Carboxypeptidase e: un regulador negatiu de la via de senyalització canònica wnt | oncogen

Carboxypeptidase e: un regulador negatiu de la via de senyalització canònica wnt | oncogen

Anonim

Temes

  • Càncer
  • Senyalització cel·lular
  • Oncogènesi

Resum

L'activació aberrant de la via de transducció del senyal Wnt canònic està implicada en moltes malalties, inclòs el càncer, i està especialment implicada en el desenvolupament i la progressió del càncer colorectal. La proteïna efectora clau de la via canònica de Wnt és la β-catenina, que funciona amb el factor T-cell / factor potenciador limfoide per activar l’expressió dels gens objectiu Wnt. En aquest estudi, es va utilitzar una nova pantalla funcional basada en la supervivència cel·lular en presència de cADNs que codifiquen proteïnes que activen la via Wnt identificant així nous components de senyalització Wnt. Aquí identifiquem la carboxipeptidasa E (| CPE) i la seva variant d’empalmament, ΔN-CPE, com a nous reguladors de la via Wnt. Mostrem que mentre que ΔN-CPE activa el senyal Wnt, la proteïna CPE (F-CPE) de longitud completa és un inhibidor de la senyalització de Wnt / β-catenina. F-CPE forma un complex amb el lligand Wnt3a i el receptor Frizzled. A més, els F-CPE interrompen els signalosomes induïts per desgràcia que són importants per a la transducció del senyal Wnt i redueixen els nivells i l'activitat de proteïnes de β-catenina. En conjunt, les nostres dades indiquen que F-CPE i ΔN-CPE regulen la via de senyalització Wnt canònica de manera negativa i positiva, respectivament, i demostren que aquest enfocament de cribratge pot ser un mitjà ràpid per aïllar els nous components de senyalització Wnt.

Introducció

La via Wnt / β-catenina és una via de desenvolupament clau que controla tant el desenvolupament embrionari com el manteniment dels teixits en adults. Tanmateix, l’activació aberrant de la via Wnt comporta una proliferació, creixement i supervivència cel·lulars incontrolades, promovent la progressió de diversos tipus de càncers humans, especialment els càncers colorectals humans (CRC). 1, 2, 3 En absència d'un senyal Wnt, els nivells de β-catenina, l'efector clau de la via de senyalització de Wnt, es mantenen baixos pel complex de destrucció de β-catenina que conté, entre d'altres, el supressor del tumor. proteïna poliposi adenomatosa coli i axina. Aquest complex afavoreix la fosforilació de la β-catenina per la caseïna cinasa 1α i el glicogen sintasa cinasa 3β, marcant-la adequada per a la ubiqüitat i posterior degradació proteasomal. En molts càncers, les mutacions en la poliposi coli adenomatosa, l’axina o la β-catenina interrompen la degradació d’aquest últim, provocant l’activació descontrolada dels gens diana Wnt. Quan s'activa la via Wnt, el lligand Wnt s'uneix al receptor transmembrana del Frizzled (Fz) i al receptor de coreoprètics de baixa densitat relacionat amb el receptor de lipoproteïnes 5 o LRP6 4 que condueix LRP6 a vesícules que contenen caveolina per endocitosi. 5 La cua citoplasmàtica de LRP6 és posteriorment fosforilada per la caseïna cinasa 1α i GSK-3β, que es recluten juntament amb l'Axina del complex de destrucció de β-catenina. 6 Aquests esdeveniments desencadenen la polimerització de Disheveled (Dvl), promovent la formació de cúmuls de proteïnes puntuals que són signalosomes associats a la membrana i el desmuntatge del complex de destrucció de β-catenina. 7, 8, 9, 10, 11 Com a resultat, la β-catenina no fosforilada s’acumula al citoplasma i es trasllada al nucli on s’associa amb factors de transcripció TCF i regula la transcripció dels gens diana Wnt. L'expressió anormal del gen objectiu de la senyalització Wnt és una de moltes aberracions que probablement contribueixin a la transformació neoplàstica. La cascada Wnt és extremadament complexa, regulada per diverses vies de senyalització i bucles de retroalimentació i formada per nombrosos components, alguns encara desconeguts.

Per intentar identificar nous components de senyalització Wnt, hem utilitzat una nova tècnica de cribratge. La pantalla es basa en la supervivència cel·lular només en presència d'ADNc que activen la via Wnt. Aquí es va identificar la carboxipeptidasa E (CPE) i la seva variant empalmadora, ΔN-CPE, com a nous reguladors de la senyalització Wnt. El CPE és una proteïna multifuncional que té funcions enzimàtiques i no enzimàtiques (revisada a Cawley et al. 12 ) expressada en gran mesura en cèl·lules endocrines i neurones peptidèrgiques del sistema nerviós. El CPE es coneix principalment com un enzim que processa les prohormones que també funciona en la classificació de les prohormones, el transport de les vesícules i la secreció. 12, 13, 14 Diferents formes de CPE s’expressen en diferents localitzacions subcel·lulars que presenten funcions diferents: per exemple, la CPE soluble que es troba en els grànuls secretors funciona com una exopeptidasa que clive els residus d’aminoàcids bàsics del C-terminal per produir neuropèptids i hormones madurs, 14. mentre que la CPE unida a membrana de la xarxa trans- Golgi funciona com a receptor d’ordenació. 13 estudis recents que analitzen l’ARNm CPE en microarrays suggereixen que podria estar implicat en el desenvolupament o la progressió del càncer. Es va observar una reducció de l'activitat de CPE en el neuroblastoma, 15 mentre que els nivells elevats de CPE en els tumors neuroendocrins són un predictor de bon pronòstic. 16 En les línies cel·lulars de glioma, els nivells elevats de CPE es van associar amb un augment de la taxa de proliferació, mentre que la derrota de CPE va millorar la migració i la invasió. La CPE també va estar present en cèl·lules canceroses no endocrines, on la seva expressió està normalment absent, incloent cèl·lules canceroses derivades de l'epiteli com ara càncer de mama, 18 de cèrvix i ronyó. 19 Aquests estudis suggereixen que els nivells elevats d’ARNm CPE es correlacionen amb els tumors metastàtics en comparació amb els teixits normals o els tumors benignes. Les aparents troballes contradictòries sobre si la CPE promou o inhibeix la metàstasi es va aclarir amb el recent descobriment de la variant empalmadora, CPE-ΔN (també anomenada ΔN-CPE). Examinant l'expressió de CPE en tumors derivats de l'epiteli, com el carcinoma hepatocel·lular i el carcinoma colorrectal, revelen que només s'expressa la variant empalmada i no la CPE de longitud completa (F-CPE). 20 Aquesta variant empalmada alternativa, ΔN-CPE, no té el pèptid senyal que normalment l’orienta cap a la via secretora i s’expressa en tumors altament metastàtics. 20 El ΔN-CPE citoplasmàtic es tradueix en el nucli i augmenta l’expressió del gen metastàtic, “cèl·lula precursora neural expressada en reglació del desenvolupament” (NEDD 9), d’una manera que depèn de l’histona deacetilasa 1 i 2. També es regulen altres gens metastàtics i anti-apoptòtics que condueixen a la promoció de metàstasi tumoral induïda per ΔN-CPE. 21

