Dirigir la teràpia cel·lular a llocs diana anatòmics in vivo amb ressonància magnètica | comunicacions de natura

Dirigir la teràpia cel·lular a llocs diana anatòmics in vivo amb ressonància magnètica | comunicacions de natura

Anonim

Temes

  • Teràpies cel·lulars
  • Imatges per ressonància magnètica
  • Recerca en cèl·lules mare

Aquest article s'ha actualitzat

Resum

La teràpia basada en cèl·lules explota cèl·lules humanes modificades per tractar malalties, però la seva aplicació dirigida en teixits específics, especialment en els que es troben al fons del cos on no és possible la injecció directa, ha estat problemàtica. Aquí utilitzem un sistema d’imatge per ressonància magnètica (IRM) per dirigir macròfags que porten un virus oncolític, Seprehvir, a llocs de tumors primaris i metastàtics en ratolins. Per aconseguir-ho, etiquetem magnèticament macròfags amb nanopartícules de òxid de ferro super-paramagnètics i apliquem gradients de camp magnètic polsat en la direcció dels llocs del tumor. La orientació per ressonància magnètica guia els macròfags de la circulació sanguínia cap als tumors, donant com a resultat una major infiltració de macròfags del tumor i una reducció de la càrrega i la metàstasi del tumor. El nostre estudi indica que els escàners magnètics clínics no només poden rastrejar la ubicació de cèl·lules marcades magnèticament, sinó que també poden tenir potencials per dirigir-les a un o més teixits objectiu.

Introducció

Els avenços en la nostra comprensió dels mecanismes moleculars que fonamenten les malalties principals han propiciat el desenvolupament d’una àmplia gamma de teràpies basades en cèl·lules per lliurar un agent terapèutic com una proteïna o virus, o una cèl·lula mare modificada i repobladora 1 . Quan la malaltia no està limitada a un lloc del cos o es troba en un teixit inaccessible per injecció directa de cèl·lules, aquestes teràpies basades en cèl·lules s’han d’administrar de manera sistèmica.

Estudis anteriors han demostrat que les partícules o cèl·lules magnètiques carregades amb nanopartícules d’òxid de ferro super-paramagnètics (SPIOs) poden ser injectades de forma sistèmica i atraure a un teixit diana en ratolins mitjançant l’aplicació d’un imant extern local 2, 3, 4, 5, 6 . De fet, prèviament hem demostrat que els macròfags humans carregats amb SPIO podrien atreure’s de la circulació a tumors en ratolins mitjançant aquest enfocament7. Tot i això, aquest enfocament només es pot aplicar als teixits objectiu superficials. Si bé es podien obtenir gradients de camp magnètic localitzats en teixits més profunds utilitzant stents ferromagnètics implantats 8, això requereix una cirurgia invasiva.

Un enfocament alternatiu emocionant és l’orientació per ressonància magnètica (MRT) que utilitza les bobines de gradient de camp magnètic inherents a tots els sistemes d’imatge per ressonància magnètica (IRM), per dirigir les partícules ferromagnètiques (o cèl·lules que les contenen) cap al lloc objectiu 4 . Abans hem demostrat que la RM es podia utilitzar per dirigir cèl·lules mononuclears en sang perifèrica humana marcades amb ferro en un model vascular 7, i primers estudis sobre porcs van demostrar aquest concepte dirigint una bola d’1, 5 mm amb una distància de 5 cm dins de la caròtida dreta. artèria de l’animal utilitzant els corrents de bobina de gradient d’un sistema estàndard MRI 1, 5 T 9, 10 .

Les cèl·lules derivades de medul·la òssia s’utilitzen cada cop més en teràpies basades en cèl·lules per a malalties com el miocardi infartat, lesions medul·lars 12, isquèmia cerebral 13 i malalties degeneratives com la malaltia de Parkinson 14, la malaltia d’Alzheimer 15 i el càncer 16, 17, 18 . En aquesta darrera malaltia, nombrosos assajos clínics han administrat cèl·lules derivades de la medul·la òsmica de forma sistèmica en un intent de tractar tumors malignes, incloent cèl·lules T 19, 20, cèl·lules dendrítiques 21, macròfags 22, 23 i cèl·lules mare 24 . Tanmateix, només una petita proporció d’aquestes cèl·lules es localitzen posteriorment al lloc del tumor, amb moltes trobades posteriorment en altres teixits. Aquesta manca d’orientació no només redueix l’eficàcia terapèutica, sinó que també augmenta el risc d’efectes secundaris.

Quan es va trobar que els macròfags s’acumulen en gran quantitat en àrees hipòxiques / necròtiques avasculars d’aquests teixits en ratolins i humans 17, 25, 26, vam suggerir que aquestes cèl·lules es podrien utilitzar per lliurar agents terapèutics com els virus oncolítics (OVs) a aquests malament. àrees vascularitzades, i per tant relativament inaccessibles, de tumors 17 . En el present informe, mostrem que la MRT es pot utilitzar per augmentar el nombre de macròfags carregats en VO en tumors primaris i metastàtics en ratolins. És important destacar que la MRT va augmentar notablement els efectes antitumorals d'aquesta viroteràpia macròfags. Els nostres resultats suggereixen que és possible utilitzar un escàner MRI estàndard per dirigir les cèl·lules no invasivament tant a tumors primaris com secundaris, i, en teoria, aquest enfocament es podria utilitzar per dirigir qualsevol teràpia basada en cèl·lules al seu lloc objectiu ( s) dins del cos.

