El ccl-1 a ​​la medul·la espinal contribueix al dolor neuropàtic induït per lesions nervioses mort i malaltia cel·lular

El ccl-1 a ​​la medul·la espinal contribueix al dolor neuropàtic induït per lesions nervioses mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Quimiocines
  • Dolor neuropàtic
  • Patogènesi
  • Medul · la espinal

Resum

Es coneix que les citocines, com les interleucines, participen en el desenvolupament del dolor neuropàtic mitjançant l’activació de la neuroglia. Tanmateix, el paper de la quimiocina (motiu CC) del lligand 1 (CCL-1), una quimiocina ben caracteritzada segregada per cèl·lules T activades, encara no està clar en la transmissió nociceptiva. Vam trobar que la CCL-1 estava regulada a la banya dorsal espinal després de la lligadura del nervi ciàtic parcial. Per tant, es van examinar accions de CCL-1 recombinant sobre la puntuació del dolor conductual, la transmissió sinàptica, la funció de les cèl·lules glials i la producció de citocines a la banya dorsal espinal. Aquí mostrem que CCL-1 és un dels mediadors clau implicats en el desenvolupament del dolor neuropàtic. L'expressió de mRNA de CCL-1 es va detectar principalment en el gangli de l'arrel dorsal ipsilateral i l'expressió del receptor CCL-1 específic CCR-8 va ser regulada a la banya dorsal superficial. Es va observar una major expressió de CCR-8 no només en neurones, sinó també en microglia i astròcits al costat ipsilateral. El CCL-1 recombinant es va injectar intratecal (a) a ratolins ingènus que va induir l’al·lodnia, cosa que es va impedir amb l’addició addicional d’antagonista del receptor de N- metil- D (NMDA), MK-801. Els enregistraments amb pinça de pinces de les rodanxes medul·lars van revelar que l’aplicació de la transmissió sinàptica excitatòria excitatòria augmentada transitòriament de CCL-1 a la substància gelatinosa (làmina II). A llarg termini, la injecció de fosforilació induïda per CCL-1 de la subunitat del receptor NMDA, NR1 i NR2B, a la medul·la espinal. La injecció de CCL-1 també va augmentar el nivell de mRNA de marcadors de cèl·lules glials i citocines proinflamatòries (IL-1 β , TNF- α i IL-6). L’al·lodnia tàctil induïda per la lligadura nerviosa es va atenuar mitjançant l’administració profilàctica i crònica d’anticòs neutralitzant contra CCL-1 i per la derrota de CCR-8. Els nostres resultats indiquen que CCL-1 és una de les molècules clau en la patogènesi, i que el sistema de senyalització CCL-1 / CCR-8 pot ser un objectiu potencial per al desenvolupament de fàrmacs en el tractament del dolor neuropàtic.

Principal

El dolor neuropàtic (també classificat com a dolor crònic o maligne) està associat a una lesió nerviosa d’etiologia múltiple que inclou traumatisme agut, diabetis, càncer, infecció i patologia autoimmune. 1 La patogènesi del dolor neuropàtic reflecteix una remodelació complexa de la medul·la espinal, amb un rol primari atribuït al canvi de transmissió sinàptica i l’activació de cèl·lules neuroglials, astròcits i microglia. 2, 3, 4

El glutamat, el principal neurotransmissor excitant del cervell i de la medul·la espinal, exerceix els seus efectes postsinàptics mitjançant un conjunt divers de receptors de membrana ionotròpica i metabotròpica. Els receptors ionotròpics de glutamat N- metil-D-partpart (NMDARs), específicament els localitzats a la banya dorsal de la medul·la espinal, estan involucrats críticament en la transmissió nociceptiva i la plasticitat sinàptica i han estat considerats durant molt de temps un objectiu per al tractament del dolor neuropàtic. 5, 6 La NMDAR neuronal nativa és un tetramer que consta de dues subunitats NR1 i dues subunitats NR2. 7 La fosforilació de diversos llocs de les terminals C citoplasmàtiques de les subunitats NR1 i NR2 és coneguda per modular l'activitat de NMDAR i afectar la transmissió sinàptica. 8, 9, 10

Hi ha molts informes que la lesió nerviosa desencadena canvis reactius en el sistema immune perifèric i en les cèl·lules neuroglials tant en els sistemes nerviosos perifèrics com centrals. 4, 11, 12 A la perifèria, l’activació de cèl·lules de Schwann i macròfags residents recluten cèl·lules immunes hematogènes, que posteriorment envaeixen els nervis ferits. 12, 13, 14 A la banya dorsal espinal que rep els aferents sensorials lesionats, l’activació de la microglia s’associa habitualment a etapes d’inici inicial del dolor neuropàtic. 2, 15, 16 citocines com la interleucina-1 β (IL-1 β ), el factor de necrosi tumoral α (TNF- α ) i IL-6, que s’originen a la zona lesionada perifèrica o de les cèl·lules neuroglials activades a la medul·la espinal., se sap que alteren la transmissió sinàptica a la banya dorsal. 13, 14

Les quimiocines i els seus receptors s’expressen àmpliament a les cèl·lules immunes i al sistema nerviós. 17, 18 estudis recents han demostrat que les quimiocines motiu CC lligament 2 (CCL-2) i CX3CL-1 indueixen al·lodnia tàctil (quan els estímuls no dolorosos no dolorosos esdevenen dolorosos) mitjançant l’activació de la microglia medul·lar. 17, 19 Aquests canvis reactius mediatitzats a través de citocines i quimiocines es desenvolupen paral·lelament a l’al·lodnia tàctil, sent aquest últim el símptoma principal del dolor neuropàtic. 20

CCL-1 (també conegut com a agent quimiotàctic 3 derivat del tim) és una de les quimiocines ben caracteritzades i es classifica en el mateix grup de quimiocines CC que CCL-2. CCL-1 està secretat per cèl·lules T activades, mastocitos i cèl·lules endotelials i té un paper important com a quimioatractant per a neutròfils i monòcits. 21 Tot i que els efectes del CCL-1 sobre les cèl·lules immunes estan ben caracteritzats, els papers del CCL-1 en el sistema nerviós central, i especialment en el desenvolupament del dolor neuropàtic, encara no són clars. En aquest informe, vam detectar que CCL-1 està involucrat en el desenvolupament de l’al·lodnia tàctil després de lesions del nervi perifèric mitjançant la millora de la transmissió nociceptiva espinal i l’activació de cèl·lules glials amb posterior alliberació de citocines.

