La inducció quimioterapèutica de l'estrès oxidatiu mitocondrial activa gsk-3α / β i bax, provocant l'obertura de porus de transició i la mort de cèl·lules tumorals | mort i malaltia cel·lular

La inducció quimioterapèutica de l'estrès oxidatiu mitocondrial activa gsk-3α / β i bax, provocant l'obertura de porus de transició i la mort de cèl·lules tumorals | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Quimioteràpia
  • Mitocondris

Resum

La supervivència de les cèl·lules tumorals s’afavoreix pels canvis mitocondrials que dificulten la inducció de la mort en diverses condicions d’estrès, com ara l’exposició a quimioteràpics. Aquests canvis no es caracteritzen del tot en els mitocondris tumorals i inclouen el desequilibri de l’equilibri redox, la inhibició de l’obertura de porus de transició de permeabilitat (PTP) a través de vies de senyalització de la cinasa i la modulació dels membres de la família de proteïnes Bcl-2. Aquí mostrem que una quimioteràpia terapèutica, el complex Gold (III) -ditiocarbamato AUL12, indueix l’estrès oxidatiu i la mort de cèl·lules tumorals, tant que afavoreixen l’obertura de PTP com l’activació de la proteïna pro-apoptòtica Bax de la família Bcl-2. L’AUL12 inhibeix el complex respiratori I i provoca una ràpida ràfega de nivells de superòxid mitocondrials, provocant l’activació de la fracció mitocondrial de GSK-3 α / β i la fosforilació posterior de la chaperona mitocondrial ciclofilina D, que al seu torn facilita l’obertura del PTP. A més, després del tractament amb AUL12, Bax interacciona amb GSK-3 α / β actiu i es trasllada a mitocondris, on contribueix a la inducció de PTP i a la mort de cèl·lules tumorals. Aquests resultats proporcionen evidència que dirigir l'equilibri redox mantingut pels mitocondris a les cèl·lules tumorals permet colpejar mecanismes crucials que protegeixen les neoplasmes de la toxicitat de moltes estratègies antitumorals i identificar AUL12 com un compost quimioterapèutic prometedor.

Principal

Les neoplàsies adquireixen la capacitat de créixer de forma ràpida i desregulada sota la forta pressió selectiva de les condicions estressants, ja que adopten estratègies moleculars flexibles per superar la multiplicitat de senyals apoptòtiques i restriccions ambientals que es troben. 1, 2 Aquest alt grau de plasticitat biològica fa que les cèl·lules canceroses siguin un objectiu evasiu per a la majoria de teràpies, i insta a definir els trets biològics específics de cèl·lules malignes que es podrien utilitzar per a enfocaments farmacològics a mida.

Diversos canvis bioquímics que contribueixen crucialment a la transformació neoplàstica tenen lloc a les mitocondries. En la majoria dels casos, és en els mitocondris que el compromís cel·lular amb la mort arriba al punt de no tornar. L’obertura del por de transició de permeabilitat mitocondrial (PTP), un gran canal situat a la membrana mitocondrial interna, produeix una despolarització mitocondrial, inflor, alliberament de Ca 2+, ruptura de la membrana exterior i lliurament de proteïnes que desencadenen la fase d’executor de l’apoptosi. 3 L' alliberament d'aquestes proteïnes efectores de les mitocondries també es pot produir després de la inserció / oligomerització a la membrana mitocondrial exterior de membres pro-apoptòtics de la proteïna de la família Bcl-2, com Bax o Bak. 4 Els mitocondris de cèl·lules tumorals experimenten canvis que contribueixen a la acumulació de defenses sòlides anti-apoptòtiques. Els nivells d’expressió de proteïnes de la família Bcl-2 s’alteren, o bé s’orienten per una infinitat de modificacions post-translacionals impulsades per vies de senyalització oncogènica, 4, 5 amb un augment de les funcions anti-apoptòtiques o una disminució de les funcions pro-apoptòtiques. També es va observar una sensibilitat reduïda de la PTP mitocondrial a diversos estímuls d’estrès a les cèl·lules neoplàstiques 3, 6 i nosaltres i altres hem trobat recentment que l’obertura PTP es millora mitjançant una fosforilació dependent de GSK-3 α / β de la chaperona ciclofilina D (CyP -D), un conegut regulador de la PTP, i que aquesta via s’inhibeix a les cèl·lules canceroses. 7, 8, 9

Durant la progressió cap a la malignitat, la acumulació neoplàstica supera el subministrament d’oxigen i nutrients que proporcionen els vasos sanguinis circumdants. Per evitar l'efecte nociu d'aquestes condicions hipòxiques, les cèl·lules de l'interior de la massa tumoral milloren la utilització de glucosa (l'efecte Warburg; 11, 12, 13 ), amb una disminució simultània de la respiració mitocondrial. Aquesta inhibició dels complexos de cadena respiratòria (RC) pot augmentar la producció d’espècies d’oxigen reactives (ROS), 15 i per sobre d’un determinat llindar, l’estrès oxidatiu pot danyar diverses estructures cel·lulars i eventualment provocar la mort cel·lular desencadenant l’obertura de PTP mitjançant mecanismes mal definits. Per tant, les cèl·lules canceroses es veuen obligades a induir simultàniament defenses anti-oxidants per establir un nou equilibri homeostàtic redox, 17, 18, 19 i els augments addicionals dels nivells de ROS podrien aclaparar les seves capacitats anti-oxidants residuals. En canvi, les cèl·lules no transformades es podrien gestionar amb més facilitat el mateix grau d’estrès oxidatiu. Així, l’orientació a l’equilibri redox constitueix una estratègia prometedora en el desenvolupament d’estratègies anticanceroses i selectives, a partir de fàrmacs que eliminen les cèl·lules neoplàstiques augmentant la ROS mitocondrial fins a nivells capaços de desbloquejar la desensibilització PTP.

