/2 o Calu-15. La tubulina i el laminat, respectivament, etiqueten la fracció citoplasmàtica i nuclear. ( d ) La IP amb anticòs contra EGFP es va realitzar als lisats de cèl·lules HEK293T que expressen Calu-15 – EGFP o EGFP, seguida de la immunoblot (WB) amb els anticossos indicats. ( e ) Les cèl·lules HeLa cotransfectades amb Calu-15–2 × EGFP i RanQ69L-mRFP es van tractar amb (panells dret) o sense leptomicina B (LMB) durant 3 h, i després es van fixar per a la seva observació. L’ADN nuclear es va tacar amb DAPI (blau). Barra, 10 μ m

Imatge a mida completa

Per determinar la localització subcel·lular de Calu-15 endògena, es va fer servir l’anticòs contra Calu-1 i Calu-2, que també va poder reconèixer el sobreexpressat Calu-15 – EGFP similar a l’anticòs EGFP (Figura 2b). Utilitzant aquest anticorp, vam analitzar les proteïnes de fracció nuclear i citoplasmàtica extretes de les cèl·lules HeLa per Western Totting, i vam trobar que Calu-1 i Calu-2 es trobaven en la fracció citoplasmàtica que contenia tubulina, mentre que Calu-15 es va detectar principalment en la fracció nuclear juntament amb el retolador nuclear (figura 2c).

Després de confirmar que Calu-15 està localitzat al nucli, seguidament vam investigar si passava per la via clàssica per entrar al nucli. Vam realitzar experiments d'immunoprecipitació i vam trobar que Calu-15 estava associat a la importina- α (figura 2d), una proteïna participant en el procés d'entrada nuclear. 32, 33 A més, la immunoprecipitació va demostrar que Calu-15 també va interactuar amb Ran GTPase (figura 2d), que s'ha informat que es desvincula del complex importina-càrrega i que era necessari per al procés d'importació nuclear. 33, 34 A més, la cotransfecció amb RanQ69L, que és un mutant defectuós en l'activitat de GTPasa, 35 van inhibir en gran mesura la localització nuclear de Calu-15 (Figura 2e). Per tant, el procés d'importació nuclear de Calu-15 està mediat per la importina- α i regulat per Ran GTPase.

Curiosament, Calu-15 també va interactuar amb la proteïna exportina Crm1 (figura 2d), que es reporta que media el transport nucleocitoplasmàtic. 33, 36 Per tant, és raonable hipotitzar que Calu-15 es pugui exportar del nucli mitjançant una ruta dependent de Crm1. Per provar-ho, es va utilitzar la leptomicina B (LMB), una petita molècula que interfereix amb la unió de la càrrega de Crm1, 37 per suprimir l'exportació nuclear depenent de Crm1. A les cèl·lules que sobreexpressen Calu-15–2 × EGFP a causa del seu alt nivell d’acumulació nuclear, el tractament amb LMB no va poder augmentar l’acumulació nuclear de Calu-15 (Figura 2e). No obstant això, davant la presència de RanQ69L, el tractament amb LMB va induir, òbviament, que Calu-15 es localitzés al nucli (figura 2e). Així, Calu-15 pot transvasar-se entre el nucli i el citoplasma, i això està mediat per la importina- α , Ran GTPase i Crm1.

La localització nuclear de Calu-15 depèn de la fosforilació a Thr-73 per CK2

Tenint en compte que la fosforilació pot regular el desplaçament nuclear-citoplasmàtic de proteïnes, 38, 39 vam analitzar la seqüència d'aminoàcids de Calu-15 amb eines 40 de bioinformàtica i vam trobar que la treonina a la posició 73 (Thr-73) podria ser fosforilada per la caseïna quinasa 2 (CK2) Aquesta troballa ens va impulsar a examinar si aquest lloc tenia un paper en la llançament nuclear-citoplasmàtica de Calu-15. Hem mutat aquest aminoàcid a alanina (T73A) i àcid glutàmic (T73E) per imitar l'estat no fosforilat i fosforilat, respectivament, i examinem les seves localitzacions subcel·lulars. Per quantificar el patró de localització, el vam classificar en tres tipus: (1) cèl·lules amb localització predominantment nuclear de proteïna de fusió EGFP (N> C); (2) amb localització tant nuclear com citoplasmàtica ( N = C); i (3) amb localització predominant citoplasmàtica (NC), Calu-15-T73A no va mostrar cap localització nuclear (0% de N> C), mentre que no es va observar diferència significativa entre Calu-15-T73E i tipus salvatge (Figura 3a, P = 1, 41 × 10 −33 i P = 0, 10, respectivament). Així, aquests resultats suggereixen que la fosforilació de Calu-15 a Thr-73 està relacionada amb la seva localització nuclear.