En el present estudi, demostrem que mentre que la proteïna ΔN-CPE activa la via oncogènica Wnt, la proteïna F-CPE disminueix tant la senyalització Wnt com els nivells de β-catenina. Addicionalment, F-CPE colocalitza amb Wnt3a mentre que ΔN-CPE colocalitza al nucli amb β-catenina. Finalment, F-CPE interacciona tant amb el lligand Wnt3a com amb el seu receptor Fz, resultant en una interrupció dels signosomes induïts per Dvl. Aquests descobriments indiquen que CPE i ΔN-CPE funcionen com a nous reguladors de la via canònica de senyalització Wnt.

Resultats

CPE: un nou regulador de Wnt

Una pantalla dirigida a la identificació de nous activadors de senyalització Wnt va conduir a l'aïllament de 104 gens. Una pantalla secundària va reduir aquests candidats a 32 activadors de senyalització Wnt de la novel·la putativa (figures suplementàries 1 i 2; taula suplementària 1). Un dels gens identificats a la nostra pantalla era CPE. El CPE es va aïllar en tres rondes independents de cribratge, mostrant una activació relativament forta de la transcripció gènica de la β-catenina / TCF (figura suplementària 2). L’ADNc de CPE aïllat a la nostra pantalla només contenia els 140 aminoàcids C-terminal (ja que la biblioteca de l’ADNc és una biblioteca dT oligo). Per investigar l'efecte de la CPE a la ruta Wnt, es va utilitzar l'ADNc F-CPE i els residus CPE terminals del 365 C (ΔN-CPE) fusionats a la proteïna fluorescent verda (GFP) o a l'etiqueta FLAG. Els plàmids codificants CPE es van provar per primer cop per comprovar la seva capacitat d’afectar específicament la via Wnt mitjançant la mesura de la transcripció mediada per β-catenina / TCF (mitjançant el test del reporter pTOPFLASH / pFOPFLASH). L'efecte sobre els nivells de proteïna de β-catenina també es va examinar per electroforesi en gel de SDS – poliacrilamida i per blot occidental. Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb els plasmides reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH, GFP-β-catenina i les dues construccions CPE. D'acord amb els resultats de la nostra pantalla, la proteïna ΔN-CPE va conduir a un augment de la transcripció de β-catenina / TCF i de proteïnes de β-catenina (Figura 1a). Sorprenentment, l’expressió de F-CPE va donar lloc a una disminució de la transcripció de β-catenina / TCF i a uns nivells reduïts de proteïnes de β-catenina (Figura 1a). La capacitat de F-CPE per reduir la transcripció i la proteïna de β-catenina mediada per β-catenina i els nivells de proteïna β-catenina es va tornar a aplicar mitjançant un assaig depenent de la dosi (Figura 1b) Es van obtenir resultats similars quan es va utilitzar myc o FLAG-β-catenina (no mostrada). A continuació, vam regularitzar la via Wnt mitjançant l'expressió ectòpica d'altres activadors de Wnt coneguts: Dvl o el lligant Wnt3a i el seu receptor Fz1. De nou, la proteïna F-CPE va reduir els nivells de transcripció mediada per β-catenina i TCF, així com els nivells endògens de proteïna β-catenina (utilitzant un anticòs que detecta la forma activa de β-catenina) 22 (Figura 1c). L’especificitat de l’efecte es va confirmar mitjançant l’ús de la interferència d’ARN per reduir l’expressió CPE a les cèl·lules PC-12 que expressen F-CPE endògena (figura 7d), però no hi ha ΔN-CPE detectable. Com es mostra a la figura 1d, l’esgotament de la CPE va provocar un augment dels nivells de senyalització de Wnt i la regulació de la forma activa de β-catenina i dels gens cíntics W-cc myc i SOX-9.

Image

CPE afecta la ruta de senyalització de Wnt. ( a ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH i el plasmidi β-gal, juntament amb GFP-β-catenina i F-CPE-GFP o ΔN-CPE-GFP tal com s'indica (0, 5 μg / ml). Quaranta-vuit hores després es van collir les cèl·lules i es van determinar els nivells de luciferasa (panells superiors). Les mateixes mostres van ser sotmeses a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-GFP. L'activitat de la β-galactosidasa es va utilitzar per normalitzar l'eficiència de transfecció. La tubulina servia com a control de càrrega. ( b ) Com en a, que mostra l'activitat que depèn de la dosi de la construcció de F-CPE-GFP sobre la β-catenina i la senyalització Wnt. ( c ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH, el plasmidi β-gal i F-CPE-GFP, Fz1 + Wnt3a o Dvl segons s'indica. Quaranta-vuit hores després es van collir les cèl·lules i es van determinar els nivells de luciferasa (panell superior). Les mateixes mostres van ser sotmeses a anàlisi de taquilla occidental. La proteïna F-CPE-GFP es va detectar utilitzant un anticòs anti-GFP, i es va detectar β-catenina activa endògena mitjançant un anticorp β-catenina anti-actiu. La tubulina servia com a control de càrrega. ( d ) Utilitzant la transfecció transitòria d’oligos específics que codifiquen siRNA CPE, es va disminuir l’expressió de la proteïna F-CPE endògena en cèl·lules PC-12. Vint-i-quatre hores després de la transfecció de siRNA, les cèl·lules van ser transfectades amb plàmids pTOPFLASH / pFOPFLASH i β-gal per a la detecció de la luciferasa. A les 48 hores posteriors a la transfecció, les cèl·lules es van collir i van ser sotmeses a assaig de luciferasa segons les instruccions del fabricant seguides de l'anàlisi de taquilla occidental tal com es descriu anteriorment. El CPE, c-myc i SOX-9 endògens es van detectar mitjançant anticossos específics. La β-catenina activa endògena es va detectar utilitzant un anticòs anti-β-catenina anti-actiu. La tubulina servia com a control de càrrega.

