Síndrome de cornelia de lange: la haploinsuficiència del nipbl rebaixa la via canònica wnt en embrions de peixos zebra i pacients amb fibroblasts | mort i malaltia cel·lular

Síndrome de cornelia de lange: la haploinsuficiència del nipbl rebaixa la via canònica wnt en embrions de peixos zebra i pacients amb fibroblasts | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Desenvolupament del sistema nerviós
  • Genètica de malalties

Resum

La síndrome de Cornelia de Lange és un trastorn genètic greu caracteritzat per malformacions que afecten múltiples sistemes, amb una característica comuna de retard mental greu. Es creu que les variants genètiques dins de quatre gens ( NIPBL (com Nipped-B) , SMC1A, SMC3 i HDAC8 ) són responsables de la majoria dels casos; tots aquests gens codifiquen proteïnes que formen part del "complex de cohesina". Les cohesines presenten dos rols importants separats temporalment en cèl·lules: un de control del cicle cel·lular i l’altre implicat en la regulació de l’expressió gènica. El present estudi se centra en el paper del paralogne del mamiló del peix zebra durant el desenvolupament neuronal, examinant la seva expressió en el sistema nerviós central i analitzant les conseqüències de la pèrdua de funció del nipblb . El desenvolupament neuronal es va veure afectat per la derrota de les mamelles del peix zebra. Els embrions amb pèrdua de funció de nipblb presentaven un major apoptosi en els teixits neurals en desenvolupament, la regulació baixa dels gens de la via Wnt canònica i la baixada dels nivells de Cyclin D1 (Ccnd1). Importantment, es va observar el mateix patró de via canònica WNT i de baixada de la CCND1 en fibroblasts específics per a pacients modificats per NIPBL. Finalment, l'activació química de la via en embrions amb pèrdua de funció de nipblb va rescatar el fenotip advers i va restablir els nivells fisiològics de mort cel·lular.

Principal

La síndrome de Cornelia de Lange (CdLS) és una síndrome de malformació múltiple que implica normalment retard en el desenvolupament, característiques facials específiques, anormalitats del comportament i malformacions congènites importants. Gairebé qualsevol òrgan es pot veure afectat, però els defectes més freqüents són els que afecten els sistemes neurodesenvolupament, gastrointestinal i musculoesquelètic. Hi ha un ampli espectre d’intervencions clíniques, amb un reconeixement creixent d’un fenotip molt més lleu del que s’apreciava anteriorment. Clínicament, una característica comuna de CdLS és el retard mental que sovint s’associa amb ventricles cerebrals engrandits, aprimament o atrofia de la substància blanca, hipoplasia del tronc cerebral i hipoplasia vermell cerebral o agènesi. 1, 2, 3 Durant el desenvolupament, el sistema nerviós central (SNC) sorgeix de la placa neural que es plega sobre el seu eix anterior – posterior (AP) per formar un tub dividit en tres unitats principals: l’anlènia del prosencefàlic (avantbranc), el mesencefaló (cervell mitjà) i el romboencefàfon (cervell posterior). Caudalment, el tub es desenvoluparà a la medul·la espinal. Aquests esdeveniments coordinats s’aconsegueixen mitjançant un equilibri finament ajustat entre la proliferació cel·lular i la mort cel·lular programada. A cada regió, es genera una gran diversitat de tipus de cèl·lules neuronals, cadascuna amb identitats diferents quant a la seva morfologia, trajectòria axonal, especificitats sinàptiques i neurotransmissors. 4 Aquesta especificació fonamental està controlada per gradients dorsoventral (DV) i AP de molècules. Per exemple, es coneix que components de la família Wnt indueixen estructures anteriors (com ara el cervell), mentre que les proteïnes morfogenètiques òssies són responsables de la neurogènesi del tub neural dorsal. 5

Genèticament, CdLS és causada tant per mutacions autosòmiques com de lligades i X. Aproximadament, el 60% dels casos es deuen a defectes genètics en un dels quatre gens: NIPBL (com a Nipped-B) , SMC1A, SMC3 i el recent identificat HDAC8 . 1, 6 gen NIPBL va ser el primer que es va associar associat a CdLS. SMC1A es va identificar posteriorment com un gen addicional la disrupció del qual produeix les troballes fenotípiques del CdLS, mentre que es va informar d'un cas CdLS que tenia una mutació en SMC3 . Es va trobar que el HDAC8 va ser mutat en pacients amb SDCS , de forma coherent amb el seu paper en el control de l'estat d'acetilació de SMC3 . Més recentment, s’han trobat mutacions en RAD21 , una proteïna estructural del complex de cohesina, en nens amb un espectre de discapacitats que s’encavalcaven amb la síndrome de CdLS, presentant deterioracions cognitives més lleus i coherents amb l’anomenada coesinopatia. Tots aquests gens codifiquen les proteïnes implicades en el "complex de cohesina".