Resultats

Expressió de CCL-1 a la medul·la espinal en ratolins neuropàtics

Primer es va examinar el desenvolupament de l’al·lodnia en un model de lligament del nervi ciàtic parcial (PSNL). Els ratolins van mostrar un augment significatiu de la resposta de retirada a l'estímul mecànic en la patada posterior ipsilateral (al·lodnia tàctil) als 7 dies després de la PSNL. La puntuació de dolor a la pota posterior ipsilateral va ser de 7, 5 ± 0, 8 ( n = 8), mentre que la pota posterior contralateral va ser de 1, 9 ± 0, 6 ( n = 8) (figura 1a). En paral·lel, el nivell de proteïna de CCL-1 va augmentar significativament 7 dies després de PSNL a la medul·la espinal ipsilateral (nivell de proteïna relativa, 0, 14 ± 0, 01; n = 4) en comparació amb la medul·la espinal contralateral (nivell de proteïna relativa, 0, 10 ± 0, 01; n = 4) (figura 1b). D'altra banda, els nivells d'altres citocines, TNF- α , interferoni- γ i IL-1 β no es van canviar significativament 7 dies després de la lliga nerviosa (figura 1b).

Image

Augment del CCL-1 a la medul·la espinal després de la lligadura nerviosa. ( a ) Els ratolins van mostrar al·lodnia tàctil a la pota posterior ipsilateral als 7 dies després de la PSNL. Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 8). ** P <0.01: davant de la lliga contralateral (anàlisi bidireccional de la variància (ANOVA) seguida de la prova de Tukey-Kramer). ( b ) Matèries de citocines a mostres de medul·la espinal als 7 dies després de la lligadura nerviosa. Els valors relatius de les proteïnes citocines i quimiocines es van normalitzar a valors de control positius en el kit de matrius. Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 4). ** P <0.01: versus contralateral (test t-pair de Student de dos cues). ( c ) Comparació d'ARNm CCL-1 entre medul·la espinal i DRG. Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 4). * P <0, 05: versus medul·la espinal (test de parella de dos cua Student). ( d ) El curs del temps dels nivells de mRNA de CCL-1 en el DRG després de la lliga nerviosa es va avaluar mitjançant transcriptasa inversa quantitativa (RT) -PCR. ( e ) El temps transcorregut dels nivells d'ARNm CCL-1 a la medul·la espinal després de la lliga nerviosa es va avaluar mitjançant RT-PCR quantitativa. Les dades representen la mitjana ± SE ( d, n = 4; e, n = 6). ** P <0, 01, * P <0, 05: enfront de la lliga (ANOVA unidireccional seguida de la prova de Bonferroni)

Imatge a mida completa

Període d'expressió d'ARNm CCL-1 a la medul·la espinal i al ganglió de l'arrel dorsal (DRG) després de la vinculació nerviosa

Primer, vam comparar el mRNA de CCL-1 entre la medul·la espinal i el DRG abans de la lligadura nerviosa. L’ARNm CCL-1 es va expressar en DRG (12428 ± 3606, 7%; n = 4) més que la medul·la espinal (figura 1c). A continuació, es va examinar l'expressió de mRNA de CCL-1 en un model PSNL. El nivell de mRNA de CCL-1 va augmentar significativament a les 3 h, 1 i 3 dies (194, 4 ± 19, 9%, 147, 3 ± 17, 3%, 142, 0 ± 2, 0%, respectivament; n = 4) després de la vinculació nerviosa en el DRG (figura 1d). A la medul·la espinal, el nivell de mRNA de CCL-1 va augmentar significativament a les 3 h després de la lliga nerviosa (361, 1 ± 74, 5%; n = 6; Figura 1e).

Període d'expressió de proteïnes CCR-8 a la medul·la espinal

CCR-8 és un receptor específic per a CCL-1. 22 La lligadura nerviosa va augmentar els nivells de proteïna de CCR-8 a la medul·la espinal dorsal ipsilateral 6 hores després de la cirurgia (figures 2a i c). El nivell de proteïna relativa de CCR-8 en comparació amb β -actina també va mostrar un augment significatiu a les 6 h després de la lligada (nivell de proteïna relativa, 0, 9 ± 0, 1; n = 9; Figura 2b). Es va realitzar una co-tinció de CCR-8 amb marcadors neuronals o glials 6 h després de la lligadura del nervi a la medul·la espinal. Es va observar una major expressió de CCR-8 no només en neurones, sinó també en microglia i astròcits en el costat ipsilateral (figura 3). A més, vam demostrar que CCR-8 s’expressava no només en neurones glutamatergiques sinó també en fibres neuronals GABAergic en neurones de cultiu primari (figura suplementària S1).

Image

Expressió de CCR-8 a la medul·la espinal després de la lligadura nerviosa. ( a i b ) Els nivells de proteïnes de CCR-8, un receptor selectiu per a CCL-1, a la medul·la espinal en diferents punts de temps després de la lligadura nerviosa es van avaluar mitjançant taquillació occidental. C, contralateral; I, iilateral. Les dades representen la mitjana ± SE ( b, n = 9). ** P <0.01: versus ipsilateral abans de la lliga, # P <0.05: versus contralateral (anàlisi bidireccional de la variància seguida de proves Tukey-Kramer). ( c ) Immunització de CCR-8 a la medul·la espinal contralateral (Contra-) i ipsilateral (Ipsi-) abans i 6 h després de la lliga nerviosa. Barres = 200 μ m (panells superiors), 100 μ m (panells inferiors)

Imatge a mida completa

Image

Expressió CCR-8 en neurones, microglia i astròcits després de la lligadura nerviosa. ( a ) Immunització de NeuN (vermell) i CCR-8 (verd) 6 hores després de la lligadura nerviosa a la medul·la espinal. Barres = 10 μ m. ( b ) Immunització de Iba1 (vermell) i CCR-8 (verd) 6 hores després de la lligadura nerviosa a la medul·la espinal. Barres = 10 μ m. ( c ) Immunització de GFAP (vermell) i CCR-8 (verd) 6 hores després de la lligadura nerviosa a la medul·la espinal. Barres = 10 μ m

Imatge a mida completa

La injecció d’un anticòs neutralitzant contra l’al·lodnia induïda per la lligadura nerviosa inhibida per CCL-1

Per examinar l'efecte profilàctic del bloqueig de CCL-1 contra l'al·lodnia tàctil, es va injectar un anticòs neutralitzant contra CCL-1 (anti-CCL-1, 2, 5, 25 i 50 ng) 10 minuts abans de la lliga nerviosa i durant 6 dies consecutius després del nervi. lligament. La injecció d’anticossos anti-CCL-1 de 50 ng va reduir significativament l’al·lodnia tàctil en 3, 5 i 7 dies després de la lligadura nerviosa (puntuació del dolor en cada moment, 5, 2 ± 0, 8, 6, 0 ± 0, 8 i 6, 0 ± 0, 9; n = 15, respectivament) ; Figura 4a). La inhibició mitjançant l'administració profilàctica de l'anticòs anti-CCL-1 era dependent de la concentració (figura 4b). Per provar els efectes de l'administració postcronica, es va iniciar la injecció diària d'anticossos anti-CCL-1 3 dies després de la lligadura nerviosa i es va continuar durant 7 dies. A diferència de l’administració profilàctica, l’al·lodnia tàctil no es va bloquejar una vegada que va ser induïda per la lligadura nerviosa (figura 4c).