Image

La caseïna cinasa 2 (CK2) fosforila la calumenina (Calu) -15 a la treonina a la posició 73 (Thr-73) i facilita la seva localització nuclear. ( a ) La localització subcel·lular de tipus salvatge Calu-15 (WT), T73A o T73E. Taulers de l’esquerra, imatges representatives. L’ADN nuclear es va tacar amb DAPI (4 ’, 6-diamidino-2-fenilindol; blau). Barra, 10 μ m. En el quadre dret, el gràfic mostra el percentatge de cèl·lules amb predominantment nuclears (N> C), tant nuclears com citoplasmàtiques (N = C) o predominantment citoplasmàtiques (N b ) Lisats de cèl·lules HEK293T que expressen els mutants Calu-15–2 × EGFP WT o T73A (panell superior), i els lisats de cèl·lules HEK293T que expressen Calu-15–2 × EGFP tractades amb dimetilsulfoxid (DMSO) o 4, 5, 6, El 7-tetrabromo-2-azabenzimidazol (TBB; panell inferior) van ser separats per electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida SDS-tag, després es van immunoblotar amb un anticòs contra EGFP. Les fletxes indiquen la forma fosforilada. ( c ) Les cèl·lules HeLa transfectades amb el mutant Calu-15–2 × EGFP WT o T73E van ser tractades amb DMSO o TBB durant 10 hores després de la transfecció i després es van fixar per a la seva observació. Taulers de l’esquerra, imatges representatives. L’ADN nuclear es va tacar amb DAPI (blau). Barra, 10 μ m. El quadre dret, els gràfics mostren el percentatge de cel·les amb diferents patrons de localització ( n = 3;> 50 cel·les per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0, 001; ns, cap diferència significativa (test de taula de contingència per a la independència). ( d ) Les cèl·lules HeLa transfectades amb Calu-15–2 × EGFP WT, T73A o T73E van ser tractades amb o sense leptomicina B (LMB) abans de la fixació i observació. L’ADN nuclear es va tacar amb DAPI (blau). Barra, 10 μ m. Els gràfics mostren el percentatge de cel·les amb diferents patrons de localització ( n = 3;> 50 cel·les per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; ns, cap diferència significativa (test de taula de contingència per a la independència)

Imatge a mida completa

Per confirmar que Calu-15 està fosforilat a Thr-73, es va utilitzar SDS-PAGE amb acrilamida Phos-tag de 50 μ M, en la qual les bandes fosforilades migren més lentament. 41 Es va detectar una banda fosforilada elevada de Calu-15 en tipus silvestre, mentre que aquesta banda gairebé va desaparèixer en el mutant Calu-15-T73A (Figura 3b). A continuació, per determinar si CK2 fosforila el Thr-73 de Calu-15 i afecta la seva localització nuclear, es va utilitzar 4, 5, 6, 7-tetrabromo-2-azabenzimidazol (TBB) per inhibir específicament l'activitat CK2 42 immediatament després la transfecció de Calu-15–2 × EGFP. El tractament amb TBB va disminuir el nivell de fosforilació de Calu-15 (figura 3b), i la localització nuclear de Calu-15 també es va interrompre significativament (del 75, 3% al 32, 3% de N> C) després de 10 hores amb tractament TBB (figura 3c, P = 5, 27 × 10 −10 ). Tot i això, el tractament amb TBB no va canviar la localització subcel·lular del mutant Calu-15-T73E (figura 3c, P = 0, 78), cosa que suggereix que CK2 fomenta la localització nuclear de Calu-15 mitjançant la fosforilació a Thr-73. Com que la pèrdua de fosforilació a Thr-73 va comportar una localització nuclear de Calu-15 (Figura 3a), es va examinar si es va deure a la disminució de la importació nuclear o a un augment del procés d’exportació nuclear. El tractament amb l’inhibidor d’exportació nuclear LMB no va poder augmentar la localització nuclear de Calu-15-T73A (Figura 3d, P = 0, 84), cosa que suggereix que el motiu pel qual el mutant Calu-15 – T73A no va mostrar cap localització nuclear no és l’augment de exportació nuclear. Junts, arribem a la conclusió que la fosforilació de Calu-15 a Thr-73 per CK2 és indispensable per a la seva localització nuclear.