El complex de cohesina es conserva evolutivament des dels fongs fins a les cèl·lules humanes, i el seu paper canònic és la regulació de la separació de cromàtides durant la divisió cel·lular. En particular, el complex de cohesina controla la cohesió cromàtida germana durant la fase S. A les cèl·lules somàtiques dels vertebrats, s’han identificat quatre subunitats centrals que formen el complex: SMC1 (SMC1A o SMC1B), SMC3, SCC1, i SA1 o SA2. Associades al complex del nucli, altres proteïnes ajuden durant la divisió cel·lular, per exemple, NIPBL, que sembla facilitar la pujada del complex, o WAPL, que permet la dissociació complexa. 8

Recentment s’ha observat un paper no canònic, pel qual el complex de cohesina també representa un regulador clau de l’expressió gènica. A Drosophila , s'ha demostrat que l' ortòleg NIPBL (és a dir, Nipped-B ) participa en l'activació a llarga distància de l'expressió gènica de tall i Ultrabithorax . 9 Al peix zebra ( Danio rerio ), les cohesines regulen els factors de transcripció de runx i l'hemopoesi. Curiosament, sembla que funcionalment, el control del cicle cel·lular i la regulació de l’expressió gènica estan separats temporalment. Per exemple, els mutants de Drosophila per a ortòlegs de gens del complex de cohesina mostren un defecte en la retracció d’axons que es produeix fisiològicament en les neurones post-mitòtiques, per tant en les cèl·lules que han sortit del cicle cel·lular. 11 En el peix zebra, les cohesines s’expressen en cèl·lules proliferadores i no proliferades, 12 mentre que els ratolins heterozigots per Nipbl presenten greus defectes de desenvolupament i alteren l’expressió gènica generalment en absència de cicle cel·lular o deficiència cromàtida germana. 13

Un model de deficiència nipbl en peixos zebra mostra una expressió alterada de gens implicats en la diferenciació endodèrmica juntament amb un espectre de defectes cardíacs, intestins i òrgans viscerals que presenten una sorprenent similitud amb els observats en pacients amb SDCS. En el present estudi, hem utilitzat dos enfocaments combinats, embrions de peixos zebres i cèl·lules derivades de pacients, per tal de disseccionar mecanismes moleculars subjacents als trastorns del neurodesenvolupament. En primer lloc, es van caracteritzar els efectes de la pèrdua de funció del nipblb en el SNC en desenvolupament del peix zebra, en particular a nivell del cervell posterior. Els resultats obtinguts d'estudis funcionals en embrions de peixos zebra es van confirmar després en fibroblasts de pacients amb CdLS amb mutació coneguda en NIPBL.

Resultats

El peix zebra s’expressa al SNC

D'acord amb la literatura, 12, 14 nipblb es van expressar ubiqüament durant la somitogènesi primerenca en embrions de peixos zebra. L’expressió va disminuir progressivament al tronc i va aparèixer localitzada específicament al SNC a 24 CV (hores després de la fecundació) (figura 1a). Tal com es veu en aquesta visió dorsal, es va detectar l'expressió de nipblb (figura 1b) en el dienfàfal i mesencefaló i va destacar la progressió de l'obertura del ventricle posterior. Les seccions longitudinals i transversals histològiques dels embrions de 24 CV han demostrat clarament que el nipblb s’expressa al llarg de tots els eixos dorsal-ventral (DV) i AP del SNC (figures 1c i d). La colocalització amb krox20 , un marcador dels rombombes III i V, 15 va demostrar que l'expressió del nipblb es va estendre caudalment fins al romomòmere V en aquesta fase de desenvolupament (figura 1e).