En aquest marc conceptual, hem investigat els mecanismes moleculars d’acció d’un derivat de compostos familiars d’or (III) -ditiocarbamato, anomenat AUL12 ((AuIIIBr2 (ESDT)), ESDT: ethylsarcosinedithiocarbamate), el disseny del qual està destinat a la identificació de metall-ditiocarbamato derivats que s’assemblen a cisplatina, però estan dotats d’una major activitat anticancerigen, millor selectivitat i biodisponibilitat i menors efectes secundaris. Els agents de ditiocarbamato d'or (III) tenen nivells de citotoxicitat destacats in vitro cap a diverses línies de cèl·lules tumorals humanes. 21 AUL12 es va seleccionar entre aquesta classe de molècules per a la seva eficaç activitat antineoplàstica, tant in vitro , ja que mata les cèl·lules cancerígenes augmentant els nivells de ROS intracel·lulars, 22 i in vivo cap a diversos xenografts de càncer, inclosos alguns obtinguts amb càncer de pròstata resistent al cisplatí. cèl·lules, 23, 24 i per la seva extremadament baixa nefrotoxicitat i toxicitat aguda. 24

Aquí hem caracteritzat el mecanisme d’acció d’AUL12, trobant que inhibeix el complex I RC, augmentant els nivells de ROS i activant GSK-3 α / β . El GSK-3 α / β actiu provoca la mort de les cèl·lules del tumor, facilitant l’obertura del PTP i provocant la redistribució de Bax als mitocondris. Les nostres dades indiquen que una plataforma de supervivència que connecta funcionalment complexos de RC, l’equilibri redox, la senyalització de la cinasa i els botxins de la mort mitocondrial es pot orientar a cèl·lules neoplàstiques per obtenir el seu desbrossament selectiu.

Resultats

L’AUL12 indueix la mort cel·lular dependent de dosi

Per tal d’entendre el mecanisme de citotoxicitat d’AUL12, primer hem caracteritzat els seus efectes sobre la viabilitat en: (a) un model de cèl·lules canceroses altament agressives, les cèl·lules SAOS-2 d’osteosarcom humà, caracteritzades per la pèrdua d’activitat p53; (b) les cèl·lules de la pròstata epitelial humana RWPE-1, que estan immortalitzades però no tenen potencial tumorigenic, i (c) les cèl·lules RWPE-2, que es fan tumorigèniques mitjançant l'expressió de K-Ras en les cèl·lules RWPE-1. El tractament AUL12 25, 26 va suposar un augment ràpid (3 h) de nivells de superòxid mitocondrials en funció de la dosi i del temps en les cèl·lules SAOS-2 (figura suplementària 1a), que va ser paral·lelitzat per una despolarització mitocondrial massiva i una inducció de la mort cel·lular en la el mateix àmbit de la dosi i el temps del medicament (Figura 1a, b). A les cèl·lules RWPE, la transformació de K-Ras va millorar significativament la mort de cèl·lules induïda per AUL12 (compareu les figures suplementàries 2a i 2b). El tractament pre-tractant de cèl·lules amb l'anti-oxidant N -acetil-L-cisteïna (NAC) va evitar la despolarització mitocondrial (figura 1a) i la mort de les cèl·lules (figura 1b i les figures suplementàries 2a i 2b), demostrant la dependència del ROS de la toxicitat AUL12. Per contra, el medicament de referència cisplatina no va aconseguir induir la mort cel·lular després d'una incubació de 3 h (figura suplementària 3a), mentre que va desencadenar una mort cel·lular insensible al NAC després de 24 h (figura suplementària 3b). En conjunt, aquests resultats indiquen que els dos compostos basats en metalls causen dany a les cèl·lules mitjançant diferents mecanismes i que AUL12 promou una mort cel·lular ràpida augmentant els nivells de ROS mitocondrials.

Image

AUL12 indueix una despolarització mitocondrial i la mort cel·lular mitjançant la producció de superòxid mitocondrial. ( a ) Anàlisi citofluorimètrica (Forward Scatter, FSC, versus tetrametilrhodamine ester metílic, TMRM) que mostra la despolarització de les mitocondries en cèl·lules d'homeosarcoma SAOS-2 humanes exposades a AUL12. Es informa d'un experiment representatiu a l'esquerra, en el qual les cèl·lules viables (V, positives TMRM) estan delimitades pel quadrant superior i les cèl·lules que mostren mitocondris despolaritzats (Dp) són delimitades pel quadrant inferior. ( b ) La inducció de la mort en cèl·lules SAOS-2 exposades a AUL12 es mostra com a anàlisi citofluorimètrica de iodur de propidi (PI) versus la tinció a l'annexina V-FITC. A l'esquerra es mostra un experiment representatiu Les cèl·lules viables (V, doble negativa per a la PI i l’annexina V-FITC) es delimiten pels quadrants inferior esquerre; Les cèl·lules apoptòtiques primerenques (annexina V-FITC positiva) es troben als quadrants inferior dret; Les cèl·lules apoptòtiques tardanes i / o necròtiques (PI i annexina V-FITC dobles positives) es troben als quadrants superior dret; Les cèl·lules necròtiques (PI positives) es troben als quadrants superior dret. D (mort) indica la suma de totes les cèl·lules apoptòtiques i necròtiques. Tant a ( a ) com a ( b ), la quantificació de dades es troba en els gràfics de barres de la dreta; els valors són la mitjana ± SD d'almenys cinc experiments. Al llarg de la xifra, els nombres en parcel·les són percentuals; AUL12 es va incubar durant 3 h; La N- acetil cisteïna (NAC, 1 mM) es va pre-incubar 1 h abans del tractament amb AUL12