Imatge a mida completa

Es necessita un complex funcional de destrucció de β-catenina per a l'activitat de CPE

Per entendre millor el mecanisme pel qual la CPE regula la via Wnt, vam provar l'efecte de F-CPE en un mutant β-catenina β-catenina constitutivament actiu que no pot ser fosforilat per GSK-3β 23 (Figura 2a). Com a alternativa, hem utilitzat LiCl que inhibeix la funció del GSK-3β i activa la via Wnt (figura 2b). Els resultats demostren que en ambdues condicions, la F-CPE tenia poc efecte sobre la transcripció de β-catenina / TCF o sobre els nivells de proteïnes de β-catenina. A continuació, vam provar la capacitat de la CPE per modular la senyalització Wnt independentment del "complex de destrucció de β-catenina". Per a això, es va utilitzar la línia de cèl·lules CRC SW480 que conté un complex de degradació β-catenina no funcional. 24 La F-CPE no va tenir cap efecte en la transcripció de la β-catenina / TCF, ni en els nivells endògens de β-catenina ni en el gen de Wnt SOX-9 . Tanmateix, la construcció ΔN-CPE va augmentar la transcripció mediada per β-catenina / TCF de forma dependent de la dosi i va millorar els nivells de β-catenina i en menor mesura el gen objectiu de la senyalització Wnt SOX-9 (Figura 2c). En conjunt, aquests resultats suggereixen que es necessita un complex funcional de degradació de β-catenina perquè la capacitat de CPE afecti el senyal Wnt.

Image

Es requereix un complex funcional de degradació de la β-catenina per a l'activitat de la CPE. ( a ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH, el plasmidi β-gal, una forma constitutivament activa de GFP-β-catenina (S33A-β-catenina) i diferents quantitats de F-CPE-GFP. Quaranta-vuit hores després es van collir les cèl·lules i es van determinar els nivells de luciferasa. Les mostres van ser sotmeses a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-GFP. La tubulina servia com a control de càrrega. ( b ) Les cèl·lules HEK293T van ser transseccionades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH, el plasmidi β-gal, GFP-β-catenina (0, 3 μg / ml) i diferents quantitats de F-CPE-GFP tal com es va indicar. Vint-i-quatre hores després, es van tractar les cèl·lules amb 30 m de LiCl durant 24 hores. Les mostres van ser recollides i sotmeses a assaig de luciferasa i anàlisi de blot occidental mitjançant un anticòs anti-GFP. La tubulina servia com a control de càrrega. ( c ) Les cèl·lules SW480 van ser transfectades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH, renilla luciferasa i F-CPE-GFP (esquerra) o ΔN-CPE-GFP (dreta). Quaranta-vuit hores després es van collir les cèl·lules i es van determinar els nivells de luciferasa. Els nivells de renilla luciferasa es van utilitzar per normalitzar l'eficiència de transfecció. Les mostres van ser sotmeses a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-GFP. Es van determinar els nivells de β-catenina endògena i de SOX-9 mitjançant anticossos específics. La tubulina servia com a control de càrrega.

Imatge a mida completa

El CPE inhibeix la via Wnt depenent del proteasoma

Els nostres resultats indiquen que l’expressió de CPE condueix a nivells reduïts de la proteïna β-catenina. Per provar si l'efecte de la CPE en la β-catenina era dependent del proteasoma, es va utilitzar l'inhibidor del proteasoma MG132. L’anàlisi de Western blot mostra clarament que l’efecte de la F-CPE sobre els nivells de proteïna β-catenina es va revertir quan es van tractar les cèl·lules amb MG132 (Figura 3a). Com que el CPE no va afectar els nivells de Wnt3a, (Figura 3b) la disminució de la senyalització Wnt no s’atribueix a nivells reduïts de la proteïna Wnt3a. A continuació, es va coexpressar la micc-β-catenina a les cèl·lules HEK293T juntament amb les construccions ΔN-CPE o F-CPE, i es van realitzar assajos d’immunofluorescència (IF). Com era d'esperar, la tinció de mic-β-catenina es va abolir quan es co-transfectava amb F-CPE. No obstant això, el tractament de les cèl·lules amb l’inhibidor del proteasoma MG132 va revertir aquest efecte (figura 3c). De manera intrigant, la sobreexpressió de F-CPE-GFP va donar lloc a l'esgotament de la mic-β-catenina tant en cèl·lules transfectades com no transfectades, cosa que suggereix que el CPE secretat afectava els nivells de β-catenina als últims (Figura 3c). En absència de CPE (control del GFP), es va detectar β-catenina a les cèl·lules transfectades i una mica estabilitzada per MG132 tal com s’esperava (Figura 3d). La coexpressió de la construcció de ΔN-CPE amb la mic-β-catenina no va disminuir els nivells de β-catenina independentment del tractament amb MG132 (Figura 3e). A les cèl·lules co-transfectades, les dues proteïnes es van colocalitzar parcialment tant en el citoplasma com en el nucli (ampliació de la figura 3). Aquests resultats indiquen que F-CPE indueix la degradació de β-catenina mediada per proteasomes.

Image

L’efecte de CPE sobre el senyal de Wnt depèn de l’activitat del proteasoma. ( a ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb GFP-β-catenina i F-CPE-GFP, tal com es va indicar. Vint-i-quatre hores després, es van afegir 25 μ M MG132 a les cèl·lules durant 24 hores addicionals. Es van recol·lectar cèl·lules i es van sotmetre a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-GFP. La tubulina servia com a control de càrrega. ( b ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb Wnt3a-HA i quantitats creixents de F-CPE-GFP, tal com s'ha indicat. L’anàlisi de Western blot es va realitzar mitjançant anticossos anti-HA i anti-GFP, respectivament. ( c, d i e ) les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb F-CPE-GFP, GFP o les construccions ΔN-CPE-GFP juntament amb la mic-β-catenina (com s'indica). Vint-i-quatre hores després de la transfecció, les cèl·lules es van tractar durant la nit amb 25 μ M MG132. Les cèl·lules es van fixar i van reaccionar amb un anticòs anti-mic i un anticòs conjugat amb rodamina. Les imatges es van fer mitjançant un microscopi confocal. Tingueu en compte l’immunostainció ΔN-CPE al citoplasma i al nucli d’algunes cèl·lules. Barra = 10 μm.