Image

Inhibició de l’al·lèrnia induïda per lligament mitjançant la neutralització de l’anticòs contra CCL-1. ( a i c ) Efectes de l'anticòs neutralitzant CCL-1 (anti-CCL-1) sobre l'al·lodnia induïda per la lligadura nerviosa. L’anticòs neutralitzant CCL-1 (anti-CCL-1) o vehicle (sèrum de control) es va injectar per primera vegada 10 minuts abans de la lligadura nerviosa ( a ) o 3 dies després de la lligadura nerviosa ( c ), seguit de l’administració diària (mostrada per les fletxes). Les puntuacions es van mesurar mitjançant un filament de von Frey (vehicle, n = 17; cada concentració de anti-CCL-1, n = 15). 0 = abans de la lliga. ( b ) Inhibició de l’al·lodynia depenent de la concentració mitjançant anticossos anti-CCL-1 7 dies després de la lligadura nerviosa mitjançant el mètode d’administració profilàctica i crònica. Cada informació representa la mitjana de ± SE * P <0.05: versus vehicle (anàlisi bidireccional de la variància seguida de la prova Tukey-Kramer)

Imatge a mida completa

La injecció de CCL-1 va provocar al·lodynia, que va ser atenuada per l'inhibidor del NMDAR

A continuació, es va examinar l'efecte d'una injecció intratecal (it) de CCL-1 sobre el comportament nociceptiu. L’efecte de CCL-1 va dependre de la dosi i del temps; CCL-1 de 25 ng va augmentar significativament la puntuació de dolor després de 10, 20, 30, 40 i 80 min (puntuació de dolor en cada moment, 8, 6 ± 1, 2, 11, 3 ± 1, 11, 4 ± 1, 7, 11, 6 ± 0, 9, 9, 2 ± 1, 4 i 7, 4 ± 0, 9, respectivament; n = 8; Figura 5a). La puntuació de dolor a 20 minuts després de la injecció de diferents concentracions de CCL-1 es presenta a la figura 5b. Els RMN són crítics en la patogènesi de l’al·ludnia. 5, 6 En el nostre model, l’al·lodnia induïda per la injecció de CCL-1 (25 ng) estava bloquejada depenent de la dosi mitjançant la co-injecció de MK-801, un antagonista NMDAR no dependent de l’ús, competitiu, a una concentració de 125, 250 i 500 pM (figura 5c). El MK-801 va mostrar una inhibició de l’al·lodnia depenent de la dosi induïda per CCL-1 a 10, 20, 30, 40 i 50 min després de la injecció (puntuació de dolor en cada moment, 3, 0 ± 0, 7, 4, 6 ± 0, 7, 6, 4 ± 1, 0, 4, 3 ± 0, 8, 4, 0 ± 0, 7, respectivament; n = 8; Figura 5c). La IC 50 per als efectes MK-801 va ser de 354 pM ( n = 8) quan es va determinar en 20 min després de la injecció de CCL-1 (Figura 5d), cosa que suggereix el paper de la transmissió mediada per NMDA en l’al·lodnia.

Image

Inducció de l’al·lodynia per CCL-1 i atenuació de l’al·lodnia induïda per CCL-1 per antagonista de NMDA i efecte de CCL-1 en la transmissió sinàptica excitatòria a la banya dorsal espinal superficial. ( a ) La injecció intratecal (de) de CCL-1 a ratolins ingènus va provocar al·lodnia (vehicle, n = 12; cada concentració de CCL-1, n = 8). ( b ) Dependència de concentració d'al·lodnia induïda per CCL-1 a 20 min després de la injecció de CCL-1. ( c ) La co-injecció de MK-801 va bloquejar l’al·lodnia induïda per CCL-1 (25 ng, it) (vehicle, n = 12; cada concentració de MK-801, n = 8). ( d ) Inhibició de l'al·lodynia depenent de la concentració per MK-801 a 50 min després de la injecció. La concentració de MK-801 per a la inhibició del 50% (IC50) va ser de 354 pmol. Les dades representen la mitjana ± SE ** P <0, 01, * P <0, 05 versus el vehicle; ## P <0.01, # P <0.05: versus CCL-1 (25 ng) (anàlisi bidireccional de la variància seguida de proves Tukey-Kramer). ( e ) Efecte excitatori representatiu de CCL-1 (50 ng / ml) sobre sEPSCs evocat en neurones de gelatinosa substancial amb un potencial de retenció de -70 mV (les traces de l'esquerra). CCL-1 va provocar una barrera de sEPSCs. L’acció excitatòria de CCL-1 es va detectar a prop d’un 40% de les neurones testades (vegeu la secció Resultat). Els gràfics de la dreta mostren accions CCL-1 sobre la freqüència i l'amplitud dels sEPSCs ( n = 9)

Imatge a mida completa

CCL-1 va augmentar l’alliberament de glutamat a la banya dorsal superficial de la medul·la espinal

Es va examinar l’acció de CCL-1 sobre la transmissió sinàptica excitatòria a la banya dorsal espinal superficial, a la substància gelatinosa (làmina II), mitjançant l’enregistrament de patxets de cèl·lules senceres de les rodanxes de la medul·la espinal. Quan es mantenia la cèl·lula a -70 mV, les neurones gelatinoses substancials mostraven corrents excitatoris postsinàptics espontanis (sEPSCs) amb una freqüència mitjana de 7, 1 ± 1, 0 Hz i una amplitud d’11, 4 ± 0, 9 pA ( n = 9). En quatre de les nou cèl·lules examinades, l’aplicació de bany de CCL-1 (50 ng / ml) durant 60-90 s va millorar la transmissió sinàptica excitadora com es mostra a la figura 5e; aquesta acció va durar més de 3-5 minuts. A les cèl·lules sensibles a CCL-1, la freqüència i l'amplitud dels sEPSCs en presència de CCL-1 van ser 174 ± 11% i 110 ± 6, 3% de controls, respectivament (Figura 5e). En presència de TTX (1 μ M), també es va detectar aquest efecte excitatori de CCL-1 en dues de les sis cèl·lules provades (dades no mostrades).

