Regulació específica del tipus de cèl·lula de la senyalització d'acte associat a la bassa mort i malaltia cel·lular

Regulació específica del tipus de cèl·lula de la senyalització d'acte associat a la bassa mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Senyalització cel·lular
  • Càncer de SNC
  • Mecanisme d’acció

Resum

20 S -protopanaxadiol (aPPD) és un metabòlit de les saponines del ginseng, que s'informa que són pro-apoptòtiques en algunes cèl·lules, però anti-apoptòtiques en cèl·lules neuronals mitjançant la regulació de la senyalització d'Akt. Degut a la seva estructura similar al colesterol, vam plantejar que l’aPPD pot regular la senyalització Akt mitjançant la interacció amb les basses lípides. Aquí, vam comparar la senyalització Akt en glioblastoma U87MG i neuroblastoma Cèl·lules Neuro-2a tractades amb aPPD. APPD no va canviar l’activitat Akt en les membranes plasmàtiques totals de cada tipus de cèl·lula, però va alterar dràsticament l’activitat de Akt associada a la bassa. Curiosament, l'activitat de Akt va disminuir a les basses de les cèl·lules U87MG, però va augmentar en les cèl·lules N2a per PPD mitjançant la regulació de la fosforilació associada a la bassa. La regulació bidireccional de la senyalització Akt associada a la bassa per aPPD va millorar la quimiotoxicitat de Paclitaxel o Vinblastina a les cèl·lules U87MG, però va atenuar l'excitotoxicitat del N- metil-D-partat a les cèl·lules N2a. Els nostres resultats van demostrar que l’activitat de la membrana Akt associada a la bassa, però no total, determina les seves funcions cel·lulars. Les basses de lípids difereixen en diferents tipus de cèl·lules, la qual cosa permet la orientació específica del tipus cel·lular per a la qual el PPAP podria ser un agent útil.

Principal

20 S -protopanaxadiol (aPPD) és un metabolit gastrointestinal de les saponines del ginseng. Aquests últims són els principals components farmacològicament actius del ginseng. aPPD és un compost interessant que sembla tenir efectes oposats a les cèl·lules no neuronals i a les cèl·lules neuronals. Estudis anteriors del nostre grup i d’altres han demostrat que l’aPPD inhibia l’activitat Akt i indueix l’apoptosi en diverses cèl·lules tumorals. 1, 2, 3 Tanmateix, també s’ha demostrat que l’aPPD protegeix les cèl·lules neuronals contra el glutamat i l’excitotoxicitat induïda per N- metil-D (NMDA) 4, 5 i que estimula la regeneració de les cèl·lules neuronals activant la via Akt. 6, 7 El mecanisme subjacent als efectes que depenen del tipus cel·lular de la PPAP encara no ha estat elucidat.

La membrana plasmàtica (PM), com a lloc principal d'activació de Akt, conté múltiples microdomanes, i entre aquestes, s'ha suggerit un tipus de microdomina que té contingut en colesterol, resistent al detergent, conegut com la bassa lipídica, com a plataforma crítica per a la senyalització cel·lular. 8, 9 basses de lípids funcionen com a contribuïdors de l'heterogeneïtat de les membranes laterals i es generen mitjançant interaccions lípid-lípid i específiques lípid-proteïna. 10 A causa dels àcids grassos llargs i saturats dels esfingolípids i del colesterol, existeixen basses de lípids en fase ordenada per líquids. En canvi, altres compartiments de PM es produeixen en la fase desordenada de líquids perquè estan compostos per fosfolípids amb àcids grassos curts i insaturats. Es creu que el colesterol serveix com a espaciador entre les cadenes d'hidrocarburs d'esfiongolípids i que funciona com una cola dinàmica que manté el conjunt de la bassa. 12