Calu-15 promou la transcripció de GDF-15

Per desvelar la funció fisiològica de Calu-15 al nucli, es van examinar els nivells de transcripció d’un grup de gens (figura 4a). L'anàlisi quantitativa de PCR en temps real va demostrar que el nivell de mRNA de GDF-15 va augmentar significativament a la línia cel·lular HeLa expressant de manera estable Calu-15 – EGFP (Figura 4a, P = 6, 85 × 10 −6 i figura suplementària S3). De forma corresponent, també es va augmentar el nivell de proteïna GDF-15 quan es va sobreexpressar Calu-15–2 × EGFP, que es revela per Western Blot (Figura 4b, P = 0, 0006).

Image

La calumenina (Calu) -15 promou la transcripció del factor de diferenciació del creixement-15 (GDF-15). ( a ) Anàlisi quantitativa de PCR en temps real dels nivells relatius d'expressió d'ARNm dels gens indicats a les cèl·lules HeLa que expressen de forma estable Calu-15 – EGFP ( n = 3). ABHD2, domini α- / β- hidrolasa que conté proteïna 2; NELL2, factor de creixement epidèrmic neural similar al 2; ITPR1, receptor de l’inositol 1, 4, 5-trifosfat, tipus 1; PML, leucèmia promielocítica; EGFP, com a control. Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( b ) Els lisats de cèl·lules HEK293T que expressen Calu-15–2 × EGFP o 2 × EGFP es van immunoblotar (Western Blotting (WB)) amb els anticossos indicats. Al quadre dret, el gràfic mostra el nivell de proteïna relativa de GDF-15 ( n = 4). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( c ) Anàlisi de l'activitat promotora de GDF-15 mitjançant assaig reporter de doble luciferasa. El tauler esquerre mostra les estructures esquemàtiques dels plasmids amb diferents longituds del promotor GDF-15 seguit del gen luciferasa. El gràfic dret indica l'activitat relativa de la luciferasa a les cèl·lules HeLa de Calu-15 – EGFP que sobreexpressen transfectades amb els plasmids indicats ( n = 4). EGFP, com a control. Les dades són mitjanes ± SEM; ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 (prova de t d' alumne de dos cues no aparellada). ( d ) Test d'immunoprecipitació de cromatina (ChIP) de cèl·lules HeLa que expressen Calu-15 – EGFP o EGFP. ( e ) Quantificació de l'activitat del promotor GDF-15 en cèl·lules HeLa que expressen tipus salvatge Calu-15–2 × EGFP (WT), T73A o T73E ( n = 3). Les dades són mitjanes ± SEM; * P < 0.05 (test de t d' alumne de dos cues no aparellat)

Imatge a mida completa

Per investigar si Calu-15 canvia el nivell d’expressió GDF-15 mitjançant la interacció amb el seu promotor, vam realitzar un assaig reporter de doble luciferasa i vam trobar que sota el control del promotor de GDF-15 (1 kb) l’activitat relativa de luciferasa es va incrementar en gran mesura. a les cèl·lules que expressen Calu-15 – EGFP (Figura 4c, P = 3, 67 × 10 –3 ). Anàlisis posteriors van demostrar que només una regió de 200 pb del promotor GDF-15 era suficient (figura 4c, P = 1, 13 × 10 –3 ). D'altra banda, el test ChIP va confirmar la interacció entre Calu-15 i el promotor de GDF-15 (Figura 4d). Per verificar més els nostres descobriments, vam demostrar que la mutació no fosforilació T73A, amb un patró de localització citoplasmàtica, era insuficient per augmentar la relativa activitat luciferasa, que estava sota el control de la regió de 200 pb del promotor GDF-15, mentre que tant el tipus salvatge com la fosforilació imiten el mutant T73E podent (figura 4e, P = 0, 0337). En conjunt, aquests resultats suggereixen que el Calu-15 nuclear regula la transcripció del GDF-15 mitjançant unió a la seva regió promotora.