Fosforilació NMDAR després de la injecció de CCL-1 a la medul·la espinal

Es va examinar si la fosforilació induïda per CCL-1 de les subunitats de NRM i NR2B de NMDAR a la medul·la espinal usant la taquillació occidental (figures 6a i b). CCL-1 va afectar els nivells de fosforilació de la subunitat de NR1 a Ser896 (p-NR1) a la medul·la espinal a les 3 h, 1 i 3 dies després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it) (nivells de proteïna relativa, 2, 7 ± 0, 75, 4, 5 ± 1, 16, 3, 5 ± 0, 88, respectivament; n = 3; Figura 6c). Després de la immunobloratge, la membrana es va despullar i es va retreure amb un anticòs anti-NR1 (Figura 6a). Tot i això, CCL-1 no va tenir cap efecte en l’augment del nivell de proteïna NR1 (Figura 6d). El nivell de proteïna de p-NR1 / NR1 es va incrementar a 1, 3 h, 1 i 3 dies després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it) (nivells de proteïna relativa, 5, 5 ± 0, 69, 5, 5 ± 1, 32, 9, 8 ± 1, 84, 7, 3 ± 1, 46, respectivament; n = 3; Figura 6e). La fosforilació induïda per CCL-1 de la subunitat NR2B a Tyr1472 (p-NR2B) a la medul·la espinal a 1 i 3 h després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it) (nivells de proteïna relativa, 2, 4 ± 0, 24, 4, 7 ± 0, 18, respectivament ; n = 3; Figura 6f). Després de la immunobloratge, la membrana es va despullar i li va retreure amb un anticòs anti-NR2B (Figura 6b). CCL-1 va augmentar el nivell de proteïna NR2B a 1, 3 i 7 dies després de la injecció de CCL-1 (25 ng; nivells de proteïna relativa, 2, 9 ± 0, 33, 2, 9 ± 0, 35, 3, 2 ± 0, 65, respectivament; n = 3; Figura 6g). El nivell de proteïna de p-NR2B / NR2B es va incrementar a 1 i 3 h després de la injecció de CCL-1 (25 ng; nivells de proteïna relativa, 0, 90 ± 0, 34, 0, 97 ± 0, 34, respectivament; n = 3; Figura 6h).

Image

Fosforilació NMDAR després de la injecció de CCL-1 a la medul·la espinal. ( a ) Els nivells de fosforilació de la subunitat de NR1 a Ser896 (p-NR1) a la medul·la espinal en diferents punts de temps després de la injecció de CCL-1 (25 ng, això) es van avaluar mitjançant Western TFT. La membrana es va despullar i es va retreure amb un anticòs anti-NR1. ( b ) Els nivells de fosforilació de la subunitat de NR2B a Tyr1472 (p-NR2B) a la medul·la espinal en diferents punts de temps després de la injecció de CCL-1 (25 ng, es) es van avaluar per Western Blot. La membrana es va despullar i es va retreure amb un anticòs anti-NR2B. ( c ) El gràfic resumeix el nivell de proteïnes de p-NR1. ( d ) El gràfic resumeix el nivell de proteïna de NR1. ( e ) Comparació dels nivells de p-NR1 normalitzats a NR1. ( f ) El gràfic resumeix el nivell de proteïnes de p-NR2B. ( g ) El gràfic resumeix el nivell de proteïna de NR2B. ( h ) Comparació dels nivells de p-NR2B normalitzats a NR2B. Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 3). ** P <0.01, * P <0.05: versus control (cont) (anàlisi unidireccional de la variància seguit del test de Bonferroni)

Imatge a mida completa

Efectes de la injecció de CCL-1 a les cèl·lules glials i a les citocines a la medul·la espinal

L’activació de les cèl·lules glials contribueix al desenvolupament i manteniment de l’al·lodnia tàctil. 11, 13 Es van examinar microglia i astròcits a la medul·la espinal després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it). Els nivells d’ARNm d’Iba1 van augmentar significativament a la medul·la espinal a 1, 3 h i 1 dia després de la injecció de CCL-1 (25 ng; 179, 8 ± 12, 0, 168, 4 ± 20, 0, 149, 5 ± 20, 0%, respectivament; n = 4; Figura 7a ). I vam demostrar que CCL-1 (25 ng) va induir un augment i un canvi morfològic de microglia positiva Iba1 un dia després de la injecció (figura suplementària S3). Els nivells de mRNA de CD11b també van augmentar significativament a la medul·la espinal a 1 dia després de la injecció de CCL-1 (25 ng; 249, 5 ± 51, 2%; n = 4; Figura 7b). Es va informar que P2X 4 R a la microglia és important per al desenvolupament de dolor neuropàtic. 2, 3 Es va examinar l'expressió de mRNA de P2X 4 R després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it). Tot i això, el mRNA P2X 4 R no havia canviat després de la injecció de CCL-1 (figura 7c). El nivell d’ARNm de proteïna d’àcid fibril·lar glial (GFAP) va augmentar significativament a la medul·la espinal a 1, 3 h i 1 dia després de la injecció de CCL-1 (25 ng; it; 199, 1 ± 19, 0, 163, 5 ± 16, 6, 169, 7 ± 20, 8%, respectivament); n = 4; Figura 7d). A més, vam observar que CCL-1 (25 ng) va induir un canvi morfològic i el nombre d’astròcits positius GFAP un dia després de la injecció (figura suplementària S3). A més, es va examinar l'activació de microglia i astròcits després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it) mitjançant l'anticòs MAPK fosfor-p38 (p-p38). La fosforilació induïda per CCL-1 de p38 MAPK en microglia i astròcits (figura suplementària S2). Les citocines i els factors de creixement són mediadors importants de les interaccions neuronal-glial. 12, 23 Es va examinar la citocina (IL-1 β , TNF- α , IL-6) i el factor neutròfic derivat del cervell (BDNF) a la medul·la espinal després de la injecció de CCL-1 (25 ng, it). Tot i que els nivells de proteïna d’IL-1 β , TNF- α i IL-6 no es van canviar després de 7 dies de lligament nerviós (figura 1b), l’ARNm de IL-1 β va augmentar significativament a la medul·la espinal a 1 i 3 h després de la injecció de CCL -1 (25 ng, it; 688, 0 ± 150, 8, 609, 2 ± 148, 1%, respectivament; n = 4; Figura 7e), així com TNR- α mRNA a 30 min, 1 i 3 h (25 ng, ell; 368, 1 ± 150, 1, 485, 8 ± 94, 4, 408, 1 ± 97, 4%, respectivament; n = 4; Figura 7f), i ARNm IL-6 a 1 i 3 h (25 ng, això; 248, 7 ± 40, 8, 318, 0 ± 68, 8%, respectivament; n = 4; Figura 7g) després de la injecció de CCL-1. D'altra banda, l'ARNm BDNF no va canviar després de la injecció de CCL-1 (Figura 7h).

Image

CCL-1 va augmentar l'expressió de cèl·lules glials i citocines a la medul·la espinal. Expressió d'ARNm de ( a ) Iba1, ( b ) CD11b, ( c ) P2X 4 R, ( d ) GFAP, ( e ) IL-1 β , ( f ) TNF- α , ( g ) IL-6 i ( h) ) BDNF després de la injecció de CCL-1 (25 ng, es) es van avaluar per RT-PCR. Cada valor es va normalitzar al nivell de control (cont). Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 4). ** P <0.01, * P <0.05: versus control (anàlisi unidireccional de la variància seguit del test de Bonferroni)

Imatge a mida completa

Efectes del tractament amb siRNA CCR-8 sobre l’al·lodynia

A continuació, es van examinar els efectes de la desregulació del CCR-8 sobre l’al·lodnia tàctil. Es va fer un model de derrocament CCR-8 mitjançant la transfecció de siRNA contra CCR-8. Vam confirmar que el nivell de proteïna de CCR-8 es va reduir a la medul·la espinal 5 dies després de la injecció de siRNA de CCR-8 (Figura 8a). Els ratolins CCR-8 van ser sotmesos a PSNL 5 dies després de la injecció de siRNA de CCR-8. Es va examinar l'efecte del derrocament de CCR-8 en l'al·lodynia i el moviment coordinat mitjançant la prova de filament de von Frey i la prova de rodeta. La baixada de la CCR-8 va reduir l’al·lodnia tàctil induïda per PSNL durant 2 setmanes ( n = 5; Figura 8c). Per contra, la desregulació de CCR-8 no va tenir cap efecte en el moviment coordinat ( n = 5; Figura 8d).