Imatge a mida completa

L’AUL12 inhibeix el complex I RC i genera la producció de ROS

Els complexos I, II i III de RC mitocondrials es troben entre les principals fonts de ROS intracel·lular 15 i la seva orientació per AUL12 podria inhibir la taxa de consum d’oxigen (OCR) i augmentar els nivells de ROS a les cèl·lules tumorals. Vam observar que un pre-tractament de 15 minuts amb AUL12 va inhibir de forma dependent de la dosi tant la respiració acoblada com l’OCR total mitocondrial, fins a una abrogació completa de qualsevol consum d’oxigen mitocondrial (figura 2a, quadre dret i esquerre).

Image

AUL12 inhibeix el complex OCR i RC I. ( a ) A la dreta, rastres representatius de les mesures d’OCR realitzades en monocapa de cèl·lules vives SAOS-2 tractades amb AUL12. Es van realitzar addicions posteriors de l’oligomicina inhibidor d’ATP sintasa, de l’incoupler FCCP, del rotenona inhibidor del complex RC I i de l’antimicina A del complex III RC RC. AUL12 a les concentracions reportades es va incubar 15 minuts abans de començar els experiments. Els gràfics de barres de la dreta mostren la respiració mitocondria acoblada, que es va calcular restant l’OCN mitocondrial no acoblada a l’OCR basal (després i abans de l’addició d’oligomicina, respectivament) després d’haver detret el component no mitocondrial de l’OCR (OCR insensible per rotenona / antimicina) fracció). L’activitat enzimàtica dels complexos RC II – III ( b ) o del complex I ( c ) de RC es va avaluar en mitocondris aïllats de cèl·lules SAOS-2 en presència o absència de diferents concentracions d’AUL12 afegides 5 min abans d’iniciar l’experiment. A ( d ), es va analitzar l'activitat del complex RC I en cèl·lules SAOS-2 permeabilitzades prèviament o no durant 90 minuts amb 40 μM AUL12. Totes les dades de l'activitat del complex RC es van normalitzar a l'activitat de citrat sintasa i són valors mitjans ± SD ( n = 6). La importància estadística es va mesurar amb la prova t d’ un estudiant i s’indica amb asteriscs (** P <0.005)

Imatge a mida completa

Per disseccionar l'efecte de l'AUL12 sobre la respiració, vam provar directament l'activitat del complex RC màxim, en condicions en què els complexos es fan accessibles en mitocondris o en cèl·lules permeables i exposats a un excés de substrats. L’AUL12 va exercir un modest efecte inhibidor sobre el complex RC II / III (figura 2b), mentre que va abolir completament l’activitat del complex I RC tant en les mitocondries com en les cèl·lules permeabilitzades (figures 2c i d). La manca d'efecte additiu sobre l'augment dels nivells de ROS mitocondrials entre el rotenona inhibidor del complex I i AUL12 (Figura suplementària 1b) indica que AUL12 augmenta la ROS orientant el complex I.

AUL12 sensibilitza el por de transició de la permeabilitat a l'obertura

Es postula que la ROS augmenta el Ca 2+ intracel·lular, la qual cosa al seu torn augmentaria la generació de ROS, en un circuit de feed-forward que acabaria provocant l’obertura PTP i la mort cel·lular. 16, 27, 28 En els models de cèl·lules canceroses, l’obertura de PTP es fa més difícil mitjançant una inhibició constitutiva de GSK- α / β , que actua com un mecanisme de supervivència sòlid. 8

Per investigar si AUL12 influeix en el porus, es va utilitzar un assaig de capacitat de retenció de Ca 2+ (CRC) de cèl·lula sencera, que avalua la modulació de l’obertura de PTP mitjançant la valoració de la quantitat de Ca 2+ presa per mitocondris de digitonina. cèl·lules permeabilitzades. El tractament de 3 hores amb AUL12 va provocar un escurçament del CRC depenent de la dosi, és a dir, una inducció de l’obertura de PTP, tant a les cèl·lules (figures 3a i b) com a mitocondris hepàtics aïllats (figures 3c i d). Aquesta inducció va ser totalment impedida pel NAC anti-oxidant (Figures 3e i f), mentre que l'addició a cèl·lules permeabilitzades de la ciclosporina A (CsA), un inhibidor del regulador de poros CyP-D, va augmentar notablement la quantitat de Ca 2+ requerida. per obrir el PTP (figures 3a i b).

Image

AUL12 sensibilitza el PTP a l'obertura de manera dependent de ROS. ( a ) L’obertura PTP de cèl·lules SAOS-2 tractades amb AUL12 es mesura amb l’assaig CRC de cèl·lula sencera. La fluorescència del calci Green-5N en cèl·lules permeabilitzades a la digitonina es coneix com a unitats arbitràries de l'eix y . Com que la sonda no penetra en les mitocondries, l’absorció de Ca 2+ als orgànuls després de cada pols (5 μM Ca 2+ ) es mostra mitjançant una disminució ràpida de la punta de fluorescència. Es preveu que els inhibidors i els inductors del por augmentin o disminuïxen, respectivament, el nombre d’espigalls abans de la transició de permeabilitat, és a dir, que es produeix un augment sobtat i marcat de la fluorescència. AUL12 es va afegir a les cèl·lules a les concentracions indicades 3 h abans de la permeabilització amb digitonina. Quan s'indica, es va afegir ciclosporina A (CsA) 5 min abans de començar el test. Els gràfics de barres de ( b ) reporten la presa de Ca 2+ total abans de l'obertura PTP (els resultats són mitjans ± SD; n = 6). ( c, e ) Experiments representatius de CRC realitzats en mitocondris hepàtics aïllats tractats amb diferents concentracions de AUL12 ( c ) i / o amb N -acetil-cisteïna (NAC, 1 mM; ( e )). Els gràfics de barres de ( d, f ) reporten la captació total de Ca 2+ abans de l'obertura PTP (els resultats són mitjans ± SD; n = 6). La importància estadística es va mesurar amb la prova t d’ un estudiant i s’indica amb asteriscs (** P <0.005)