Image

Anàlisi d'expressió de nipblb. ( a - d ) VOLS amb sonda específica de nipblb a 24 CV. ( a ) L'embrió de muntanya sencera que mostra l'expressió modulada de la branca al llarg de l'eix AP. c i d indiquen la posició de les seccions histològiques reportades a c i d, respectivament. ( b ) Vista dorsal (anterior a l’esquerra) de les diferents regions d’expressió del nipblb al SNC. ( c ) Secció transversal del tub neural que demostra que la transcripció de les mamelles s'expressa de manera omnipresent al llarg de l'eix DV. ( d ) Secció longitudinal que mostra l'expressió nipblb al llarg de l'eix AP. ( e ) Comparació entre expressions nipblb (en blau) i krox20 (en vermell) que mostren que el nipblb s’estén posteriorment fins al rombo V a 24 CV. di, diencefal; m, cervell mitjà; h, cervell posterior; ot, otocistis. Barra d’escala, 100 μ m

Imatge a mida completa

La inhibició de la funció Nipblb en embrions de peixos zebra afecta el desenvolupament del SNC

Els embrions injectats amb nipblb -morpholino (MO) van començar a presentar defectes a 24 CV, inclosos defectes cerebrals (50% del nipblb -MO injectat, total n = 200, figures 2a i b). En particular, els embrions amb pèrdua de funció de nipblb eren microptalmics i microcefàlics. A més, els embrions injectats per nipblb -MO es van presentar amb una cua curta i corba (40% del nipblb -MO injectat, n = 180 total, figura 2b), un fenotip descrit anteriorment per Muto et al. 14 després de la pèrdua de funció del nipblb . L’ eficàcia i l’especificitat de nipblb -MO es van verificar mitjançant experiments de western blot en què els nivells de proteïna Nipbl es van reduir en un 39% en els embrions injectats per nipblb -MO a 24 CV, en comparació amb els embrions de control ajustats en fase (figures 2c i d).

Image

Tope MO de nipblb . ( a i b ) Morfologia d’embrions vius a 24 CV. ( a ) Embrions injectats amb el ctrl-MO. ( b ) Embrions injectats amb el nipblb -MO presentant defectes cerebrals i una cua corbada. ( c ) El Nipbl es redueix en 39 embrions injectats per MO en un 39 ± 0, 04% en comparació amb els controls (expressats com a mitja d'anàlisis densitomètriques triplicades normalitzades contra controls). ( d ) Western blot de proteïna extreta d’uns 30 embrions mínims per grup experimental que mostren nivells reduïts de Nipbl (316 KDa) en dos lots diferents d’embrions injectats per nipbob-OO de 24 CV en comparació amb els controls en la mateixa etapa de desenvolupament. La banda inferior és beta-actina (50 KDa)

Imatge a mida completa

La regulació descendent del nipblb afecta la supervivència cel·lular, però no la proliferació cel·lular

En comparació amb els controls, els embrions injectats per nipblb -MO van mostrar una mort cel·lular programada augmentada al SNC a 24 CV, mentre que l’apoptosi va ser menys acusada en els SNC dels embrions de control (figures 3a-d). Curiosament, la tinció de TUNEL va demostrar que les cèl·lules apoptòtiques eren més evidents en els teixits que expressaven el gen nipblb (compareu la figura 1a i les figures 3b-d). Estudis anteriors en peix zebra van descriure l’apoptosi depenent de p53 després del derrocament de la cohesió smc3 i la regulació de p53 en mutants per a la subunitat de ràdio de cohesió . 16, 17 És ben sabut que les molècules de MO podrien provocar efectes fora de destinació indesitjables com l’activació de la proteïna p53. És important destacar que la reversió de la mort de cèl·lules depenent de p53 per la derrota de p53 no va afectar la mort cel·lular provocada per una pèrdua de funció específica del gen. 18 Per verificar que l'apoptosi en embrions injectats per nipblb -MO es va deure a la pèrdua específica de funció d'aquest gen i no a conseqüència de l'activació de p53, vam co-injectar p53 -MO amb nipblb -MO. En els embrions injectats per p53 -MO + nipblb -MO, la quantitat de cèl·lules apoptòtiques era comparable a les embrions amb pèrdua de funció de nipblb , que van comprovar que l’apoptosi neural es va produir específicament per enderrocar el nipblb ( n = 42) (figura suplementària S1) . Aquests resultats suggereixen que el nipblb és necessari per a la supervivència cel·lular durant la neurulació en embrions de peixos zebres.