La senyalització més activa en microdominis PM només s'ha examinat recentment com a via oncogènica important. 13, 14, 15 La unió dels factors de creixement a la tirosina quinases del seu receptor estimula la fosforilació de la fosfatidilinositol 3-cinasa (PI3K) composta per subunitats P85 i P110, que es localitzen en basses lipídiques. PI3K converteix la fosfatidilinositol-4, 5-bisfosfat (PI (4, 5) P2) en fosfotidilinositol-3, 4, 5-trisfosfat (PI (3, 4, 5) P3), mentre que la fosfatasa i la tensina homòlides es van eliminar en el cromosoma 10 aquesta reacció. Akt es tradueix al PM i interacciona amb PI (3, 4, 5) P3 a través del seu domini PH i, respectivament, està fosforilat en dos residus (Thr308 i Ser473) per la cinasa dependent de fosfositositides (PDK) i diverses cinases associades a la bassa, inclòs el mTORC2 i la kinasa relacionada amb la integrina (ILK). 16, 17 Un dels primers objectius de Akt que va tenir implicacions directes en la regulació de la supervivència cel·lular és un membre de la família proapoptòtica de Bcl-2 i es coneix com a mort associada a Bcl-2 (BAD). Està unit a les basses lipídiques en cèl·lules proliferades, tot i que està associada als mitocondris a les cèl·lules apoptòtiques. 12, 18 Un cop fosforilats, els residus de fosfoserina (Ser136 i Ser112) del BAD formen llocs d’unió a l’afinitat per a les molècules 14-3-3, localitzant així la BAD fosforilada al citosol i neutralitzant eficaçment la seva activitat pro-apoptòtica. 19, 20 estudis recents van indicar que Akt associat a la bassa podria ser un determinant important de l’oncogenicitat. 21, 22 Estudis sobre cèl·lules de càncer de pulmó de cèl·lules petites van demostrar que les isoformes PI3K específiques resideixen a les basses lípides i que la interrupció de les basses de membrana per metil- β- ciclodextrina (M β CD) inhibeix l'activitat Akt-mediada per PI3K. 23 La imatge de fluorescència de cèl·lules vives ha demostrat que la bassa Akt s'activa més ràpidament i amb més potència que la no de la bassa Akt, probablement a causa de la compartimentació de diversos components de la via de senyalització, inclosos els receptors, PI3K i el propi Akt. 22

Atesa la seva estructura similar a la saponina, els ginsenosides són molt coneguts per la seva capacitat per augmentar la fluïdesa de les membranes cel·lulars. 11, 24 Com que l’estructura de l’aPPD s’assembla molt a la del colesterol, hem estimat que aquest compost pot interferir amb les basses lipídiques i alterar el moviment lateral de les proteïnes residents de la bassa. Es va especular, a més, que diferents tipus de cèl·lules podrien diferir entre les proteïnes residents de les seves basses lipídiques, cosa que pot explicar el contrast esmentat anteriorment en els efectes de la PPA sobre les neurones enfront de les cèl·lules no neuronals. Per provar la hipòtesi anterior, es va utilitzar la línia de cèl·lules del glioma U87MG i la cèl·lula de neuroblastoma N2a per a la nostra investigació. Tot i que les dues cèl·lules tenen un origen de teixit nerviós, difereixen en què U87MG deriva de cèl·lules glials i N2a és un tipus de cèl·lula neuronal. 25, 26 Després del tractament dels dos tipus cel·lulars amb aPPD, es va investigar la via de senyalització Akt a les basses lipídiques i, en conseqüència, la seva resposta cel·lular a agents quimioterapèutics i excitotòxics. Els nostres resultats van mostrar que l’aPPD va alterar l’activitat Akt associada a la bassa diferent de les dues línies cel·lulars però no del PM total. A més, els resultats cel·lulars per a un estímul tòxic eren oposats, cosa que indica que els efectes farmacològics d’aquest compost poden ser específics del tipus cel·lular a causa de diferències en el seu efecte sobre la senyalització cel·lular associada a la bassa de diferents cèl·lules.

Resultats

APPD afecta les basses de lípids de manera diferent a la M β CD i aquests efectes depenen del tipus cel·lular

Per demostrar els efectes diferencials de l’aPPD sobre les basses lipídiques en les dues línies cel·lulars, es va mirar els canvis en les concentracions de colesterol de diverses fraccions de PM de cèl·lules U87MG i N2a tractades amb CDP aPPD o M β CD. Aquest últim és un conegut interruptor de la bassa lipídica que funciona agotant el colesterol de la membrana. 11, 27 Per examinar si l'aPPD és citotòxic per a les cèl·lules, es va mesurar la mortalitat cel·lular amb diferents concentracions d'aPPD en diferents moments. Tot i que el tractament amb 10 μ M aPPD no va tenir cap efecte sobre la mortalitat cel·lular a 4 h per a les dues cèl·lules 5, 20 ± 2, 45%, P = 0, 196) per a U87MG i 3, 76 ± 5, 97%, P = 0, 276) per a cèl·lules N2a), la mortalitat va augmentar lleugerament, però no estadísticament significatiu en 24 h (12, 64 ± 13, 57%, P = 0, 089 en cèl·lules U87MG i 11, 30 ± 10, 41% en cèl·lules N2a, P = 0, 059). Es va observar una mort cel·lular significativa a les 24 h en cèl·lules tractades amb 20 μ M aPPD, especialment no només per a U87MG (42, 7 ± 14, 78%, P = 0, 002), sinó també per a N2a en menys grau (23, 12 ± 5, 39, P = 0, 002). Així, es van utilitzar 10 μ M aPPD en els experiments següents. Les membranes cel·lulars es van separar a les 4 h després del tractament amb 10 μ M aPPD mitjançant ultracentrifugació en 12 fraccions (figura 1b). Les basses de lípids es van localitzar principalment en la fracció 5, com ho demostren les taques occidentals de flotil·lina-1, un marcador de la bassa lipídica (figura 1c). Com era d’esperar, el contingut màxim de colesterol també es va trobar a la fracció 5 de les cèl·lules U87MG i N2a no tractades (figures 2a i b), confirmant encara més l’enriquiment de les basses lipídiques en aquesta fracció. El tractament amb 10 mM M β CD va disminuir completament l’aspecte ennuvolat de la fracció 5 de les proteïnes de membrana d’ambdós tipus cel·lulars (figura 2c) i va reduir significativament els nivells de colesterol total d’aquesta fracció (figures 2a i b), cosa que suggereix una interrupció completa de la basses de lípids de tots dos tipus cel·lulars per aquest agent. El tractament de cèl·lules d’ambdues línies amb aPPD també va disminuir l’aparició tèrbola de la fracció 5 (figura 2d). Sorprenentment, però, no es va produir cap canvi en els nivells de colesterol en aquesta fracció (figures 2a i b), cosa que indica que, a diferència de M β CD, l’aPPD no provoca cap esgotament del colesterol de membrana. A més, els nivells de proteïnes de flotilina-1 a les cèl·lules U87MG i N2a van disminuir en la fracció 5 després del tractament amb M β CD (figura 3a). Tot i això, el tractament amb aPPD va reduir la concentració de flotilina-1 només a les cèl·lules U87MG. En canvi, el tractament amb PPA va regular el nivell de flotilina-1 a les basses de les cèl·lules N2a fins a 142, 91 ± 10, 71% del control, tal com es mostra a la figura 3b. En conjunt, aquestes dades suggereixen que l’aPPD pot interferir amb les basses lipídiques, però no amb el mateix mecanisme utilitzat en el cas del M β CD. A més, el PPAP pot tenir un efecte contrari en la proteïna resident a la flotilina-1 de la bassa, segons el tipus de cèl·lula.