Image

SiRNA intratecal contra el tractament CCR-8 va inhibir la lligadura nerviosa induïda per l’al·lodynia. ( a ) Nivell proteic de CCR-8 a la medul·la espinal després de la transfecció de siRNA CCR-8. ( b ) Programa per fer ratolins model i anàlisi de comportament. ( c ) El CCR-8 siRNA va inhibir la lligadura nerviosa induïda per l'al·lodynia. ( d ) No es va produir cap canvi en el moviment coordinat després del tractament amb siRNA. Les dades representen la mitjana ± SE ( n = 5). ** P <0, 01 davant contralateral; ## P <0, 01, # P <0, 05: siRNA versus scramble (anàlisi bidireccional de la variància seguida de proves Tukey-Kramer)

Imatge a mida completa

Discussió

El present estudi, per primera vegada, demostra que l'expressió de CCL-1 a la medul·la espinal i DRG a l'ARNm i a nivells de proteïnes s'incrementa després de la lliga nerviosa i s'al·lumina l'al·lodnia tàctil induïda per la lligadura nerviosa mitjançant tractament amb anticossos neutralitzants contra CCL-1 i en ratolins CCR-8. A més, mostrem que CCL-1 té una acció excitatòria sobre la transmissió i la fosforilació glutamatergiques de les subunitats NMDAR, NR1 i NR2B, a la banya dorsal espinal i augmenta l’expressió dels marcadors d’activació de les cèl·lules glials (Iba1, CD11b i GFAP) i les citocines (IL -1 β , TNF- α i IL-6). Els nostres resultats indiquen, doncs, que CCL-1 pot ser un dels mediadors clau de l’al·lodnia tàctil crònica que actua mitjançant una modulació aguda de la transmissió sinàptica nociceptiva, la fosforilació de NR1 i NR2B, l’activació glial i l’augment de citocines a la medul·la espinal.

En aquest estudi, vam demostrar que el receptor específic CCL-1, CCR-8, es va expressar no només en neurones, sinó també en cèl·lules glials 6 h després de la lligadura nerviosa del costat ipsilateral (vegeu la figura 3). Es va suggerir que augment de la proteïna CCR-8 total després de la lligadura nerviosa a la medul·la espinal per augment de l’expressió CCR-8 a les cèl·lules glials. L’ARNm CCL-1 va mostrar només un augment transitori a la medul·la espinal (vegeu la figura 1e) i als 3 h, 1 i 3 dies després de la lligadura nerviosa en DRG (vegeu la figura 1d). Això indica que CCL-1 es pot produir principalment en DRG després de la lligadura nerviosa. En el cas de CCL-21 i CCL-2, es van produir en DRG després de la lligadura nerviosa i es van transportar a terminals neuronals de la banya dorsal. 24, 25 CCL-2 es va alliberar de les vesícules sinàptiques neuronals de la medul·la espinal. De manera similar, suposem que CCL-1, que es produeix en neurones DRG després de la lligadura nerviosa, és posteriorment transportat a la medul·la espinal i després alliberat. L’ARNm CCL-1 a la medul·la espinal a les 3 h després de la lligadura nerviosa també es va produir a les cèl·lules glials tot i que només de forma transitòria; però, requereix més investigacions.

Les cèl·lules immunes i les cèl·lules glials interactuen amb les neurones per alterar la sensibilitat al dolor i mediar la transició del dolor agut al crònic. 11, 14, 19 Generalment es creu que les microglies estan implicades en el desenvolupament i astròcits en el manteniment del dolor neuropàtic. 27, 28, 29 Les citocines són missatgers importants per a la comunicació entre neurones i glia. 11, 13, 30 La injecció de CCL-1 a la medul·la espinal va augmentar el nivell d'ARNm de marcadors microglials (CD11b o Iba1) i astroglial (GFAP), així com el de citocines (IL-1 β , TNF- α i IL- 6) (vegeu Figura 7). També vam observar una doble tinció de GFAP o CD11b amb p-P38 després de la injecció de CCL-1, cosa que suggereix que la microglia i els astròcits estaven en estats reactius (vegeu la figura suplementària S2). L’activació de la microglia a la banya dorsal espinal després d’una lesió del nervi perifèric està ben caracteritzada. 2, 31 Els mecanismes d'activació microglial induïda per lesions nervioses són complexos i impliquen diversos sistemes de senyalització. La senyalització purinèrgica mediada a través dels receptors P2X 4, P2X 7 i P2Y 12 sembla contribuir a l’activació inicial de la microglia després d’una lesió nerviosa aguda. 2, 3, 16, 31, 33, 34 No obstant això, no hem pogut identificar els canvis en l’ARNm del receptor P2X 4 a la medul·la després de la injecció de CCL-1. Això suggereix que l'activació de microglia mediada per CCL-1 no implica la regulació superior dels receptors P2X 4, sinó que implica cascades (es) de senyalització diferents. Diversos informes han demostrat anteriorment que les citocines i quimiocines activen microglia i astròcits, induint la secreció de factors proinflamatoris (per exemple, IL-1 β , TNF- α , BDNF, IL-6, IL-17, CCL-2). 2, 12, 27 Diverses citokines i quimiocines proinflamatòries han estat implicades en el processament alterat de nociceptives. 12 TNF- α millora l'eficàcia sinàptica augmentant l'expressió superficial dels receptors AMPA. 35 IL-1 β modula la transmissió de neurones sensorials mitjançant un augment de l'alliberament de la substància neuropèptida nociceptiva P i del pèptid relacionat amb el gen de la calcitonina. 36, 37, 38 IL-1 β també va induir la fosforilació de NR1. Es va informar que IL-6 estava involucrada en el desenvolupament de dolor neuropàtic. Per contra, hi ha alguns informes que la IL-6 té efectes neuroprotectors en el sistema nerviós central. 41 IL-1 β i TNF- α van induir l'expressió IL-6 en neurones cultivades i en astròcits. 42 Segons aquests informes, podria ser raonable que una expressió màxima de IL-6 a la medul·la es produís posteriorment en comparació amb la de TNF- α i IL-1 β després de la injecció de CCL-1 (vegeu la figura 7g). Aquests resultats indiquen que CCL-1 està involucrat en el desenvolupament de l’al·lodynia mitjançant l’activació glial i l’expressió de citocines. Tot i això, altres molècules de senyalització també poden estar implicades en la patogènesi del dolor neuropàtic. Els efectes del CCL-1 sobre la funció glial han de ser investigats amb més detall en el futur.