Image

L’apoptosi s’incrementa en el SNC dels embrions amb pèrdua de funció de nipblb . ( a i b ) Les cèl·lules apoptòtiques etiquetades amb TUNEL es van incrementar fortament a ( b ) embrions injectats per NEBB -MO a 24 CV en comparació amb els embrions de control ( a ) en la mateixa etapa de desenvolupament. ( c i d ) Les seccions transversals van indicar la mort cel·lular predominant al tub neural dels embrions injectats per ( d, fletxa) nipblb -MO en comparació amb els controls ( c ). nt, tub neural. Barra d’escala, 100 μ m

Imatge a mida completa

Per determinar si la pèrdua de funció del nipblb també altera la velocitat de proliferació, es van tacar embrions amb l'anticòs antigen nuclear de cèl·lules proliferatives. Tal com s’esperava d’estudis publicats anteriorment sobre la pèrdua de funció de la cohesina, 10, 19 vam trobar que l’entrada a la fase S no estava compromesa, ja que el nombre d’antigen-cèl·lules nuclears proliferatives d’antigen positiu en embrions injectats per OEM a 24 hpf no era augment significativament en comparació amb els controls (figura suplementària S2).

La pèrdua de funcions del nipblb altera l'expressió de la ruta de senyalització Wnt

A causa de l'expressió de nipblb a tot el SNC, hem investigat més si la formació de AP de SNC es va alterar en els embrions amb pèrdua de funció de nipblb a 24 CV. L’expressió de marcadors d’identitat d’AP, com hoxb2a , 20 pax2a, 21 i krox20 , 15 no es va alterar en embrions injectats per nipblb -MO (figura suplementària S3), cosa que suggereix que el SNC està modelat correctament. Tanmateix, vam trobar que l’expressió wnt1 22 es va veure greument alterada en el nucli posterior dels embrions injectats per OEM-nipblb a 24 CV (80%, total dels embrions analitzats n = 120; Figures 4a i b). Es va poder observar fenotips de caiguda del nipblb amb diferents graus de fusió del senyal wnt1 al cervell posterior entre el romomòmer II i la medul·la espinal: el fenotip més sever incloïa una fusió completa dels senyals del cervell posterior del wnt1 (20%, n total = 120), el fenotip intermedi va expressar múltiples punts de fusió wnt1 al llarg de l’eix del cervell posterior AP (40%, n = 120 total), i el fenotip menys greu presentat com a un únic punt de fusió wnt1 o com una obertura incompleta del ventricle (20%, total n = 120, figures 4a i b).

Image

L' expressió wnt1 està específicament mal regulada en el cervell posterior dels embrions injectats per nipblb -MO. ( a i b ) expressió wnt1 en controls i embrions injectats per nipblb -MO a 24 CV. Alteració de l’expressió wnt1 en el cervell posterior dels ( b ) embrions injectats per NEBBB -MO a 24 CV en comparació amb els controls ( a ) en la mateixa etapa de desenvolupament. Els asteriscs indiquen múltiples punts de fusió wnt1 al llarg de l’eix del cervell posterior AP dels ( b ) embrions injectats per NEBBB -MO. ( c i d ) l'expressió axin2 que mostra defectes comparables del patró en embrions injectats per nipblb -MO ( d ) en comparació amb els controls ( c ). Barra d’escala, 100 μ m

Imatge a mida completa

Per investigar si els defectes observats eren específics per a la mala regulació de l’expressió wnt1 després de la pèrdua de funció del nipblb o eren causats per defectes morfològics en la formació del cervell posterior , es va analitzar l’expressió de atoh1 , un marcador dels progenitors dorsal del cervell i l’obertura del ventricle. L’ expressió 23 atoh1 no es va alterar en els embrions injectats amb nipblb -MO a 24 CV (90%, total n = 50; Figures suplementàries S4A i B), que demostren que el patró anatòmic del cervell en desenvolupament no es veu afectat per la pèrdua de funció del nipblb .

Com que els defectes del patró de tubs neurals podrien interrompre la diferenciació neuronal, es va examinar la població dopaminèrgica (neurones positives de la tirosina-hidroxilasa) a 24 hpf després de la pèrdua de la funció del nipblb . És ben sabut que la formació de neurones dopaminèrgiques mesencefàliques està dirigida no només per senyals difusibles del notoord, de la placa del sol i de l’organitzador istmic com Shh i Fgf, sinó també per Wnt1 i altres factors extrínsecs. En els embrions amb pèrdua de funció nipblb, es va trobar que la neurodiferenciació d’aquesta població no estava afectada negativament (figures suplementàries S4C i D).