Imatge a mida completa

F-CPE secretada afecta la senyalització Wnt

Com que el CPE és una proteïna secretada, 25 es va examinar si les diferents construccions de CPE utilitzades en aquest estudi estan segregades de cèl·lules transfectades. Els nostres resultats mostren que F-CPE, ja sigui no etiquetat o etiquetat amb un epítop GFP o FLAG, està secretat de manera eficaç al mitjà (figura 4a, panell superior). ΔN-CPE que mostrava nivells d’expressió relativament inferiors no es va secretar (figura 4a, plafó inferior) fins i tot quan es van utilitzar quantitats més grans de plasmids. Això no sorprèn, ja que la proteïna ΔN-CPE no té un pèptid senyal. La figura 4b representa una clara correlació entre les quantitats transfectades i secretades de proteïna F-CPE. Per explorar si la CPE secretada afecta el medi condicionat CM (senyalització Wnt) a partir de cèl·lules transfectades amb F-CPE-GFP o de cèl·lules que secreten Wnt (L-Wnt3a) 26, s’han utilitzat. Les cèl·lules HEK293T transfectades amb els reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH es van cultivar en diferents CM durant 18 h. Com era d'esperar, el Wnt CM va augmentar la transcripció dependent de TCF / β-catenina i va conduir a nivells de proteïnes amplificades de proteïnes de β-catenina (figura 4c, carril 4). El suplement de les cèl·lules amb CPE CM va donar lloc a una disminució de la transcripció mediada per TCF / β-catenina i els nivells de proteïna β-catenina (figura 4c, carril 3). Els nivells reduïts de transcripció mediada per TCF / β-catenina també es van obtenir quan es va afegir CPE CM a les cèl·lules transfectades amb diferents activadors de la cascada Wnt (figura 4d). Per establir l’especificitat dels nostres resultats es va utilitzar una proteïna recombinant CPE purificada. La senyalització wnt activada per sobreexpressió Wnt3a + Fz1 es va reduir en presència de proteïna CPE purificada (figura 4e). També es demostra que el tractament de cèl·lules L-Wnt3a amb la proteïna CPE purificada va conduir a una disminució dels nivells endògens de β-catenina activa (figura 4f).

Image

El CPE secretat afecta la senyalització Wnt. ( a ; panell superior) Les cèl·lules HEK293T van ser transfectades amb F-CPE-GFP, F-CPE-FLAG i sense etiquetar-F-CPE. Quaranta-vuit hores després de la transfecció es van recollir els mitjans cel·lulars i es van collir les cèl·lules transfectades. Els medis i els lisats van ser sotmesos a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-CPE. Les cel·les HEK293T van ser transfectades amb F-CPE i ΔN-CPE etiquetades amb FLAG (panell inferior). Quaranta-vuit hores després de la transfecció es van recollir els mitjans cel·lulars i es van collir les cèl·lules transfectades. Els medis i els lisats van ser sotmesos a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-FALG. La tubulina servia com a control de càrrega. ( b ) Les cèl·lules HEK293T van ser transfectades amb diferents quantitats de F-CPE-GFP. Els medis i els lisats van ser sotmesos a anàlisis de Western blot mitjançant un anticòs anti-CPE. ( c ) Les cèl·lules HEK293T van ser transfectades amb F-CPE-GFP. Vint-i-quatre hores després, es va recollir CM de les cèl·lules transfectades. El Wnt CM es va recollir a partir de cèl·lules L-Wnt3a. Els diferents mitjans es van afegir a les cèl·lules HEK293T transfectades amb els plasmides reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH. Els nivells de luciferasa es van detectar 24 hores després. El panell superior mostra els nivells d’β-catenina endògena activa com es detecta mitjançant un anticorp específic. ( d ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb β-catenina-GFP, HA-Wnt3a, HA-Dvl i Fz1 juntament amb els plasmides reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH. Es va afegir CPE CM (com a c ) a les cèl·lules transfectades durant 24 h i es van detectar els nivells de luciferasa. ( e ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb Wnt3a i Fz1 juntament amb els plasmides reporters pTOPFLASH / pFOPFLASH. Dotze hores després es van suplementar les cèl·lules amb medis que contenien CPE purificat, tal com s’indica. Dotze hores després es van determinar els nivells de luciferasa. ( f ) Les cèl·lules L i L-Wnt3a es van complementar amb medis que contenien CPE purificat, tal com es va indicar. Les cèl·lules es van collir 12 hores després i es van detectar nivells actius de β-catenina mitjançant un anticorp específic. La tubulina servia com a control de càrrega (a l’esquerra). Es va realitzar una anàlisi densitomètrica de β-catenina activa mitjançant el programa TINA (a la dreta).

Imatge a mida completa

CPE interacciona tant amb Wnt3a com amb Fz1, però no pertorba el complex Wnt-Fz

Els següents experiments estaven dirigits a determinar si hi ha una interacció cel·lular entre F-CPE i els membres de la via Wnt. Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb construccions que codifiquen HA-GSK-3β, Dvl o Wnt3a i F-CPE-GFP. Tal com es veu a la figura 5a, F-CPE va coimmunoprecipitar específicament amb Wnt3a però no amb GSK-3β o Dvl. Per mapar els dominis en interacció, vam provar un constructe que expressa els primers 113 residus d'aminoàcids de CPE (N-CPE) a més de les construccions ΔN-CPE i F-CPE. Només el domini F-CPE i el N-terminal van interactuar amb Wnt3a (figura 5b). També mostrem que ambdues construccions interaccionen amb el domini ric en cisteïna (CRD), que és el domini que lliga Wnt de Fz1 (Figura 5c). Com que l'activació de la via Wnt depèn de la unió del lligand Wnt al seu receptor Fz, es va examinar si el CPE interfereix amb la capacitat de Wnt3a d'unir Fz1. Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb HA-Wnt3a, FLAG-HFz1-CRD i amb F-CPE-GFP o vector buit. Les dades mostren que les mateixes quantitats de Wnt3a coimmunoprecipitades amb HFz1-CRD en presència i absència de F-CPE, indicant que F-CPE no pertorba el complex Wnt-Fz (Figura 5d).

