Desregulació coordinada de mrnas i micrornes a la còrtex prefrontal medial de rata després d'un historial de dependència a l'alcohol | la revista farmacogenòmica

Desregulació coordinada de mrnas i micrornes a la còrtex prefrontal medial de rata després d'un historial de dependència a l'alcohol | la revista farmacogenòmica

Anonim

Temes

  • Genètica del sistema nerviós
  • miRNAs
  • Escorça prefrontal

Resum

S'han identificat canvis a llarg termini en l'expressió gènica cerebral en la dependència de l'alcohol, però es desconeixen els mecanismes subjacents. Aquí, es va examinar el paper potencial dels microARN (miRNAs) per a canvis persistents d’expressió gènica en la còrtex prefrontal medial de rata (mPFC) després d’historial de dependència de l’alcohol. El consum d’alcohol de dos ampolles de lliure elecció va augmentar després de l’exposició de setmanes a la intoxicació intermitent amb alcohol. Un enfocament bioinformàtic mitjançant anàlisis de microarray, PCR quantitativa (qPCR), anàlisi bioinformàtica i anàlisi integratiu de microARN (ARNm) (ARNm) (MRNA) identificat patrons d’expressió indicatius d’una interrupció en els processos sinàptics i la neuroplasticitat. Al voltant de 41 miRNAs de rata i 165 ARNm de la mPFC es van alterar significativament després de l’exposició crònica a l’alcohol. QPCR va confirmar un subconjunt de miRNAs i ARNm. Les categories d’ontologia gènica d’expressió diferencial apunten a processos funcionals normalment associats a neurotransmissió, neuroadaptació i plasticitat sinàptica. El maridatge d’expressió de microRNA-ARNm va identificar 33 miRNAs de manera positiva dirigida a 89 ARNm suggerint xarxes transcripcionals implicades en l’orientació axonal i la senyalització de neurotransmissors. Els nostres resultats demostren un canvi significatiu en els patrons d’expressió de microRNA en el mPFC després d’una història de dependència. A causa de la regulació global de múltiples transcripcions de targetes avall, els ARNm poden tenir un paper fonamental en la reorganització de les connexions sinàptiques i les neuroadaptacions a llarg termini en la dependència de l'alcohol. Les alteracions de les xarxes transcripcionals mediades per microRNA poden estar implicades en el control prefrontal interromput sobre el consum d'alcohol observat en pacients alcohòlics.

Introducció

La dependència de l’alcohol provoca alteracions cel·lulars de llarga durada en el cervell i és probable que en part es produeixin canvis persistents en l’expressió gènica. 1 Estudis de perfil transcriptoma en humans i rosegadors han identificat canvis en l'expressió gènica induïts per l'alcohol implicats en múltiples funcions biològiques i cel·lulars, incloses respostes a l'estrès, senyalització del receptor acoblat a la proteïna G, alliberació i senyalització de neurotransmissors i tràfic de proteïnes. 2, 3, 4, 5, 6 La còrtex prefrontal medial (mPFC) és una regió cerebral clau en el control cognitiu del comportament que consumeix alcohol i és susceptible dels efectes a llarg termini de l’exposició crònica a l’alcohol. 7, 8, 9 Nosaltres i altres ja hem identificat patrons de canvis d’expressió gènica sostinguts en la mPFC induïda per l’exposició crònica, el consum i la dependència a l’alcohol, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, però mecanismes que indueixen i mantenen persistents. es desconeixen els canvis en l’expressió gènica després de l’exposició a l’alcohol.

Aquí vam començar a explorar el possible paper dels microARN (miRNAs) com a mediadors dels canvis d’expressió gènica cerebral induïts per l’alcohol. Els ARNm són molècules d'ARN no codificants altament conservades, que modulen l'expressió gènica a nivell post-transcripcional amb una longitud de nucleòtid de ∼ 22-30. Després del processament de Dicer, el miRNA dúplex imperfet de 20-25 pb de longitud es desemboca en una cadena de viatgers madura i de passatgers (estrella miR). Els miRNA madurs s'uneixen als elements de reconeixement del miRNA als 3'-UTR del seu ARN missatger objectiu (ARNm) provocant degradació o repressió translacional. El fil conductor del passatger és generalment present en nivells més baixos dins de la cèl·lula. Es va pensar inicialment que la cadena de viatgers es degrada ràpidament com a subproducte no funcional, 15 però recentment s'ha demostrat que la cadena de viatgers pot ser completament funcional, unint-se als seus propis elements de reconeixement miRNA i inhibint l'expressió del seu propi conjunt de ARNm. 16, 17, 18, 19 Els miRNAs individuals són pensats per orientar i regular múltiples ARNm. A causa del seu potencial d’exercir canvis d’expressió coordinats a conjunts de transcripcions completes, els miRNAs ofereixen un interessant mecanisme candidat a canvis provocats per l’alcohol en l’expressió gènica.

Els miRNA estan molt expressats al cervell i tenen un paper important en una gran varietat de processos biològics, incloent la diferenciació neuronal, la formació de 20 sinapsis i la plasticitat, la plasticitat sinàptica homeostàtica 22 i la degeneració neuronal. L'evidència creixent ha demostrat que els ARNm poden tenir un paper crític en els processos neuroadaptatius desencadenats per l'exposició crònica a fàrmacs. 24 Dades recents suggereixen que els ARNm poden tenir un paper important en comportaments relacionats amb les addiccions, com ara la ingesta de cocaïna, la dependència de la nicotina, la tolerància a la morfina i la tolerància a l'alcohol. 25, 26, 27, 28 Lewohl et al. 11 recentment van identificar 48 miRNAs que es van regular en l'anàlisi post mortem de la còrtex frontal d'alcohòlics humans. L’anàlisi post mortem del teixit cerebral d’individus amb alcoholisme proporciona una finestra inestimable sobre la interrupció de la regulació de l’expressió gènica d’aquest trastorn, però ofereix oportunitats limitades per aïllar les conseqüències de l’exposició a l’alcohol cerebral dels factors de vulnerabilitat preexistents o d’influències ambientals associades a l’alcoholisme com, per exemple, un trauma al cap o una deficiència nutricional.