És important observar que es van observar alteracions comparables en la distribució gènica observada a wnt1 en el patró d’expressió axin2 , un component clau a l’aigua de la via que s’utilitza normalment com a lectura de la cascada (figures 4c i d).

Perfil d’expressió dels gens objectiu de la via WNT / beta-catenina en pacients amb fibroblasts i embrions injectats per nipblb-MO

En els embrions de peixos zebra, la pèrdua de la funció de nipblb va donar lloc a alteracions de la via Wnt / beta-catenina, modelant els defectes moleculars subjacents a pacients amb CdLS mutada amb NIPBL. Per tant, hem intentat analitzar el perfil d’expressió d’aquesta via de senyalització en fibroblasts de pacients, comparant-ho amb el de cèl·lules obtingudes a partir de controls sans relacionats amb l’edat, l’ètnia i el sexe. Es creu que els fibroblasts representen un model vàlid per a la deficiència de cohesina en humans 6, ja que en estudis sobre expressió gènica, es van observar perfils alterats consistents en cultius primaris de fibroblasts i línies de cèl·lules limfoblastoides. 6

Es va poder excloure la participació de la via no canònica, ja que tant DVL1 com DVL2 26 són comparables en pacients i grup de control (Figures suplementàries S5A i B). L'anàlisi de l'expressió de dianes directes de la via canònica, com Cyclins, mitjançant PCR quantitativa (q-PCR) va mostrar una tendència cap a la reducció de la ciclina D1 ( CCND1) en pacients amb NIPBL, en comparació amb controls sans (Figura 5a). Com se sap que les ciclines poden compensar la deficiència d'altres isoformes en mamífers, 27 també hem analitzat la ciclina D2 ( CCND2) i hem trobat que es trobava regulada significativament ( P <0, 01) (figura suplementària S5C). Consistentment, es va observar una reducció mitjana dels nivells de CCND1 de gairebé el 50% en mostres de pacients en comparació amb controls sans (figura 5c, figura suplementària 5D). També es va trobar que Ccnd1 estava regulat significativament en els embrions injectats per nipblb -MO mitjançant q-PCR (Figura 5b), anàlisi de blot occidental amb una disminució de l'expressió Ccnd1 en un 42% (Figura 5d) i hibridació in situ de muntatge complet (WISH ) anàlisis (figures 5e i f). Aquest últim va demostrar que l'expressió de ccnd1 es va alterar en els embrions injectats per nipblb -MO a 24 CV en comparació amb els controls (40%, n = 30).

Image

La via canònica Wnt està regulada en models animals i humans de CdLS. ( a i b ) Anàlisi en temps real de humans ( CCND1) i peixos zebra ( ccnd1 ) en ( a ) fibroblasts específics dels pacients i en ( b ) embrions injectats per NIPBB -MO que mostren una tendència de reducció de les transcripcions en ambdós models (asteriscs a b representen P <0, 01). ( c i d ; g i h ) Anàlisis de blot occidental. Quantificació de l'expressió relativa de proteïna després de la normalització en beta-actina. La quantificació es va fer en tres experiments (peixos zebra) o dos (humans) independents i les dades s’expressen com a canvi de plecs sobre controls relatius amb errors estàndard. ( c i d ). La reducció de CCND1 es confirma en els nivells de proteïnes en cèl·lules ( c ) derivades de pacients ( C ) amb CdLS i en embrions injectats amb O-nipblb ( d ). ( e i f ) L'anàlisi WISH mostrant disminució dels nivells d'expressió de ccnd1 en els embrions injectats per NEBBB -MO ( f ) en comparació amb els embrions de control ( e ) en la mateixa etapa de desenvolupament. ( g i h ) Es van reduir els nivells d’ABC tant als models CdLS, és a dir, humans ( g ) com peixos zebra ( h ), en comparació amb controls específics. L’asterisme en h representa P <0, 05. ( e i f ) Vista dorsal, anterior a l'esquerra

Imatge a mida completa

A més, es va trobar una mitjana de reducció del 18% de la forma activa de beta-catenina (ABC) 28 en pacients en comparació amb els controls després de la normalització (figura 5g, figura suplementària 5D). El mateix patró es va observar en embrions injectats per nipblb -MO amb una reducció estadística significativa dels nivells d’ABC del 80% (Figura 5h).