Image

CPE forma un complex amb Wnt3a i Fz1 però no interromp el complex Wnt-FZ. ( a ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb F-CPE-GFP, HA-Wnt3a, HA-GSK-3β o HA-Dvl, tal com s'indica. El lisat cel·lular total va ser immunoprecipitat mitjançant un anticòs anti-HA i analitzat per Western blotting mitjançant un anticossos anti-HA i anti-GFP. ( b ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb Wnt3a i les diferents constructes CPE tal com es va indicar. La IP es va realitzar tal com es descriu a a . ( c ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb FLAG-Hfz1-CRD i les construccions CPE tal com s'indica. La IP es va realitzar mitjançant un anticòs anti-FLAG. ( d ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb Wnt3a, FLAG-Hfz1-CRD i F-CPE-GFP tal com es va indicar. La IP es va realitzar tal com es descriu a c .

Imatge a mida completa

El CPE secretat forma un complex amb Wnt3a i Fz1-CRD secretats

Quan vam plantejar que la F-CPE extracel·lular afecta la cascada de Wnt, vam provar si F-CPE i Wnt3a poden interactuar fora de les cèl·lules. Per a això es van expressar ectòpicament CPE i Wnt3a i es van recollir extrems de CM i cèl·lules per a assajos d’immunoprecipitació (IP). De fet, CPE i Wnt3a interaccionen tant en els lisats de cèl·lules com en els medis de les cèl·lules transfectades (figura 6a). Les cèl·lules van ser després transfectades amb FLAG-HFz1-CRD i complementades amb CPE CM per provar la formació complexa. Tal com es mostra a la figura 6b, la CPE secretada pot interactuar amb el domini extracel·lular del receptor Fz1: la CRD. Per estudiar les interaccions endògenes es van utilitzar cèl·lules L-Wnt3a, ja que són les úniques cèl·lules que expressen i secreten tant CPE com Wnt3a en diverses línies cel·lulars provades (figura 6c). Tal com es veu a la figura 6d, es va precipitar un complex proteic que contenia CPE i Wnt3a tant del lisat com dels medis de cèl·lules L-Wnt3a mitjançant anticossos anti-Wnt3a o anti-CPE.

Image

CPE i Wnt3a formen un complex extracel·lular. ( a ) Les cèl·lules HEK293T van ser co-transfectades amb F-CPE-FLAG i HA-Wnt3a, tal com es va indicar. Vint-i-quatre hores després, els mediats i els lisats cel·lulars van ser sotmesos a assaig IP mitjançant comptes d'agarosa conjugada amb FLAG. A continuació, es va realitzar una anàlisi de Western blot mitjançant anticossos anti-FLAG i anti-HA. ( b ) Les cèl·lules HEK293T van ser transfectades amb FLAG-Hfz1-CRD. Dotze hores després de la transfecció, les cèl·lules es van complementar amb CPE CM durant 12 hores addicionals. Les cèl·lules es van recol·lectar i sotmetre a un assaig IP mitjançant perles d'agarosa conjugades amb FLAG. L’anàlisi de Western blot es va realitzar després utilitzant anticossos anti-FLAG i anti-CPE. ( c ) El patró d'expressió de diferents components de senyalització Wnt en medis i lisats es va determinar en diferents línies cel·lulars mitjançant anàlisis de Western blot mitjançant anticossos específics. ( d ) Les cèl·lules L i L-Wnt3a es van utilitzar per determinar la formació complexa entre CPE i Wnt3a mitjançant assajos IP. Es van recopilar tant medis com lisats i es van utilitzar anticossos específics per a l’anàlisi d’IP i Western blot.

Imatge a mida completa

El CPE colocalitza en part amb Wnt3a i pertorba els conjunts de proteïnes de Dvl

Per intentar identificar el mecanisme pel qual F-CPE afecta la cascada Wnt, es va examinar la seva localització subcel·lular juntament amb diversos altres membres de la senyalització Wnt. Segons els nostres resultats, la CPE transfectada no va colocalitzar amb Axin i GSK-3β, ni va alterar la seva localització subcel·lular (dades no mostrades). Tot i això, tant a les cèl·lules COS-7 com a HEK293T, F-CPE va mostrar certa colocalització amb Wnt3a (Figura 7a). És important destacar que la CPE expressada ectòpicament es va colocalitzar amb Wnt3A endògena (figura 7b). Com que el trànsit CPE i Wnt s’uneixen al complex 27, 28 de Golgi , probablement s’embalen a les mateixes vesícules per obtenir la secreció. 29 Més interessant, quan es coexpressa amb Dvl, F-CPE sembla pertorbar els conjunts de proteïnes de Dvl (figura 7c). Es va informar que aquests proteïnes puncti, anomenats signalsomes, eren essencials per a l'activitat de Dvl com a regulador positiu de la via Wnt. 7, 8, 30 L’efecte de la CPE sobre Dvl només es va veure en cèl·lules que sobreexpressaven ambdues proteïnes. Potser la concentració local de CPE al voltant de les cèl·lules transfectades era superior a les cèl·lules veïnes no transformades, per tant, insuficient per afectar-les. S'ha demostrat que el Dvl sobreexpressat forma grans puntes citoplasmàtiques mentre que el Dvl endogen forma oligòmers de baix pes molecular. 31 Aquests grans puntes també es va demostrar que activen la via Wnt (revisada a Reznik i Fricker 32) És possible que la CPE sobreexpressada pugui afectar fortament Dvl sobreexpressat (que forma grans signosomes) en cèl·lules que expressen ectòpicament les dues proteïnes. Hem comparat el patró d’expressió ectòpica. de Dvl en dues línies de cèl·lules neurals. De fet, en les cèl·lules PC-12 que expressen i segreuen F-CPE, el patró de tinció de Dvl expressat ectòpicament és en bona part citoplasmàtica i difusa, en canvi, la tinció de Dvl en cèl·lules U-87 que no tenen El CPE detectable mostra cúmuls puntuals típics (Figura 7d). A continuació, vam provar si la F-CPE secretada pot provocar el mateix efecte: les cèl·lules COS-7 van ser transfectades amb HA-Dvl i complementades amb CPE i Wnt3a CM abans dels assaigs IF (Figura 7e). El patró d’expressió de Dvl exògena en cèl·lules exposades tant a CPE com a Wnt3a CM va ser més difós en comparació amb el patró puntual característic que es sol veure quan Dvl està sobreexpressat. Es van comptar els patrons de tinció de DVD. Els resultats mostren que exposar cèl·lules a CM que contenien CPE i Wnt3a va donar lloc a un nombre més elevat de cèl·lules que presentaven una expressió Dvl citoplasmàtica i difusa (figura 7e, dreta). Es va realitzar un experiment similar en cèl·lules L-Wnt3a complementades amb F-CPE purificada. Un patró puntual de Dvl endògena s’observa clarament a les cèl·lules no tractades, mentre que el tractament amb F-CPE soluble va donar lloc a un patró més difós de Dvl (figura 7f). Aquests resultats suggereixen que la CPE pertorba els signalosomes, augmentant la degradació proteasomal de la β-catenina.