Image

Aïllament i identificació de les basses lípides. ( a ) L’estructura química del 20 S- protopanaxadiol (aPPD). ( b ) Preparats de membrana després de la centrifugació per aïllar les basses lipídiques, tal com es descriu a Materials i mètodes. Les basses lípides apareixien principalment en la fracció 5 que apareixien com a banda opaca. ( c ) Les proteïnes de cada fracció mostrada a ( b ) van ser analitzades per SDS-PAGE i es van detectar amb anticossos de flotilina-1. Com a proteïna resident a la bassa lipídica, la flotilina-1 estava principalment present en la fracció 5 (de vegades també en la 6). Tots els resultats són representatius d'almenys tres experiments independents

Imatge a mida completa

Image

l’aPPD no esgota el colesterol a la membrana. ( a ) Les concentracions de colesterol en el PM i cada fracció de cèl·lules U87MG mesurades amb un kit d’assaig de colesterol Red Amplex. ( b ) Les concentracions de colesterol en la PM i cada fracció de cèl·lules N2a. El nivell més alt de colesterol es va detectar a la fracció 5 en ambdues línies cel·lulars. ( c i d ) Mostres de membrana cel·lular de 10 mM M β CD- o 10 μ M aPPD tractades amb cèl·lules U87MG i N2a recollides per centrifugació. Tot i que tant M β CD com aPPD van provocar la desaparició de la banda opaca, només M β CD i no aPPD van esgotar el colesterol ( a i b ). * P <0, 05, ** P <0, 001 comparat amb el control, t- test ( n = 3 experiments independents)

Imatge a mida completa

Image

Nivells de flotilina-1 a les basses lípides de les cèl·lules U87MG i N2a tractades amb M β CD ( a ) o aPPD ( b ). * P <0, 05, ** P <0, 001 comparat amb el control, t- test ( n = 3 experiments independents)

Imatge a mida completa

APPD altera la fosforilació Akt associada a la bassa sense canviar el nivell Akt total de la membrana

A continuació, ens vam preguntar si aPPD van alterar els nivells d’Akt i el seu estat de fosforilació a la membrana cel·lular dels dos tipus de cèl·lules. Es van realitzar blots occidentals de Akt total i els seus dos residus de fosforilació, Thr308 i Ser473, amb proteïnes de membrana total de cèl·lules U87MG i N2a tractades amb aPPD. Les figures 4a i b mostren que no hi va haver canvis significatius en Akt ni el seu estat de fosforilació en el PM de cada tipus de cèl·lules tractades amb aPPD.