Rescat del fenotip de deficiència de nipblb per inducció química de la via canònica Wnt

Com les nostres dades suggereixen que el fenotip advers causat per la derrota de nipblb en embrions de peixos zebra i en pacients amb fibroblasts es va veure mediat per l’atenuació de la via canònica Wnt amb una disminució posterior de l’expressió Ccnd1, es va buscar rescatar el fenotip en nipblb -pèrdua -funció embrions per inducció química de la via Wnt mitjançant tractament amb clorur de liti (LiCl). La concentració utilitzada en tres conjunts d'experiments no va produir efectes visibles en embrions de control (mínim 30 per experiment), però va poder revertir de manera impactant els defectes induïts per la injecció de nipblb- MO (mínim 30 per experiment). En particular, les estructures cefàliques van mostrar una morfologia restaurada i el patró de distribució wnt1 és similar al dels embrions de control (Figures 6a – c). Els nivells d’apoptosi determinats per la tinció de TUNEL es van reduir després del tractament de LiCl en embrions injectats per nipblb -MO fins a nivells comparables als d’embrions de control (Figures 6d-f). L’anàlisi de Western Blot d’embrions injectats per nipblb -MO tractats amb LiCl va demostrar que es va induir la via canònica Wnt, ja que els nivells d’ABC es van incrementar per quatre vegades en comparació amb els controls i més de 10 vegades en comparació amb els embrions injectats per nipblb -MO (Figures 6g– i). Ambdues diferències eren estadísticament significatives. En particular, els nivells de proteïna Ccnd1 després del tractament amb LiCl es van induir més de 3, 7 vegades en comparació amb els embrions injectats per nipblb -MO i un augment de 2, 4 vegades en comparació amb els controls. (Figures 6h – j).

Image

Es pot rescatar defectes moleculars i morfològics en el model de peix zebra CdLS mitjançant tractament LiCl. ( a - c ) Vista dorsal (anterior a l'esquerra) d'embrions de planta plana que mostren una expressió wnt1 alterada en embrions injectats per bip-O ( b ) amb múltiples punts de fusió (asteriscs) en comparació amb els controls ( a ) i restaurats expressió wnt1 a l’ atenció normal en embrions injectats per nipblb -MO tractats amb LiCl ( c ). ( d i f ) Vista lateral d’embrions sencers tenyits amb TUNEL test que demostra que el tractament amb LiCl ( f ) rescata els defectes cefàlics morfològics i redueix el nivell d’apoptosi anormal ( e ) restablint nivells fisiològics comparables als embrions control ( d ). ( g - j ) Western blot anàlisis que demostren que els nivells de proteïnes ABC ( g - i ) i Ccnd1 ( h - j ) augmenten fortament els embrions tractats amb LiCl injectats per nipblb -MO en comparació amb els embrions injectats per nipblb -MO. La quantificació del blot occidental es va fer en tres experiments independents (peix zebra), i les dades s’expressen com a canvis de plecs en embrions injectats per Libl i MOB i embrions tractats amb LiCl injectats per nipblb -MO per controls amb errors estàndard. Els asteris en g representen * P <0, 05 o ** P <0, 01

Imatge a mida completa

Discussió

En aquest estudi, es van utilitzar dues estratègies de modelització diferents per analitzar anormalitats subjacents a CdLS, centrada en NIPBL, que és el gen més mutat en pacients afectats per la malaltia. 1, 30 Es va utilitzar inicialment un estudi de desenvolupament in vivo mitjançant embrions de peixos zebra per identificar vies gèniques que podrien contribuir al fenotip, seguit d'un estudi de validació en el qual posteriorment es van provar cultius primaris de pacients amb fibroblastos amb SDC.