L’ús de models animals controlats complementa els estudis humans post-mortem a aquest respecte. L’objectiu de l’estudi va ser identificar els canvis d’expressió del miRNA i els seus objectius genètics potencials en l’MPFC després d’una història de dependència de l’alcohol en un model animal. Aquí, es va utilitzar un model de rata establert de dependència de l’alcohol, que s’ha demostrat que resulta en una escalada persistent de la ingesta voluntària d’alcohol voluntària posterior, acompanyada de canvis igualment duradors en l’expressió gènica. 2, 29, 30 Hem utilitzat matrius d'ARNm i miRNA d'Affymetrix, identificar canvis d'expressió de miRNA i ARNm en el mPFC de rata després d'un historial de dependència de l'alcohol i confirmar aquests mitjançant PCR quantitativa en temps real (qRT-PCR). L’anàlisi de l’ontologia gènica (GO) va agrupar els ARNm dirigits en categories implicades en transmissió sinàptica, canals iònics, tràfic, resposta immune, guia axonal i regulació transcripcional. L’aparellament d’expressions va suggerir efectes reguladors mundials de diversos miRNAs sobre els seus ARNm dirigits en el mPFC. Aquests resultats identifiquen xarxes d'ARNm-ARNm que poden contribuir a la disfunció del control inhibidor sobre el comportament per part del mPFC observat en la addicció a l'alcohol.

Mètodes

Temes

Les rates masculines adultes de Wistar que pesaven 300–500 g al principi de l’experiment es van allotjar per parelles en un ambient controlat per la temperatura (21 ° C) i la humitat amb cicles inversos de 12 hores durant la nit. Durant les proves, es va oferir accés lliure a les aigües de fregament i aixeta durant tota la durada de l’experiment. Els estudis s’han realitzat d’acord amb la Guia NIH per a la cura i l’ús d’animals de laboratori. Es van utilitzar dos lots d’animals que van ser tractats de manera uniforme amb vapor d’alcohol intermitent o amb exposició a l’aire. Per confirmar la inducció del consum voluntari d’alcohol augmentat sense confondre l’anàlisi d’expressió posterior, dos grups van ser mostrats aleatòriament de cada lot, un per a la confirmació del comportament i un altre per a l’anàlisi d’expressió (miRNA o ARNm). A partir del lot 1, n = 4 per grup es van utilitzar per a la perfilació d'expressió de la matriu de miRNA i la confirmació quantitativa de PCR (qPCR) i n = 10 per grup per a l'avaluació del comportament potable. Des del lot 2, n = 8 per grup es van utilitzar per a la perfilació d’expressió de mRNA i confirmació de qPCR, i n = 8-10 per grup per beure. Ja s’han notificat dades sobre la beguda del lot 2 (Sommer et al. , 2008).

Exposició a etanol

Les rates van estar exposades a vapor d’alcohol intermitent o aire normal mitjançant un sistema d’inhalació com es va descriure anteriorment. 2 Breument, es va permetre que les rates s’habituessin a les cambres durant una setmana, després s’exposessin a baixa concentració d’alcohol durant 1 setmana i s’exposessin finalment durant 7 setmanes a cicles diaris d’intoxicació i retirada d’alcohol. Setmanalment, es pesava les rates, es recollia sang de la vena posterior de la cua i es va extreure el sèrum i es va analitzar per a l'etanol mitjançant un kit d'anàlisi de fosfat deshidrogenasa / nicotinamida adenina fosfat deshidrogenasa / espectrofotomètrica (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EUA) segons les instruccions del fabricant. Com es va publicar anteriorment, 29 exposicions al vapor d’alcohol van donar lloc a cicles diaris de concentracions d’alcohol en sang que oscil·len entre 0 i 200–380 mg dl 1 . Prop del final del període d’exposició, es van observar signes de retirada en forma de rigidesa de la cua i piloerecció cap al final de la fase d’alcohol. La retirada no va assolir una gravetat en què es van observar convulsions per retirada.

Consum d’etanol

Un subconjunt d’animals dependents i de control (lot 1: n = 10 per grup) va ser sotmès a un paradigma d’elecció de dues ampolles per confirmar la dependència de l’alcohol. A partir de la setmana següent a la retirada de les rates del vapor, se'ls va entrenar per beure un 8% d'alcohol (en pes / vol) en una sacarina del 0, 2% durant dues setmanes i es va mesurar el consum durant 10 dies consecutius en un accés lliure de dues ampolles durant les 24 hores. paradigma d’elecció amb un 8% d’alcohol (pes / vol) en solució de sacarina al 0, 2% o només en solució de sacarina 0, 2%, tal com es descriu. 2 La ingesta diària d'alcohol es va promediar durant dues setmanes i es va comparar per test de T.

Extracció del cervell

Per a l'anàlisi de l'expressió, les rates mostrejades aleatòriament van ser assassinades tres setmanes després de l'exposició. Les rates i controls post-dependents (lot 1: n = 4 per grup; el lot 2: n = 8 per grup) es van decapitar entre 1000 i 1500 hores. Es van retirar els cervells, es van congelar a -40 ° C isopentà i es va mantenir a -80 ° C. Les mostres bilaterals de mPFC (inclosos Cg1 + 2, PL i IL segons Paxonis i Watson 31 ) es van disseccionar amb un bisturí a partir d'una llesca coronal de 2 mm sota una lent que s'utilitza fites anatòmiques tal com es descriu. Es van ponderar 32 mostres i es van emmagatzemar a -80 ° C fins que es va preparar l'ARN.