Image

Efecte de l’aPPD sobre l’activitat Akt a la membrana cel·lular. la dPPD no va tenir cap efecte sobre la concentració d’Akt ni el seu estat de fosforilació ni a les cèl·lules U87MG o N2a ( a i b ). aPPD regula la fosforilació Akt a les basses lípides de les cèl·lules U87MG i N2a de manera oposada ( c i d ). * P <0, 05 en comparació amb el control, t- test ( n = 3 experiments independents)

Imatge a mida completa

Curiosament, Akt i el seu estat de fosforilació eren totalment diferents a les basses lipídiques aïllades dels dos tipus diferents de cèl·lules tractades amb aPPD. Com es mostra a les figures 4c i d, tot i que l’aPPD no va canviar significativament el nivell total d’Akt a les basses lipídiques dels dos tipus cel·lulars, la fosforilació a Thr308 i Ser473 es va reduir significativament a les cèl·lules U87MG però va augmentar en N2a, cosa que indica que l’aPPD pot inhibir activitat Akt associada a la bassa a les cèl·lules U87MG però estimula aquesta activitat a les cèl·lules N2a.

aPPD regula l’activitat Akt a les basses lípides mitjançant la alteració dels nivells de fosfatases associades a la bassa

Per determinar com aPPD activa selectivament l’activitat Akt associada a la bassa a les cèl·lules N2a, però la inhibeix a les cèl·lules U87MG, es van mesurar nivells de PI3K, PDK i ILK a les basses lipídiques, que es coneixen com cinases aigües amunt que regulen la fosforilació de Akt. Com es mostra a la figura 5a, no es van observar canvis significatius en PI3K, inclosa l'activitat que involucrava la subunitat reguladora P85 i la subunitat catalítica P110 α , després d'un tractament amb APPD de cèl·lules U87MG o N2a. També es va investigar si els nivells de bassa de PDK1 i ILK, que respectivament, fosforilats Thr308 i Ser473 d'Akt, van ser afectats pel tractament aPPD. La figura 5b mostra que la quantitat de PDK1 no va canviar significativament en cada tipus de cèl·lula tractada amb APPD. Tot i això, la quantitat d’ILK1 a les basses lipídiques de les cèl·lules N2a va augmentar significativament, mentre que va disminuir en les de U87MG. Finalment, es van mesurar els nivells de dues fosfatases principals, la fosfatasa 1 i 2 (PHLPP1 i 2), rics en leucina, que són responsables de la defosforilació Akt. 28, 29, 30, 31, 32, 33 Els nostres resultats (figura 5c) van demostrar que el tractament amb aPPD va provocar canvis significatius tant en PHLPP1 com en PHLPP2 a les basses lípides. Curiosament, el nivell de PHLPP1 i PHLPP2 a les basses va augmentar un 56, 31 ± 5, 12 i un 82, 97 ± 5, 02%, respectivament, a les cèl·lules U87MG, però va disminuir un 30, 38 ± 3, 94 i un 30, 22 ± 8, 31% a les cèl·lules N2a.

Image

Efectes de l’aPPD sobre els reguladors Akt a les basses lipídiques. ( a ) No es van produir canvis significatius en els nivells de P85 i P110 α de PI3K després del tractament amb aPPD a les cèl·lules U87MG o a les cèl·lules N2a. ( b ) La quantitat de PDK1 no va canviar significativament en les cèl·lules tractades amb APPD de cada línia cel·lular. Tot i això, la quantitat d’ILK1 a les basses lipídiques va augmentar significativament a les cèl·lules N2a i va disminuir a les cèl·lules U87MG. ( c ) Els nivells de PHLPP1 i PHLPP2 a les basses van augmentar significativament a les cèl·lules U87MG però, respectivament, van disminuir a les cèl·lules N2a. * P <0.05 en comparació amb el control, t- test ( n = 4 experiments independents)

Imatge a mida completa

Regulació bidireccional de les funcions Akt de les cèl·lules del glioma enfront de les cèl·lules neuronals

Per examinar si els efectes contrastants d'un aPPD sobre Akt associat a la bassa en els dos tipus de cèl·lules es correlacionen amb una diferència en les seves respectives respostes farmacològiques, es va mesurar la viabilitat de les cèl·lules amb insult tòxic amb o sense PPD. Les cèl·lules U87MG van ser tractades amb diferents concentracions de Paclitaxel (TAXOL) (Bristol-Myers Squibb, Toronto, ON, Canadà), o les cèl·lules Vinblastine i N2a van ser tractades amb NMDA. Les dues cèl·lules van ser co-tractades amb 10 μ M aPPD. La toxicitat notablement millorada va ser evident en les cèl·lules U87MG co-tractades amb aPPD i TAXOL o Vinblastina (Figures 6a i b). En canvi, aPPD va protegir fortament les cèl·lules N2a de l’excitotoxicitat induïda per NMDA (Figura 6c).