Primer es va avaluar l'expressió de nipblb al SNC dels embrions del peix zebra a 24 CV, el moment en què el procés de neurulació està gairebé finalitzat. Això alleuja una bretxa de dades existent en la literatura, ja que s’havia informat anteriorment el patró d’expressió del pitblil peix zebra en diferents etapes de desenvolupament. 12, 14 Els resultats van mostrar un patró dinàmic d’expressió regulat espaciotemporalment, amb una localització específica al nivell dels teixits neurals cefàlics. Es va informar que l’altre neteja del peix zebra paralog amb un patró d’expressió similar i una funció en els òrgans viscerals en desenvolupament. 14

Mitjançant la tecnologia MO, es va generar un model d’haploinsuficiència en embrions de peixos zebres. Aquest model imita la haploinsuficiència genètica dels pacients amb CdLS amb mutació en NIPBL. Els embrions amb pèrdua de funció del nipblb van mostrar alteracions greus de la morfologia del cap, amb diversos graus de microcefàlia, microptalmia i desenvolupament incomplet d’aquestes estructures cefàliques.

Aquest fenotip advers es correlaciona amb l’augment d’apoptosi a les zones on s’expressa normalment el nipblb, cosa que suggereix que les cohesines tenen un paper funcional important en la supervivència cel·lular de teixits específics durant el desenvolupament dels vertebrats. Al nostre sistema, la taxa de proliferació semblava no afectada. Curiosament, la distribució d’expressions de diversos marcadors de desenvolupament d’AP semblava comparable als embrions de control. La distribució wnt1 , d’altra banda, es va veure significativament deteriorada a nivell del cervell posterior, els pons prospectius, medulla oblongata i cerebel, en mamífers. Vam descartar que les alteracions de l’expressió wnt1 van ser causades per anormalitats en l’anatomia de les estructures en desenvolupament ja que atoh1 , que l’expressió abasta tot l’aspecte dorsal i lateral de l’anglatge cerebelós, es va distribuir correctament en els embrions injectats per nipblb -MO. 31, 32 La localització wnt1 , però, no va poder restringir-se als teixits laterals d’aquests embrions. Això és coherent amb les dades anteriors que indiquen la presència del patró anterio-posterior subjacent en absència de senyals Wnt. 33, 34, 35

Es va trobar que la via canònica Wnt va ser alterada en embrions injectats per MONBB i en pacients amb fibroblasts. En ambdós casos, s'ha abregut la ABC. Ccnd1, un objectiu directe conegut de la ruta, va ser, per tant, desregulat en ambdós models. És evident que el fenotip cefàlic anormal observat en embrions injectats per nipblb -MO és fortament reminiscent de l'observat després de l'atac a Ccnd1.

Utilitzant LiCl com a conegut activador químic de la via Wnt, 34, 36 que regula negativament la inhibició de GSK3 β de la beta-catenina, 37 va ser possible rescatar el fenotip advers en embrions injectats per nipblb -MO a tots els nivells: cefàlic anatòmic les estructures apareixien morfològicament normals, els nivells programats de mort cel·lular es van restablir als nivells fisiològics vistos en els controls i es van augmentar els nivells de proteïna Ccnd1. Curiosament, el patró d’expressió wnt1 va aparèixer rescatat en embrions injectats amb OME mitjançant tractament LiCl, cosa que suggereix que en el nostre model, l’esdeveniment advers principal es troba al nivell del complex Gβ3-Beta-catenina i que la compensació química genera una retroalimentació negativa. al control d’expressions wnt1 . De fet, s'ha rebut una retroalimentació negativa mitjançant la regulació generalitzada d' Axin2 en un model de càncer. 38

El nostre model de peix zebra CdLS suggereix un paper per a la pertorbació canònica de la via Wnt en anormalitats del SNC. En un model murí de microcefàlia recessiva autosòmica, les alteracions cerebrals es produeixen per disminució dels nivells d’expressió de gens regulats pel Wnt1 i la sobreexpressió de beta-catenina a les cèl·lules neuronals podria rescatar els defectes. 39 Diversos models animals amb alteracions en l’expressió gènica relacionada amb Wnt mostren un fenotip parcialment solapat: es va trobar que la coneguda mutant masterblind ( mbl ), que desenvolupa una reducció del telencefaló, vesícules òptiques i un patró d’anormalitat de l’AP és una axina espontània1 . mutant. Des de llavors, diversos mutants (per exemple, Hesx1 , Six3 i Tcf3 ), 40, 41, 42 i peixos zebra 43, 44 han estat descrits amb fenotip comparable al patró AP del SNC durant el desenvolupament embrionari. En humans, HESX1 i SIX3 s’han trobat causants d’hipopituitarisme i displàsia septo-òptica, 45, 46, un trastorn del desenvolupament caracteritzat per defectes greus al cervell i als ulls. El 1996, un informe de casos va descriure una autòpsia de pacients amb 5 anys d'edat CdLS que va revelar una hipoplasia dels sistemes òptics, nuclis hipotàlemos, corpus callosum i vermis cerebelosos. A més, el septum pellucidum, el fornix i la comissió anterior eren rudimentaris. Aquest cas mostrava característiques de la displàsia septo-òptica combinada amb la displàsia commissural i la hipoplasia vermell cerebel·lar. 47