Aïllament del miRNA i perfilat de l’expressió del miRNA

Els miRNAs es van aïllar de les mostres del lot 1 mitjançant el kit d’aïllament mirRana miRNA (Ambion Life Technologies, Foster City, CA, EUA). La quantitat total d’ARN es va mesurar al NanoDrop (ThermoScientific, Wilmington, DE, EUA). Es van utilitzar uns 200 ng de ARN total per al procediment d’hibridació. Els miRNAs es van associar a una molècula de senyal biotinilada mitjançant el Kit de marcatge de l'ARN HSR Biotin Biotin FlashTag (Genisphere, Hatfield, PA, EUA). Els miRNAs es van hibridar durant 16 hores a 48 ° C fins a les matrius de AffRymetrix miRNA (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA) en el Forn d’Hibridació d’Affymetrix 645. Les matrius d’Affymetrix miRNA es van rentar a la Fluidics Station 450 mitjançant la seqüència de comandament fluidics FS450_0003 i escanejada a un sistema GeneChip Scanner 3000 7G (Affymetrix). Vuit xips van passar pel control de qualitat. Després de l'escaneig, les dades es van transformar, normalitzar i provar per controlar la qualitat de la base de registre 2 mitjançant el programari MiRNA QC Tool (Affymetrix). Les diferències estadístiques entre grups es van realitzar mitjançant la Partek Genomics Suite (Partek, St Louis, MO, EUA). Es van obtenir i assajar valors d'expressió mitjana multichip robustos per a l'expressió gènica diferencial mitjançant la prova de dues mostres de Welch assumint variacions desiguals, en un llindar P <0, 05. La taxa de descobriment fals (FDR) es va avaluar a tots els conjunts de sondes mitjançant el mètode de Benjamini i Hochberg. El microarray d'Affymetrix miRNA contenia sondes dirigides a miRNAs de més de 45 espècies diferents, incloses Caenorhabditis elegans , Drosophila melanogaster , Danio rerio , ratolí, rata i humans. L'anàlisi de components bàsics (PCA) de Partek Genomics Suite (Partek) es va utilitzar per determinar la diferència entre les mostres individuals. El PCA s'executa com una anàlisi R en la qual les variables ( p ) es troben en una matriu de dispersió de pxp (covariància) de variables on cada observació transformada està representada pels seus components principals.

PCR quantitativa en temps real de miRNA

A partir del mateix conjunt de mostres (lot 1), es va realitzar una anàlisi de PCR en temps real dels nivells d'expressió de miRNA mitjançant el Kit de transcripció inversa de TaRMan miRNA (Ambion Life Technologies) i es va analitzar per triplicat. Per a totes les reaccions es van utilitzar 10 ng de ARN total per a l’anàlisi de miRNA. Les reaccions es van normalitzar al control endogen de la U6 i la comparació entre grups es va fer mitjançant el mètode 2-ΔΔCt, en el qual el cicle llindar (Ct) és el cicle en què hi ha un augment significatiu detectable de la fluorescència; el valor ΔCt es calcula restant el valor Ct per al control endogen del valor Ct del miRNA d’interès. El valor ΔΔCt es calcula restant el valor ΔCt de la mostra de control a ΔCt de la mostra experimental. Per a la interpretació gràfica, els valors ΔΔCt es van transformar (-x), per la qual cosa els gens regulats a la baixa demostren ΔΔCt0. Els valors −ΔΔCt es van comparar amb una prova t diferent de cada gen o microRNA ( P <0.05 = significació; P <0.07 = tendència).

Aïllament de l’ARNm i perfilació d’expressió de mRNA

L’ARN total s’ha extret del lot de 2 mostres amb reactiu Trizol (Gibco BRL Life Technologies, Baltimore, MD, EUA) seguit d’un pas de neteja basat en columnes RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanya) segons les instruccions del fabricant. Totes les mostres d’ARN van mostrar relacions A260 / 280 entre 1, 9 i 2.1. La integritat de l'ARN es va determinar mitjançant un bioanalitzador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) i només es va utilitzar material sense signes de degradació. La preparació objectiu es va fer per a mostres individuals i es va realitzar la hibridació a les matrius RAE230A, la tinció, rentat i exploració de les fitxes segons el manual tècnic del fabricant (Affymetrix). La Microarray Analysis Suite 5.0 (MAS5) va produir fitxers d’intensitat cel·lular que es van inspeccionar per a la polarització regional d’hibridació i paràmetres de control de qualitat tal com es descriu. 34 setze fitxes van passar el control de qualitat. El MAS5 va reconèixer el ∼ 60% dels conjunts de sondes 15 800 a la matriu RAE230A presents en les nostres mostres. Els fitxers CEL es van importar a la Suite de Genòmica de Partek. Les dades es van normalitzar log2. Els valors d’expressió d’ARN es van obtenir i provar l’expressió gènica diferencial mitjançant la prova t de dues mostres de Welch assumint variacions desiguals, en un llindar P <0, 05. Consistent amb estudis de microarray anteriors que investigaven canvis d’ARNm després d’una exposició prolongada a l’alcohol, no utilitzàvem un càlcul de FDR, sinó que escollíem un valor de canvi de plec d’1, 2. 35

mRNA quantitativa PCR en temps real

A partir del mateix conjunt de mostres (lot 2), es va transcriure inversament 100 ARN total de 100 ng mitjançant el mestratge mestre de gran capacitat RNA-a-ADNc (Applied Biosystems (ABI), Darmstadt, Alemanya) seguint el protocol del fabricant. Les mostres es van assajar per triplicat en un volum de reacció total de 20 μl mitjançant Power SYBR®Green PCR Master Mix (ABI) en un sistema ABI 7900 HT RT-PCR (40 cicles de 95 ° C durant 15 s i 60 ° C durant 1 min. ). Al final de cada PCR es va registrar un perfil de fusió per comprovar les amplificacions de fragments aberrants. Els imprimadors per a cada objectiu es van dissenyar cap a l'extrem 3 'de la seqüència de codificació considerant les juncions exó-exon, quan és possible, basades en la base de dades de seqüències del Centre Nacional per a la Biotecnologia Informació (NCBI). Els amplicons es van dissenyar amb una durada de 95-110 pb de longitud i temperatures de fusió> 75 ° C per poder distingir entre els amplicons i les formacions prime-dimer en l'anàlisi de fusió. Per a seqüències d’imprimació, vegeu la Taula Suplementària 1. El programari SDS 2.2.2 d’ABI es va utilitzar per analitzar la intensitat de fluorescència verda SYBR i per calcular el número de cicle teòric quan es va passar un llindar de fluorescència definit (valors Ct). La quantificació relativa es va fer segons el mètode ΔΔCT tal com es descriu anteriorment, mitjançant la qual la beta-actina (Actb) s'utilitzava com a control intern. Els valors d’Actb Ct no eren diferents entre grups. Degut a la seva complexa pauta de variacions empalmades, es va analitzar el factor neurotròfic derivat del cervell (BDNF) mitjançant un assaig TaqMan tal com es descriu anteriorment. 36 Seqüències de sonda marcades amb el colorant reporter 6-caroxiflourescina eren: 5′-CTTCCCGGGTGATGCTCAGCAGT-3 ′ per a BDNF i 5′-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-3 ′ per a Actx. Les proves estadístiques i la representació gràfica es van fer als valors −ΔΔCT tal com es descriu anteriorment.