Image

aPPD va millorar l'efecte citotòxic dels agents quimioterapèutics en les cèl·lules del glioma i va atenuar l'efecte citotòxic a les cèl·lules neuronals tractades amb NMDA. ( a i b ) Les cèl·lules U87MG es van incubar amb o sense 10 μ M aPPD en presència de diferents concentracions de Paclitaxol (TAXOL) o Vinblastina. ( c ) APPD va reduir notablement la neuroexcitotoxicitat induïda per NMDA en les cèl·lules N2a. * P <0, 05, ** P <0, 001 comparat amb el control, t- test ( n = 3 experiments independents)

Imatge a mida completa

Finalment, ens vam preguntar si la diferència anterior en els efectes farmacològics de la PPD es pot atribuir als seus diferents efectes sobre la via Akt en les basses lipídiques de les dues línies cel·lulars sota els insults tòxics. Es van comparar els nivells de Akt associats a la bassa i Akt fosforilats, així com el BAD. Aquest últim és un objectiu aigües avall d'Akt i la fosforilació BAD és un important mecanisme anti-apoptòtic de senyalització d'Akt. Ni TAXOL ni Vinblastina van alterar significativament l’activitat Akt a les basses lípides de les cèl·lules U87MG (Figures 7a i c). A més, ambdós agents quimioterapèutics van reduir significativament els nivells totals de BAD a les basses lipídiques de les cèl·lules U87MG, però no van afectar el seu estat de fosforilació (figures 7b i d). D'altra banda, la NMDA va reduir significativament la fosforilació d'Akt a les basses lipídiques de les cèl·lules N2a i, per tant, també es va reduir la fosforilació de la BAD associada a la bassa (figures 7e i f). Com era d’esperar, l’aPPD va suprimir dràsticament la fosforilació Akt a les basses lipídiques en cèl·lules U87MG tractades amb TAXOL o amb Vinblastina. Els nivells de fosforilació BAD també es van reduir significativament (Figures 7a-d). En canvi, aPPD va restablir l'estat de fosforilació d'Akt i BAD a les basses lipídiques de les cèl·lules N2a tractades amb NMDA (Figures 7e i f). Així, aquests resultats confirmen que aPPD exerceix efectes farmacològics oposats sobre aquests diferents tipus de cèl·lules i que aquest fenomen bidireccional específic del tipus de cèl·lula es pot atribuir a la diferència específica del tipus de cèl·lula en l’activitat de aPPD en la senyalització Akt associada a la bassa.

Image

Més senyalització en basses lípides de cèl·lules U87MG i N2a tractades amb quimioterapèutica i NMDA amb i sense aPPD. La fosforilació total d’Akt i Akt a les basses dels lípids va ser inhibida per aPPD en cèl·lules U87MG tractades amb TAXOL o Vinblastina ( a i c ). La fosforilació de BAD a les basses lipídiques també es va reduir per aPPD ( b i d ). aPPD va restablir la fosforilació d’Akt i BAD a les basses lípides de les cèl·lules N2a tractades amb NMDA ( e i f ). * P <0, 05, ** P <0, 001 comparat amb el control, t- test ( n = 3 experiments independents)

Imatge a mida completa

APPD inhibeix la migració cel·lular de glioma

La ruta de senyalització Akt associada a la bassa és coneguda per regular la invasió cel·lular i la motilitat. [34] Així, es va realitzar un assaig de rascades in vitro 35 per mesurar les taxes de migració cel·lular de 24 h de les cèl·lules U87MG i N2a tractades amb pPD. La figura 8 va mostrar que el tractament amb aPPD va inhibir significativament la migració cel·lular en cèl·lules U87MG (53, 2 ± 20, 1% de control, P = 0, 0002), però va tenir un efecte molt menor sobre les cèl·lules N2a (82, 4 ± 20, 8%, P = 0, 166).

Image

Efectes de l’aPPD sobre la migració cel·lular de cèl·lules U87MG i N2a. ( a ) Migració de cèl·lules en plats de cultiu. Les vores (línies puntejades) de les cèl·lules U87MG cultivades a 0 i 24 h després del gratat es van mostrar com a línia de lesió i la línia de migració, respectivament. La zona de migració es va calcular com a regions entre les lesions i les línies de migració. ( b ) Quantificació de la taxa de migració cel·lular. La taxa de migració de cèl·lules U87MG es va reduir eficaçment amb el tractament de la pPD en les cèl·lules U87MG, però no amb les cel·les N2a. Les dades eren les mitjanes de dos experiments repetits amb quadruplets per a cada cop, * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

