El bloqueig de la caspasa indueix una necrosi programada mediada per rip3 en microglia activada per un receptor similar als peatges | mort i malaltia cel·lular

El bloqueig de la caspasa indueix una necrosi programada mediada per rip3 en microglia activada per un receptor similar als peatges | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Microglia
  • Necroptosi
  • Farmacologia
  • Receptors semblants als peatges

Resum

Les microglies són les cèl·lules immunes residents al sistema nerviós central i protagonistes claus contra patògens i lesions. Tot i això, l’activació microglial persistent sovint agreuja els danys patològics i ha estat implicada en moltes malalties neurològiques. Malgrat els seus funcions fisiològiques i fisiopatològiques fonamentals, la forma en què es regula la supervivència i la mort de la microglia activada continua mal compresa. Informem aquí que la microglia activada a través de receptors Toll-like (TLRs) està sotmesa a necrosi programada depenent de la RIP1 / RIP3 (necroptosi) quan s’exposa a l’inhibidor de pan caspasa zVAD-fmk. Tot i que ZVAD-fmk i l’inhibidor de la caspasa-8 IETD-fmk no van tenir cap efecte sobre la microglia primària no estimulada, van sensibilitzar marcadament la microglia amb lligands TLR1 / 2, 3, 4, 7 / 8 o el tractament TNF, provocant una necrosi programada que va ser completament bloquejada per Inhibidor de la kinasa R1P1 necrostatina-1. Curiosament, la necroptosi induïda per lligands TLR i zVAD es va restringir a cèl·lules microglials i no es va observar en astròcits, neurones o oligodendròcits tot i que se sap que expressen certes TLRs. La supressió de gens que codifiquen TNF o TNFR1 no va poder evitar la necroptosi microglial induïda per lipopolisacàrid i poli (I: C), presentant una via de necrosi programada independent de TNF a la microglia activada per TLR3 i TLR4. Les microglies de ratolins que mancaven de TRIF funcional van estar totalment protegides contra l’activació de TLR3 / 4 i la necrosi induïda per zVAD-fmk, i la supressió genètica de rip3 també va prevenir la necroptosi de microglia. L’activació de c-jun N-terminal kinasa i la generació d’espècies específiques d’oxigen reactiu van ser esdeveniments de senyalització a l’aigua necessaris per a l’execució de la mort de les cèl·lules microglials. En conjunt, aquest estudi revela una via robusta de senyalització de la necroptosi depenent de la RIP3 en la microglia activada per TLR al bloqueig de la caspasa i suggereix que la senyalització de TLR i les vies de mort cel·lular programades estan estretament vinculades a la microglia, cosa que podria contribuir a la neuropatologia i la neuroinflamació quan es desregula.

Principal

Les microglia són les cèl·lules immunes residents del sistema nerviós central (SNC) i els defensors primaris que protegeixen el SNC contra patògens i lesions. Tot i això, l’activació persistent i excessiva de la microglia pot resultar en inflamacions patològiques i s’ha demostrat que participa activament en molts trastorns neurològics incloent lesions cerebrals agudes, ictus, esclerosi múltiple i malalties neurodegeneratives. 1, 2 Els receptors semblants als peatges (TLRs) són una família important de receptors de reconeixement de patrons que reconeixen patrons moleculars (PAMPs) associats als patògens altament conservats expressats en microorganismes amplis i inicien respostes immunes innates. A més, els TLRs també detecten patrons moleculars associats al perill endògens, per tant tenen un paper clau tant en els trastorns infecciosos com en els SNC. 4 Microglia expressa un repertori de TLRs, 5 i el seu compromís s’ha relacionat amb danys neuronals 6 i oligodendroglial, 7, 8 i lesions cerebrals exacerbades. 9 Com que la microglia activada per TLR secreta mediadors citotòxics proinflamatoris, la resolució de microglia activada s’ha de regular estrictament. Fa temps que es reconeix que el nombre i l’activitat de la microglia activada al SNC disminueix a mesura que el patogen s’esborra o desapareix l’insult. Tanmateix, els mecanismes que regeixen l’eliminació de les microglies activades localment segueixen evitant. L’apoptosi de la microglia induïda per l’activació és un mecanisme que regula la microglia activada. L’òxid nítric, la caspasa-11, -1 i -3 i MST-1 s’han demostrat que medien l’apoptosi de la microglia activada per interferó gamma (IFN γ ) o IFN γ més lipopolisacàrid (LPS). 10, 11, 12 Tot i que és evident que la microglia activada pot patir una apoptosi depenent de la caspasa, queda per determinar si la microglia activada pot adaptar altres vies de mort cel·lular. La desregulació del procés d’autoeliminació podria agreujar potencialment malalties del SNC i, de fet, les microglies activades de manera persistent estan associades a moltes malalties neuropatològiques cròniques.

La mort de cèl·lules necrotògiques es considera tradicionalment com un procés passiu causat per un estrès aclaparador i com a causa de la inflamació degut a l’alliberament de materials intracel·lulars. L’evidència acumulada ara ha demostrat clarament que es pot programar cert tipus de mort de cèl·lules necrotiques i es podria prevenir. S'ha demostrat que l'activació del domini cinasa de la proteïna 1 (RIP1) que interacciona amb el receptor i el conjunt del complex de senyalització que conté RIP1 / RIP3 desencadena una necrosi programada en algunes cèl·lules, procés que també es denomina necroptosi. 13 Necrostatin-1 (Nec-1), una petita molècula basada en un triptòfan que inhibeix al·lostericament l'activitat de la quinasa RIP1, 14, 15 prevé la necrosi 16 induïda pel receptor de la mort i bloqueja la mort de les cèl·lules oligodendroglials oxidatives. L' administració de necrostatina-1 millora les lesions neuronals en models animals d'isquèmia, 15, 18 lesions cerebrals traumàtiques, 19 i la malaltia de Huntington. 20 Tot i que el mecanisme subjacent de l'efecte protector in vivo de la necrostatina-1 segueix estant totalment establert, l'administració de necrostatina-1 en ratolins sotmesos a un impacte cortical controlat es va associar amb una activació microglial reduïda. 19

Múltiples línies d’evidències han demostrat que la caspasa-8, la caspasa iniciadora de la via d’apoptosi induïda pel receptor de la mort i la seva proteïna adaptadora El domini de la mort associada al Fas (FADD) regulen negativament la necrosi programada depenent de la RIP1 / RIP3 mitjançant la eliminació i la inactivació del RIP1 . La supressió de l’activitat de la caspasa-8 amb l’inhibidor de la pan caspasa zVAD-fmk facilita la necroptosi induïda per TNF α en cèl·lules que expressen RIP3. A diferència de la necrosi induïda pel receptor de la mort de TNF, han començat a aparèixer els detalls de la necrosi induïda per patògens en cèl·lules immunes innates. Diversos estudis han demostrat que quan l'activitat de la caspasa-8 és suprimida per IETD-fmk, zVAD-fmk, o per l'inhibidor de la caspasa viral CrmA, la vinculació de TLR3 o TLR4 dóna com a resultat una necrosi programada en macròfags humans 23 i macròfags peritoneals de ratolí mitjançant RIP3. 22, 24 Tanmateix, si la microglia activada, les cèl·lules immunes innates del SNC, sofreixen necrosi programada, encara no tenen resposta.