Anàlisi bioinformàtica d’ordre superior

Els ARNm i els ARNm candidats es van explorar més a través de l’anàlisi bioinformàtica. L’anàlisi de la ruta de l’enginy és una eina bioinformàtica basada en línia que situa miRNA candidats i ARNm candidats a vies canòniques, xarxes gèniques i explora interaccions gen-gen i miRNA-gen mitjançant criteris estadístics. Tots els temes biològics significatius associats a xarxes de genes i miRNA, vies canòniques i funcions biològiques van ser posteriorment validades mitjançant l'enciclopèdia de genes i genomes de Kyoto (KEGG; www.genome.jp/kegg), GO Consortium (www.geneontology.org) i Base de dades per a anotació, visualització i descobriment integrat (DAVID; //david.abcc.ncifcrf.gov). DAVID es va utilitzar per determinar categories de GO. Es van establir 37 criteris de significació i filtre a un P <0, 05 mitjançant el mètode Benjamini-Hochberg i el 20% FDR. Els paràmetres de fons DAVID van ser els següents: Rattus Norvegicus es va escollir com a fons de l'espècie i el genoma de la rata RAE230A es va seleccionar per al fons de l'Affymetrix 3'-IVT.

Anàlisi integradora de dades de micromecenatge de miRNA i ARNm

L’anàlisi d’objectiu de miRNA es va realitzar mitjançant el lloc web microRNA.org. El conjunt més actual de prediccions del lloc objectiu es va obtenir per a rata, incloent-hi tant els miRNAs conservats com els no conservats. Aquestes prediccions es van emparellar, quan era possible, als 165 ARNm regulats de manera diferent i als 41 miRNAs expressats de manera diferent determinats en les anàlisis de perfilació d’expressions anteriors. Es van utilitzar bones puntuacions de miRSVR i PhastCon basades en algorismes de microRNA.org per determinar les interaccions predirigides de miRNA-ARNm. 39 Les puntuacions van determinar l’associació adequada dels patrons d’expressió de miRNA amb els nostres resultats d’expressió d’ARNm observats experimentalment. Es van prioritzar els objectius a partir de la informació proporcionada per l’anàlisi DAVID Go Ontology, així com el maridatge d’expressió miRNA-ARNm en què es va canviar l’expressió miRNA i ARNm en sentit contrari.

Resultats

Augment del consum d’alcohol després d’historial de dependència

Els animals post-dependents van estar exposats al vapor d’alcohol durant 7 setmanes, mantenint un nivell de concentració d’alcohol en sang entre 150–400 mg dl −1 (Taula complementària 2). Tot i que hi ha alguna variabilitat per lots, el consum voluntari d’alcohol posterior en el paradigma d’elecció de dues ampolles (2 o 3 setmanes després de l’exposició al vapor, els lots 1 i 2, respectivament) es va incrementar de manera similar i significativa, aproximadament per dues vegades, a la publicació. -animals dependents en comparació amb els seus respectius controls (lot 1 (cohort miRNA): 1, 75 ± 0, 26 vs 0, 9175 ± 0, 207; ( t = 2, 465, df = 18) P = 0, 024; lot 2 (cohort ARNm): 3, 8 + 0, 35 vs 1, 44+ 0, 28; F (2, 30) = 17, 5, P <0, 001, segons es reporta a Sommer et al. 29

PCA de perfils d'expressió miRNA i ARNm

Hem analitzat les dades d’expressió d’efectes de tractament globals aplicant PCA a tots els punts de dades (Figura 1). El PCA és útil per identificar efectes i outliers principals del grup dins del conjunt de dades. Aquesta anàlisi va identificar clarament el tractament com la font de variació més gran de les dades de miRNA (Figura 1, quadre esquerre), mentre que l'efecte global del tractament no va ser tan fort per a les dades de l'ARNm (Figura 1, quadre dret). Per tant, la quantitat total de variància explicada dins del conjunt de dades de miRNA va ser del 62, 8% (PC # 1 = 28, 7%, PC # 2 = 20, 4% i PC # 3 = 13, 7%). La quantitat total de variància explicada dins del conjunt de dades de l’ARNm va ser del 35, 4% (PC # 1 = 14, 8%, PC # 2 = 10, 8% i PC # 3 = 9, 8%). A nivell global, aquestes dades suggereixen que la història de la dependència de l'alcohol condueix a canvis més grans en l'expressió del miRNA que en la dels ARNm.

Image

Anàlisi del component principal d'animals individuals per a la matriu de microARN (miRNA) i ARN de missatger (ARNm). Els animals postdependents es denoten pels cercles blaus i els animals de control es denoten pels cercles vermells. L’el·lipse que envolta els dos grups de tractament identifica la variació en els patrons d’expressió d’ARNm i miRNA entre mostres a no més de 2 m de distància de la mitjana. Les línies es connecten a un centroide (denotat per una bola blava o vermella cercle de groc) per connectar grups similars. Els eixos x , y i z representen els tres primers components de principi variable més grans (PC # 1, PC # 2 i PC # 3) que representen la majoria de la variància dins del conjunt de dades. El tauler esquerre representa l’anàlisi del component del principi del miRNA (PCA) i el quadre dret representa l’anàlisi PCA de l’ARNm (gen).