Vam demostrar que l’al·lodnia induïda per injecció de CCL-1 estava bloquejada per la co-injecció d’antagonista de NMDAR. Vam suposar que CCL-1 va millorar l'alliberament de glutamat des del terminal presinàptic o les NMDAR postsinàptiques afectades. Vam confirmar que CCL-1 va afectar tots dos, augmentant de forma transitòria l’alliberament de glutamat i induint gradualment la fosforilació de NR1 i NR2B. Pel que fa a l’efecte presinàptic, vam demostrar que CCL-1 augmentava l’alliberament de glutamat només en algunes, però no en totes les neurones (vegeu la figura 5e). De la mateixa manera, el doble immunoconteniment amb anti-CCR-8 i anti-NeuN va demostrar que l'expressió CCR-8 només es trobava a la subpoblació de neurones (vegeu la figura 3), la raó de la qual es requereix més investigació. Pel que fa a l’efecte postsinàptic, ja es va informar que l’activació de NMDAR és important per iniciar canvis duradors en les sinapsis i que s’ha implicat en dolor persistent enfortint la transmissió sensorial glutamatergica. 5 Tot i que no vam comprovar directament si els corrents de NMDA postsinàptics van ser millorats o no per CCL-1, vam observar que tant la fosforilació de NMDAR com l’augment del nombre de NMDAR tenen lloc en resposta a CCL-1. La fosforilació de NMDAR és coneguda per modular l’activitat de la NMDAR i facilitar la transmissió d’entrades nociceptives en models de dolor inflamatori i neuropàtic. 39 La vinculació parcial del nervi ciàtic va augmentar significativament la proporció fosforilada de subunitats NR1 i NR2B a la banya dorsal. 43, 44 La fosforilació de la subunitat NR1 està relacionada amb la millora de l'eficàcia sinàptica i el desenvolupament de la sensibilització central 7 dies després de lesió nerviosa. 45 D'altra banda, l'antagonista selectiu NR2B va atenuar el dolor neuropàtic. 46 La fosforilació de tirosina de NR2B, però no de NR2A, està associada al desenvolupament de dolor persistent. 47 En els nostres experiments, CCL-1 va induir la fosforilació de NR1 i NR2B, tot i que amb diferents temps: la fosforilació de NR2B va ser transitòria, mentre que la fosforilació de NR1 va continuar durant 3 dies. En els nostres experiments conductuals sobre puntuació del dolor, la injecció de CCL-1 va induir al·lodynia de forma transitòria, com a fosforilació de NR2B. Com que hi ha un informe que NR2B és particularment important per a la percepció del dolor, 5 especulem que la fosforilació de NR2B seria més important que la fosforilació de NR1 juntament amb la regulació de NR2B. Quant a la fosforilació de NR1, es va informar que IL-1 β va induir la fosforilació de NR1. 45, 48 Com que l'ARNm de IL-1 β augmentava a la medul·la espinal després de la injecció de CCL-1 a 1 i 3 h (Figura 7e), especulem que NR1 fosforilaria no només per CCL-1, sinó també per IL-1. β .

En conclusió, el nostre estudi proporciona proves que CCL-1 es produeix principalment en DRG després de la lligadura nerviosa, suposadament transportada a la medul·la espinal, on augmenta l’alliberament de glutamat juntament amb el CCL-1 regulat local, i després activa les cèl·lules glials i l’alliberament de citocines. . CCL-1 també va induir la fosforilació de les subunitats NMDAR, NR1 i NR2B. El tractament amb anticossos neutralitzants contra CCL-1 i CCR-8 siRNA va bloquejar l’al·lodnia tàctil induïda per la lligadura nerviosa. Per tant, CCL-1 és una de les molècules clau en la patogènesi de l’al·lodnia i el sistema de senyalització CCL-1 / CCR-8 pot ser un objectiu potencial per al desenvolupament de fàrmacs en el tractament del dolor neuropàtic.

Materials i mètodes

Animals

S'han utilitzat ratolins ddY mascles (20-30 g, Kyudo Co. Ltd., Tosu, Saga, Japó). Els ratolins es van allotjar a 23 ± 2 ° C amb 12 h de cicle de llum: 12 h de foscor (llum des de les 07:00 fins a les 1900 hores) i se'ls va donar accés gratuït a menjar comercial i aigua de l'aixeta. Els procediments experimentals es van basar en les directrius del Comitè per a la cura i l'ús d'animals de la Universitat Kyushu, la Universitat de Fukuoka i l'Institut Nacional de Ciències Fisiològiques.

Drogues

El CCL-1 de ratolí recombinant i l'anticòs neutralitzant CCL-1 es van comprar a R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). MK801 es va comprar a Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA).

PSNL

Els ratolins van ser anestesiats amb una injecció intraperitoneal (ip) de pentobarbital (65 mg / kg). Es va produir un PSNL al lligar una lligadura estreta amb un fil de niló nº 8 al voltant d’aproximadament 1/3-1 / 2 del diàmetre del nervi ciàtic situat a la part esquerra (costat ipsilateral) basat en el mètode Seltzer. 49 Al costat dret (costat contralateral), el nervi estava exposat sense lligament.

Anàlisi del comportament

Behavioural analysis was performed to assess the development of tactile allodynia in mice. Tactile allodynia was measured using a von Frey filament (North Coast Medical, Gilroy, CA, USA). Mice were placed in glass cages with a wire mesh bottom and allowed to habituate for at least 1 h. A von Frey filament with bending forces of 0.16 g (innocuous stimulation) was pressed perpendicularly against the plantar skin of a hind-paw. The paw withdrawal responses to the mechanical stimulus were evaluated by scoring as follows: 0, no response; 1, lifting the hind-paw within 3 s; 2, lifting the hind-paw over 3 s; and 3, immediate flinching or licking of the hind-paw. The stimulation of the same intensity was applied seven times to each hind-paw at several seconds intervals and the total served as the pain-related score (score) in the SNL model. The behavioural data were analyzed using Origin (Microcal software Inc., Sunnyvale, MA, USA) software to determine the IC 50 values.

We performed a rota-rod (KN-75 Rota-rod, Natume, Japan) test to measure motor balance and coordination. Mice were pre-trained on rota-rod apparatus for 3 days and then tested on the accelerating rod in which the speed of the spindle was 10 rpm Latency until fall was automatically recorded. To eliminate stress and fatigue, mice were given a maximum cutoff latency of 120 s.

Intrathecal injection

Intrathecal (it) injection was performed using a 25- μ l Hamilton syringe with a 28-gauge needle (Muranaka Medical Instruments co. LTD., Osaka, Japan), as described previously. 50, 51 The needle was inserted into the intervertebral space of a conscious mouse between the lumbar 5 (L5) and 6 (L6) regions of the spinal cord. A reflexive flick of the tail was considered to be an indicator of the accuracy of each injection. A volume of 5 μ l was used for the it injections.