En aquest estudi, s'informa que la microglia primària activada per lligaments de TLR sofreix apoptòtica i també la mort de cèl·lules necròtiques. Bloqueig de la caspasa-8 amb la lligada zVAD-fmk o IETD-fmk sensibilitzada marcadament per la microglia amb TNF i la lligada TLR1 / 2, TLR3, TLR4 i TLR7 / 8. La necroptosi de la microglia activada per TLR3 i TLR4 es va determinar a més a més per la mediació de TRIF, RIP3 i c-Jun N-terminal kinasa (JNK) i espècies reactives d’oxigen (ROS). Com que la mort de cèl·lules necròtiques pot provocar respostes inflamatòries secundàries, desplegar els mecanismes moleculars que fonamenten la desaparició de la microglia activada pot tenir pistes importants per a la futura intervenció terapèutica de les malalties del SNC.

Resultats

Respostes microglials distintes a diferents magnituds d'activació de TLR4

El LPS genera respostes immunes a la microglia mitjançant TLR4. Per examinar la relació entre l'extensió de l'activació microglial i el destí de les cèl·lules microglials, es va desafiar la microglia primària de rata amb concentracions creixents de LPS. Tot i que l’activació de microglia amb dosis molt baixes de LPS (0, 1 ng / ml) va afavorir la supervivència cel·lular (Figures 1a i b) i la producció de TNF (Figura 1d), concentracions més altes de LPS (10–100 ng / ml) van provocar la mort de cèl·lules microglials en una manera depenent de la dosi (figures 1a i c). La producció de TNF mitjançant microglia activada va dependre de l'extensió de l'activació de la microglia i va semblar que va assolir el pic amb 10 ng / ml de LPS (Figura 1d), una concentració que també va induir una fragmentació d'ADN significativa, determinada per un nombre augmentat de cèl·lules TUNEL + (Figura 1c). Aquestes dades van en línia amb un estudi anterior 25 i suggereixen que la mort cel·lular programada és un mecanisme intrínsec i autoeliminació que impedeix la sobreactivació.

Image

Respostes microglials a diferents dosis de LPS. ( a ) La dosi baixa de LPS va augmentar la viabilitat de la microglia mentre que les dosis més altes van provocar la mort cel·lular. Es van estimular la microglia primària de rata amb concentracions creixents de LPS (0, 1, 10, 100 ng / ml) durant 20-24 h, i es va comptabilitzar el nombre de cèl·lules microglials. Les dades són un representant de tres experiments independents amb resultats similars. ( b ) Imatges representatives de contrast de fase de microglia tractades amb concentracions indicades de LPS. Barra d’escala, 50 μ m. ( c ) Augment significatiu de microglia positiva per TUNEL després de l'estimulació al LPS durant 6 hores. Les dades representen el percentatge de cèl·lules positives TUNEL del total de cèl·lules. ( d ) Augment de la producció de TNF depenent de la dosi després del tractament amb LPS durant 6 hores. Les dades són un representant de tres experiments independents amb resultats similars. ( e, f ) La microglia activada per LPS va presentar dos patrons d'activació casepe-8 diferents. L’activació localitzada de la caspasa-8 (L-Casp-8) no es va associar amb l’activació de la caspasa-3 o la mort cel·lular (panell superior, e ), mentre que l’activació citoplasmàtica profunda de l’activació de la caspasa-8 (C-Casp-8) induïda, Fragmentació d’ADN (positiu TUNEL) i mort cel·lular (panell inferior, e ). Les microglies de rata van ser tractades amb 0, 1–100 ng / ml de LPS tal i com es va fer anteriorment i es va realitzar la detecció in situ de l’activació de la caspasa-8 a les cèl·lules vives tal i com es descriu a la secció de Mètodes. A continuació, les cèl·lules es van fixar i van ser sotmeses a l'etiquetatge TUNEL o immunostaining per a la caspasa-3 clivada / activada (act. Casp-3). Els resultats es mostren com a percentatge de cèl·lules positives de Casp-8 del total de cèl·lules. NS, no significatiu; * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001

Imatge a mida completa

A continuació, ens vam preguntar si la microglia activada per LPS utilitza la via apoptòtica clàssica d’autoeliminació. L’activació de la caspasa-3 executora fou evident en microglia tractada amb dosis més elevades però no baixes de LPS (Figura 1e) i la mort de cèl·lules apoptòtiques precedides (figura suplementària S1). Com la caspasa-8 és una caspasa iniciadora necessària per a vies extrinseques d’apoptosi, es va examinar l’activació de la caspasa-8 a la microglia viva després d’estimulació de LPS amb FAM-LETD-fmk marcada amb fluoresceïna que marca les etiquetes d’afinitat activades caspasa-8. 26 Es van observar dos patrons diferents d’activació de la caspasa-8 (Figura 1e): l’activació citosòlica difusa (C-Casp-8) i l’activació subcel·lular localitzada de la caspasa-8 (L-Casp-8). Tot i que la microglia L-Casp-8 + va ser negativa per a TUNEL o la caspasa-3 activada, moltes microglia C-Casp-8 + també van ser positives per TUNEL i la caspasa-3 activada, cosa que suggereix que l’activació difusa de la caspasa-8 en citosol condueix a l’apoptosi ( Figures 1e i f). L’activació localitzada de la caspasa-8 també es va trobar prèviament en limfòcits T després de l’activació del receptor d’antigen i va estar associada a la proliferació cel·lular. En conjunt, aquestes troballes suggereixen que la caspasa-8 activada focalment pot funcionar com a molècula de senyalització en complexos, mentre que un major grau d’activació en el citoplasma inicia un programa de mort per cèl·lules apoptòtiques.

La microglia activada per dosis baixes de LPS es converteix en necròtica quan se suprimeix la caspasa-8

Per examinar la possible funció d’activació localitzada de la caspasa-8 en microglia activada per LPS, hem activat microglia de rata primària amb 0, 1 ng / ml de LPS en presència d’inhibidors específics de la caspasa. Tot i que l'inhibidor de pan caspasa zVAD-fmk (zVAD) no va tenir cap efecte sobre la microglia no estimulada que es reposa, va provocar una mort cel·lular ràpida i massiva en microglia activada per LPS (Figures 2a-c). A més, zVAD va ser eficaç de la mateixa manera per induir la mort de cèl·lules microglials quan es va afegir a la microglia que es van preactivar amb LPS i es va rentar àmpliament (figura suplementària S2). La microglia activada per LPS també era sensible a l’inhibidor de la caspasa-8 IETD-fmk (IETD) (Figures 2a i b). En canvi, la inhibició de la caspasa-3/7 DEVD-fmk, l’inhibidor de la caspasa-1 YVAD-fmk o la seva combinació no van causar cap mort cel·lular (figures 2a i b). La microglia va patir la mort de les cèl·lules necrotiques quan es va tractar amb LPS / zVAD, com ho demostra l’augment de la fragmentació de l’ADN (figures 2d i e) i la pèrdua de la integritat de la membrana plasmàtica (figures 2b – c). Com que la detecció in situ de l'ADN fragmentat per TUNEL no distingeix necessàriament entre apoptosi i necrosi, es van fer anàlisis microscòpiques electrònics. Consistent amb la nostra constatació que una magnitud més gran de l’activació de LPS / TLR4 indueix l’apoptosi depenent de la caspasa (figura 1e, figura suplementària S1), la microglia activada amb dosis més elevades de LPS només presentava característiques morfològiques de l’apoptosi típica, incloent disminució del volum cel·lular, condensació de cromatina i membrana citoplasmàtica intacta (figura 2f, mitja). En canvi, zVAD va sensibilitzar molt la microglia amb un baix nivell d’activació del LPS, la qual cosa va provocar una necrosi que es va caracteritzar per citoplasma translúcid, inflor de l’organell, augment del volum cel·lular i interrupció de la membrana plasmàtica (figura 2f). Cal esmentar que, en contraposició a la microglia primària activada per LPS, on els inhibidors de la caspasa-8 van desencadenar necrosi sense suprimir TNF (figura suplementària S3), LPS / zVAD no va provocar la mort cel·lular a la línia cel·lular microglial BV-2 i només va suprimir moderadament el TNF. secreció (figura suplementària S4). 27 En conjunt, els nostres resultats demostren que les microglies primàries activades per LPS tenen almenys dues vies de mort cel·lulars diferents en funció de l’extensió de la seva activació i de la presència de supressors de caspasa.