Image

El CPE colocalitza en part amb Wnt3a i afecta els conjunts de proteïnes Dvl. ( a ) Les cèl·lules HEK293TorCOS-7 van ser co-transfectades amb F-CPE-GFP i HA-Wnt3a. Quaranta-vuit hores després es van arreglar les cèl·lules, es van tacar amb un anticòs anti-HA que es va visualitzar mitjançant un anticorp conjugat amb rodamina. Les imatges es van fer mitjançant un microscopi confocal. ( b ) Les cèl·lules L-Wnt 3a van ser transfectades amb F-CPE-GFP. Quaranta-vuit hores després es van fixar les cèl·lules, es van tacar amb un anticòs anti-Wnt 3a que es va visualitzar mitjançant un anticòs conjugat amb rodamina. Les imatges es van fer mitjançant un microscopi confocal. ( c ) Les cèl·lules HEK293T o COS-7 van ser co-transfectades amb F-CPE-GFP i HA-Dvl. Quaranta-vuit hores després es van arreglar les cèl·lules, es van tacar amb un anticòs anti-HA que es va visualitzar mitjançant un anticorp conjugat amb rodamina. Les imatges es van fer mitjançant un microscopi confocal. ( d, panell esquerre) Es va recollir el medi de les cèl·lules PC-12 o U-87 i es van collir cèl·lules i es van sotmetre a anàlisis de blot occidental. F-CPE endògena, però no ΔN-CPE, es va detectar en cèl·lules i medis PC-12 i tampoc no es va detectar en cèl·lules U-87 o medis mitjançant un anticorp anti-CPE. La tubulina servia com a control de càrrega. Panell dret: les cèl·lules PC-12 i U-87 van ser transfectades amb HA-Dvl i sotmeses a imatges IF com es descriu. ( e ) Les cèl·lules COS-7 van ser transfectades amb HA-Dvl i incubades amb CM tal com es va indicar. Es mostra la tinció representativa (esquerra). El percentatge de cèl·lules que contenien un patró puntual i difós de tinció de HA-Dvl es va calcular en un gran nombre de cèl·lules ( n = 50) (quadre dret). ( f ) Les cèl·lules L-Wnt3a es van incubar amb F-CPE purificada a 200 n M durant 12 hores. Es mostra una coloració de Dvl endògena (panells de l’esquerra) en cèl·lules L-wnt3a amb o sense tractament amb CPE (200 n M). Les fletxes apunten al patró d’expressió puntual de Dvl. Els gràfics de barres (a la dreta) que mostren el percentatge de cel·les que expressen Dvl en un patró puntual (versus patró difós) calculat en un gran nombre de cel·les ( n = 80). Barra = 10 μm.

Imatge a mida completa

Discussió

En el present estudi, hem aprofitat la nostra capacitat per activar la senyalització Wnt en condicions definides per establir un sistema funcional de cribratge en cèl·lules de mamífers. Aquest mètode de cribratge permet una forma ràpida i eficaç d’identificar gens que l’expressió modifiqui específicament la via Wnt. Un dels gens aïllats a la nostra pantalla codifica la proteïna CPE. La família de proteïnes carboxipeptidasa participa en moltes funcions diverses, però, només s'ha connectat prèviament la carboxipeptidasa Z (CPZ) a la cascada Wnt, ja que es va demostrar que unia el lligand Wnt4 no canònic. 33, 34 A diferència de CPE, CPZ conté una CRD similar a la que es troba a la família Fz dels receptors Wnt que media la seva vinculació a Wnt4. 35 Tot i que el CPE té diverses funcions definides, no hi ha indicis actuals per a la seva implicació en cap ruta de senyalització cel·lular específica. Aquí, proporcionem proves que CPE participa en la regulació de la via canònica de senyalització Wnt. Aquesta via és extremadament complexa i està regulada a tots els nivells des de la secreció del lligand Wnt fins a la recepció del senyal al nucli per part de membres de la família TCF / LEF. Els nostres estudis indiquen que mentre que ΔN-CPE, que és intracel·lular i parcialment nuclear, indueix l’acumulació de β-catenina i activa l’expressió gènica Wnt objectiu, el F-CPE és un potent regulador negatiu d’aquesta cascada. L'efecte antagònic de la CPE a la via Wnt depèn d'un "complex de destrucció de β-catenina" intacta i una degradació proteasomal. Els nostres resultats també mostren que CPE forma un complex probablement mitjançant seqüències situades al seu domini N-terminal, amb Wnt3a i el CRD extracel·lular de Fz1.