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

La dependència a l’alcohol altera els perfils d’expressió de miRNA en l’MPFC

Es van identificar 41 ARNm-rats (rno) alterats significativament en el mPFC després d’historial de dependència a l’alcohol ( P <0.05, canvi de plecs ± 1.2, FDR <5%). Entre aquests miRNAs expressats de manera diferent, 17 es van regularitzar significativament, i 24, van ser regulats significativament. Es van agrupar els valors d’expressió per a tots els 41 miRNA alterats significativament d’animals individuals i es va derivar un mapa de calor mitjançant la agrupació de medis k (figura 2, quadre esquerre). Com era d’esperar, les dades d’expressió van caure en dos grups principals, amb membres del control i del grup post dependents, respectivament. La taula 3 addicional conté la llista completa dels ARNm alterats significativament.

Image

Agrupació jeràrquica de microRNA (miRNA) i ARN de missatger (ARNm) de missatgeria de rates i controls post-dependents. Files: miRNAs o ARNm individuals; columnes: mostres individuals. Les caixes blaves que es troben a la part superior del PD amb l'etiqueta del mapa de calor representen animals post-dependents; les caixes vermelles que es troben a la part superior del control etiquetat amb el mapa de calor (Ctrl) representen animals de control. Les caixes situades a sota de les etiquetes PD i Ctrl representen números de rata individuals. El vermell dins del mapa de calor representa la subregulació de genes o miRNA i el blau dins del mapa de calor representa una baixada de genes o miRNA. Tauler esquerre: el mapa de calor conté 41 miRNAs amb diferents expressions significatives ( P <0.05). Panell dret: el full de calor conté 165 ARNm amb expressió diferent significativa ( P <0.05). Consulteu les taules suplementàries 3 i 4 per als valors de P i el canvi de plecs per a cada miRNA i ARNm mostrat aquí.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

La dependència a l'alcohol altera l'expressió de l'ARNm en l'MPFC

El perfil de l'expressió de mRNA va identificar 165 gens amb expressió alterada de manera significativa en el mPFC després d'un historial de dependència a l'alcohol ( P <0.05, canvi de plecs ± 1.2). Entre aquests, 105 gens van ser regulats significativament i 60 gens van ser desregulats significativament. La taula 4 complementària presenta la llista completa de gens modificats significativament. Els canvis de plec en l’expressió gènica van ser relativament petits (± 1, 2-1, 7), la qual cosa és coherent amb el que s’ha trobat normalment en els canvis d’expressió cerebral en trastorns psiquiàtrics, inclosa la dependència de l’alcohol. Es van agrupar els valors d’expressió per a les 165 transcripcions alterades significativament d’animals individuals i es va derivar un mapa de calor mitjançant la agrupació de mitjans k (figura 2, quadre dret). Tot i que és menys clar que l’anàlisi de clustering de miRNA, aquest procediment generalment va segregar les dades d’expressió gènica en dos clústers principals basats en el tractament (control vs post-dependent). És important destacar que 37 dels 165 gens han estat prèviament associats a l’ús d’alcohol, l’abús i la dependència (referències proporcionades a la taula complementària 4), proporcionant suport per a una importància biològica de les nostres dades matrius. Mitjançant l’anàlisi de GO, hem trobat les categories més importants associades a mielinització, canals iònics, transmissió sinàptica i plasticitat. En general, 90 dels 165 gens regulats de manera diferent, pertanyien a categories de GO significativament sobrepresentades. Les primeres 15 categories significatives i no redundants es mostren a la taula 1, i la llista completa de categories significatives es troba a la taula complementària 5. Els ARNm també es van examinar mitjançant l’anàlisi de la via de l’enginy per identificar possibles associacions dels resultats experimentals amb funcions biològiques conegudes, malalties. i vies canòniques. Es van identificar deu vies canòniques i funcions biològiques com a significatives mitjançant un test de Fisher Exact de cua dreta. Quatre d’aquests camins suggereixen processos relacionats amb la neuroadaptació: la senyalització hormonal alliberadora de la corticotrofina, la senyalització neurotrofina / TRK, la senyalització d’orientació axonal i la senyalització del receptor acoblat a la proteïna G. Tres de les funcions biològiques més importants van incloure malalties neurològiques, trastorns psicològics i desenvolupament i funció del sistema nerviós. La llista de funcions biològiques significatives (llindar significatiu = P <0.05) i vies canòniques (llindar significatiu = −log (valor P )> 1.3) es troba a la taula complementària 6.

Taula completa

Anàlisi integradora de miRNAs i ARNm

Actualment es creu que els nivells d’expressió de miRNA estan en general inversament correlacionats amb els dels seus objectius d’ARNm respectius. 14 Per detectar els patrons coordinats de canvis d’expressió de miRNA i ARNm induïts per la dependència de l’alcohol, vam realitzar una anàlisi d’aparellament d’expressió miRNA-ARNm, és a dir, vam identificar casos en què una espècie miRNA i els seus ARNm objectiu putatiu es van canviar en el sentit contrari. Hem trobat 33 miRNAs dirigits a 89 ARNm (taula 2) dins dels nostres conjunts de dades que complien aquesta condició. Els detalls de l'anàlisi de la vinculació de l'expressió es mostren a la taula complementària 7. Es va realitzar una anàlisi de GO sobre aquests 89 ARNm per examinar les seves relacions funcionals. Les categories de GO enriquides significativament ( P <0, 05; mètode Benjamini – Hochberg i FDR 20%) es denoten amb colors al costat dels ARNm (taula 2) i estan relacionades amb processos funcionals associats habitualment amb neurotransmissió, neuroadaptació i plasticitat sinàptica. Els detalls de l'anàlisi de GO es mostren a la taula complementària 5. Es va crear una puntuació composta per a cada ARNm basat en la puntuació mirSVR precomputada del seu miRNA objectiu que es troba a la base de dades miRanda (taula suplementària 7, columna AQ). La puntuació mirSVR és un mètode de regressió per predir la probabilitat de la desregulació de l'ARNm a partir de les característiques de la seqüència i l'estructura en els llocs objectiu previstos per microRNA / ARNm. 39 La puntuació composta per a cada gen representa la suma de totes les puntuacions mirSVR arxivades a través dels miRNAs observats i el factor d'inhibició potencial que un gen podria tenir a partir de múltiples ARNm. 39