Anàlisis immunohistoquímics

Mice were anesthetized by pentobarbital sodium (50 mg/kg, ip) and perfused transcardially with saline followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS; 80 mM Na 2 HPO 4, 20 mM KH 2 PO 4, 150 mM NaCl, pH 7.4). The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord was removed, postfixed in the same fixative and placed in 20% sucrose solution for 24 h at 4 °C. Transverse L4–L6 spinal cord section (20 μ m) were sliced by a HM 550 cryostat (Micro-edge Instruments Co., Tokyo, Japan) and incubated for 1 h at room temperature in 5% donkey serum (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA). Then, the sections were incubated with the following: NeuN (1 : 200, Millipore, Bilerica, MA, USA), CCR-8 (1 : 500, Enzo, New York, NY, USA), Iba1 (ionized calcium-binding adapter molecule-1, 1 : 2000, Wako, Osaka, Japan), CD11b (1 : 500, Serotec, Oxford, UK), GFAP (1 : 800, Millipore) or p-p38 (phosphor-p38 MAPK, 1 : 100, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) for 24 h at 4 °C. The sections were incubated for 4 h at room temperature in the secondary antibody (IgG-conjugated Alexa Fluor 488 or 594, 1 : 1000, Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Sections were mounted on coverslips with permafluor aqueous mounting medium (Thermo Scientific, Yokohama, Japan). The sections were analyzed using a fluorescence microscope (BZ9000, Keyence, Japan) and a confocal laser scanning microscope (LSM510META, Carl Zeiss, Hallbergmoos, Germany). In confocal imaging, we used a series of Z-stack images (images taken at multiple focal points of an objective lens through the z -axis) for 3D analysis of each slice.

Cytokine array

Mouse cytokine array kit was purchased from R & D Systems and was assessed as described previously. 52 The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord was isolated and homogenized in the lysis buffer (10 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.4) containing protease inhibitor cocktail (Sigma) and centrifuged at 15 000 rpm for 20 min at 4 °C. Each reaction was performed according to the protocol of the manufacturer using 20 μ g of protein collected from the sample. The protein sample was incubated with a blot array precoated with 40 cytokine/chemokine antibodies overnight at 4 °C. These blots were visualized using Lumi GLO Reserve Chemiluminescent Substrate Kit (Cell Signaling Technology) and quantified by a luminoimage analyzer (Fluor Chem Imaging System, Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA).

Real-time reverse transcription (RT) PCR

The L4–L6 segment of the lumbar spinal cord and DRG were subjected to total RNA extraction according to the protocol of the manufacture and purified with QIAamp RNA Blood Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA). The amount of total RNA concentration was measured using Smart Spec 3000 (Bio-Rad, Tokyo, Japan). Total RNA (175 ng) was converted to cDNA by reverse transcription, using random 9 mer (Takara, Otsu, Japan) and RNA PCR kit (Takara). The primers were as follows: CCL-1 primers (forward: 5′-TTCCCCTGAAGTTTATCCAGTGTT-3′, reverse: 5′-TGAACCCACGTTTTGTTAGTTGAG-3′); β -actin primers (forward: 5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAGGAG-3′, reverse: 5′-GTGGACAGTGAGGCCAGGAT-3′); TNF- α primers (forward: 5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3′, reverse: 5′-TGGGCTACAGGCTTGTCACT-3′); IL-1 β primers (forward: 5′-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3′, reverse: 5′-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3′); IL-6 primers (forward: 5′-ACACTCCTTAGTCCTCGGCCA-3′, reverse: 5′-CACGATTTCCCAGAGAACATGTG-3′); BDNF primers (forward: 5′-TGCAGGGGCATAGACAAAAGG-3′, reverse: 5′-CTTATGAATCGCCAGCCAATTCTC-3′); Iba1 primers (forward: 5′-CCTGATTGGAGGTGGATGTCAC-3′, reverse: 5′-GGCTCACGACTGTTTCTTTTTTCC-3′); CD11b primers (forward: 5′-AATGATGCTTACCTGGGTTATGCT-3′, reverse: 5′-TGATACCGAGGTGCTCCTAAAAC-3′); GFAP primers (forward: 5′-CCAGCTTCGAGCCAAGGA-3′, reverse: 5′-GAAGCTCCGCCTGGTAGACA-3′); and P2X 4 R primers (forward: 5′-TGGCCGACTATGTGGTCCCA-3′, reverse: 5′-GGTTCACGGTGACGATCATG-3′). All primers were purchased from Sigma Aldrich Japan (Tokyo, Japan). PCR amplification was undertaken for Sybr qPCR Mix (Takara) in Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Each reaction volume consisted of 10 μ l Sybr qPCR Mix, 0.4 μ l 50 × ROX reference dye, 0.4 μ l mix of forward and reverse primers (0.2 μ M each) and 7.8 μ l RNAase free water containing cDNA (17.5 ng). PCR was done by 15 s denaturation at 95 °C and annealing/extending at 60 °C for 40 cycles. Each mRNA expression level was normalized by β -actin. The mRNA expression was calculated relative to β -actin using the ΔΔC T algorithm.

Western blot

Expression protein level of CCR-8 in lumbar spinal cord was examined by western blotting relative to β -actin. The L4–L6 segments of the lumbar spinal cord were isolated and homogenized in a lysis buffer containing protease inhibitor (Sigma); subsequently 20 mg of proteins were loaded for each lane and separated by SDS-PAGE gel (7.5%), and transferred to PVDF membrane (Bio-Rad). The membrane was blocked with 5% low-fat dried milk (anti-CKR8/CCR-8), 5% BSA (anti-p-NR2B, anti-NR2B) or 3% BSA (anti-p-NR1, anti-NR1) and incubated with the following for 1 h at room temperature: Rabbit monoclonal anti-CKR8/CCR-8 (1 : 500, Epitomics, Burlingame, CA, USA), anti-phospho-NR1 (Ser896; 1 : 1000, Millipore), anti-NR1 (1 : 1000, Millipore), anti-phospho-NMDAR2B (Y1472; 1 : 1000, R&D Systems), anti-NMDAR2B (D15B3) (1 : 1000, Cell Signaling Technology), and anti- β -actin (1 : 1000, Sigma). The membrane was washed and incubated with specific secondary antibodies (Amersham ECL anti-rabbit IgG and anti-mouse IgG, horseradish peroxidase-linked species-specific whole antibody, 1 : 5000, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). The blots were detected by use of ECL western blotting detection system (GE Healthcare) and LAS-4000 imaging system (Fujifilm, Tokyo, Japan). Bands were quantified using the software Multi Gauge (Fujifilm).

Preparation of spinal cord acute slices

The methods used for obtaining spinal cord slice preparations are identical to those described elsewhere. 53, 54 Mice were anesthetized with urethane (1.2–1.5 g/kg, ip), and a thoracolumbar laminectomy was performed. The lumbosacral segments of the spinal cord (L1–S1) were placed in an ice-cold Krebs solution equilibrated with 95% O 2 /5% CO 2 . The Krebs solution contained (in mM) 117 NaCl, 3.6 KCl, 2.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 1.2 NaH 2 PO 4, 25 NaHCO 3 and 11 glucose. Immediately after removal of the spinal cord, the mice were exsanguinated under the urethane anesthesia. The pia-arachnoid membrane was removed after cutting all of the ventral and dorsal roots. The spinal cord was mounted on a vibratome and a 500- μ m thick transverse or sagittal slices were cut. The slice was placed on a nylon mesh in the recording chamber with a volume of 0.5 ml and was completely submerged and perfused with Krebs solution saturated with 95% O 2 and 5% CO 2 at 36±1 °C at a flow rate of 10–15 ml/min.