Resultats

MRT de cèl·lules magnètiques en esferoides tumorals tridimensionals

Abans d'aplicar les tècniques de MRT in vivo , primer vam establir que un sistema de RMN preclínic de 7 T equipat amb una bobina de 600 mT m 11 (limitada a ∼ 300 mT m 1 per a aquest estudi) podria generar forces substancials d'actuació en magnètic. macròfags in vitro dirigint-los a través d'una capa endotelial cap a esferoides tumorals multicel·lulars humanes tridimensionals (MTS). Per fer-ho, hem dissenyat una cambra de flux de migració transendotelial (TEM) en la qual els macròfags humans circulaven per la superfície d’una membrana perforada recoberta d’una capa de cèl·lules endotelials vasculars humanes, imitant així el flux en les venules tumorals. Els MTS es van cultivar en una cambra no adherent a sota de la membrana (Fig. 1a). Els macròfags humans infectats amb una adenovirus reportadora de proteïnes fluorescents verdes (GFP) (Ad-CMV-GFP) van ser carregats amb SPIOs (1, 18 ± 0, 3 μg ml −1 ) 7 i després van passar a través de la membrana en MTS quan es va col·locar la cambra a l'isocentre. d’un sistema RMN preclínic. La captació de SPIO no va afectar la viabilitat dels macròfags (Fig. 1b).

Image

Hem dissenyat una cambra de flux que pot acollir esferoides tumorals tridimensionals (3D), així com una capa endotelial vascular. Per tant, les "cèl·lules magnètiques" que flueixen hauran de creuar la barrera vascular abans d'entrar en un tumor 3D simulant el pas de cèl·lules a través de les cèl·lules endotelials en una paret del vas sanguini ( a, panell esquerre). La cambra de flux TEM es col·loca a l’isocèntric d’un escàner MRI amb un camp magnètic homogeni de 7 T de forma esfèrica (6 mm de diàmetre). Es va aplicar un gradient polsat (50% de màxim) amb una força de 300 mT m 1 en la direcció (- y ) del gradient. El camp magnètic heterogeni resultant (camp D / B i d) pot dirigir partícules magnètiques cap a les esferoides tumorals per augmentar la presa ( a, plafó dret). La viabilitat de les cèl·lules després de la captació de SPIO no es va veure compromesa com es va valorar per la citometria de flux per a la captació de iòdur de propidi ( b ). L'absorció es va confirmar amb una distorsió a la imatge de la RM i una pèrdua de senyal en comparació amb quan no es va aplicar cap MRT ( c, panell superior). A les imatges fluorescents corresponents d’esferoides sencers infiltrats amb macròfags que porten un adenovirus reportador (Ad-CMV-GFP) es mostra a ( c, segon quadre). Barra d’escala, 100 μm. La citometria de flux d'esferoides disperses enzimàticament va revelar que el nombre de cèl·lules magnètiques que es infiltraven esferoides (% de totes les cèl·lules presents en esferoides que eren CD14 +) va augmentar significativament quan es va aplicar un gradient ( c, panells inferiors). Totes les imatges i dades (mitjans ± sem) provenen de sis experiments independents. Les comparacions entre els grups es van realitzar mitjançant la prova t de dos estudiants de dos cues que no es compara amb *** P = 0, 0001, en comparació amb cap grup de MRT.

Imatge a mida completa

Els experiments de MRT van utilitzar un gradient de camp magnètic polsat (2 ms, 7 m de despesa, 50% de resistència ∼ 300 mT m 1 (ref. 4)) durant 1 h en direcció als esferoides (Fig. 1a) amb una compensació efectiva de camp magnètic addicional, B fora ∼ +1, 5 mT al lloc del MTS. En condicions de control, les mostres van estar exposades al camp magnètic de l'escàner, però els gradients no van ser polsats. Després de la MRT, vam trobar una pèrdua de senyal amb pes T 2 * que indica una major concentració de ferro en comparació amb les mostres de control de mostres de MRT ( n = 6) (Fig. 1c, panell superior). Els macròfags que expressaven GFP també eren clarament visibles dins del MTS (Fig. 1c, segon quadre) i l’anàlisi del flux va confirmar encara més l’aprofitament de macròfags amb macrofags CD14 + / iòdur infiltrant significativament més viables - que expressen macròfags amb MRT (29, 7 ± 2, 6%) que sense ( 2, 9 ± 1, 8%; fig. 1c, panell inferior).

La MRT millora la presa de tumor de cèl·lules magnètiques in vivo

A continuació, es va investigar si un sistema de gradient IRM es podia utilitzar per dirigir macròfags magnètics a tumors in vivo (Fig. 2). Es van administrar tres milions de macròfags carregats amb SPIO per via intravenosa a ratolins que portaven tumors de pròstata ortotòpics primaris i metastàtics (pulmó). Es va aplicar un gradient 4 de camp magnètic polsat durant 1 h, en direcció a la pròstata (Fig. 2a), amb un desplaçament de camp magnètic eficaç, B off ∼ +7 mT a la part superior del camp magnètic estàtic de l'escàner ( B 0 = 7 T). El grup de control va estar exposat al camp magnètic estàtic de l'escàner en absència dels gradients de direcció (sense MRT).