Image

La microglia activada per dosis baixes de LPS pateix una ràpida mort de cèl·lules necrotiques al bloqueig de la caspasa-8. ( a - c ) La inhibició de la caspasa-8 a la microglia activada per LPS va provocar una important pèrdua de viabilitat cel·lular. Es va estimular la microglia primària de rata amb o sense LPS (0, 1 ng / ml) en presència o absència de l’inhibidor de la caspasa de pan, z-VAD-fmk, inhibidor específic de la caspasa-8 IETD-fmk, inhibidor de la caspase-3/7 DEVD-fmk, inhibidor de la caspasa-YVAD-fmk, o la combinació de DEVD-fmk i YVAD-fmk (25 μ M cadascun) durant 20-24 h. La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant el test d’Alamar Blue que mesura l’activitat metabòlica, i es va confirmar mitjançant l’anàlisi de cèl·lules vives / mortes mitjançant iodur de propidi (PI) i Calcein AM tal com es descriu. Es va mostrar el contrast de fase representatiu i imatges de tinció de PI / Calceina AM de microglia tractades tal com s’indica. Les dades són representatives d'almenys tres experiments independents. Barra d’escala, 50 μ m. ** P <0, 01; *** P <0, 001. ( d, e ) LPS més zVAD-fmk induït per la mort de cèl·lules microglials en cultius glials mixtos de rata que van ser tractats amb LPS (1 μ g / ml) i zVAD-fmk durant 24 h. Es va determinar el percentatge de TUNEL + Iba1 + microglia. ( f ) Microscòpia electrònica de transmissió de microglia tractada amb vehicle DMSO (esquerra), 10 ng / ml de LPS sol (mig) o 0, 1 ng / ml de LPS més zVAD-fmk (10 μ M) (dreta) durant 6 h. La microglia tractada amb vehicle i 10 ng / ml de LPS tenien membrana citoplasmàtica intacta, mentre que moltes microglia tractades amb LPS / zVAD presentaven citoplasma translúcida, mitocondria inflamada (inserció) i desglossament de la membrana. Barres d’escala, 2 μ m, 0, 1 μ m (inserir)

Imatge a mida completa

La necrosi programada induïda per lligands TLR / zVAD només es produeix en microglia, no en neurones, astròcits o oligodendròcits

Com la microglia expressa múltiples TLRs, es va examinar a continuació si zVAD també provoca necrosi de microglia activada per altres lligands TLR com ara RNA de doble tensió imitant poli (I: C) (lligand TLR3), Pam3CSK4 (TLR1 / 2) i R848 (TLR7 / 8). De fet, la resta de lligands TLR van provar necrosi microglial induïda (figura 3a). En canvi, l’activació de microglia amb ATP (fins a 1 mM) o IL-13 (100 ng / ml) més zVAD no va causar mort cel·lular (figura suplementària S5), cosa que suggereix l’especificitat de la necrosi microglial al receptor de la mort i l’activació de TLR. Curiosament, encara que les neurones, astròcits i oligodendròcits són coneguts per expressar el receptor funcional del TNF i certs TLRs, per exemple, TLR2 / TLR3 en oligodendròcits i astròcits 28, 29, 30, 31 i TLR3 / TLR8 en neurones, 32, 33 no ho eren sensible al tractament TNF / zVAD o TLR ligand / zVAD (Figures 3b – d). Aquests resultats demostren que TNF / zVAD o TLR ligand / zVAD indueix necrosi específicament en microglia primària però no en altres cèl·lules del SNC.

Image

Els agonistes de TLR i TNF plus zVAD indueixen la mort de cèl·lules necròtiques només en microglia, però no en astròcits, oligodendròcits o neurones. ( a ) Les microglies primàries de rata van ser tractades amb vehicle, agonistes TLR poli (I: C) (PIC, 10 μ g / ml), Pam3CSK4 (0, 1 μ g / ml), R848 (1 μ g / ml) o TNF α ( 10 ng / ml) en presència o absència de zVAD-fmk (25 μ M) segons s’indica. Es va determinar la viabilitat cel·lular 20-24 h més tard, tal com es descriu. Les dades representen la mitjana de ± SEM de tres experiments independents. *** P <0, 0001. ( b - d ) Els astròcits primaris enriquits, els oligodendròcits i les neurones es van tractar amb vehicle, LPS (20 ng / ml), poli (I: C) (50 μ g / ml), Pam3CSK4 (0, 5 μ g / ml), R848 (5 μ g / ml) o TNF α (30 ng / ml) en presència o absència de zVAD-fmk (50 μ M), i es va determinar la viabilitat cel·lular 20-24 h després. No es va observar pèrdua de viabilitat cel·lular en astròcits, oligodendròcits o neurones. Les dades són representatives de tres experiments independents

Imatge a mida completa

El bloqueig de la kinasa RIP1 amb necrostatina-1 aboleix completament la necrosi de la microglia

Per investigar el mecanisme molecular subjacent a l’activació de TLR i la necrosi induïda per zVAD, primer vam provar l’efecte del Nec-1, que inhibeix l’activitat 14 de la quinasa RIP1 i l’associació RIP1 / RIP3. 34, 35 Cotractament amb Nec-1 va abolir completament la mort de cèl·lules microglials induïdes per LPS / zVAD (figures 4a i b). A més, tot i que RIP1 i RIP3 es van expressar endògènament en microglia no estimulada, es van registrar marcadament en microglia primada per LPS tant a nivell de transcripció com de proteïna (figures 4c i d). Aquesta expressió augmentada de RIP1 i RIP3 en microglia activada per LPS pot donar compte de la seva vulnerabilitat millorada a la necrosi programada. De forma consistent, el Nec-1 era igual d’efectiu per protegir la microglia contra la zVAD i altres morts de cèl·lules induïdes per lligands TLR (Figura 4e).