Imatge a mida completa

L’activació GSK-3 α / β media els efectes biològics de l’AUL12

Aquestes dades indiquen que AUL12 pot induir ràpidament la inhibició del RC Complex I i l'estrès oxidatiu, desbloquejant la PTP mitocondrial de les cèl·lules tumorals de manera dependent de ROS. A les cèl·lules tumorals, una condició que indueix notablement la PTP és l’activació GSK-3 α / β . Es va detectar que les dosis creixents d'AUL12 generen un augment marcat i sensible al NAC de l'activitat 30 de GSK-3 α / β 30 (Figura 4a). A més, la pre-incubació cel·lular amb l’inhibidor de GSK-3 α / β indirubina-3’-oxime abans del tractament amb AUL12, tant la sensibilització abrogada PTP (figura 4b) com les cèl·lules protegides de l’apoptosi (figura 4c). Per tant, AUL12 activa el GSK-3 α / β de forma dependent de ROS i l'activació GSK-3 α / β al seu torn indueix l'obertura PTP. La inhibició de GSK-3 α / β mitjançant l’activació de la senyalització de la supervivència quinasa afavoreix el reclutament de la isoforma II de l’hexokinasa (HK II) a la superfície mitocondrial de les cèl·lules tumorals, 31, 32 on disminueix la sensibilitat PTP als estímuls d’estrès. Tanmateix, vam trobar que el nivell de HK II lligat a la mitocondria no es va canviar pel tractament amb AUL12 (dades no mostrades). Un altre possible mecanisme de regulació dels poros per GSK-3 α / β va ser la fosforilació del regulador PTP CyP-D per la fracció mitocondrial de la cinasa, millorant així l’obertura PTP. D’acord amb això, vam trobar que AUL12 activa GSK-3 α / β mitocondrial (figura 4d) i indueix la fosforilació CyP-D (figura 4e).

Image

AUL12 indueix la mort de cèl·lules mitjançant l’activació de ROS-dependent de GSK-3 α / β . ( a ) Anàlisi immunoblot occidental que mostra la fosforilació del residu activador Y (279/216) de GSK-3 α / β en els lisats de cèl·lules SAOS-2 totals. Quan es va indicar, es van tractar cèl·lules amb AUL12 (2 h) i es van incubar prèviament amb NAC (1 mM, 1 h) o amb indirubina inhibidor de GSK-3 α / β (IND, 2 μM, 3 h) abans d'exposar-se a AUL12. ( b ) Experiments de CRC sobre cèl·lules senceres tractades o no amb AUL12 (40 μM, 2 h) demostren que el pretractament amb indirubina (IND) rescata l’obertura de PTP induïda per la quimioterapèutica. Es compara la presa de Ca 2+ mitocondrial en les diverses condicions amb la mesurada en cèl·lules no estimulades. A l’entrada, l’eficàcia de la indirubina per inactivar el GSK-3 α / β es mostra com una desfosforilació del residu Y (279/216). ( c ) La inducció de la mort en cèl·lules SAOS-2 exposades a diferents concentracions d'AUL12 amb o sense pre-incubació amb IND s'analitza mitjançant citofluorimetria amb un iodur de propidi / Annexin V-FITC, com a la figura 1B. Les cèl·lules viables reportades al gràfic de barres són negatives per als dos fluoròfors. ( d ) Anàlisi immunoblot occidental del residu de fosfo-Y (279/216) GSK-3 α / β en fraccions mitocondrials i citoplasmàtiques de cèl·lules SAOS-2 exposades a AUL12 amb o sense pre-incubació amb IND. ( e ) La immunoprecipitació de residus antifosforo-serina / treonina procedents de mitocondris de cèl·lules SAOS-2 exposades a inanició sèrica (24 h) o a AUL12 va ser seguida de l'anàlisi immunoblot occidental de la ciclofilina D. Totes les figures, els gràfics de barres reporten la mitjana. ± Valors SD ( n = 3). Es va mesurar la importància estadística amb la prova t d’ un Estudiant i s’indica amb asteriscs (** P <0.005). L'inhibidor IND (2 μM) es va preincubar durant 3 h

Imatge a mida completa

El GSK-3 α / β també desencadena la mort cel·lular a través de circuits mitocondrials alternatius a l’obertura PTP, com la translocació mitocondrial de la família pro-apoptòtica Bcl-2 Bax, 33, que condueix a la permeabilització de la membrana mitocondrial exterior. Els experiments de coimmunoprecipitació van revelar que Bax i GSK-3 α / β fosforilats actius, Tyr interaccionen en cèl·lules tractades amb AUL12, i aquesta interacció va ser abrogada per pretractament cel·lular amb indirubina-3'-oxime o amb el anti-oxidant NAC (Figura 5a i b). A més, vam observar que AUL12 indueix la translocació de Bax als mitocondris i aquest procés és inhibit per l’inhibidor GSK-3 α / β indirubina-3’-oxime (Figura 5c). En particular, el pretractament cel·lular amb un pèptid selectiu que inhibeix la Bax (BIP) podria inhibir parcialment l’obertura de porus induïda per AUL12 (figura 5d) i protegir les cèl·lules tumorals de la letalitat AUL12 (figura 5e). En conjunt, aquestes troballes indiquen que l’augment de nivells intracel·lulars de ROS obtinguts per AUL12 activa GSK-3 α / β , que al seu torn desencadena la mort cel·lular a través de la permeabilització de la membrana mitocondrial mediada tant per l’obertura PTP com pel reclutament de Bax en mitocondris, cosa que podria contribuir al por. inducció.