Actualment, hi ha dos models principals que descriuen l’activació de la cascada de senyalització Wnt. Segons el primer, la unió de Wnt als seus receptors condueix a la interiorització del complex i a la formació de vesícules endosomes primerencs intracel·lulars. El GSK-3β es recluta a aquests endosomes juntament amb altres membres del complex de "degradació de la β-catenina". Això condueix a la presa del GSK-3β de la β-catenina ia la interrupció del complex de degradació de la β-catenina. The latter is then disrupted resulting in β-catenin accumulation. 5 A second model proposes that binding of the Wnt ligand to its receptors leads to recruitment and polymerization of Dvl at the plasma membrane. In turn, Dvl interacts with Axin promoting the formation of 'signalosomes' in which GSK-3β-mediated phosphorylation of β-catenin is blocked (reviewed in Reznik and Fricker 32 ). It has also been suggested that when the Wnt extracellular inhibitor Dickkopf homolog 1 (dkk1) binds LRP6, the complex is internalized into endosomes preventing the formation of the Dvl-induced signalosomes. 36 Although the findings presented in this study do not fully describe the mechanism by which CPE functions to inhibit the Wnt pathway, we hypothesize that, similarly to dkk1, secreted F-CPE may be internalized together with the Wnt-receptor complex into endosomes and in turn lead to disruption of the signalosomes thus reducing Wnt signaling levels (Figures 8a and b). Our findings show that F-CPE colocalizes with the Wnt3a ligand. As CPE functions as a sorting receptor helping direct pro-hormones from the trans -Golgi network into regulated secretory granules 27 and the Wnt proteins are also known to use the trans -Golgi to secretory granule route, 28 one assumption may be that both CPE and Wnt3a are expressed in the same Golgi compartments, and the same secretory vesicles as seen in cases of other proteins. 29

Image

Hypothetic models for the role of F-CPE and ΔN-CPE in Wnt signaling. ( a ) Following binding of the Wnt ligand to its receptor, a complex containing different Wnt signaling components forms in cytoplasmic endosomes resulting in sequestration of GSK-3β and signalosome formation. The 'β-catenin degradation complex' is disassembled and β-catenin accumulates and translocates into the nucleolus. ( b ) Binding of F-CPE to Wnt and Fz affects signalosome formation and β-catenin can be efficiently degraded. ( c ) The ΔN-CPE splice variant expressed in cancer cells translocates into the nucleus and upregulates β-catenin mRNA transcription and protein levels to promote Wnt signaling.

Imatge a mida completa

The Wnt/β-catenin signaling pathway is a major determinant of gene expression patterns along the colonic crypt axis and controls proliferation versus differentiation in healthy and malignant intestinal epithelial cells. It has been shown that while the Wnt pathway is highly active at the crypt bottom, as the cells move up the crypt and start to differentiate, the Wnt pathway is shut down. 37, 38 Interestingly the latter study also shows that the expression pattern of CPE is altered in ΔnTCF4-expressing CRC cells. Previous studies have described the expression of CPE in different epithelia-derived cancers. 19 However, recent work indicates that in these cancer types only the CPE splice variant-ΔN-CPE, but not F-CPE, is expressed. Moreover, ΔN-CPE is expressed in highly metastatic cancers as compared with normal tissue or benign tumors. 20 In these cells, ΔN-CPE may also contribute to cancer development by inducing both Wnt signaling activity (perhaps by the hypothetical mechanism shown in Figure 8c) and NEDD9 gene expression, leading to transformation and tumorogenesis. 20 Thus, it is plausible to speculate that CPE and its splice variant ΔN-CPE are important modulators of the Wnt cascade affecting both normal and aberrant cell processes. According to this scenario, in the first stages of CRC development the expression of F-CPE is lost and as the disease progresses ΔN-CPE begins to be expressed. ΔN-CPE may promote tumor development in both Wnt-dependent and -independent manners, whereas the F-CPE acts extracellularly to antagonize the Wnt pathway in normal colonic development, as well as in malignant transformation.

Materials i mètodes

Cell culture, transfection

HEK293T, HEK293-EBNA (stably expressing the EBNA-1 gene; Invitrogen, Grand Island, NY, USA), L-Wnt3a cells, L cells, COS-7, U-87, Jurkat and the human CRC cell line SW480 were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum and 100 U/ml penicillin/streptomycin at 37 °C in a humidified 5% CO 2 atmosphere. PC-12 and β-cells were maintained as described above with additional 10% horse serum. Transfection of HEK293T cells was performed by CaPO 4 precipitation. All other cells were transfected using the DNA transfection reagents jetPEI (Polyplus Transfection, Illkirch, France) or Lipofectamine 2000 (Invitrogen), following the manufacturers' protocols.

Plasmids i reactius

CPE constructs: CPE-GFP (pEGFP-N3) and hCPE (pcDNA3.1(+)) were kindly provided by YP Loh (NICHD, NIH, Bethesda, MD, USA). ΔN-CPE-GFP and N-terminal CPE-GFP were constructed by inserting the cDNA into pEGFP-N3 (Clontech, Oxon, UK) using Bam HI and Xho I restriction sites. FLAG-CPE constructs were prepared by inserting the different CPE cDNAs into the FLAGX3-pcDNA3.1(−) using Apa I and Xho I restriction sites. GFP-β-catenin was constructed by inserting the β-catenin cDNA into pEGFP-C1 (Clontech) using Bam HI and Xba I restriction sites. This expression vector was used as a template for mutagenesis of β-catenin by the QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) to replace serine 33 with alanine to generate GFP-S33A-β-catenin. The HA-GSK-3β expression vector was kindly provided by Dr TC Dale (Developmental Biology, Chester Beatty Laboratories, Institute of Cancer Research, London, UK). FLAG-GSK-3β was kindly provided by Dr Hagit Eldar-Finkelman (Tel-Aviv University, Tel Aviv, Israel). FLAG-Dvl, FLAG-Fz1-CRD and HA-β-catenin were kindly provided by Dr Arnona Gazit and Dr Abraham Yaniv (Tel-Aviv University). Human Frizzled 1 (Fz1), described previously, was kindly provided by Dr SA Aaronson (Mount Sinai Medical Center, New York, NY, USA). HA-Wnt3a was purchased from Upstate Biotechnology (New York, NY, USA). HA-Dvl was constructed in the pcDNA3 vector. The Wnt-responsive TCF-dependent luciferase constructs pTOPFLASH (containing multi TCF-binding sites linked to a luciferase reporter) and its mutated version pFOPFLASH were kindly provided by Dr H Clevers (Center for Biomedical Genetics, Hubrecht, The Netherlands) and were described previously. 39 pCMV-Renilla and pCMV-β-galactosidase expression plasmids, used to evaluate transfection efficiency, were purchased from Promega (Madison, WI, USA) and Clontech, respectively. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA), LiCl (Sigma, Rehovot, Israel), puromycin and hygromycin B (Sigma) were used at concentrations as indicated. Recombinant Human CPE (10069-H08H; Sino Biological Inc., Beijing, China) diluted in Dulbecco's modified Eagle's medium and added to cells as indicated.