Discussió

Els resultats anteriors mostren clarament que (1) el PPAP és altament eficaç per interferir en la composició proteica de les basses lipídiques sense alterar el nivell de colesterol; (2) els efectes de la PPAP sobre les proteïnes residents de la bassa són molt dependents del tipus cel·lular; (3) aPPD suprimeix l'activitat de la via Akt a les basses lipídiques de les cèl·lules del glioma, però la augmenta a les cèl·lules neuronals sense afectar l'activitat Akt al PM total dels dos tipus de cèl·lules; (4) l'activitat Akt associada a la bassa està regulada per un APPD alterant els nivells de fosfatases a la bassa; (5) la diferència en l'efecte de la PPD sobre l'activitat de la via Akt associada a la bassa comporta una inhibició en la migració cel·lular i una citotoxicitat millorada amb TAXOL o Vinblastina a les cèl·lules U87MG, però va excitotoxitat atenuada amb NMDA en les cèl·lules N2a; El nostre estudi demostra que el metabolit final dels ginsenosides de protopanaxadiol, aPPD, és un trastorn de la bassa altament eficaç. A diferència del M β CD, l’aPPD altera el contingut de les proteïnes residents a les basses lípides sense canviar els nivells de colesterol. Rh2, també s'ha demostrat que una forma glicosilada de protopanaxadiol influeix en el moviment lateral de Fas entre la bassa i les microdomanes no de la bassa cel·lular. 11 Com que l’aPPD és estructuralment més similar al colesterol, no seria estrany que funcioni com a disrupció de la bassa més forta al intercalar-se a les basses lipídiques per provocar canvis en el microambient de la membrana, que al seu torn es tradueix en una alteració de la proteïna. composició de les basses lipídiques. Resta determinar si l’aPPD altera les proteïnes residents de la bassa provocant una alteració general en la fluïdesa de la membrana, similar a altres derivats del colesterol, 36 o si el compost interactua directament amb proteïnes específiques de les basses lipídiques per modular la seva activitat. Val la pena assenyalar que, tot i que l’aPPD no canvia el nivell de colesterol a les basses lipídiques, va fer que l’opacitat de la fracció de la bassa lipídica desaparegués, com va fer M β CD (figura 2). Com que l'opacitat podria indicar la presència d'una forma específica de complex que conté proteïnes i lípids insolubles, la seva desaparició induïda per aPPD suggereix clarament que el compost pot alterar l'estat físic de les proteïnes a les basses lipídiques.

La troballa més sorprenent de la investigació actual és que un PPAP regula la via Akt associada a la bassa de les cèl·lules del glioma i les cèl·lules neuronals de manera oposada. aPPD regula la fosforilació Akt a les cèl·lules U87MG, però regula la fosforilació a les cèl·lules N2a. Els resultats van demostrar que aquesta regulació bidireccional de l’activitat de la pluja associada a la bassa per un APPD no es va deure a canvis en l’activitat de PI3K o PDK1 a les basses (Figura 5). Aquest últim és responsable de la fosforilació a Thr308, que es creu essencial per a l’activació d’Akt. 37 Com que aPPD va alterar l'estat de fosforilació d'Aj sense cap canvi en PI3K o PDK1, és més probable que l'activitat Akt estigués regulada per canvis en les fosfatases associades a la bassa. De fet, es va observar una alteració específica del tipus cel·lular en les PHLPPs associades a la bassa en cèl·lules tractades amb aPPD. Les dues fosfatases són conegudes pel seu paper en la atenuació del nivell total de fosforilació del motiu hidrofòbic Akt i la supervivència cel·lular. 28 No hi ha cap explicació òbvia sobre els efectes contrastants de la PPAA en les dues línies cel·lulars respecte a la senyalització d'Akt a les seves basses lípides. Es va informar que PHLPP1 podria estar associat a Akt2 i Akt3, mentre que PHLPP2 pot ser a Akt1 i Akt3. 33 Cal estudiar si la distribució diferencial de les isoformes Akt i els seus PHLPP tenen alguna funció en les seves funcions en les basses lipídiques de diferents tipus cel·lulars. Alternativament, també és possible que les cèl·lules puguin diferir en les estructures respectives de les basses lipídiques, com les que reflecteixen la composició de proteïnes residents, i que aquestes diferències es puguin dilucidar amb anàlisi proteòmica de la bassa lipídica. 38

La regulació bidireccional anterior de la senyalització Akt associada a la bassa per aPPD és altament coherent amb l’activitat farmacològica contrastada d’aquest compost a les cèl·lules U87MG i a les cèl·lules N2a quan es co-estimula amb insult tòxic (figura 6). És interessant que, a les cèl·lules U87MG, tant TAXOL com Vinblastine van reduir significativament la quantitat total de BAD associat a la bassa, l’objectiu fosforilant d’Akt, sense canviar la quantitat de BAD fosforilades a les basses lípides. Com que no hi va haver cap diferència significativa en l’activitat Akt a les basses de cèl·lules tractades amb fàrmacs, sembla que els agents quimioterapèutics van augmentar la proporció de BAD fosforilada amb BAD no fosforilada a les basses lipídiques mitjançant l’eliminació d’aquestes darreres estructures. Curiosament, en les cèl·lules N2a, el NMDA va inhibir la fosforilació de Akt i BAD associades a la bassa sense canviar les quantitats totals d’aquestes proteïnes a les basses lípides. Finalment, aPPD va millorar la quimiotoxicitat a les cèl·lules U87MG i va protegir les cèl·lules N2a de l’excitotoxicitat induïda per NMDA. Aquests efectes bidireccionals estaven d'acord amb els canvis observats en l'activitat Akt, així com en el seu objectiu descendent BAD en les basses lipídiques dels dos tipus de cèl·lules, que poden correlacionar directament amb l'efecte pro-apoptòtic o anti-apoptòtic depenent del tipus cel·lular. d’un PPAP. Més important encara, el fet que les funcions farmacològiques de l’aPPD es correlacionin amb l’activitat de Akt associada a la bassa, però no que, en el PM, destaca encara més la idea que Akt més associada a la bassa determina les funcions de la seva senyalització.