Image

( a ) Esquema de regions orientades que utilitzen gradients d'imatge per a MRT. Hem aplicat un gradient a- y a parts iguals a l’animal per orientar-nos a la ubicació de la pròstata tal com es mostra (caixa vermella). A continuació, es van administrar tres milions de macròfags marcats magnèticament a ratolins mitjançant injecció de iv i es van col·locar ratolins anestesiats a l'isocentre d'un escàner de RMN de 7 T. Els subjectes es van dividir en dos grups amb n = 5 ratolins per grup. El grup 1 es va imaginar al cap de 1 h (sense MRT). El grup 2 es va sotmetre a un MRI. Post mortem, vam confirmar l’augment dels nivells de captació de macròfags humans mitjançant ( b ) l’anàlisi FACS de tumors tractats amb col·lagenasa 1 h després de l’orientació per RM, i ( c ) la tinció histològica de seccions de tumors incrustades en cera de parafina amb un anticòs anti-CD68 humà i El blau prussià (els macròfags CD68 positius són marrons i els macròfags SPIO positius, els blaus: vegeu fletxes). Les imatges RARE representatives de cinc ratolins per grup i mapes R2 per a cada grup es mostren a d i a. T, tumor; barra d’escala, 200 μm. ( f ) El nombre de vasos perfusats en tumors en ratolins que van passar per MRT comparat amb ratolins sense MRT es va determinar per perfusió amb tomàquet de lectina (verd). Les fletxes apunten a les zones amb fuites vasculars. Mitjana ± sem, P = 0, 75, test t de l'alumne; anàlisi de tumors de n = 5 ratolins per grup i 5-10 camps de vista (FOV) per tumor. El volum total de la vasculatura fuga no difereix entre els tumors dels dos grups de ratolins (mitjana ± sem; P = 0, 6, test de t de l’alumnat; anàlisi de tumors de tres ratolins per grup i 5-10 FOV per tumor). Barra d’escala, 34 μm.

Imatge a mida completa

El MRT de forma significativa (test t independent de l’alumnat, P = 0, 0001) va augmentar la presa de macròfags carregats amb SPIO en tumors de pròstata primaris (42, 2 ± 2, 5%) en comparació amb el grup control que no es va sotmetre a MRT (7, 17% ± 0, 8) (Fig. 2b ). A més, es va observar que aquests macròfags humans SPIO + es van distribuir a través dels tumors amb molt pocs signes d’agrupament cel·lular a la vasculatura tumoral després de la MRT, tal com es va veure mitjançant l’etiquetatge de seccions seqüencials de tumors amb un anticòs contra CD68 humà (un marcador de macròfag pan) i una taca histològica de ferro (blau prussià) (Fig. 2c). Això també es va confirmar amb una tinció d’immunofluorescència on les cèl·lules tumorals s’etiqueten amb l’anticòs anti-GFP (verd) i els macròfags humans infiltrats del tumor amb anti-CD68 (vermell) (figura suplementària Fig. 1a). La direcció RMN dels macròfags no va afectar negativament la vasculatura tumoral (figura suplementària Fig. 1b); es va examinar la morfologia i la integritat de cada vas sanguini CD31 + en cadascun dels cinc tumors d’aquests dos grups i no es van trobar diferències entre ells. No es van poder observar signes d’interrupció de les cèl·lules endotelials ni es van detectar signes de coagulació de la sang (per exemple, l’agregació de plaquetes) ni a la part abluminal dels vasos sanguinis després de l’orientació de la RM. En l'adquisició ràpida en diversos ecos amb imatges de ressonància magnètica de la millora de la relaxació (RARE), hi ha poca diferència entre els MRT i els grups MRT (Fig. 2d). Això és molt probable a causa del contingut de ferro en voxel. Tanmateix, una diferència marcada entre els subjectes injectats amb SPIO i els no injectats és evident en les imatges de temps de ressò llarg (TE) ponderades en T2, amb la pèrdua d’intensitat del senyal dins del tumor que indica la presència d’altes concentracions de ferro (Fig. 2e ). En un esforç per avaluar l'increment de la presa de macròfags magnètics in vivo , es va utilitzar una relaxometria de ressonància magnètica per mesurar la velocitat de decadència de relaxació transversal de la ressonància magnètica en els tumors dels dos grups. Les mesures de R 2 van ser de 21, 8 s −1 per al grup MRT i de 18, 8 s -1 per al grup control. Per a la comparació també s'inclou una taxa de càlcul normal del teixit R 2 sense la presència de SPIOs (10, 5 s −1 ). L’augment de la taxa de càlcul de R 2 va indicar un augment de captació de ferro per al grup MRT, cosa que suggereix que és possible avaluar la captació amb RMN, tal com s’observa amb l’anàlisi post mortem (figura suplementària Fig. 1c). La diferència de valors de R 2 dirigits i no objectius es va utilitzar per estimar el TE òptim per analitzar diferències de senyal amb seqüències de resonància magnètica basades en eco-spin (TE de 60 ms). Mitjançant aquest TE, MRT condueix a una disminució del 10% en el senyal respecte dels controls coincidents.