Image

AUL12 indueix una interacció entre GSK-3 α / β fosforilada i Bax, que es tradueix en mitocondris i contribueix a la inducció del PTP i a la mort cel·lular. ( a ) A l'esquerra, immunoprecipitació GSK-3 α / β a les cèl·lules SAOS tractades o no durant 2 h amb 40 μM AUL12; on s’indica, es pre-incubaven les cèl·lules amb IND (2 μM, 3 h) o NAC (1 mM, 1 h). La immunoblot occidental es va sondar amb Bax, mentre que la β- catenina s'utilitza com a control positiu de la coimmunoprecipitació amb GSK-3 α / β en cèl·lules famolanes (STV); NC, control negatiu. A la dreta, p (Y216) immunoprecipitació GSK-3 α / β en cèl·lules SAOS tractades o no durant 2 h amb 40 μM AUL12. Es va sondar l’immunoblot occidental amb GSK-3 α / β i Bax. En els dos panells, IgG s'utilitza com a control de càrrega. ( b ) Immunoprecipitació de Bax en cèl·lules SAOS tractades o no durant 2 h amb 40 μM AUL12; on s'indica, les cèl·lules es pre-incubaven amb IND, com a ( a ). Es va sondar l’immunoblot occidental amb GSK-3 α / β amb Bax, i amb IgG com a control de càrrega; NC, control negatiu. ( c ) Immunoblot occidental en fraccions citosòliques i mitocondrials de cèl·lules SAOS-2 tractades o no durant 2 h amb 40 μM AUL12; on s'indica, les cèl·lules es pre-incubaven amb IND, com a ( a ). Per comprovar la puresa de la fracció, també es va sondar el tacte amb β -catenina com a marcador citosòlic i amb TOM20 com a marcador mitocondrial. ( d ) experiments de CRC a cèl·lules senceres tractades amb les concentracions reportades de AUL12 (amb o sense 1 h de preincubació amb un pèptid inhibidor de Bax (BIP, 60 μM)). La comparació amb la presa de Ca 2+ mitocondrial en les diverses condicions es compara amb la mesurada ( e ) La inducció de la mort en cèl·lules SAOS-2 exposades a diferents concentracions d’AUL12 amb o sense pre-incubació amb la BIP (60 μM) s’analitza per citofluorimetria amb un iodur de propidio / Annexina V-FITC de doble tinció. a la figura 1b. Les cèl·lules viables reportades en el gràfic de barres són negatives per als dos fluoròfors. Al llarg de la figura, els gràfics de barres reporten valors ± valors SD ( n = 3). La importància estadística es va mesurar amb la prova t d’ un estudiant i està indicada per asteriscs ( * P <0, 01, ** P <0, 005)

Imatge a mida completa

Discussió

En el present treball, hem caracteritzat els mecanismes bioquímics que sustenten l’acció anticancerigen d’AUL12, una nova quimioterapèutica de la família Goldi (III) -ditiocarbamato. Hem trobat que AUL12 inhibeix fortament l’activitat del RC Complex I i provoca un ràpid augment dels nivells de ROS, que al seu torn condueixen a l’obertura de PTP mitocondrial i a l’apoptosi de cèl·lules canceroses. El paper que tenen els oxidants en la transformació neoplàstica és complex i no s’entén del tot. ROS pot contribuir a estimular la proliferació, la invasió i la metàstasi i a la inhibició de l’apoptosi. 34 Induint la inestabilitat genòmica, ROS accelera la velocitat de mutacions i condueix a alteracions neoplàstiques, com ara disfuncions en el metabolisme energètic, amb fuites d’electrons durant el procés de fosforilació oxidativa i la conseqüència de la generació de superòxid i posteriorment peròxid d’hidrogen. 18, 35, 36 L'activació de diversos oncogens, com Ras, Bcr-Abl i c-Myc o la pèrdua de p53 funcional augmenten la producció de ROS millorant la glicòlisi i inhibint la fosforilació oxidativa. 37, 38, 39 Aquestes alteracions es postulen per fer les cèl·lules tumorals vulnerables a un nou estrès oxidatiu. D’acord amb això, hem descobert que les cèl·lules SAOS-2 d’osteosarcoma humanes, que no disposen d’un p53 funcional 40, sofreixen una apoptosi massiva després de 3 h de tractament amb AUL12.