En el present estudi, es demostra que només la fosforilació de Akt associada a la bassa determina l’activitat i la direcció de la senyalització Akt, ja que l’aPPD no té cap efecte sobre la fosforilació Akt en el PM total dels dos tipus cel·lulars. Això subratlla la importància de centrar-se en les microdomanes de membrana en lloc de la membrana cel·lular global quan s’estudien les funcions de les proteïnes de senyalització. Els nostres resultats són els primers a demostrar amb claredat que les cèl·lules es poden orientar de manera diferent segons les diferències en les estructures de les seves microdomanes de membrana, i aquí es va utilitzar un APPD com a primer agent aplicat per a aquest propòsit.

Materials i mètodes

Materials

aPPD va ser proporcionat pel Centre de Recerca Innovadora de Medicina Tradicional Xinesa de Shanghai (Xangai, Xina). El compost era del 97, 9% pur, mesurat per l’anàlisi HPLC. Anticossos a fòsfor-Akt (Ser 473 ), fòsfor-Akt (Thr 308 ), Akt (pan), PI3 Kinase p85, PI3 Kinase p110 α , ILK1, fòsfor-PDK1 (Ser 241 ), BAD, fosfor-BAD (Ser 112 ) i fosfor-BAD (Ser 136 ) es van comprar a Cell Signaling Technology, Inc. (Mississauga, Ontario, Canadà). L’anticorpo de Flotillin-1 es va comprar a Abcam, Inc. (Cambridge, MA, EUA). Els anticossos PHLPP1 i PHLPP2 es van comprar a Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX, EUA). Es va comprar anti-conill i anti-conill IgG conjugat per HRP a Perkin-Elmer Life Sciences (Boston, MA, EUA). Es van obtenir còctels inhibidors de proteases de Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Alemanya). Es va comprar un equip modificat d’assaig de proteïnes DC i membranes de nitrocel·lulosa a BIO-RAD (Hercules, CA). El CD de M β , Vinblastine, NMDA, medis (el medi Eagle modificat de Dulbecco, DMEM), el bromur de tetrazolium blau tiazolil (MTT) i altres productes químics es van comprar a Sigma (St. Louis, MO, EUA). Paclitaxel es va comprar a la farmàcia de la British Columbia Cancer Agency (Vancouver, BC, Canadà). Les cèl·lules U87MG i les cèl·lules N2a es van comprar a la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, EUA). Es van obtenir GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, EUA) amb suplements de salina tampoc fosfat (PBS), suplements de cultiu cel·lular (sèrum boví fetal (FBS) i antibiòtics).

Tractaments i cultius cel·lulars

Les cèl·lules humanes U87MG i N2a es van cultivar en DMEM suplementades amb 10% de FBS, 100 U / ml de penicil·lina i 100 μ g / ml estreptomicina, a 37 ° C en una atmosfera humidificada que contenia 5% de CO 2 i alimentades cada 2-3 dies. Es va preparar una solució estoc de 50 mM aPPD en 100% etanol i es va diluir a concentracions adequades en DMEM immediatament abans de cada experiment. Les cèl·lules per al tractament de fàrmacs es van pretractar amb DMEM durant 4 h a 37 ° C, seguida de l’addició de 10 mM M β CD o 10 μ M aPPD durant 1 h.

Aïllament de la bassa lipídica

Les cèl·lules en cinc plats de 100 mm es van barrejar amb 3 ml de tampó de lisi per plat (150 mM NaCl, 20 mM Na 2 HPO 4, 2 mM NaH 2 PO 4, 20% (v / v) glicerol, 2 mM de ortovanadat de sodi amb inhibidors de proteases, pH 7, 4) i homogeneïtzats 30 vegades amb un homogenitzador ajustat de Dounce (Sigma). Les mostres es van veure alterades per sonicació intermitent (sis polsos de 30 s amb un període de refredament d’1 min entre) i després centrifugades a 10 K rpm (ultracentrifuga Beckman-Coulter Optima L-90K amb un rotor SW55Ti, Mississauga, ON, Canadà) durant 11. min a 4 ° C per separar les deixalles cel·lulars i materials nuclears. A continuació, el sobrenedant es va centrifugar a 32, 5 K rpm (rotor SW55Ti) durant 90 min a 4 ° C per obtenir la pell. El PM es va suspendre i es va solubilitzar en 2 ml tampó solubilitzant que contenia 0, 5% v / v de Triton X-100 en solució salada tamponada amb mes (MBS: 25 mM Mes, pH 6, 5 / 0, 15 M NaCl), inhibidors de proteases i ortovanadat de sodi 2 mM durant 15 min en gel. A continuació, es van diluir encara més 2 ml de PM solubilitzat amb un volum igual del 80% de sacarosa en MBS i es van carregar al fons d’un tub d’ultracentrifuga de 13 ml sobreposat amb 4 ml de sucreosa al 30% / MBS. Finalment, es van afegir 4 ml d’una solució 5% de sacarosa / MBS com a capa superior del gradient. El gradient es va centrifugar a 31 K rpm (rotor SW41Ti) durant 16 h a 4 ° C per aïllar la bassa lipídica i els compartiments no de la bassa. Després es va fraccionar el gradient en 12 fraccions. 39