Entre els controls addicionals es van incloure ratolins portadors de tumors: (i) amb macròfags no etiquetats i MRT i (ii) amb macròfags no etiquetats sense MRT. Per a aquests grups de control, es van detectar molt pocs macròfags dins dels tumors, tal com es confirma per la RM (Fig Suplementària Fig. 1d) i la citometria de flux de tumors dispersos enzimàticament (figura suplementària Fig. 1e). Cal destacar, pràcticament, no es van detectar macròfags CD68 + humans en altres teixits incloent el fetge (<2% de totes les cèl·lules per secció de teixit), la melsa (<1%) i els ronyons (cap detectat) (figura suplementària Fig. 2).

Per investigar més si el lliurament de macròfags als tumors per MRT va interrompre la funció o la integritat de la vasculatura tumoral, es va determinar la perfusió i la permeabilitat vasculars mitjançant la lectina de tomàquet intravenós i la tinció de Ricinus communis agglutinina I, respectivament. No hem pogut detectar diferències en el nombre de vaixells perfusats o les fuites vasculars entre els grups no MRT i + MRT (Fig. 2f). Això es va confirmar estimant la permeabilitat vascular a l’àcid gadolini-dietilenetriaminepentaacètic (Gd-DTPA) mitjançant una ressonància dinàmica reforçada per contrast (Fig. 3).

Image

Es mostren mapes representatius de l'agrupació de gadolini per a cada grup de ratolins on n = 3 ratolins per grup. Es mostra la posició de les llesques (grogues) de les quals es van extreure les imatges de la RMN: una per als ronyons i l’altra pel tumor ( a ). En tots els casos, les imatges ponderades per T1 mostren una intensitat de senyal més alta als ronyons ( b ; panell superior) que en els tumors de pròstata ( b ; plafó inferior), on el gadolini es va agrupar dins del sistema urinari dels ratolins després de l'administració. ( c ) Es van tenir regions d'interès en el ronyó, el tumor i el teixit muscular i es mostra l'anàlisi de sèries horàries de l'agrupació d'agents de contrast per al grup MRT i el grup "sense MRT" coincident amb el temps. Tant el múscul com el teixit tumoral no mostren cap canvi aparent en la intensitat del senyal de ressonància magnètica en el temps en comparació amb el ronyó, proporcionant més proves que la vasculatura s’ha mantingut intacta després de la teràpia MRT. Totes les dades són mig ± entre n = 3 ratolins per grup.

Imatge a mida completa

MRT de cèl·lules magnètiques per metàstasi pulmonar

La MRT té una aplicació particular quan els tumors són difícils o impossibles d’eliminar quirúrgicament, com en el pulmó, el cervell, el fetge o la medul·la espinal i poden permetre el lliurament de teràpies basades en cèl·lules a tumors primaris o metastàtics en aquests llocs. En un segon experiment in vivo , es va utilitzar MRT per dirigir macròfags marcats amb SPIO als pulmons dels nostres ratolins que porten tumors de pròstata metastàtics (Fig. 4). Això es va realitzar immediatament després de l'administració de 3 milions de macròfags iv. Els ratolins no exposats a MRT, però exposats al camp magnètic de l'escàner durant el mateix temps, es van utilitzar com a controls.

Image

Es van utilitzar gradients magnètics de pols curt per dirigir macròfags carregats SPIO cap als pulmons. ( a ) L'anàlisi FACS dels pulmons tractats amb col·lagenasa va mostrar que els macròfags CD14 + humans eren molt més significatius en els pulmons amb que no tenia MRT. Anàlisi de tumors de n = 3 ratolins per grup on les dades són mitja ± sem, la prova t- P * 0, 01 de l'estudiant en comparació amb els pulmons objectius de ressonància no magnètica. ( b ) Es mostren imatges representatives de n = 3 ratolins per grup, la qual cosa va revelar un augment d'immunostaining per al CD68 humà i el blau prussià a les seccions pulmonars (les cèl·lules CD68 + són marrons i les cèl·lules SPIO + blaves: vegeu fletxes). Barra d’escala, 75 μm. Això també es va confirmar en seccions tenyides d’immunofluorescència mitjançant un anticòs anti-GFP / verd i CD68 / vermell (barra d’escala, 75 μm, M, metàstasi i fletxes apunten a cèl·lules positives CD68). ( c ) La immunologia amb CD31 (barra d’escala, 50 μm) i hematoxilina i eosina (barra d’escala, 200 μm) van indicar que la ressonància magnètica el lliurament dirigit de macròfags magnètics als pulmons no va tenir cap efecte advers sobre la vasculatura pulmonar en comparació amb el lliurament sense apuntar. Les dades representatives es mostren a partir d’un dels dos experiments de rèplica en què n = 3 ratolins per grup. es mostren els sem i la test P t de 0, 75 comparativa amb la ressonància magnètica dirigida a la ressonància magnètica amb els pulmons orientats a ressonància no magnètica.