Tanmateix, la interacció entre la transducció de senyal pro-neoplàstica i la regulació redox pot ser complexa, com en el cas de l’oncogen K-Ras: un nivell baix d’expressió K-Ras promou un programa de desintoxicació ROS necessari per a l’inici, la proliferació i la supervivència del tumor, El 19 però un important augment de la seva activitat augmenta la ROS mitocondrial, que estimula la proliferació cel·lular i el creixement independent del ancoratge, 41 i fàrmacs com la lanperisona o l'erastina indueixen l'alliberament mitocondrial de ROS, la mort de cèl·lules oxidatives i la supressió del creixement del tumor en model oncogènic que alberga K oncogènica. Mutacions ras. 42, 43 Consistent amb una sensibilització K-Ras a l'estrès oxidatiu, l'AUL12 és més eficaç en la inducció d'apoptosi a les cèl·lules epitelials de pròstata RWPE-2 transformades en K que no a les cèl·lules parentals no transformades RWPE-1, encara que aquestes són més sensible a una varietat d’estímuls apoptogènics. A més, AUL12 inhibeix el creixement xenogràfic de cèl·lules tumorals de pròstata in vivo , provocant una toxicitat sistèmica mínima. 23

Tanmateix, per sobre d’un determinat llindar, l’estrès oxidatiu pot induir una obertura prolongada de la PTP mitocondrial, de manera irreversible amb les cèl·lules a la mort. Un augment dels nivells de ROS pot desencadenar un bucle de feed-forward que comporta un augment de Ca 2+ progressiu, un augment de ROS addicional i unes obertures prolongades de PTP, 16, 27, 28, però els mecanismes moleculars que promouen aquest procés i la seva possible desregulació en càncer es mantenen mal definits. . La majoria de les ROS generades en mitocondris intactes són aportades per RC Complex I, 44 a NADH: Quinone Oxidoreductasa dotada d’una estructura extremadament complexa. 45 Es produeix una regulació fina de l’activitat del Complex I durant la tumorigenesi. Per exemple, els fibroblasts transformats en K-Ras disminueixen el contingut i l’activitat del complex I, en comparació amb una contrapart del control. 46 La rotenona analògica de quinona augmenta la producció de superòxid de substrats enllaçats amb NAD + i interfereix amb la formació d'una ubisemiquinona estabilitzada a la part de la matriu del complex. 34 A mesura que observem que la ROS induïda per AUL12 no s’incrementa encara més per rotenona, sospitem que els dos fàrmacs actuen sobre el mateix procés bioquímic dins del Complex I. Destaca, sobretot, que l’estrès oxidatiu depenent de la rotenona provoca mort autòfaga en cèl·lules cancerígenes. 47

ROS recluta i ajusta l'activitat de la senyalització de molècules de manera altament compartimentada dins de la cèl·lula. 48 proteïnes sensibles al ROS regulen una varietat de funcions cel·lulars rellevants en l’aparició i desenvolupament del tumor. 35 Observem que l’estrès oxidatiu generat per AUL12 provoca la fosforilació del residu de Tyr (279/216) en GSK-3 α / β , que activa l’enzim i afavoreix la seva redistribució subcel·lular. 49 Es va observar una activació de GSK-3 α / β depenent de ROS en diversos models cel·lulars, inclosos cardiomiocits mitjançant activació sostinguda d’ERK 50 o mTOR 51, cèl·lules mesangials, on una via de senyalització ROS-GSK-3 α / β indueix l’autofagia, 52 o cèl·lules neuronals, en què l'estrès oxidatiu genera una marcada activació de GSK-3β que antagonitza els senyals de supervivència. El GSK-3 α / β pot afavorir l’obertura de PTP ja sigui promovent el despreniment HK II de les mitocondries, 29, 31, 32 o fosforilant la chaperona i el regulador PTP CyP-D, 7, 8, 9 i en neoplasmes, convergeixen diversos senyals oncogènics. al GSK-3 α / β mitocondrial per mantenir el PTP bloquejat. 6 Aquí determinem que l'activació GSK-3 α / β depenent de ROS no canvia l'equilibri d'unió HK II amb els mitocondris, sinó que fosforila el CyP-D, connectant funcionalment l'activació GSK-3 α / β depenent d'AUL12 amb la inducció del PTP.

En paral·lel, hem observat que la ROS creada per AUL12 indueix una interacció entre GSK-3 α / β i la proteïna pro-apoptòtica de la família Bcl-2 Bax, amb una reubicació dramàtica de Bax en els mitocondris. Aquest resultat és d’acord amb observacions anteriors, mostrant que GSK-3 α / β pot activar Bax directament, mitjançant fosforilació en Ser-163 o promovent la seva expressió induïda per p53. La Bax mitocondrial indueix la mort cel·lular, provocant la permeabilització de la membrana exterior i la consegüent alliberació de factors apoptogènics. 54 Tot i això, també s'han proposat connexions funcionals entre Bax i la regulació PTP, ja que es va demostrar que Bax bloqueja un canal K + depenent de la tensió anomenat K V 1.3 a la membrana mitocondrial interna, donant lloc a una ràpida producció de ROS i obertura de PTP. 55 En conseqüència, observem que la inhibició de Bax amb un pèptid selectiu rescata parcialment l’obertura de PTP i la mort cel·lular provocada per AUL12.

Els mecanismes mitjançant els quals AUL12 s’orienta a l’equilibri redox homeostàtic desequilibrat de cèl·lules malignes permeten fer llum a la maquinària mitocondrial que orquestra la supervivència de les neoplàsies. La connexió funcional que observem entre el complex I, la producció de ROS millorada, l’activació de GSK-3 α / β i Bax i el desbloqueig del PTP ofereix múltiples objectius terapèutics prometedors. La toxicitat derivada del tractament, la insensibilitat cel·lular als fàrmacs i la manca de selectivitat terapèutica són problemes importants en el desenvolupament d’estratègies que condueixin a la cura del càncer. Atesa la seva capacitat per matar selectivament cèl·lules canceroses in vivo i in vitro sense toxicitat sistèmica, AUL12 podria constituir un compost líder en el desenvolupament de quimioterapéutics que apuntin a les alteracions neoplàstiques úniques de l’equilibri redox cel·lular.