Western blot

La concentració de proteïna es va mesurar mitjançant un assaig de proteïna DC modificada. Es va separar un volum de fracció igual (10 µl / carril) de cada mostra en un gel de poliacrilamida. Per a la immunoblotització, les proteïnes van ser transferides a membranes de nitrocel·lulosa mitjançant un sistema de transferència en humit (BIO-RAD). Les membranes es van bloquejar amb 5% de llet sense greixos (BIO-RAD) durant 1 h a temperatura ambient i es van sondar amb anticossos primaris a 4 ° C durant la nit. Les membranes es van rentar tres vegades amb solució salina tamponada amb Tris amb Tween 20 al 0, 05% (TBST) i es van incubar amb IgG anti-conill o cabra conjugada amb HRP (1: 5000) durant 1 h a temperatura ambient. Els senyals es van detectar mitjançant quimioluminescència millorada (Perkin-Elmer Life Sciences) i les intensitats de banda es van quantificar mitjançant el programari Image J (NIH, Bethesda, MD, EUA).

Mesura del colesterol

Cinquanta microlitres de cada fracció es van analitzar amb un kit d’assaig de colesterol Amplex Red (Molecular Sondes, Eugene, OR, EUA) segons el protocol del fabricant.

Test MTT

Per a la viabilitat cel·lular, es van sembrar cèl·lules en plaques de 96 pous a una densitat de 2, 5 × 10 4 / pou, un dia abans dels experiments. A continuació, es van incubar els cultius amb DMEM que contenien TAXOL, Vinblastina o NMDA, amb o sense aPPD (10 μ M) durant 24 hores a 37 ° C. Al final de cada moment, es va eliminar el medi de cultiu i es van afegir 50 µl de MTT (0, 5 mg / ml en medi sense sèrum) a cada pou. Després de la incubació a 37 ° C durant 4 h, 100 μ l de tampó de lisi (50v / v N, N- dimetilformamida (Sigma), 20% SDS (BIO-RAD) i 0, 4% (v / v) àcid acètic glacial en destil·lat es va afegir aigua (pH 4, 8)) i es van incubar les plaques durant la nit en una atmosfera humidificada (37 ° C amb 5% de CO2). La densitat òptica de cada pou es va determinar amb un lector de plaques (BIO-TEK, Winooski, VT, EUA) a 595 nm.

Anàlisi de migració cel·lular

Les cèl·lules U87MG o N2a es van cultivar en plats de cultiu de sis pous fins a una confluència del 70-90%, seguida d'un rascat amb puntes de pipeta esterilitzades d'1 ml. Després del rentat amb PBS preescalfat, es van cultivar cèl·lules en DMEM lliure de sèrum durant 24 hores. Les imatges van ser preses a les 0 i les 24 h després del zero per microscopi Zeiss Axiovert 200 (Zeiss, Toronto, ON, Canadà) amb objectius × 5 (per a cèl·lules U87MG) o × 10 (per a cèl·lules N2a). Les imatges dels mateixos punts realitzats a les 0 i 24 hores es van sobreposar i es van ajustar amb el programari Photoshop CS4 (Adobe, Ottawa, ON, Canadà). La vora de les cèl·lules de cultiu estava marcada per enllaçar cossos cel·lulars de cèl·lules més llunyanes, però contínuament, provinents de regions no classificades. La vora a les 0 i a les 24 h es va definir com a línia de lesió i línia de migració, respectivament. Es considerava que l’àrea entre les línies de lesions i les de migració era l’àrea de migració i estava sotmesa a quantificació. Es van mesurar 40 àrees de migració de les imatges amb ImageJ.

Anàlisi estadística

Les dades es van obtenir a partir d'almenys dos experiments independents, cadascun dels quals es va realitzar almenys per tres. Les dades es van expressar com a mitjans ± SE i es van analitzar per a la seva significació estadística mitjançant el test t d’un estudiant de dues cues. Les diferències amb els valors P <0, 05 es van considerar estadísticament significatives i estan indicades per un asterisc ( * ) a les figures.

Glossari

aPPD

20S-protopanaxadiol

DOLENT

Promotor de mort associat a Bcl-2

CD M β

metil- β- ciclodextrina

NMDA

N- metil- D -partit

PHLPP

Fosfatasa repetida rica en leucines

PM

membrana plasmàtica

TAXOL

Paclitaxel