Imatge a mida completa

L'anàlisi citomètrica de flux de pulmons dispersos enzimàticament va mostrar la presència de macròfags CD14 + significativament més humans després del MRT que en el grup control (17, 7% ± 4 enfront del 4, 4% ± 2, 6, respectivament) (Fig. 4a). Això també es va confirmar per la tinció histològica i d’immunofluorescència dels pulmons, on es van detectar macròfags CD68 + humans a prop o a prop dels petits dipòsits metastàtics presents als pulmons de ratolins després de la MRT (Fig. 4b; Fig. 3a). Aquests macròfags també es tenien positius pel blau prussià (ferro) (Fig. 4b) i el seu contingut en ferro també era visible després de la tinció d’hematoxilina i eosina (figura suplementària Fig. 3b). Es va inspeccionar la morfologia dels vasos sanguinis CD31 + als pulmons després de la seva presa de macròfags marcats amb SPIO amb o sense MRT (Fig. 4c). A causa de la curta T2 / T2 * del teixit pulmonar, no es va poder imaginar el parènquima pulmonar amb tècniques convencionals de RMN 1 H a un camp elevat per a la validació in vivo de la captació augmentada. Els futurs desenvolupaments tècnics poden fer possible, per exemple, l'ús de gasos hiperpolaritzats als espais aeris es podria utilitzar com a mètode de detecció de senyal de ressonància magnètica indirecta 28 . No obstant això, en diferents òrgans o teixits tous, o en sistemes clínics, hi pot tenir lloc la imatge T2 *.

La MRT dels macròfags oncolítics redueix el creixement del tumor

En un experiment final per avaluar els beneficis terapèutics del MRT, es van administrar macròfags carregats amb SPIO armats amb el VO, Seprehvir (HSV1716) a ratolins portadors de tumors. La replicació HSV1716 és recolzada per cèl·lules canceroses de pròstata 29 de PC3 i aquí mostrem, per primera vegada, oncolisi en cèl·lules LNCaP tant en condicions hipòxiques (0, 5% O 2 ) com normòxiques (20% O 2 ) (Fig. 4a). El serevvir es reprèn fàcilment pels macròfags i, mentre que l’absorció és significativament més alta en condicions de cultiu normòxic (figura suplementària Fig. 4b), la replicació viral és major en hipòxia i la mort de cèl·lules macròfags és igual d’efectiva en un entorn hipòxic (figura suplementària Fig. 4c, d). En el nostre model in vivo , els ratolins portadors de tumor van rebre una sola injecció iv de macròfags portadors d’OV (macròfags derivats de monòcits (MDM) + OV), es van col·locar al camp estàtic de l’escàner sense MRT 'MDM + OV (no MRT) ', o estaven exposats a l'escàner amb MRT (MDM + OV + MRT). A l'efecte de la comparació, es va administrar OV "lliure" a un grup de ratolins separat. Grups addicionals de control de ratolins van rebre 100 μl de tractament salí (control) o 3 milions de macròfags no tractats (MDM) iv OV (1 × 10 7 unitat formadora de plaques 29 només van retardar significativament el creixement del tumor primari fins a 7 dies en comparació amb els ratolins que van rebre PBS o només MDM (Fig. 5a). Aquest efecte es va perllongar significativament amb el lliurament de Seprehvir mediat per macròfags ( P <0, 006 el dia 14 i P <0, 007 el dia 21), es va utilitzar una anàlisi unidireccional de la variància seguida de la prova post- Bonferroni. per a anàlisis estadístiques) i van coincidir amb els nostres estudis anteriors en què els macròfags que portaven VO eren més efectius que en infusió viral sols 17.18 . És important notar que no es van observar diferències en els ratolins que van rebre MDM + OV, però no van estar exposats a la RMN i al MDM + OV. (sense MRT) on aquest últim està exposat a l'escàner, però sense cap direcció, no obstant això, la MRR de la nostra viroteràpia macròfag no només va ser millor a reduir el creixement dels tumors primaris a partir del dia 7 en endavant, sinó que també va retardar el regrupiment del tumor primari. h per a tot l’experiment (Fig. 5a). La bioluminescència de ratolins que van rebre teràpia OV macròfag amb o sense MRT el primer dia de tractament (dia 0) i al final de l’experiment (dia 21) va mostrar aquesta marcada reducció del tumor primari (Fig. 5a, b). Això es va confirmar visualment a les RMN (Fig. 5c). A més, els tumors sotmesos a MRT després d’OV lliurats per macròfags eren significativament més necròtics que els que no rebien MRT (Fig. 5d).