Taula completa

Les 89 transcripcions potencialment regulades per miRNAs van ser sotmeses a anàlisis de la via d'enginy per explorar xarxes reguladores potencials basades en interaccions gen-gen i ARNm-miRNA descrites en la literatura. La figura 3 mostra una xarxa creada per l'algorisme Ingenuity. Aproximadament 15 de les 25 transcripcions d'aquesta xarxa estan regulades (4) o regulades (11) a la mPFC de rates post-dependents. Les funcions principals d’aquesta xarxa inclouen la replicació, recombinació i reparació d’ADN, el cicle cel·lular i la regulació de l’expressió gènica. Aquesta xarxa particular és d'interès perquè conté múltiples gens que es pensen implicats en trastorns i addiccions neuropsiquiàtriques, incloent BDNF, 40 Fos, 30, 41, 42 Per2, 43 i Arc, 44 Nr4a1, 45 Nr4a3. 46 A més, els 15 ARNm expressats de manera diferent dins d'aquesta xarxa estan dirigits a 26 dels miRNAs trobats a l'experiment de micromuntes de miRNA. Molts d’aquests miRNAs apunten a alguns dels mateixos ARNm. Això és important perquè els ARNm tenen la capacitat de treballar de manera sinèrgica o competitiva per modular l’expressió de l’ARNm. 47, 48

Image

Xarxa reguladora de gens alterats per ARNs missatgers dependents de l’alcohol (ARNm) i els seus micro-ARNs (miRNAs). ( a ) Una xarxa reguladora de gens construïda a partir de les vores (línies) de l'ARNm depenent de l'alcohol. Els nodes de connexió (gens) representen interaccions reguladores com ara la regulació de l’expressió gènica, interaccions proteïna-proteïna, interaccions proteïna-àcid nucleic i interaccions proteïna-hormona. Els gens obsolets estan indicats en vermell, sense canvis en grisos i baixats en blau. Les lletres en negreta representen gens o miRNAs confirmats per PCR. ( b ) Tretze gens a ( a ) orientats per miRNAs al conjunt de dades de matrius. * cadena de viatgers miRNA: es van obtenir puntuacions compostes d’estrelles a la taula complementària 7. Les lletres en negreta representen gens o miRNAs confirmats per PCR. Consulteu les taules suplementàries 3 i 4 per als valors de P i el canvi de plecs per a cada miRNA i ARNm mostrat aquí.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

Confirmació de dades d’expressió de micromecenatge d’ARNm i miRNA amb qRT-PCR

A partir de les anàlisis anteriors, vam triar subconjunts de miRNAs i ARNm de diferent expressió per a la verificació d’expressió diferencial mitjançant qRT-PCR quantitativa. La selecció de candidats va considerar la robustesa de les troballes de microarray i el paper suggerit a la xarxa anteriorment descrita. Els miRNAs i ARNm candidats van ser escollits per a la seva confirmació per qRT-PCR basant-se en la seva participació en vies anteriorment demostrades regulades pel consum i addicció de drogues. Els ARNm candidats també es van triar a partir de la seva unió prevista a miRNAs alterats significativament. Els resultats qRT-PCR de miRNA eren generalment consistents amb les dades de microarray (Figura 4). Per a la confirmació de l’ARNm el resultat va ser més variable. Concretament, Per2 no va assolir el llindar d’importància ( P <0.05) en l’assaig PCR, tot i que va mostrar una tendència en la direcció prevista.

Image

Resultats de rtPCR per microRNA (miRNA) (panell superior) i ARN de missatger (ARNm) (panell inferior). Confirmació de miRNA i ARNm seleccionats amb PCR en temps real. ( a, b ) Representació del llindar negatiu del cicle del delta del delta (−ΔΔCT) ± sem dels ( a ) miRNAs seleccionats o ( b ) ARNm, que expressen el canvi dels llindars de cicle del tractament als controls en comparació amb un control endogen. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001. Els gens rebaixats mostren el valor 0. Consulteu les Taules suplementàries 3 i 4 per als valors de P de microarray comparables i el canvi de plecs per a cada miRNA i ARNm mostrat aquí.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

Discussió

El resultat més destacat del present estudi va ser un canvi robust de l’expressió mundial de miRNA en el mPFC de rates després d’un historial de dependència de l’alcohol. A més, la nostra anàlisi suggereix que les xarxes d'ARNm-ARNm poden estar implicades en les neuroadaptacions associades a l'estat post-dependent i que, finalment, afecten el comportament. Aquests descobriments ofereixen objectius candidats per a futurs estudis in vitro i in vivo dirigits a determinar el paper funcional de les xarxes d’ARNm-ARNm en la funció neuronal i els comportaments relacionats amb l’addicció.

Segons el que sabem, aquest és el primer estudi que investiga l’expressió de miRNA cerebral en abstinència prolongada 49 de la dependència de l’alcohol, una etapa que en els subjectes humans dependents de l’alcohol s’associa amb l’aparició de l’anhel d’alcohol i un alt risc de recaiguda. Sobretot, els perfils miRNA d’animals post-dependents i de control segregats en cúmuls clarament separables. Aquesta observació va ser inesperada, donada experiència prèvia d’estudis transcriptius en models animals de dependència alcohòlica, que normalment han demostrat un alt grau de superposició entre animals post-dependents i animals control. 3, 4, 50, 51 La detecció d’efectes de tractament en els perfils d’expressió mitjançant enfocaments de particions variants com PCA ha estat generalment un repte en condicions neuropsiquiàtriques i models animals corresponents, inclosos els fenotips relacionats amb l’alcoholisme. 34, 52 Es preveu que la menor complexitat del conjunt de microRNA en comparació amb el transcriptoma facilitarà la partició dels perfils d’expressió mitjançant aquest tipus d’enfocaments. A més, però, les nostres dades poden indicar que l’expressió concertada de grups de miRNA més grans és més sensible als efectes alcohòlics que l’expressió de transcripcions de codificació.