Se sap que la disminució dels nivells de senyalització de Wnt1 dóna lloc a la baixada de Ccnd1 que condueix a l’apoptosi en diversos models animals. 48, 49, 50 És important tenir en compte que en els mamífers, hi ha una compensació parcial per la subregulació de Ccnd2, 27 tal com es va observar al nostre sistema cel·lular. També se sap que la sobreexpressió β GSK3 indueix una major apoptosi in vivo pertorbant la proliferació i la maduració, provocant la pèrdua de neurones immadures. La reducció dels nivells de lligand Wnt o l’eliminació del component de via canònica beta-catenina comporta menys cèl·lules mare neuroepitelials / radials glials i una diferenciació neuronal precoç en embrions de ratolí. 52

A més, s'ha demostrat que en els models murins de trastorns com l'autisme, el fenotip més destacat és un augment de la mort cel·lular programada en el cerebel en desenvolupament. 53, 54 En pacients amb CdLS, es coneixen alteracions en el desenvolupament d’estructures cerebeloses a nivells anatòmics, però anàlisis més robustes amb ressonància magnètica podrien ajudar a desvelar l’enllaç entre les característiques de l’autisme, convulsions i el desenvolupament del SNC alterat en aquests pacients.

L’augment d’apoptosi en el nostre sistema in vivo ens va portar a la hipòtesi que, almenys fins a cert punt, el retard mental i el comportament semblant a l’autisme associats habitualment a pacients amb SDCS podrien tenir les seves arrels en aquesta anomalia. L’autòpsia 47 reportada va mostrar una reducció del nombre de cèl·lules de Purkinje al cerebel i les nostres dades podrien implicar un desequilibri del control de la mort cel·lular durant el desenvolupament com a causant.

Diverses evidències suggereixen una possible regulació de la via Wnt per les cohesines en cèl·lules no dividides en diferents models. En els fibroblasts de la pell que expressen una forma mutada de HDAC8, WNT5A , WNT2 , WISP2 i FZD8 es trobaven regulats a la baixa en comparació amb cèl·lules de tipus salvatge. 6 A Drosophila, SMC3 sembla important per controlar l'expressió de Flamingo / Starry night (Fmi / Stan) dels ortòlegs del vertebrat Celsr , que es coneix per transduir la cascada de senyalització Wnt a la via no canònica per controlar la polaritat cel·lular. 55 És interessant assenyalar que aquesta regulació pot ser bidireccional, ja que en el càncer colorectal, la coneguda regulació de la beta-catenina sembla controlar l'expressió de SMC3 . 56

En conclusió, aquest treball mostra per primera vegada, segons sabem, una regulació de la via canònica Wnt per cohesines durant el desenvolupament en embrions de peixos zebra i en fibroblasts de pacients amb CdLS. Això suggereix un potencial mecanisme subjacent per a les anormalitats del desenvolupament observades en el SNC dels pacients amb CdLS.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Taules complementàries

  2. 2

    Figura Legendes complementàries

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària S1

  2. 2

    Figura suplementària S2

  3. 3.

    Figura suplementària S3

  4. 4.

    Figura suplementària S4

  5. 5.

    Figura suplementària S5

Glossari

CdLS

Síndrome de Cornelia de Lange

Ccnd1

Ciclina D1

Ccnd2

Ciclina D2

CNS

sistema nerviós central

AP

anterior – posterior

DV

dorsoventral

DESITJAR

Hibridació in situ a muntanya completa

RPMI

Sèrum Roswell Park Memorial Institute

q-PCR

RT-PCR quantitativa

TBST

solució salina amb tampon tris / Tween 20 buffer

ABC

forma activa de beta-catenina

Fmi / Stan

Flamenc / estrellada

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)