Image

Els ratolins portadors de tumors es van administrar amb una única dosi de macròfags derivats de monòcits humans (MDMs) portadors del virus oncolític, HSV1716 (MDM + OV). Aquests es van dividir en tres grups de ratolins (cadascun amb cinc ratolins per grup). Un grup es va sotmetre a MRT a la glàndula prostàtica o als pulmons (MDM + OV + MRT) durant 1 h, un altre va estar exposat a l’escàner d’MRI però sense MRT (MDM + OV no MRT) i el tercer (MDM + OV) no introduïu l'escàner de ressonància magnètica Grups addicionals de ratolins van rebre 100 µl de PBS (control), una dosi única d’1 × 10 7 unitat formadora de plaques HSV1716 (OV) o 3 milions de MDM no tractats. Els ratolins es feien imatges setmanalment mitjançant el sistema d’imatge de l’IVIS i, després de 21 dies, es van treure tumors i pulmons i es van processar per histologia. ( a ) La lluminositat del tumor en n = 5 ratolins per grup va mostrar que la MRT millorava significativament l'efecte de l'OV-MDM sobre el creixement del tumor. ( b ) Imatges i fotografies representatives de l'IVIS de tumors primaris després de diversos tractaments. ( c ) Les imatges RARE representatives de MDM + OV amb o sense MRT mostren una diferència marcada en la mida del tumor al començament i al final de la teràpia. Les imatges representatives de les seccions tenyides d’hematoxilina i eosina de n = 5 ratolins per grup mostren ( d ) l’àrea de necrosi ( N ) en els tumors primaris i ( e ) el nombre de metàstasis (vegeu fletxa, M, metàstasi) als pulmons. de ratolins que reben MDM + OV amb o sense MRT. Barra d’escala, 200 μm ( d - e ). Les dades mostrades són mitjans ± sem de n = 5 ratolins per grup. Per a la metàstasi pulmonar, es va realitzar una anàlisi quantitativa en 10 camps d’alta potència (× 20 ampliació) per secció de teixit. Les comparacions entre més de dos grups es van realitzar mitjançant l'anàlisi d'unidireccional de la variància seguit d' un test de Bonferroni post hoc . * P <0, 05; ** P <0, 001; *** P <0, 0001 en comparació amb MDM + OV + MRT amb MDM + OV (no MRT) i ^ P <0, 05 i ^^ P <0, 001 es comparen MDM + OV (no MRT) i el grup OV gratuït.

Imatge a mida completa

Als pulmons, es van detectar poques metàstasis en ratolins injectats amb PBS o MDM sols ja que els ratolins van haver de ser sacrificats el dia 14 (a causa de la gran mida dels seus tumors primaris). Per tant, no era vàlid comparar les metàstasis d’aquests grups control amb els altres grups experimentals. Tanmateix, tal com es mostra a la figura 5e, el nombre de metàstasis pulmonars es va reduir notablement en els ratolins que van rebre ressonància magnètica objecte de macròfags portadors de OV que en els que van rebre les cèl·lules però no MRT.

Discussió

En aquest estudi, demostrem que un escàner d’MRI es pot utilitzar per dirigir de forma no invasiva les cèl·lules tant a tumors primaris com secundaris dins del cos i això comporta una millora significativa del resultat terapèutic. A més, les mesures de relaxometria suggereixen que es pot utilitzar una RMN estàndard per controlar l'eficàcia d'aquesta teràpia. Mentre que aquest estudi s'ha centrat en el lliurament de cèl·lules als tumors, la tecnologia es podria utilitzar per orientar qualsevol cèl·lules (per exemple, cèl·lules mare mesenquimals i així successivament) a un teixit determinat del cos incloent tipus de cèl·lules no fagocítiques, que podrien magnetitzar-se. 'utilitzant anticossos conjugats per SPIO dirigits contra proteïnes a la seva superfície cel·lular (Fig. 6).

Image

( a ) Les cèl·lules utilitzades per a aquests estudis provenen de monòcits aïllats de la sang del pacient. Aquestes cèl·lules es cultiven davant de diversos estímuls per produir macròfags “terapèutics” (per exemple, citocines, gens terapèutics o virus) i es carreguen amb SPIO abans de la reinfusió de nou al mateix pacient. ( b ) El subjecte es col·loca al centre d’un escàner magnètic magnètic on es poden utilitzar gradients magnètics de codificació espacial lineal per induir una força sobre un cos magnetitzat. Les cèl·lules magnètiques injectades al flux sanguini del subjecte circulen i s’orienten a l’òrgan / teixit malalt sota la influència del camp magnètic aplicat. Les trames del mapa de camp demostren que les bobines de gradient MRI poden generar gradients significatius de camp en diverses direccions. El camp magnètic resultant (camp d / B i d) pot dirigir les cèl·lules magnètiques cap al teixit malalt per augmentar la presa de cèl·lules.

Imatge a mida completa

L’ús de MRT, que explota els gradients de camp magnètic dins dels sistemes d’MRI per augmentar el lliurament de cèl·lules, s’adapta idealment al teixit profund o superficial 7 . La qüestió de la traducció clínica depèn de la capacitat de proporcionar la mateixa força d’orientació a un sistema d’MRI clínica. Els escàners clínics, amb sistemes de gradient de camp magnètic d’alt rendiment de 300 mT m −1, ja estan en ús i, per tant, poden produir forces similars 30 . A més, vam poder imaginar les distribucions de cèl·lules seguint MRT, indicant la possibilitat d’orientar la imatge en temps real mitjançant un sistema d’MRI. Aquests resultats mostren el valor potencial de la MRT amb imatges simultànies per millorar l’orientació de cèl·lules per a la teràpia.