Image

El bloqueig de l'activitat de la kinasa RIP1 abroca la necrosi microglial induïda per l'activació de TLR. ( a ) El bloqueig de l'activitat de la quinasa RIP1 amb la necrostatina-1 (Nec-1) va evitar completament la necrosi induïda per LPS / zVAD. Les microglies de rata primària es van tractar com s’indicava amb LPS (0, 1 ng / ml), zVAD (25 μ M) o Nec-1 (20 μ M) i es va avaluar la supervivència cel·lular mitjançant el recompte de cèl·lules. *** P <0, 001. ( b ) Les imatges representatives PI / Calcein AM (panell superior) i contrast de fase (panell inferior) de microglia tractades de la manera anterior mostrant que la mort de cèl·lules microglials induïda per LPS / zVAD va ser abrogada per Nec-1. Les dades representen almenys tres experiments independents. Barres d’escala, 50 μ m. ( c ) El LPS va regular de forma significativa l'expressió RIP1 i RIP3 a la microglia determinada per l'anàlisi de western blot. La microglia de rata es va preactivar durant la nit amb dosis baixes de LPS, es va rentar àmpliament i es va exposar posteriorment a zVAD o zVAD / Nec-1 durant 3 hores. A continuació, es van preparar lisats de cèl·lules i es van sotmetre a anàlisis de Western blot. Es va mostrar una representació occidental representativa amb un temps d'exposició més curt. La quantificació de l'expressió relativa de RIP1 i RIP3 es va realitzar mitjançant anàlisis densitometries de blots occidentals de 3 a 7 experiments independents. * P <0, 05; Prova t d' alumnes de dues cues. ( d ) Anàlisi RT-PCR de microglia tractada com anteriorment, mostrant que LPS augmenta transcripcionalment l'expressió RIP1 i RIP3. L’actina i l’Iba1 es van utilitzar com a controls interns i el TNF com a indicador d’activació microglial. RT, transcriptasa inversa. Els experiments es van repetir tres vegades amb resultats similars. ( e ) La necrosi microglial Nec-1 efectivament abrogada induïda per altres lligands TLR. Les microglisses es van tractar tal com s’indica amb zVAD, Nec-1 i diversos agonistes TLR: agonista TLR1 / 2 Pam3CSK4 (0, 1 μ g / ml), agonista TLR3 poli (I: C) (PIC, 10 μ g / ml) o TLR7 / 8 agonista R848 (1 μ g / ml). La supervivència cel·lular es va determinar mitjançant el recompte de cèl·lules. Les dades representen la mitjana ± SEM de dos experiments independents. *** P <0, 001

Imatge a mida completa

La necroptosi microglial induïda per l’activació TLR3 i TLR4 és independent de TNF / TNFR1, però depèn de TRIF i RIP3

Tenint en compte que la TNF / zVAD és capaç de desencadenar necrosi programada a la microglia primària (Figura 3a) i el fet que el TNF es produeix per microglia activada, a continuació investigarem la possible implicació de la senyalització TNC autocrina en necrosi microglial induïda per LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD. Primer, vam confirmar que la necrosi induïda per LPS / zVAD va estar efectivament mediada a través del receptor LPS TLR4, ja que la necroptosi induïda per poli (I: C) es va abrogar completament en la microglia mutant de tlr4 (figura 5a). A continuació, vam preparar cultius glials barrejats a partir de cervells tnf + / + i tnf - / - mouse, i vam examinar la supervivència microglial després d’estimulació durant la nit amb LPS / zVAD. Tot i que els microglis no eren capaços de produir TNF, 36 eren igualment susceptibles a la mort de cèl·lules induïdes per LPS / zVAD (Figura 5b), cosa que suggereix que la producció autocrina de TNF no era necessària per a la necrosi induïda per LPS / zVAD. En línia amb això, la pèrdua de microglia induïda per LPS / zVAD també va ser independent del receptor TNF TNFR1 (Figura 5b). De la mateixa manera, poli (I: C) / zVAD va causar un nivell de toxicitat significatiu tant en microglia de tipus salvatge com en tnf deficient (figura suplementària S6). En conjunt, aquests resultats demostren l’existència de vies alternatives d’inici de necrosi diferents de la via TNF / TNFR1 a la microglia activada per TLR4 i TLR3.

Image

La mort de cèl·lules microglials induïda per LPS / zVAD és independent de TNF / TNFR1, però depèn de TRIF i RIP3. ( a ) El receptor LPS TLR4 era necessari per a la mort de cèl·lules microglials induïdes per LPS / zVAD, però no per poli (I: C) / zVAD. Es van tractar cultius glials mixtes procedents de la dissecció individual de tlr4 de tipus salvatge (WT) ( n = 2-5) i eliminacions (KO) ( n = 3) cadells de lliteraire amb vehicle, LPS (1 μ g / ml), LPS / zVAD (50 μ M), poli (I: C) (50 μ g / ml) o poli (I: C) / zVAD de 20 a 24 h. La supervivència de la microglia es va determinar comptant les cèl·lules Iba1 + . *** P <0, 001; NS, poc significatiu. ( b ) TNF i TNFR1 eren prescindibles de necrosi microglial induïda per LPS / zVAD. Els cultius glials barrejats preparats a partir de WT i tnf -, els ratolins deficients tnfr1 van ser tractats amb vehicle, LPS o LPS / zVAD, tal com s’indica de 20 a 24 h. La supervivència dels microglis es va determinar comptant les cèl·lules Iba1 + . La susceptibilitat de microglia a LPS / zVAD va ser la mateixa en cultius glials mixtos WT, tnf- i tnfr1 -KO. Les dades representen de tres a quatre experiments independents. *** P <0, 001; NS, poc significatiu. ( c ) TRIF era essencial per a la necrosi microglial induïda per LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD. Es van tractar cultius glials barrejats de WT i ratolins trifrants amb LPS / zVAD o poli (I: C) / zVAD tal i com es va indicar, i es va valorar la supervivència de la microglia com es va dir anteriorment. Les dades representen una mitjana de ± SEM d'almenys tres experiments independents. La mort de cèl·lules microglials induïdes per LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD es va abolir completament en cultius trif. Inserir, Western blot, analysis of TRIF expression protein in Trif- WT and microglia mutant. *** P <0, 001. ( d ), Producció de TNF induïda per poli (I: C) mediada per TRIF per microglia. Es va estimular la glia barrejada de ratolins tipus silvestre i triferents amb vehicles, LPS i poli (I: C) segons les especificacions. La secreció de TNF es va determinar per ELISA de sobrenedants de cultiu de cada condició en el moment indicat. Les dades representen dos experiments independents amb resultats similars. ( e ) La necrosi programada induïda per LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD mediada per RIP3 a la microglia. Els cultius glials barrejats derivats de rip3 + / +, rip3 +/− , i rip3 - / - littermates es van disputar amb LPS, poli (I: C) i zVAD durant 24 h, i la supervivència microglial es va determinar comptant les cèl·lules Iba1 + . Les dades representen la mitjana de ± SEM de tres experiments independents. *** P <0, 001

Imatge a mida completa

L'activació de TLR3 i TLR4 és coneguda per iniciar una sèrie de cascades de senyalització mitjançant diversos adaptadors. Com que TRIF és una molècula adaptadora comuna tant per a la senyalització TLR3 com per TLR4, es va examinar el paper de TRIF en la necroptosi microglial. Mentre que LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD van induir una pèrdua important de microglia de tipus salvatge, la microglia trifatant es va protegir completament, demostrant un paper crític per a TRIF en la mort de cèl·lules microglials activades per TLR3 / TLR4 (figura 5c). Per verificar si TRIF efectivament va mediar els esdeveniments de senyalització després de la lliga TLR3, es va analitzar la secreció de TNF en sobrenadants de cultiu. Com era d'esperar, la producció de TNF induïda per poli (I: C) es va abolir a la microglia mutant trif mentre que la producció de TNF induïda per LPS només es va bloquejar de forma transitòria (figura 5d). Això és coherent amb el concepte que TLR4 recluta molècules adaptadores MyD88 i TRIF, mentre que TRIF és l’única molècula adaptadora per a TLR3. 3 Un potencial enllaç mecanicista entre l’activació de TLR3 / TLR4 i la necroptosi és que TRIF interacciona físicament amb RIP1 i RIP3 a través d’un motiu d’interacció homotípica de proteïna (RHIM). 24, 37 En suport d'aquesta idea, la deficiència de rip3 va impedir completament la microglia de LPS / zVAD, així com de necrosi induïda per poli (I: C) / zVAD (Figura 5e), i no va tenir cap efecte en la producció de TNF induïda per LPS (no mostrat). Curiosament, la microglia rip3 +/− heterozigota presentava al voltant del 50% de la sensibilitat cap a LPS / zVAD o poli (I: C) / zVAD en comparació amb rip3 + / + microglia (Figura 5e). Per tant, a més que l’activació de RIP3 sigui un punt regulador clau de la necroptosi, les nostres dades també indiquen que el nivell d’expressió de proteïna de RIP3 és important per a la inducció efectiva de la necroptosi.