Els miRNA han estat implicats en la ingesta i escalada de cocaïna, 27, 53 estimulació de la nicotina 54 i la tolerància a l'alcohol, 25 i també han estat recentment perfilats en el teixit cerebral post-mortem d'alcohològics humans. En comparació amb aquest darrer estudi, es va trobar un solapament de 9 miRNAs que es van alterar la seva expressió després de la dependència de l'alcohol tant en rates com en humans: miR-18a, miR-339-5p, miR-7, let-7f, miR-101, miR-376c, miR-152, miR-374b i miR-380. Si bé és important tenir en compte que hem trobat miRNAs superposats, no necessàriament significa que els ARNm objectius del nostre conjunt de dades siguin idèntics. Això es deu al fet que les seqüències de l'ARN 3'-UTR no estan gaire conservades entre la rata i l'ésser humà, cosa que indica que els miRNAs poden unir-se a diferents regions de la rata i el 3'-UTR de la rata i inhibir diferents transcripcions de codificació de proteïnes.

El miR-9, que va ser regulat en la mPFC de rates post-dependents en el nostre estudi, té un interès especial a la llum dels estudis recents in vitro que suggereixen la seva participació en la mediació de respostes a l’exposició aguda i crònica a l’alcohol. Es va trobar que el tractament agut de cultius neuronals organotípics amb 20 m M d’alcohol (al voltant del límit d’embriaguesa legal) durant fins a 24 h regenerava significativament els nivells de miR-9 i contribueix a la tolerància a l’alcohol, alterant la composició de subunitat del calci de gran conductància. i canal de potassi activat per tensió. No obstant això, l'exposició de 5 dies a concentracions d'alcohol més elevades, equivalents a les assolides en alcohòlics (70 m M), així com en les nostres rates, va inhibir l'expressió miR-9 en lloc 48, que està d'acord amb els nostres resultats ex vivo . Entre els objectius miR-9 potencials del nostre conjunt de dades s’inclouen Cdr2, Gpnmb, Kcna1, Mettl7a, Mobp, Myo1d, Nefm, P2rx6, Pmp22 i Vamp1, que són d’interès funcional (Taula 2). Això suggereix que miR-9 podria tenir la capacitat d’ajustar l’expressió de tota una xarxa gènica implicada en el desenvolupament de la dependència de l’alcohol. Els futurs estudis són necessaris per a dilucidar com la dependència de l’alcohol altera l’expressió miR-9 dins de les poblacions neuronals in vivo i com aquesta pot afectar les xarxes de baixada i la producció funcional.

Es van identificar múltiples ARNm amb expressió alterada en el mPFC de rates post dependents. S’ha demostrat que aproximadament 62 d’aquests 165 mRNA tenen un paper en els trastorns neuropsiquiàtrics o el consum i addicció de drogues. A més, 37 dels 165 ARNm han estat prèviament associats a consum, abús o dependència d'alcohol (per referència, vegeu la Taula suplementària 4). Els mecanismes moleculars implicats en l’ús alcohòlic crònic afecten una varietat de sistemes de neurotransmissors. 55 El consum crònic d’alcohol comporta molt probablement la remodelació de les connexions sinàptiques dins d’aquests sistemes de neurotransmissors, un procés que depèn dels canvis en l’expressió gènica. 56 A més, les adaptacions a l’alcohol poden semblar una semblança amb la plasticitat cerebral que es produeix durant l’exposició crònica a altres drogues d’abús, com ara l’heroïna i la cocaïna. 57, 58 En el mPFC de rates post-dependents, es va trobar una expressió diferencial de gens implicats en les vies de senyalització de la dopamina (Drd1a, Qdpr, Gpr88 i Prkc), serotonina (Htr2c i Qdpr) i glutamat (Homer1, Slc17a6 i Rgs12). Curiosament, hi ha un solapament substancial entre els gens que es troben aquí i una xarxa de gens comuna recent identificada que es regula en el cervell dels ratolins després d’abstinència prolongada de diversos fàrmacs d’abús incloent morfina, nicotina, tetrahidrocannabinol i alcohol. 59 A més, l’anàlisi de GO i de ruta va assenyalar de manera independent i sòlida cap a múltiples funcions relacionades amb la neuroadaptació, implicant processos de senyalització de mielinització, axó i neurotransmissor i que impliquen gens com Arc , CamkIIA , Gna12 , Homer1 , Ngdn , Prkcg , Syn2 , Syngr2 , Syt17 , Unc5b i Vamp1 . En conjunt, aquestes anàlisis suggereixen que les neuroadaptacions es produeixen en aquests sistemes neuroquímics durant l’exposició crònica a l’alcohol a l’alcohol i persisteixen en els seus després.

La regulació global exercida pels miRNAs i la seva naturalesa omnipresent poden oferir un mecanisme darrere dels amplis canvis en l'expressió gènica observats després de la dependència de l'alcohol. Molts ARNm s’expressen en neurones o glia d’una manera específica de la regió, cosa que els fa possibles candidats a regular múltiples ARNm en diferents circuits cerebrals. Alguns miRNAs identificats aquí (miR-485, miR-206, estrella miR-106b, miR-101 i miR-186; Taula suplementària 3) regulen els ARNm implicats en la plasticitat i la neurotransmissió sinàptica, cosa que pot contribuir a la reorganització de la sinàptica. inputs i neuroadaptacions a llarg termini subjacents a la dependència de l'alcohol. Utilitzant el maridatge d’expressions basat en la relació inversa entre miRNAs i els seus objectius, vam identificar nombrosos substancials de parells de miRNA putat-ARNm (taula 2). Aquesta anàlisi va assenyalar una xarxa transcripcional reguladora que implicava la senyalització BDNF.