Calu-15 facilita la formació de filopodia mitjançant una via mediada per GDF-15

Curiosament, vam trobar que la sobreexpressió de Calu-15 – EGFP va promoure la migració cel·lular en l’assaig de cicatrització de ferides (Figura 5a i Figura Suplementària S4). A més, Calu-15 també va augmentar significativament el nombre i la grandària de filopodia (figura 5b, P = 9, 59 × 10 –5 ), que facilita la migració cel·lular mitjançant un reordenament d’actina altament actiu. 13 En conseqüència, el mutant imitant de la fosforilació T73E també va induir la formació de filopodia, mentre que el mutant T73A imitant la fosforilació va fallar (Figura 5c, P = 1, 46 × 10 –5, P = 5, 03 × 10 −6 i P = 3, 84 × 10 −5, respectivament) . Totes aquestes observacions coincideixen amb els informes anteriors que GDF-15 està implicat en la regulació de la migració cel·lular. 13 Tenint en compte que GDF-15 és una citocina i es segrega a l’espai extracel·lular, es va provar el medi condicionat a partir de cèl·lules HEK293T que expressen Calf-15–2 × EGFP i també es va induir la formació de filopodia (figura 5d, P = 1, 38 × 10 –4 ). A més, vam eliminar GDF-15 a les cèl·lules HeLa de Calu-15–2 × EGFP-sobreexpressant i vam trobar que l’esgotament de GDF-15 inhibia la funció de Calu-15 en la formació de filòfodes (Figura 5f, P = 9.20 × 10 –4 ). Col·lectivament, aquestes dades suggereixen que Calu-15 pot induir la formació de filopodia mitjançant GDF-15, que al seu torn afavoreix la migració cel·lular.

Image

La calumenina (Calu) -15 afavoreix la migració cel·lular i facilita la formació de filòfodes en una via depenent de la diferenciació del factor-15 (GDF-15). ( a ) Mides de ferides de cèl·lules HeLa que expressen Calu-15 – EGFP o EGFP en els punts de temps indicats ( n = 3). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( b ) Les cèl·lules HeLa transfectades amb Calu-15–2 × EGFP o 2 × EGFP es van tacar amb faltoidina Atto 565 per mostrar la localització i distribució de la actina filamentosa (F). Tauler esquerre, imatges representatives. Barra, 10 μ m. Al quadre dret, el gràfic mostra el percentatge de cèl·lules amb filopodia ( n = 3;> 100 cèl·lules per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( c ) Les cèl·lules HeLa transfectades amb tipus silvestre Calu-15–2 × EGFP (WT), T73A o T73E es van tacar amb la fal·loidina Atto 565. Tauler esquerre, imatges representatives. Barra, 10 μ m. Al quadre dret, el gràfic mostra el percentatge de cèl·lules amb filopodia ( n = 3;> 100 cèl·lules per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( d ) El medi condicionat recollit a partir de cèl·lules HEK293T transfectades amb Calu-15–2 × EGFP o 2 × EGFP es van afegir als cultius de cèl·lules HeLa, i després es van tacar les cèl·lules HeLa amb faltoidina Atto 565. Tauler esquerre, imatges representatives. Barra, 10 μ m. Al quadre dret, el gràfic mostra el percentatge de cèl·lules amb filopodia ( n = 3;> 100 cèl·lules per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( e ) A les 48 h després de la transfecció de shRNA de GDF-15, el nivell de proteïna de GDF-15 – EGFP a les cèl·lules HEK293T es va examinar per immunoblot (Western blotting (WB)). NC, control negatiu; 88, 91 i 92 indiquen el shRNA GDF-15 amb diferents seqüències objectiu; Pool, una barreja de shRNA 88, 91 i 92. GDF-15 ( f ) A 48 h després de la cotransfecció amb piscina de shRNA Calu-15–2 × EGFP i GDF-15 (piscina, panells inferiors) o shRNA NC (panells superiors ), Les cèl·lules HeLa es van tacar amb faltoidina Atto 565. Tauler esquerre, imatges representatives. Barra, 10 μ m. Al quadre dret, el gràfic mostra el percentatge de cèl·lules amb filopodia ( n = 3;> 100 cèl·lules per experiment). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). ( g ) Anàlisi quantitativa de PCR en temps real dels nivells relatius d'expressió d'ARNm de Calu-15 i GDF-15 en cèl·lules canceroses SW480 i SW620 ( n = 5). Les dades són mitjanes ± SEM; *** P < 0.001 (test de t d' estudiant de dos cues no aparellat). Per a b, c, d i f, per quantificar el nombre de cèl·lules amb filopodia, les cèl·lules es van obtenir positives en presentar almenys 10 filopodia ≥4 μ m de longitud