Assenyala un periodista de la Luciferasa

To assay TCF-mediated transcription, cells were seeded at 1 × 10 5 cells per well in a 24-well plate 24 h before transfection. Cells were transfected with the indicated vectors, along with pTOPFLASH/pFOPFLASH and β-gal or pCMV-Renilla plasmids. Forty-eight hours post transfection the cells were harvested and subjected to luciferase assay according to the manufacturer's instructions. In all assays, FOPFLASH activity was measured by replacing the pTOPFLASH with pFOPFLASH under equivalent conditions. Data are presented as mean values and s.d's for at least three independent experiments done in duplicate.

Western blot analysis and IP

Forty-eight hours following transfection, cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS) and solubilized in reporter lysis buffer (luciferase buffer, Promega), lysis buffer (100 m M NaCl, 50 m M Tris, pH7.5, 1% Triton X-100, 2 m M EDTA) or radioimmuno precipitation assay buffer (50 m M Tris–HCl, pH 7.4, 1% NP-40, 0.25% sodium-deoxycholate, 150 m M NaCl, 1 m M EDTA) containing protease inhibitor cocktail (Sigma). Extracts were clarified by centrifugation at 12 000 g for 15 min at 4 °C. Following SDS–polyacrylamide gel electrophoresis separation, proteins were transferred to nitrocellulose membranes and blocked with 5% low-fat milk. Membranes were incubated with specific primary antibodies, washed with PBS containing 0.001% Tween-20 (PBST) and incubated with the appropriate horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. After washing in PBST, membranes were subjected to enhanced chemiluminescence detection analysis. For IP analysis, cells were solubilized in lysis buffer (see above). Cell lysates were incubated with anti-FLAG M2-agarose affinity gel (Sigma), with rotation for 2–18 h at 4 °C. Alternatively, cell lysates were incubated with the specific antibody for 1–2 h at 4 °C before 2–18 h rotated incubation with protein A/G agarose (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) at 4 °C. Beads were collected by slow centrifugation, washed four times with lysis or radioimmuno precipitation assay buffer and analyzed by SDS–polyacrylamide gel electrophoresis followed by detection with specific antibody. IP from medium was performed similarly. Cells were grown in medium without serum for 24 h, which was then collected and subjected to IP assays. Intensity of the protein bands was quantified by a computer-assisted densitometer (TINA 2.0c; Fuji BAS, Tokyo, Japan).

Immunofluorescència

HEK293T, PC-12, U-87, L, L-Wnt3a and COS-7 cells were grown on coverslips and fixed 48 h post transfection for 20 min in PBS containing 4% paraformaldehyde. After three washes with PBS, the fixed cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min and blocked with bovine serum albumin for 1 h. Subsequently, cells were incubated at room temperature with primary and secondary antibodies for 60 and 30 min, respectively. 4-6′ diamidino-2 phenylindole (Sigma) was used to stain cell nuclei. GFP was detected without staining. Cells were visualized by confocal microscopy.

Anticossos

The following antibodies were used: mouse anti-β-catenin (IB: 1:5000; IF: 1:300; BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), mouse anti-active β-catenin (Anti-ABC clone 8E7; Merck Millipore, Temecula, CA, USA) (IB: 1:1000; IF: 1:150; Millipore), rabbit anti-GFP (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), rat anti-HA (IB: 1:2500; IF: 1:300; Roche, Indianapolis, IN, USA), anti-HA-probe (Y-11) antibody (IB: 1:1000; Santa Cruz Biotechnology), mouse anti-FLAG (1:5000; Sigma), rabbit anti-FLAG (1:400; Sigma), mouse anti-CPE (IB: 1:500; IF: 1:50; IHC 1:50; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), rabbit anti-Dvl2 (IB: 1:1000; Abcam, Cambridge, UK), rabbit anti-Wnt3a (IB: 1:2500; IF: 1:50; Cell Signaling, Temecula, CA, USA), rabbit anti-Fz1 (IB: 1:500; Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-sox-9 (IB: 1:2000; Millipore), mouse anti-myc (IB: 1:1000; IF:1:100; Santa Cruz Biotechnology) and rabbit anti-CPE. 20 Mouse anti-actin (1:10 000; ImmunO, Aurora, OH, USA) and mouse anti-tubulin (1:10 000; Sigma) were used as loading controls. Anti-rat horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies were obtained from Santa Cruz Biotechnology (1:5000). Anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies were obtained from Jackson Immuno Research (West Grove, PA, USA) (1:10 000). For IF Alexa red and green (1:500; Molecular Probes, Grand Island, NY, USA) were used.

Small interfering assay

CPE small interfering RNA (siRNA) oligonucleotides were purchased from Thermo Scientific Dharmacon (Chicago, IL, USA; siGENOME SMART pool M-005823-00-0005, Human CPE, NM_001873) as well as transfection reagent Dharmafect-1. Transfection was performed according to the manufacturer's protocol. All experiments were performed in PC-12 cells using 100 n M siRNA oligonucleotides for 72 h. Non targeting RNA oligonucleotides (Thermo Scientific Dharmacon) were used for scr control. PC-12 cells were transfected 24 h after siRNA transfection with pTOPFLASH/pFOPFLASH and β-gal plasmids for luciferase detection. Forty-eight hours post transfection, the cells were harvested and subjected to either luciferase assay or western blot analysis as describe above.

CM effect

Transfection of HEK293T or COS-7 cells with the indicated plasmids was performed in a 24-well plate. Thirty hours later the medium was replaced with condition medium (CM) from HEK293T cells transfected with F-CPE-GFP or GFP and medium collected from L or L-Wnt3a cells. The two types of media were combined at a 1:1 ratio and added to the transfected cells for 18 h. Alternatively, purified recombinant CPE (Sino Biological Inc.) diluted in Dulbecco's modified Eagle's medium to the desired concentration (specified in the figure) was added to cells for 18 h. The HEK293T cells were then harvested and subjected to either western blotting or luciferase reporter assay. COS-7 cells transfected with HA-Dvl and L-Wnt3a cells were supplemented with CPE CM 12 h before IF assay as described above.

Informació complementària

Arxius de Powerpoint

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

Documents de paraula

  1. 1.

    Taula suplementària 1

  2. 2

    Informació complementària

    La informació complementària acompanya el document del lloc web d'Oncogene (//www.nature.com/onc)