Activació de JNK i producció d’espècies d’oxigen reactives d’orquestració de les cèl·lules microglials

Anteriorment, hem demostrat que l’àcid araquidònic desencadena la necrosi programada a l’oligodendròfia mitjançant RIP1 i la c-jun N-terminal kinasa (JNK) avall. 17 Per determinar si es necessita l’activació de JNK per a necroptosi microglial induïda per LPS / zVAD, es va examinar l’efecte de l’inhibidor específic JNK SP600125 sobre la supervivència microglial. El cotractament amb SP600125 va impedir significativament, però no completament, la mort de cèl·lules induïda per LPS / zVAD (figura 6a), mentre que el bloqueig de la pasa cinasa o ERK1 / 2 no va tenir cap efecte protector (figura suplementària de la figura S7). Coherent amb el paper de JNK en la necrosi microglial, es va observar una activació robusta de JNK 3 hores després del tractament LPS / zVAD i va ser inhibida significativament per SP600125 i completament per Nec-1 (Figura 6b), cosa que indica que l'activació JNK es produeix aigües avall del RIP1.

Image

Es necessiten espècies reactives d’oxigen (ROS) i fosforilació JNK per a la necrosi programada de microglia. ( a ) Abrogació de la mort de cèl·lules microglials induïdes per LPS / zVAD per SP600125 (10 μ M) i BHA (150 μ M). Les microglies de rata pura es van tractar segons les indicacions i la supervivència cel·lular es va determinar comptant les cèl·lules de Calcein AM + / PI - 20–24 h després. La vitamina K1 (1 μ M) i K2 (1 μ M, menaquinona-4) van tenir un efecte moderat però no estadísticament significatiu. L'AA861 (10 μ M) no va tenir cap efecte protector. Les dades representen una mitjana de ± SEM de tres a cinc experiments independents. *** P <0, 001; NS, poc significatiu en comparació amb cèl·lules tractades amb LPS / zVAD. ( b ) Augment de la fosforilació de JNK a la microglia tractada amb LPS / zVAD i de la inhibició completa del Nec-1. Les microglies de rata es van tractar prèviament amb vehicle, Nec-1 (20 μ M), BHA (150 μ M) o SP600125 (10 μ M) durant 1 h seguit d'estimulació amb o sense LPS (0, 1 ng / ml) i zVAD (10 μ M) durant 3 h. A continuació, es van preparar lisats microglials i se van sotmetre a anàlisis de blot occidental tal com es descriu. Les dades representen la mitjana ± SEM d’anàlisis de densitometria de tres experiments independents. * P <0, 05; ** P <0, 01; *** P <0, 001; Prova t d’ alumne de dues cues

Imatge a mida completa

S’ha suggerit que la producció d’espècies reactives d’oxigen (ROS), la peroxidació dels lípids i la fuga lisosòmica són passos bàsics per a l’execució de la necrosi en certes línies cel·lulars. 13 Com que les microglies activades per LPS són capaces de produir espècies reactives d’oxigen / nitrogen, 8 vam raonar que l’hidroxianisol butilat cargolador ROS (BHA) pot evitar la necrosi induïda per LPS / zVAD. De fet, la necrosi microglial induïda per LPS / zVAD va ser mitigada gairebé completament per BHA (figura 6a). En canvi, i per la nostra sorpresa, no vam observar cap protecció per l’inhibidor de la 12-lipoxigenasa AA861, i només una protecció menor, però no estadísticament significativa per la vitamina K1 i K2 (Figura 6a), reactius que eren altament eficaços per millorar el glutatió induït per l’esgotament lesions oxidatives en oligodendròcits i neurones 38, així com en necroptosi induïda per l’àcid araquidònic en oligodendròcits. 39 A més, altres antioxidants clàssics com el Trolox hidrofílic i la vitamina E lipofílica ( α -tocopherol) no van oferir protecció significativa (figura suplementària S8), ni tampoc vam observar una protecció significativa per l’inhibidor de l’oxida nítrica sintasa L-NMMA, superòxid dismutasa imitant MnTMPyP, Inhibidor del NADPH oxidasa difenilenodioni, catalitzador de descomposició de peroxinitrita FeTMPyP o glutatió peroxidasa imiten Ebselen (figura suplementària S7).

Per determinar encara més el paper de la ROS en la necrosi microglial, es va avaluar la producció de ROS intracel·lular. A diferència d’estudis anteriors, no vam detectar un senyal de fluorescència significatiu en microglia tractada amb LPS / zVAD mitjançant H 2 DCF-DA, un indicador d’estrès oxidatiu cel·lular generalment utilitzat àmpliament / ROS, 40 probablement a causa del baix estat d’activació de la microglia. No obstant això, es va detectar un augment significatiu del senyal de fluorescència de l'indicador de superòxid hidroetidina (HE) 41 en microglia tractada amb LPS / zVAD durant 3 hores en comparació amb els tractats només amb LPS (figura 7a). Consistent amb els seus efectes sobre la supervivència, el senyal HE induït de LPS / ZVAD eficaçment Nec-1 i BHA, mentre que les vitamines E i K2 no (Figura 7a). L'inhibidor de JNK SP600125, tot i que la mort de cèl·lules induïda LPS / zVAD significativament i parcialment, només tenia un efecte limitat sobre l'augment del senyal HE induït per LPS / zVAD, cosa que suggereix que l'activació de JNK es troba al nivell o a la baixa de la producció de ROS. Això està d’acord amb l’observació que el BHA va impedir la producció de ROS i va bloquejar significativament i parcialment l’activació de JNK induïda per LPS / zVAD (Figura 6b). Per a més anàlisis de la microscòpia de fluorescència a nivells de cèl·lula unica, es va revelar que la producció de superòxid produïda per LPS / zVAD va procedir a la permeabilització de la membrana plasmàtica i la mort cel·lular (Figures 7b – e). En conjunt, aquests resultats donen suport a la idea que l'excés de superòxid o espècies relacionades és una font principal de ROS a la microglia tractada amb LPS / zVAD. En resum, les nostres dades demostren que la necroptosi microglial induïda per TLR4 està orquestrada per una sèrie d’esdeveniments mediatitzats per TRIF, senyalització RIP1 / RIP3, activació de JNK i producció específica de ROS.