Materials i mètodes

Productes químics i reactius

L’annexina-V conjugada del FITC era de Roche (Indianapolis, IN, EUA); El calci Green-5N i el metilèster tetrametil-rodamina (TMRM) eren de sondes moleculars (Eugene, OR, EUA); PD 98059 i Indirubin-3-monoxime eren de Calbiochem (San Diego, CA, EUA); la resta de productes químics (oligomicina, antimicina, rotenona, N -acetil-L-cisteïna (NAC)) eren de Sigma (St. Louis, MO, EUA). L’anticòs monoclonal anti-actina (entrada) del ratolí era de Sigma; els anticossos monoclonals anti-GSK-3α / β, els anticossos policlonals de conill anti-BAX i anti-TOM20 eren de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA), l'anticòs monoclonal anti-CyP-D era de Calbiochem; Els anticossos anti-fosfo-Y del conill (279/216) GSK-3 α / β eren de procedència de Cell Signaling (Beverly, MA, EUA); Els anticossos secundaris conjugats per FITC eren de Sigma. N -acetil-L-cisteïna (NAC), es va afegir 1 h abans d'iniciar la inducció de l'apoptosi per AUL12, mentre que IND es va afegir 3 h abans.

Anàlisi de citometria de flux de la inducció de l'apoptosi

Es van realitzar enregistraments de citometria de flux dels canvis apoptòtics, tal com es descriu. 56, 57 Breument, després de la inducció de l’apoptosi, es van suspendre de nou les cèl·lules en NaCl 135 mM, HEPES 10 mM, CaCl 2 a 5 mM i es van incubar durant 15 min a 37 ° C en annexina-V conjugada amb FITC, TMRM (20 nM) i propidi. iodur (PI, 1 μ g ml 1 ), per detectar despolarització mitocondrial (reducció de tinció TMRM), exposició a fosfatidilserina a la superfície cel·lular (augment de tinció annexina-V conjugada amb FITC) i pèrdua de la integritat de la membrana plasmàtica (permeabilitat PI i tinció) . Es van analitzar mostres en un citòmetre de flux FACS Canto II (Becton Dickinson, San Diego, CA, EUA). L’adquisició i anàlisi de dades es van realitzar mitjançant el programari FACSDiva (Becton Dickinson). Cada experiment es va repetir almenys quatre vegades i la consistència de les dades va permetre mostrar un experiment representatiu per a cada condició.

Lisi cel·lular, fraccionament i anàlisi immunoblot occidental

Es van preparar extractes cel·lulars totals a 4 ° C en NaCl 140 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 7, 4), 5 mM EDTA, 10% glicerol i 1% Triton X-100 en presència d'inhibidors de fosfatasa i proteasa (Sigma). Per separar els mitocondris de la fracció citosòlica, les cèl·lules es van col·locar en un tampó aïllant (250 mM de sacarosa, Tris-HCl de 10 mM, EGTA-Tris de 0, 1 mM, pH 7, 4) i es van homogeneïtzar a 4 ° C. A continuació, els mitocondris es van aïllar per centrifugació diferencial (tres vegades, primer a 700 × g i dues vegades a 9000 × g , tot a 4 ° C, 10 min) en un tampó aïllant mitocondrial.

Per a immunoprecipitacions, es van incubar 2000-3000 μ g de proteïnes per reacció amb anticossos conjugats a les proteïnes A- o proteïnes G-Seharose perles (Sigma) a 4 ° C durant la nit. Es van realitzar controls negatius incubant lisats en perles conjugades en absència d'anticossos primaris. Les mostres es van separar per reduir les condicions en gels de SDS-poliacrilamida i es van transferir a les membranes Hybond-C Extra (Amersham, Little Chalfont, Regne Unit). Els anticossos primaris es van incubar durant 16 h a 4 ° C, i es van afegir anticossos secundaris conjugats amb peroxidida de cavall picant durant 1 h. Els immunoblots occidentals es van dur a terme en condicions estàndard i es van visualitzar proteïnes mitjançant una quimioluminiscència millorada (Millipore, Billerica, MA, EUA).

Aïllament dels mitocondris del ratolí

Els mitocondris es van aïllar dels fetges de ratolins BALBc de tipus salvatge, mitjançant centrifugacions seqüencials, tal com es descriu. 58 Tots els procediments es van realitzar a 4 ºC.

Mesura de la capacitat de retenció de Ca 2+ mitocondrial

El test CRC es va utilitzar per avaluar l’obertura de PTP seguint trens de polsos de Ca 2+ 29, 58 i es va mesurar fluorimètricament a 25 ° C en presència de l’indicador de Ca 2+ Calcium Green-5N (1 μ M; λ exc: 505 nM; λ nM: 535 nM; Sondes moleculars). Hem realitzat experiments de CRC a mitocondris aïllats o a cèl·lules senceres col·locades en un tampó isotònic (KCl 130 mM, Pi-Tris 1 mM (Pi: fosfat inorgànic), Tris / MOPS de 10 mM, 10 μM EGTA / Tris, 5 mM glutamat / 2, 5 mM de malat, 10 μM citocrom c , pH 7, 4). Cèl·lules senceres CRC es va dur a terme després de la permeabilització de la membrana plasmàtica amb la detergent no iònica digitonina, molt selectiu per a les membranes enriquides en colesterol i no dany les membranes mitocondrials. Les cèl·lules es van rentar dues vegades en un tampó compost per 130 mM KCl, 1 mM Pi-Tris, 10 mM Tris / MOPS, 1 mM EGTA / Tris, pH 7, 4 i després permeabilitzats amb 150 μ M digitonina (15 min, 4 ° C) en el mateix buffer amb EGTA / Tris modificat, (1 mM, pH 7, 4). A continuació, es va rentar la digitonina mitjançant les cèl·lules girant dues vegades al tampó de rentat amb 0, 1 mM EGTA / Tris i es va valorar el nombre de cèl·lules acuradament abans de començar cada experiment. A continuació, es van col·locar mitocondris (0, 5 mg ml −1 ) o cèl·lules permeabilitzades (7 × 10 6 cèl·lules per experiment) en presència de l’indicador de Ca 2+ Calcium-Green-5N, que no penetra en les mitocondries i s’exposa a Ca 2+ punxes (10 μ M i 5 μ M, respectivament). Es van utilitzar gotes de fluorescència per avaluar l'absorció de Ca 2+ mitocondrial. L’obertura PTP es va detectar com un augment de fluorescència.