Mètodes

Aïllament i cultura dels macròfags humans

Tots els pacients que donaven sang van donar el seu consentiment informat al Servei de Transfusió de Sang de Sheffield i tots els procediments han estat aprovats pel Comitè d’Ètica de la Universitat de Sheffield. Les cèl·lules mononuclears es van aïllar dels revestiments bufons esgotats amb plaquetes (Blood Transfusion Service, Sheffield, Regne Unit) mitjançant Ficoll-Paque Plus (Amersham Pharmacia, St Albans, Regne Unit).

En resum, 50 milions de monòcits es van col·locar en matràs de cultiu de teixits T75 (NUNC, Regne Unit) i després de 2 h es van eliminar cèl·lules no adherents. La resta de cèl·lules adherides es van cultivar durant 7 dies a IMDM (Lonza, Regne Unit) complementat amb 2 mmol l −1 L -glutamina, 100 U ml −1 penicilina, 100 μg ml −1 estreptomicina i 2% sèric Ab humà (Lonza).

Cultius de cèl·lules endotelials

Les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana es van obtenir de Promocell (Heidelberg, Alemanya) i es van utilitzar en els experiments fins al pas 8. Les cèl·lules (150.000) es van sembrar durant 24 hores sobre membranes recobertes de col·lagen (0, 1 mg ml −1, tipus humà IV). que conté una membrana de polietilè tereftalat de poros de 5 μM (Neuroprobe).

Esferoides tumorals multicel·lulars humans

La línia cel·lular de càncer de pròstata humana, LNCaP (ATCC CRL-1740), es va sembrar (5 × 10 3 ) en un medi de 100 µl a cada pou d'una placa de cultiu de teixit de 96 pous amb una agarosa del 2% (Sigma, Dorset, Regne Unit). Al cap de 7-10 dies, cada pou contenia un esferoide tumoral amb un diàmetre mitjà de 700 a 800 μm.

Infecció de macròfags primaris

Els MDM del dia 3 es van infectar amb un adenovirus deficient de replicació (CMV-AdV5-GFP) a la multiplicitat de la infecció (MOI) 100. Es va aïllar l'adenovirus eliminat per E1A / B, CMV-AdV5-GFP (impulsat per un promotor de CMV). a partir d’una sola placa, expandida en 293 cèl·lules renals embrionàries humanes. Tots els virus es van purificar per doble centrifugació de gradient de cesi i es van titolar mitjançant assaig de placa en 293 cèl·lules amb el títol expressat com a unitats formadores de placa per cèl·lula. La MOI utilitzada en aquest estudi abans es va optimitzar en macròfags i es descriuen a la referència. 17.

Captació cel·lular de nanopartícules magnètiques per macròfags

Els MDM (infectats amb Ad-CMV-GFP) es van cultivar durant la nit amb 100 μg ml 1 SPIOs (25 nm) (Sigma-Aldrich, Poole, Regne Unit). L’acumulació de SPIO a les cèl·lules es va avaluar prèviament per citometria de flux i es va confirmar per l’atracció de les cèl·lules cap a un imant situat al costat del plat de cultiu tal com s’observa per microscòpia lleugera (Leica Microsystems UK Ltd). La viabilitat de les cèl·lules després de la captació de SPIO per macròfags també es va mesurar mitjançant la citometria de flux i es va comparar amb cèl·lules que no van ser incubades amb SPIOs utilitzant iodur de propidi de colorant ADN (Sigma). Les comparacions realitzades mitjançant la prova t d’ un estudiant no aparellat van revelar cap diferència estadísticament significativa entre els dos grups P = 0.4 (Fig. 1b) N = 3.

Anàlisi de flux transendotelial in vitro

La cambra TEM es va muntar com es mostra a la figura 1a. MDM carregat amb SPIO (1, 5 × 10 5 cèl·lules per ml en PBS + 2% FCS) va fluir sobre la monocapa de cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana a fluxos venosos típics (1.1885, ml min -1 ) a una tensió pura d'1.4 dyn cm. −2, això equival al flux sanguini a través de les vènules post-capil·lars. La cambra TEM es va col·locar directament a l’isocèntric a una distància distal de 5 mm d’un imant de 7 T (Bruker BioSpecAVANCEII, ales de 310 mm, sistema MRI B / C 70/30). El flux a la cambra era en la direcció z (dins i fora del forat de l'imant). Hem utilitzat gradients polsats de 2 ms i de 7 ms, tal com es descriu per Reigler et al. 4 . Per orientar els SPIO a la cambra que conté esferoides tumorals, vam aplicar un gradient pulsat i- al 50% de força per evitar un sobreescalfament (∼ 300 mT m −1 ) durant 30 min. Post MRT, un ressonador de 1 H de volum (Bruker, 300 MHz, 1 kW màxim, diàmetre exterior 118 mm per diàmetre interior 72 mm) va permetre la captura d’imatges ràpides d’angle baix (FLASH) i RARE MRI.

A continuació, es va avaluar la infiltració esferoïdal per MDMs mitjançant un microscopi fluorescent per detectar les cèl·lules positives GFP i la citometria de flux mitjançant esferoides disperses enzimàticament. Per determinar el contingut de ferro dins dels macròfags carregats amb SPIO, els pellets cel·lulars es van solubilitzar en un 70% d’àcid nítric durant 7-14 dies abans de l’anàlisi. Les concentracions de ferro es van quantificar amb una solució de ferro estàndard de calibració (Fischer Scientific) mitjançant espectroscòpia d’emissions atòmiques mitjançant Varian Vista-M PX.