Image

Producció elevada d’orquestres d’anions de superòxid que desapareixen microglials i procedeix la permeabilització de la membrana plasmàtica. ( a ) Augment de la producció d'anió de superòxid per microglia activada per LPS / zVAD i supressió completa per Nec-1 i BHA. Les microglis es van tractar prèviament amb Nec-1 (20 μ M), BHA (150 μ M), vitamina E (10 μ M), vitamina K2 (10 μ M) o SP600125 (10 μ M) durant 1 h abans estimulació amb baixa concentració de LPS (0, 1 ng / ml) o LPS (0, 1 ng / ml) / zVAD (25 μ M) durant 3 h. A continuació, es van avaluar espècies reactives d’oxigen mitjançant l’indicador d’anió superòxid hidroetidina (HE, 1 μ M) i la citometria de flux, tal com es descriu. Les dades representen la meitat de tres experiments independents. ** P <0, 01; NS, poc significatiu. ( b ) Imatges representatives de fluorescència viva i de contrast de fase de microglia estimulades amb LPS / zVAD durant 3 h i incubades amb HE (1 μ M) i Sytox (10 nM) durant 20 min, mostrant un augment de senyal HE oxidat abans de la mort de cèl·lules microglials (fletxes) ). La bisbenzimida es va utilitzar per visualitzar tots els nuclis. Barra d’escala, 50 μ m. ( c, d ) Cèl·lules microglia representatives a ( b ) a major ampliació, mostrant un senyal HE oxidat elevat en subpoblació de microglia (fletxa en c, cap de fletxa en d ) precedent a la permeabilització de la membrana plasmàtica a la cèl·lula que mor (fletxa en c ). La fletxa stealth a ( d ) indica una cèl·lula microglia amb senyal HE mínim oxidat. ( e ) L'anàlisi d'imatge en temps transcorregut de microglia carregada amb HE i Sytox i tractada amb LPS / zVAD revela que el senyal HE oxidat precedeix la mort cel·lular. Representació gràfica correcta de les intensitats mitjanes del senyal HE i Sytox de la cel·la representativa al llarg del temps. Barres d’escala, 15 μ m

Imatge a mida completa

Discussió

La mort de cèl·lules programades és un procés cel·lular fonamental amb funcions crítiques en el desenvolupament, l’homeòstasi i la immunitat. L’apoptosi depenent de la caspasa i la necrosi programada recentment identificada, també denominada necroptosi, són dues vies de mort programades de les cèl·lules que s’han demostrat que tenen papers de pivot en el sistema immunitari perifèric, com l’eliminació de cèl·lules T reactives i el control innat d’infeccions víriques. 42, 43, 44 Microglia són les cèl·lules immunes del SNC i regulen les respostes immunes innates i adaptatives; tanmateix, fins al moment, fins ara sabem poca informació disponible sobre un programa de necroptosi en microglia. En aquest estudi, es va demostrar un funcionament de dues vies programades de mort cel·lulars interconnectades en microglia primària activada per TLR: (1) apoptosi depenent de la caspasa en microglia hiperactivada i (2) necroptosi mediada per RIP3 com a desemmascarada pel bloqueig de la caspasa. Els agonistes dels receptors del TLR i el TNF van ser capaços d’iniciar necrosi primària de la microglia quan la caspasa-8 va ser suprimida per zVAD-fmk o IETD-fmk, fenòmens no observats en altres cèl·lules del SNC incloses neurones primàries, astròcits i oligodendròcits. L’inhibidor específic de la quinasa RIP1, la necrostatina-1, va ser altament eficaç per rescatar la microglia contra la necroptosi. També vam descobrir que la necrosi induïda per la lligada de la microglial TLR4 o TLR3 amb LPS i poli (I: C), respectivament, i zVAD era independent de la senyalització autocrina TNF / TNFR1 i es va transduir a través de la molècula adaptadora TRIF, com a LPS / zVAD i poli (I: C) / zVAD no van provocar necroptosi microglial a cèl·lules trifotants . TRIF, RIP1 i RIP3 són conegudes proteïnes adaptadores que contenen motius RHIM capaços d’interactuar entre elles mitjançant RHIM, 37, 45 i l’activació de TLR3 i TLR4 en presència de zVAD indueix la formació del complex TRIF / RIP3. 24 Coherent amb això, l’ablació genètica de rip3 completament abrogada necroptosi a la microglia, demostrant un requisit absolut per a la senyalització RIP3 en iniciar la mort necròtica de microglia activada. Finalment, l'activació de JNK i la generació de ROS específiques semblen executar el programa de mort cel·lular i donar lloc a la desintegració de microglia activada.

La microglia actua com a primera línia de defensa en el SNC i es pot activar mitjançant TLRs en situacions diverses, no només per PAMP microbianes, sinó també per molècules derivades d’hostes alliberades de les cèl·lules danyades. Tanmateix, la regulació de l’homeòstasi de la microglia activada continua sent mal entesa. L’activació excessiva de microglia amb LPS es va associar amb l’augment de la mort de cèl·lules apoptòtiques. Intrigant, encara que una dosi baixa de microps activats per LPS sense induir la mort cel·lular, el bloqueig de la caspasa-8 va desencadenar un robust programa de necrosi depenent del RIP1. Una possibilitat és que la caspasa-8 inactivi RIP1 mitjançant la divisió proteolítica 21 i la seva supressió millori l’estabilitat RIP1, sensibilitzant així les cèl·lules a la necrosi mediada per RIP1. De fet, s'ha demostrat que la caspasa-8 posseeix activitats prosurvival ja que es requereix per a l'activació de limfòcits T, 46, 47, diferenciació de monòcits 48, 49, així com la supressió de la necroptosi induïda per TNF. 13, 21 Caspase-8 i -3/7 recentment també s’han vist implicats en l’activació microglial, ja que el seu bloqueig amb IETD-fmk i DEVD-fmk va suprimir la subregulació induïda per LPS d’iNOS i certes citocines a microglies BV-2 sense provocar la mort cel·lular. . 27 També vam trobar que els inhibidors de la caspasa no van causar la mort de cèl·lules BV-2 i només van suprimir moderadament la producció de TNF induïda per LPS. En canvi, el bloqueig de la caspasa no va impedir la secreció de TNF induïda per LPS en la microglia de rata primària, sinó que va sensibilitzar notablement les cèl·lules al repte del LPS. Cal destacar que les microglies de rata primària són més vulnerables que les microglies de ratolí davant l'estimulació TLR3 / 4 i el bloqueig de la caspasa. Com la caspasa-8 pot interactuar i formar complexos de senyalització amb, per exemple, cFLIP, FADD, RIP1 / 3 i TRIF en diferents contextos, es requereix 50 investigacions més per definir la funció exacta de la caspase-8 en la regulació de l’activació, la supervivència i la microglialitat mort cel·lular mitjançant enfocaments genètics. Una altra troballa interessant d’aquest estudi és que l’estimulació nocturna de microglia amb LPS dóna lloc a l’expressió RIP1 / RIP3 millorada que predisposa les cèl·lules a la inducció de la necroptosi. El mecanisme subjacent a la regulació superior del RIP3 induït per LPS.