Whole-cell patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons

The substantia gelatinosa was easily discernible with transmitted illumination as a relatively translucent band across the dorsal horn in the transverse or parasagittal slice preparations. Blind whole-cell voltage-clamp recordings were made from SG neurons, as previously described. 53, 54 The patch pipettes were filled with potassium gluconate solution, a solution containing (in mM); 135 K-gluconate, 5 KCl, 0.5 CaCl 2, 2 MgCl 2, 5 EGTA, 5 HEPES, and 5 ATP-Mg (pH 7.2). The tip resistance of the patch pipettes was 6–12 MΩ. Series resistance was assessed from current in response to a 5-mV hyperpolarizing step. Series resistance was monitored during the recording session and data were rejected if its value changed by >15%. Ion currents were monitored with a patch-clamp amplifier (Axopatch 700A, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). The data were digitized with an analog-to-digital converter (Digidata 1321A, Molecular Devices), stored on a personal computer using a data acquisition program (Clampex version 10, Molecular Devices) and analyzed using a software package Clampfit version 10 (Molecular Devices). Recordings were made in a voltage-clamp mode at holding potential of −70 mV to isolate EPSCs. Drugs were dissolved in the Krebs solution and applied by superfusion.

Transfection of CCR-8 siRNA by electroporation

siRNA against CCR-8 were obtained from Bonac Corporation (Kurume, Japan) (GenBank accession number: NM_007720, mCcr8#1 sense 5′-GCAAGAAACUGAGGAGCAU-3′, anti-sense 5′-AUGCUCCUCAGUUUCUUGC-3′, mCcr8#2 sense 5′-GAGCAGUCUUUGAGGUGGA-3′, anti-sense 5′-UCCACCUCAAAGACUGCUC-3′, and mCcr8#3 sense 5′-GAGAGAAGUUUAAGAAACA-3′, anti-sense 5′-UGUUUCUUAAACUUCUCUC-3′). Mice were anesthetized by pentobarbital sodium (50 mg/kg, ip). Mixed siRNA (0.2 μ g/ μ l, 10 μ l) was injected it using a 25- μ l Hamilton syringe with a 28-gauge needle (Muranaka Medical Instruments co. LTD.). 55, 56 Scrambled siRNA (sense 5′-UACUAUUCGACACGCGAAG-3′, anti-sense 5′-CUUCGCGUGUCGAAUAGUA-3′; Bonac Corporation) was used as a negative control. A volume of 5 μ l was used for the it injections at each points. Electric pulses (poring pulse: 75 V, 5 ms of length with 50-ms interval, transfer pulse: 20 V, 50 ms of length with 50-ms interval) were delivered using NEPA21 (Nepa Gene, Ichikawa, Japan). 57, 58 Knock-down effects were evaluated by western blotting.

Cultiu cel·lular

Cortex neurons were obtained from embryonic days 14–16 ddY mice as described previously. 59 Briefly, neurons were cultured at 37 °C in a 10% CO 2 incubator for 5–7 days with neurobasal medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) containing 2% B27 supplement (GIBCO) and 0.5 mM L-glutamine (GIBCO).

Immunocytochemical analysis

Primary cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 30 min at room temperature and permeabilized with 0.1% TritonX-100 in PBS for 5 min, followed by treating with blocking solution (Block Ace; Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan) for 30 min at room temperature. Cells were incubated with primary antibodies: CCR-8 (1 : 200, Epitomics), MAP2 (1 : 1000, Sigma, St. Louis, MO, USA), VGLUT1 (1 : 1000, Synaptic Systems, Göttingen, Germany) or VGAT (1 : 500, Synaptic Systems) overnight at 4 °C. The cells were washed in PBS and then incubated for 3 h at room temperature with secondary antibody (IgG-conjugated Alexa Fluor 488 or 568 or 633, 1 : 1000, Molecular Probes). The cells were washed in PBS and treated with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 300 nM, Molecular Probes) for 10 min and then washed with PBS. Slides were cover-slipped with permafluor aqueous mounting medium. The sections were analyzed using a confocal laser scanning microscope (LSM510META, Carl Zeiss).

Anàlisi estadística

All data are presented as mean±SEM The statistical analyses of the results were evaluated by using two-tailed Student's paired or unpaired t -test, one-way ANOVA followed by Student–Newman–Keuls test, one-way ANOVA followed by Bonferroni's test or two-way ANOVA followed by Tukey–Kramer test. P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • NM_007720

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària S1

  2. 2

    Figura suplementària S2

  3. 3.

    Figura suplementària S3

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

Glossari

AMPA

alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid

AMV

avian myeloblastosis virus

ANOVA

analysis of variance

ATP

adenosine triphospjate

BDNF

factor neurotròfic derivat del cervell

CCL-1

chemokine (CC motif) ligand 1

CCL-2

chemokine (CC motif) ligand 2

CCL-21

chemokine (CC motif) ligand 21

CCR-8

chemokine (CC motif) receptor 8

CX3CL-1

chemokine (CX3C motif) ligand 1

DAPI

4', 6'-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride

DMEM

Dulbecco's modified eagle medium

DRG

dorsal root ganglion

EGTA

àcid tetraacètic etilenglicol

FBS

sèrum boví fetal

GABA

γ-amino butyric acid

GFAP

glial fibrillary acid protein

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

Iba-1

ionized calcium-binding adapter molecule 1

IC 50

half maximal inhibitory kinase

IFN-γ

interferon γ

IL-17

interleukin-17

IL-1β

interleukin 1β

IL-6

interleukin-6

it

intrathecal injection

IP

intraperitoneal injection

L5

lumbar 5

MAPK

proteïna quinasa activada mitogen

MAP2

microtubule-associated protein 2

mEPSC

miniature excitatory postsynaptic current

ARNm

messenger ribo nucleic acid

NeuN

neuron specific nuclear protein

NMDA

N-methyl-D-aspartate

NR1

NMDA receptor 1

NR2B

NMDA receptor 2B

PBS

phosphate buffered saline

pNR1

phosphorylated NR1

pNR2B

phosphorylated NR2B

PSNL

partial sciatic nerve ligation

PVDF

polyvinylidene difluoride

RT-PCR

reverse transcription polymerase chain reaction

SE

standard error

SG neuron

substantia gelatinosa neuron

siRNA

small interfering ribo nucleic acid

sEPSC

spontaneous excitatory postsynaptic current

TCA-3

thymus-derived chemotactic agent 3

TNF-α

tumour necrosis factor-α

??X

tetrodotoxin

VGAT

vesicular GABA transporter

VGLUT1

vesicular glutamate transport protein 1

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)