La BDNF és una neurotrofina regulada per l’activitat amb una expressió generalitzada a tot el cervell i es creu que està implicada en la patogènesi de la depressió. 36, 60 El nostre estudi va identificar la BDNF com a objectiu de miR-206. L'anàlisi mitjançant microRNA.org va revelar dos llocs objectiu conservats per a miR-206 en el 3'-UTR de la transcripció de BDNF, les posicions 200 i 378. Una rellevància funcional d'aquesta observació es recolza en observacions anteriors que l'expressió de BDNF va ser reprimida per miR-206 en un assaig reporter de 3'-UTR, i que un inhibidor de miR-206 va ser capaç de revertir la repressió de miR-206 de l'expressió de BDNF. 61 A més, es va proposar un mecanisme depenent de la BDNF per a la regulació del consum d'alcohol en animals no dependents mitjançant estudis que van implicar ratolins nuls 62 mutants nuls heterozigots BDNF o la inhibició del receptor de BDNF TrkB. Aquestes manipulacions van conduir a un augment del consum d’alcohol i la preferència 63, 64, així com un augment de les respostes d’ansietat. 65

BDNF és un potent modulador de la transmissió sinàptica i la plasticitat de les neurones corticals. 66 Com que la senyalització BDNF es transdueix en part mitjançant l’activitat MAP-kinasa, els nivells de BDNF suprimits de mPFC poden interactuar amb una transducció del senyal MAP-kinasa desregulada, que en el present estudi va ser indicada per la família de fosfatases dual-regulada (Dusp1 i Dusp6). De fet, prèviament hem proporcionat proves de la funció alterada del MAP-kinasa en el mPFC de rates post-dependents. 30 Com a conseqüència potencial de la senyalització MAP-kinasa alterada, es va trobar una regulació inferior de diversos factors de transcripció neuronal, inclosos els membres de les famílies Egr, Fos i Nr4a. Aquests canvis poden conduir finalment a una expressió desregulada de nombrosos gens i donen com a resultat una disfunció neuronal que contribueix a canvis de comportament vistos en l'estat post-dependent. És important presentar proves que alguns dels esdeveniments moleculars descrits anteriorment ja s'han posat en marxa durant l'exposició a l'alcohol. Els ratolins exposats a una exposició crònica a l’alcohol intermitent similar al procediment que s’utilitza aquí van mostrar una baixada pronunciada de BDNF i Egr1 en la PFC. 50

També es van identificar casos mitjançant el maridatge d’expressions on els ARNm i les seves transcripcions de target objectiu es regulaven en la mateixa direcció (Taula suplementària 7). Diverses explicacions per aquesta aparent contradicció a la hipòtesi de Guo et al. Cal tenir en compte 14. Primer, els ARNm no només són reguladors potencials de la transcripció, sinó que també estan subjectes al control transcripcional per diversos factors de transcripció a través de bucles de retroalimentació complexes. Aquests bucles de retroalimentació ARNm-ARNm semblen tenir un paper en mecanismes homeostàtics com ara la regulació de la plasticitat sinàptica. 22 En segon lloc, els gens miRNA se situen sovint dins dels introns dels objectius putatius i, per tant, se sotmeten a un control transcripcional del gen host. Finalment, no podem excloure que algunes de les nostres observacions siguin simplement coincidents. Tot i això, els gens amb les puntuacions més altes de miRSVR compostos, com Bdnf , Nr4a3 i Fos , també semblen mostrar la prova més forta d’expressió diferencial en els assaigs corroboratius (qPCR per a Bdnf i Nr4a3 , hibridacions in situ per c- Fos 30 ), així que donant suport a les nostres conclusions generals.

Una limitació potencial del present estudi és que els perfils de miRNA i ARNm van ser originats en diferents animals. A causa d'una variació aleatòria individual, això pot disminuir la sensibilitat per detectar canvis coordinats en l'expressió de miRNA i ARNm. D'altra banda, els canvis que es van detectar podrien estar relacionats amb el consum post-dependent de l'escalada, cosa que es va confirmar en els dos lots d'animals. Aquest resultat comportamental important i la sensibilitat augmentada associada a l’estrès que segueix l’exposició crònica intermitent a l’etanol s’ha trobat ara en diversos laboratoris, en condicions variables d’administració d’alcohol, i tant en rates com en ratolins. 6 Una altra limitació a l’hora de valorar la rellevància funcional del maridatge d’expressió miRNA-ARNm basat en l’anàlisi d’homogenats de teixit cerebral és que no permet la resolució cel·lular. En conseqüència, es podrien produir canvis en l'expressió de miRNA i ARNm en diferents poblacions cel·lulars. A nivell cel·lular, enllaçar causalment canvis en l’expressió de miRNAs individuals a la regulació de les transcripcions objectiu requerirà experiments basats en cèl·lules. A nivell de sistemes, enllaçar causalment els canvis en l'expressió de miRNA de mPFC amb el comportament requerirà una sobreexpressió localitzada de miRNA candidats o la seva inhibició. El nostre estudi actual identifica els objectius dels candidats per a aquestes futures investigacions.

In conclusion, we have identified persistent, coordinated changes in the expression of miRNAs and their target mRNAs in the rat mPFC following alcohol dependence. The miRNAs identified target multiple mRNAs that are associated with mechanisms involved in reward pathways, neurotransmission and synaptic plasticity. The ability of miRNAs to regulate ensembles of mRNAs that control complex cellular processes in the brain in a coordinated manner suggests a possible role for miRNAs in the pathophysiology of alcohol dependence. The coordinated and long-lasting shift in microRNA and mRNA expression may restructure the function of neural circuits involved in the cognitive control that the mPFC exerts over alcohol drinking and relapse, ultimately contributing to alcohol dependence.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Taula suplementària S1

  2. 2

    Taula complementària S2

Fitxers Excel

  1. 1.

    Taula complementària S3

  2. 2

    Taula suplementària S4

  3. 3.

    Taula suplementària S5

  4. 4.

    Supplementary Table S6

  5. 5.

    Supplementary Table S7

    Supplementary Information accompanies the paper on the The Pharmacogenomics Journal website (//www.nature.com/tpj)