S'ha demostrat que la producció de ROS és necessària per a necroptosi en alguns tipus cel·lulars, però no en altres. 35, 50, 51 És interessant assenyalar que només l’antioxidant lipofílic BHA va prevenir la necroptosi mediada per TLR3 / 4 i va ser en realitat l’antioxidant utilitzat en la majoria d’estudis anteriors sobre necroptosi. Altres antioxidants lipofílics, com ara α- tòforol, imitació de l'enzim antioxidant i inhibidors de la lipoxigenasa, tot i que efectius per prevenir la necroptosi induïda per l'àcid araquidònic en oligodendròcits, 17 no van bloquejar eficientment la necrosi microglial mediada per TLR. Zhang et al. 22 també va assenyalar que només la BHA va evitar la necrosi induïda pel TNF a les cèl·lules N. En línia amb les nostres troballes, es va trobar que els nivells elevats de producció de superòxid en microglia tractada amb LPS / zVAD van precedir la mort cel·lular i van ser abolits completament per Nec-1 i BHA. Tot i que no podem excloure la possibilitat que BHA pugui tenir efectes diferents de prevenir la producció de superòxid, en general, les nostres dades suggereixen fortament que es necessita una ROS específica en llocs subcel·lulars específics per a la necroptosi induïda per l’activació de TLR en microglia.

Els microglatges són macròfags especificats al SNC. Estudis recents han demostrat que les microglies tenen un origen embrionari diferent del monòcits derivats de la medul·la òssia, colonitzen el SNC durant el desenvolupament embrionari precoç i presenten característiques singulars com la ramificació que els distingeix dels macròfags. 52 Tanmateix, la nostra identificació d’una via de necroptosi induïda per TLR / zVAD, similar a la dels macròfags, 24, 35 a la microglia planteja la qüestió de si la protecció contra la mort de cèl·lules microglials necròtiques pot ser beneficiosa en el SNC donat que la mort de cèl·lules necròtiques sovint es tradueix en inflamació. D’altra banda, és concebible que la necroptosi sigui una estratègia de còpia de seguretat de les cèl·lules immunes innates contra els patògens per estimular el sistema immune quan l’apoptosi és bloquejada, per exemple, per virus. 13, 34 La mort o degeneració de les cèl·lules microglials patològiques s’han observat efectivament en models de ratolins d’esclerosi lateral amiotròfica, 53 d’ esclerosi múltiple 54 i malalties neurodegeneratives. Tanmateix, el desencadenant i les conseqüències de la mort de cèl·lules microglials romanen en gran mesura inexplorades i justifiquen una investigació posterior.

En resum, les nostres dades van revelar que la microglia activada mitjançant TLRs pot patir apoptosi per autoeliminació o necrosi programada mediada per RIP3 quan es sensibilitzava amb zVAD o en certes condicions. Sembla, doncs, que l’activació microglial de TLR no només inicia respostes immunes del SNC contra patògens i danys als teixits, sinó que també es pot explotar per regular el destí cel·lular de la microglia activada. De fet, durant el procés de revisió del nostre manuscrit, un estudi recent va informar que zVAD indueix necrosi de microglia activada per LPS en cultius neuronals / glials mixts, protegint així les neurones indirectament de la toxicitat del LPS. 56 Com que la microglia té un paper fisiològic i patològic crític en molts trastorns neurològics, una comprensió detallada del mecanisme que regula la supervivència i la mort de la microglia activa pot proporcionar noves estratègies per orientar la neurodegeneració i la neuroinflamació.

Materials i mètodes

Animals and reagents

Wild-type B6.129SF2/J and C57BL/6J mice, TNF α (wild-type control B6.129SF2/J, # 003008) and TNFR1 (wild-type control C57BL/6J, #003242) knockout (KO) mice, and TRIF (Ticam1, background C57BL/6J, #005037) mutant mice were obtained from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Rip3-deficient mice were generous gift from Dr. Xiaodong Wang (National Institute of Biological Sciences, China) and Dr. Astar Winoto (University of California, Berkeley). BV-2 microglial cells were kindly provided by Dr. Monica Carson (University of California, Riverside). DMEM, HBSS, propidium iodide, Calcein AM, Alamar blue, and hydroethidine were purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Antibody against Iba1 was from Wako chemicals (Richmond, VA, USA). Recombinant TNF, zVAD-fmk, IETD-fmk, DEVD-fmk, YVAD-fmk, and antibody against RIP1 were obtained from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Rabbit anti-RIP3 and TRIF antibodies were from IMGENEX (San Diego, CA, USA). JNK, pJNK and active caspase-3 antibodies were obtained from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Pam3CSK4 and R848 were obtained from InvivoGen (San Diego, CA, USA). JNK inhibitor II (SP600125) was from Merck (Darmstadt, Germany). MnTMPyP, 0FeTMPyP, L-NMMA and Ebselen were obtained from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, UA). HRP-conjugated secondary antibodies were obtained from Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Unless specified otherwise, all other reagents were from Sigma (St. Louis, MO, USA).

Primary glial cell cultures

Primary microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and mixed glial cultures were prepared from forebrains of 1- to 2-day-old Sprague–Dawley rat pups as described previously. 8, 36 Briefly, dissociated cells were plated onto poly- D -lysine (PDL)-coated T75 flasks or 96 well culture plates and were fed every other day with D10S (DMEM with 10% FBS) for 7–10 days. Microglia were isolated by shaking mixed glia-containing flasks for 1 h at 200 rpm The purity of microglia at this stage was consistently >95%. For highly purified microglia monocultures (>99%), the cells were plated onto regular petri dishes for 1 h, detached from the plates with ice cold EBSS, and plated at final density of 3 × 10 4 cells per well in 96-well plates. Following 1-h pre-shaking, the flasks were shaken overnight at 200 rpm to separate OL precursors (preOLs) from the astrocyte layer. The cell suspension was then plated onto uncoated Petri dishes for 1 h to remove residual contaminating microglia, and the resulting preOLs were plated into poly- L -ornithine-coated culture plates and maintained in a serum-free basal defined medium (0.1% bovine serum albumin, 50 μ g/ml human apo-transferrin, 50 μ g/ml insulin, 30 nM sodium selenite, 10 nM D -biotin and 10 nM hydrocortisone in DMEM) supplemented with PDGF 10 ng/ml and bFGF 10 ng/ml for 5–9 days at 37 °C in a humid atmosphere of 5% CO2 and 95% air. Astrocytes (>95%) were purified from the remaining astrocyte layer in the flask after being exposed to a specific microglia toxin L -leucine methyl ester (1 mM) for 1 h and were subcultured one to two times. Mouse mixed glial cultures were prepared with similar methods as described above from B6.129SF2/J, C57BL/6J, TRIF mutant, TNF KO, TNFR1 KO, and rip3 KO mice and were seeded in PDL-coated 96-well plates. Mixed glial cultures at DIV6-7 were used in this study.