Determinació de l’activitat del complex respiratori mitocondrial

Per mesurar l’activitat enzimàtica dels complexos RC, es van homogeneïtzar mitocondris de fetge de ratolí amb un terrisser elèctric (Sigma) en un tampó compost per 250 mM de sacarosa, Tris-HCl de 10 mM, EGTA-Tris de 0, 1 mM, pH 7, 4, 10% Percoll, proteasa. i inhibidors de la fosfatasa i mitocondris aïllats, tal com s’ha descrit anteriorment amb diferents centrifugacions. Les activitats del complex respiratori mitocondrial I i II / III es van determinar espectrofotomètricament, tal com es descriu. 59 Breument, per a mitocondris hepàtics del ratolí I complex (40 μ g ml −1 ) es van col·locar en un medi d'assaig compost per Tris 10 mM pH 8, albumina sèrica bovina 3 mg ml −1, alameticina 5 μ M, azida de sodi 5 mM, l'antimicina 1 μM, CoQ 6, 5 μ M i el canvi d'absorbància (340 nM, 37 ° C) amb o sense AUL12 (10 min. incubació) es van registrar durant 1 min. A continuació, es va afegir NADH (0, 1 mM) i es va mesurar l'activitat de NADH oxidoreductasa durant 5 min abans de l'addició de rotenona (20 μ M) després de la qual es va mesurar l'activitat durant 3 min addicionals. L’activitat del complex I és l’activitat de la NADH oxidoreductasa sensible a la rotenona.

Per a la determinació d’activitats complexes II / III, es van col·locar mitocondris de fetge de ratolí (40 μ g ml −1 ) en un medi compost per KH 2 PO 4 25mM, albúmina sèrica bovina 1 mg ml 1, azida de sodi 5 mM, succinat 10 mM, alameticina 5 μ M, ATP 0, 1 mM amb o sense AUL12 (incubació de 10 minuts). A continuació, es va afegir el citocrom c 50 μ M i es va registrar la disminució de l’absorbància (550 nM, 37 ° C) durant 10 min. Finalment, es van corregir les dades per l’activitat de citrat sintasa: mitocondris de fetge de ratolí (40 μ g ml 1 ) es van col·locar en un medi compost per Tris / HCl 100 mM, pH = 8, DTNB 0, 1 mM, acetil CoA 0, 3mM i oxaloacetat 0, 5 mM. A continuació, es va registrar l'augment d'absorbància (412 nM, 37 ° C) durant 10 min.

Experiment de taxes de consum d’oxigen (OCR)

La taxa de consum d’oxigen es va avaluar en temps real amb l’analitzador de flux de flux extracel·lular XF24 (Seahorse Biosciences), que permet mesurar els canvis d’OCR després de fins a quatre addicions seqüencials de compostos. Les cèl·lules (5 × 10 4 per pou) es van xapar el dia abans de l'experiment en un medi sèric DMEM / 10%; es van realitzar experiments amb monocapa confluent. Abans de començar les mesures, les cèl·lules es van col·locar en un medi DMEM en marxa (suplementat amb 25 mM de glucosa, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvat de sodi i sense sèrum) i es van incubar durant 1 h a 37 ° C en CO 2 atmosfèric. Els valors OCR es van normalitzar per al contingut de proteïnes de cada mostra. Es va realitzar una valoració precisa amb el FCCP discoupler, per tal d’utilitzar la concentració de FCCP (20 nM) que augmenta el màxim de OCR.

Anàlisi estadística

Les investigacions van ser recopilades per investigadors cegats a la configuració experimental i es van analitzar estadísticament mitjançant el test t paramétric de Student. En tots els gràfics es mostra la mitjana ± SD (desviació estàndard de la mitjana). Els valors P es van considerar estadísticament significatius. L'anàlisi estadística es va realitzar amb Statgraphics Centurion XVI, versió 16.1.12 (StatPoint Technologies, Inc. Warrenton, VA, EUA)

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

Glossari

AUL12

([AuIIIBr2 (ESDT)]

ESDT

etilsarcosinedithiocarbamate)

BIP

Pèptid inhibidor de Bax

CRC

Capacitat de retenció de Ca 2+

CsA

ciclosporina A

CyP-D

ciclofilina D

HK II

isoforma hexokinasa II

IND

indirubina-3'-oxime

NAC

N -acetil-L-cisteïna

OCR

taxa de consum d’oxigen

OXPHOS

fosforilació oxidativa

PTP

permeabilitat porus de transició

RC

cadena respiratòria

ROS

espècies reactives a l'oxígen

La informació complementària acompanya el document del lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)