Imatge a mida completa

Per confirmar encara més la correlació entre Calu-15, GDF-15 i el potencial metastàtic del tumor, es va realitzar una anàlisi quantitativa de PCR en temps real en les línies cel·lulars de càncer colorectal SW480 i SW620, que eren del mateix pacient. En comparació amb el clon primari SW480, el SW620 originat a partir del gangli limfàtic metastàtic presenta un potencial metastàtic més elevat del tumor. 43, 44 De manera consistent, tant els nivells d'ARNm de Calu-15 com GDF-15 van augmentar significativament a les cèl·lules SW620 (figura 5g, P = 2, 25 × 10 −7 i P = 5, 13 × 10 −14, respectivament), cosa que suggereix una correlació significativa entre Calu -15, GDF-15 i potencial metastàtic del tumor.

Discussió

En aquest estudi, hem trobat que el gen CALU codifica 13 noves isoformes a més de Calu-1 i Calu-2. Entre ells, només Calu-15 mostra localització nuclear. Demostrem que Calu-15 està fosforilat a Thr-73 per CK2, i després entra al nucli per promoure la transcripció de GDF-15 via unió al seu promotor, donant lloc a una millora de formació de filopodia i migració cel·lular (Figura 6). A més, l'entrada de Calu-15 al nucli està mediada per la importina- α i la Ran GTPase, mentre que la seva exportació del nucli està mediada per Crm1.

Image

Model de treball proposat de calumenina (Calu) -15. Calu-15 experimenta fosforilació a la treonina a la posició 73 (Thr-73) per la caseïna cinasa 2 (CK2) i després afavoreix la seva entrada al nucli. Al nucli, Calu-15 pot activar la transcripció del factor de diferenciació de creixement-15 (GDF-15) via unió a la seva regió promotora, i després condueix a la formació de filopodia, que al seu torn afavoreix la migració cel·lular

Imatge a mida completa

Un gen pot produir més d'una isoforma per funcionar de manera semblant o diferent. Els nostres resultats mostren que el gen CALU produeix 15 isoformes a les cèl·lules humanes mitjançant empalmament alternatiu, mentre que 13 d’elles s’identifiquen primer. Entre aquests 15 isoformes, Calu 1-14 tots tenen un pèptid de senyal N-terminal i poden localitzar-se en el lumen del sistema endomembrana. Tot i això, només Calu-15, que no té el N-terminal 151 aa, mostra acumulació nuclear i té noves funcions com a regulador de transcripció. Curiosament, el gen homòleg de Drosophila melanogaster , SCF , també codifica una isoforma nuclear DmSCF (factor de supercoblament d’ADN) mitjançant el splicing alternatiu. 45 Per tant, suggereix que la producció d’una isoforma nuclear del gen CALU es conserva evolutivament i té una funció fisiològica important.