Cell treatment and survival determination

Microglia monocultures were washed two times with D1S (DMEM containing 1% FBS) and treated in triplicate with vehicle, LPS, Pam3CSK4, R848, poly(I:C), or TNF α in the presence or absence of zVAD-fmk or IETD-fmk as specified. For mixed glial cultures, cells were treated in serum-free basal defined medium. 30 As microglia in mixed glial cultures were not as sensitive as in isolated pure cultures to LPS/zVAD-induced necroptosis, higher concentrations of LPS and poly(I:C) were used. Microglial survival was determined by counting Iba1 + cells with normal nuclei in mixed glia cultures or Calcein AM + /propidium iodide (PI) cells in pure microglia cultures. Total number of cells was revealed by staining all nuclei with Hoechst 33342. Five to ten random consecutive fields were counted in each well under 100 × or 200 × magnification, with a total of >1000 cells counted in the control condition. In some cases, cell viability in monocultures was determined by measuring cell metabolic activity using Alamar Blue, a tetrazolium dye that is reduced by living cells to a colored product as previously described. 38 57

For experiments involving RNA and protein isolation, primary microglia were seeded into six-well plates at a density of 1.5–2 × 10 6 cells/well in D10S. After attachment, the cells were washed twice with D1S, and pre-treated with LPS (0.1 ng/ml) for 12–16 h. At the end of LPS treatment, microglia were washed twice with D1S and incubated with Nec-1, butylated hydroxyanisole (BHA), SP600125, or corresponding vehicle for 1 h before the induction of necrosis with zVAD-fmk addition. Microglia were then collected with ice-cold PBS at 1 h (RNA extraction) and 3 h (protein preparation) post zVAD-fmk treatment. Vehicles used were PBS for LPS, DMSO for zVAD-fmk, Nec-1, and SP600125, and ethanol for BHA, and these were used at the same final concentration volume (<0.1%) as the corresponding reagent.

In situ caspase-8 activity assay

To detect caspase-8 activity in situ in living microglia, a caspase-8 detection kit containing a specific and fluorescent FAM-LETD-fmk that covalently labels active caspase-8 was used according to the manufacturer's instruction (Image-iTs LIVE Green Caspase-8 Detection Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After live labeling of active caspase-8, microglia were fixed and subjected to immunocytochemistry as specified in the Figure 1 legend. Images were captured using a fluorescence microscope equipped with an Olympus DP70 digital camera. On the basis of the intracellular location of active caspase-8, the percentage of microglia with cytoplasmic diffuse caspase-8 signal (C-casp-8) and localized active caspase-8 (L-casp-8) was counted and analyzed across treatment conditions.

Detection of intracellular ROS

Intracellular ROS production was evaluated by flow cytometry using the superoxide indicator hydroethidine (HE) 41, 58, 59 and visualized by fluorescence microscopy. Briefly, freshly isolated primary rat microglia were treated in suspension as specified in Figure 7 legend. At the end of the treatment, cells were incubated with 1μM HE and 10 nM Sytox green nucleic acid stain for 20 min at 37 °C, centrifuged at 100 × g , resuspended in 100 μ l of PBS containing 2% FBS and analyzed immediately using a flow cytometer equipped with 488 nm laser for excitation (Accuri C6, BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Data were collected using FL1 for Sytox green nucleic acid stain (530±15 nm) or FL2 channel for HE (585±20 nm). A minimum of 10 000 cells were analyzed per condition. For time lapse microscopy, microglia seeded in slide chambers were loaded with 1 μ M HE and 10 nM Sytox for 20 min, washed and subjected to LPS (0.1 ng/ml)/ zVAD-fmk (25 μ M) stimulation. Images were manually acquired from the same chamber field at specified time points. To minimize photobleaching, cells were imaged with <0.5 s of exposure time for each filter. Fluorescence intensity of representative cells was analyzed with Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

Reverse transcription -PCR

Transcriptional expression levels of RIP1, RIP3, Iba1, TNF α , and β-actin in microglia upon stimulation with LPS and zVAD-fmk were examined as described previously. 57 Using Tri reagent, total RNA was extracted according to the manufacturer's instructions. Residual DNA was digested by incubating RNA samples with DNase I for 15 min at room temperature followed by DNase inactivation at 65 °C for 10 min according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). The samples were reverse transcribed to cDNA using the reverse transcription system kit (Promega, Madison, WI, USA) as described previously. 57 Primers specific for β -actin were used as a loading control. All products were amplified by PCR using 50 ng of cDNA and the following specific primers: RIP1, forward 5′-GCACCAGCTGTCAGGGCCAG-3′, reverse 5′-GCCCAGCTTTCGGGCACAGT-3′; RIP3, forward 5′-ACCTTGGCTGGCACTCCCCA-3′, reverse 5′-CCCCTGCCGAACTGTGCTGG-3′; TNF α , forward 5′-GCCCACGTCGTAGCAAAC-3′, reverse 5′-GCAGCCTTGTCCCTTGAA-3′; Iba1, forward 5′-CTTTTGGACTGCTGAAAGCC-3′, reverse 5′-GTTTCTCCAGCATTCGCTTC-3′; and β -actin, forward 5′-AGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′, reverse 5′-CCATCATGAAGTGTGACGTTG-3′. After the PCR reaction, products were electrophoresed on 2% agarose gels and visualized under UV light using a Bio-Rad Chemidoc XRS gel documentation system and Quantity-one software.

TNF α ELISA

TNF α levels in culture supernatants were determined using a commercially available ELISA kit according to the manufacturer's instruction (eBioScience). Absorption at 450 nm was determined with a microplate reader (Fluostar Optima, BMG Labtech, Cary, NC, USA). The detection limits of the TNF ELISA were 8 pg/ml for mouse TNF α and 16 pg/ml for rat TNF α .

Transmission electron microscopy

After a quick wash with PBS, microglia were fixed in 1% glutaraldehyde and 4% paraformaldehyde (Electron Microscopy 225 Sciences, Hatflield, PA, USA) in 0.1 M, pH 7.4 phosphate buffer overnight at 4 °C. Following three washes with 8% sucrose in 0.1 M phosphate buffer, the cells were washed again in 0.1 M sodium cacodylate buffer and stained with 1% osmium tetroxide and 0.5% potassium ferrocyanide in 0.5% sucrose for 1.5 h. The cells were then dehydrated in ascending alcohol series and embedded in epoxy resin. Ultrathin sections of microglia were examined using an FEI Morgagni 268 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV. Digital images were acquired with a MegaViewIII camera operated with iTEM software (Olympus Soft Imaging Systems, Germany).

Immunostaining, TUNEL and immunofluorescence microscopy

After the treatment, microglia were fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 10 min. Cells were rinsed three times with TBS, and blocked with TBS-T (0.1% Triton X-100) containing 5% goat serum for 1 h at room temperature. Primary antibody against Iba1 (1 : 2000) was used for detecting microglia. Antibody against cleaved, active casaspe-3 (1 : 1000) was used to evaluate caspase-3 activation. After overnight incubation at 4 °C, secondary antibodies conjugated with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 594 (1 : 1000; Invitrogen) were used. Nuclei were stained with Hoechst 33342. To label fragmented DNA, TUNEL was performed using an in situ cell death detection kit (Roche, Indianapolis, IN, USA). All images were captured with an inverted fluorescence microscope equipped with an Olympus DP70 digital camera (model IX71; Olympus, Tokyo, Japan).

Anàlisi estadística

All cell culture treatments were performed in at least triplicate samples. GraphPad prism software (San Diego, CA, USA) was used for data analyses. Data were expressed as mean±SEM and analyzed by one-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test unless stated otherwise. Differences were considered to be statistically significant when P <0.05.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Glossari

CNS

central nervous system

HE

hydroethidine

JNK

c-jun N-terminal kinase

LPS

lipopolisacàrid

Nec-1

necrostatin-1

RHIM

receptor-interacting protein homotypic interaction motif

DESCANSI EN PAU

receptor-interacting protein

ROS

espècies reactives a l'oxígen

TLR

Receptor similar al peatge

TNF

tumor necrosis factor α

TNFR1

TNF receptor 1

TRIF

TIR-domain containing adapter-inducing interferon- β

TUNEL

terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)