A les cèl·lules eucariotes, els receptors d’importació nuclear com la importina- α i la β reconeixen el senyal de localització nuclear (NLS) de les proteïnes i després formen un complex d’importació per entrar al nucli, 33 mentre que les exportines com Crm1 reconeixen el senyal d’exportació nuclear. (NES) i formar un complex d'exportació per sortir. 33, 36 Al nostre experiment, Calu-15 interacciona tant amb importina- α com amb Crm1. Tanmateix, no hem identificat cap NLS i NES clàssica a Calu-15, cosa que suggereix que hi pot haver altres proteïnes per mediar el seu llançament nuclear-citoplasmàtic o que Calu-15 contingui NLS i NES no clàssiques. A més, mostrem que la fosforilació de Calu-15 a Thr-73 per CK2 és indispensable per a la seva localització nuclear, cosa que és similar als informes recents que la llançament nuclear-citoplasmàtica es pot regular mitjançant modificacions de proteïnes com la fosforilació i la desfosforilació. S'ha informat que 38, 39 CK2 regulen l'exportació nuclear de S6K1 II, 46, però en el nostre estudi actua com un regulador per facilitar la importació nuclear de Calu-15. Tanmateix, encara no sabem si la fosforilació de Thr-73 facilita la unió de Calu-15 directament a la importina- α o a algunes altres proteïnes de bastides. Un mecanisme més detallat necessita una investigació més avançada.

GDF-15 funciona com una citocina, participant en diversos processos cel·lulars. 13, 14, 15, 16, 17 Mentrestant, té funcions pleiotròpiques en la progressió del càncer. 17 Per la seva importància, el nivell de transcripció de GDF-15 està sota un control estricte de diverses vies reguladores. S'ha informat que molts factors de transcripció regulen la seva expressió, com p53, proteïna 1 de resposta al creixement precoç (EGR-1), Sp1, factor nuclear-B, poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 i hipòxia-factor inductible- 1 α . 14, 47, 48, 49, 50, 51 Els nostres resultats mostren que Calu-15, com a nou regulador GDF-15, s’uneix a la regió promotora de GDF-15 i les nostres dades preliminars suggereixen que podrien ser necessaris altres factors per a això. vinculant (dades no mostrades) La regió d’unió de Calu-15 a GDF-15 identifiquem oscil·la entre –168 i +32 pb al voltant del lloc d’inici de la transcripció, en la qual també conté un p53- (a +21 pb), tres Sp1- (dins de -133 a +41 pb), i dos llocs d’unió EGR-1- (dins dels –73 a –51 pb). 21, 47, 48 Si Calu-15 funciona de manera coordinada amb ells per promoure l'expressió de GDF-15 encara no està clar, però és evident que aquesta regió de 200 pb del promotor GDF-15 és crucial per a la seva transcripció. A més, no excloem la possibilitat que Calu-15 reguli les activitats de transcripció d’altres gens.

S'ha informat que GDF-15 promou la formació de filopodia i la metàstasi de cèl·lules canceroses de pròstata a través de la via de senyalització d'adhesió cinasa (FAK) -RhoA. Aquí mostrem que Calu-15 fomenta funcionalment la migració cel·lular facilitant la formació de filopodia i aquesta funció depèn de GDF-15. Per tant, les futures investigacions per investigar si Calu-15 també promou la formació de filopodia a través de la via de senyalització FAK-RhoA podria facilitar la comprensió del mecanisme detallat. A més, la funció del GDF-15 en la progressió del tumor és múltiple, però el mecanisme regulador del GDF-15 en les cèl·lules canceroses encara no s’entén de manera incompleta, mentre que les cèl·lules tumorals amb filopodia abundant són més malignes i invasives durant la progressió del tumor. 3, 4, 5 Tenint en compte els dos fets anteriors, Calu-15, com a regulador nou del GDF-15, podria tenir un paper pro-tumorigènic en el desenvolupament del càncer i servir de nou objectiu per a la teràpia contra el càncer.

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • HM002604 – HM002616

Informació complementària

Documents de Word

  1. 1.

    Informació complementària

Glossari

Calu

calumenina

XIP

immunoprecipitació per cromatina

CK2

caseïna cinasa 2

EGR-1

proteïna de resposta primerenca al creixement 1

FAK

adhesió focal cinasa

GDF-15

factor de diferenciació del creixement-15

LMB

leptomicina B

NLS

senyal de localització nuclear

NES

senyal d’exportació nuclear

TBB

4, 5, 6, 7-tetrabromo-2-azabenzimidazol

TGF- β

factor de creixement transformant - β

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)