Anàlisi citomètrica de flux

Les suspensions d’un sol ús es van obtenir mitjançant trypsinització de MDM (inclosos els MDM co-transduits). A continuació, es van incubar les cèl·lules durant 30 min a 4 ° C amb un anti-CD14 de ratolí, 1: 100 en PBS que contenia 1% d’albúmina sèrica bovina (Sigma) per evitar la unió d’anticossos inespecífica. Com a alternativa, es van digerir esferoides mitjançant un 0, 25% de trypsina / EDTA per separar les cèl·lules tumorals i els macròfags infiltrats i es va analitzar la mort cel·lular mitjançant citometria de flux afegint iodur de propidi (Sigma) a les cèl·lules immediatament abans d’executar-se en el citòmetre de flux.

Model de xenograft de pròstata ortotòpic

Tots els procediments del ratolí es van realitzar d’acord amb les regulacions de l’Oficina de la llar del Regne Unit segons la Llei de Animals sobre Animals (Procediments científics) de 1986 i el número de llicència de projecte adjudicat en què es van realitzar aquests protocols és PPL: 40/3424. A més, l'òrgan de revisió ètica i de benestar animal de la Universitat de Sheffield va aprovar tots els experiments in vivo utilitzats en aquest estudi. En aquests estudis es van utilitzar ratolins atímics CD1 masculins (entre 7 i 8 setmanes, número de borsa 000711) (Charles Rivers, Regne Unit). Animals were randomized before beginning the treatment schedule and were kept in ventilated cages with food and water provided ad libitum . Animal group sizes were calculated by power analysis. In general, a maximum of five animals per group were used unless otherwise stated. One million LNCaP:LUC:GFP cells (a gift from Professor Magnus Essand, Uppsala Sweden) were mixed 1:1 in Matrigel and injected into the dorsolateral prostate. Tumour size was determined by administering luciferin (Molecular Probes) followed by bioluminescent IVIS imaging and measuring the daily weights of the mice. Tumour uptake was monitored by bioluminescence imaging using the IVIS Lumina II imaging system (Caliper Life Sciences). This detects live luciferase-labelled tumour cells, enabling real-time monitoring of tumour growth and spread in the mice. The mice were injected intraperitoneally with 90 mg kg −1 D -luciferin (Caliper Life Sciences) dissolved in sterile water and anaesthetized using 2.5% isoflurane (Abbott Scandinavia AB) in 100% oxygen at 3.5 l min −1 (for induction) in the anaesthesia chamber of the imaging system. Mice were transferred to the dark box and isoflurane was lowered to 1.5%. Images were taken every 3 min as a sequence of 10 images for every group of mice, once a week. Automatic contour regions of interest were created, and the tumour sizes (or tumour radiance) were quantified as photons per second per square centimetre per steradian. Progression and spread of tumours were evaluated by calculating the tumour radiance values from inoculated mice in each group. Tumour-bearing mice were used in experiments ∼ 14 days following implantation or 21 days in the metastases model when the pulmonary tumours develop following orthotopic implantation of the tumour cells into the prostate 17 . Mice not developing tumours were excluded from the experiments (10 10 photons per second, or 15 mm in diameter) or any pain/suffering/distress sufficient to impede natural behaviour were culled.

Use of the MRI scanner to direct cell movement

Three million MDMs with or without SPIOs were administered via tail vein in 100 μl volume of PBS ( n =5), control groups received 100 μl PBS ( n =5) or 100 μl PBS containing 3 × 10 6 macrophages without SPIOs ( n =5). Immediately after MDM administration, mice were anaesthetized with gaseous isoflurane (Abbott, UK) and then secured within a magnet-compatible holding capsule and MRT was carried out immediately using a 7 T small bore magnet with a 660 mT m −1 gradient insert (Bruker BGA 12-S).

Mice were split into two groups of n =5. Group 1 was a time-matched control without MRT and group 2 underwent 1 h of MRT with gradients pulsed 2-ms on, 7-ms off at 50% total strength (300 mT m −1 ); and applied direction selected for coarse steering to the tumour site for the prostate (− z and − y ) (Fig. 2a). For steering to the lungs (+ z and − y gradients), the absence of an x gradient should ensure even distribution of magnetic particles in each lung.

The force on magnetically labelled cells is dependent on whether the SPIOs have become magnetically saturated. When unsaturated, the force is dependent on the magnetic susceptibility of the SPIOs, the magnetic field and also the magnetic field gradient 31 . However, once the SPIOs reach saturation, the force is no longer dependent on the magnetic susceptibility of the particle but the saturation magnetization and as such only the magnetic field gradient will affect the force applied to the cells 7 . SPIOs typically reach magnetic saturation well below 1 T, for example, in Riegler et al. 6, where the SPIOs become saturated at around 300 mT, therefore, MRT is feasible on clinical MRI systems provided the same magnetic field gradient is used ∼ 300 mT m −1 .

Following MRI steering, high-resolution RARE (retention time (TR)=4.2 s, TE=12 ms, RARE factor 8, 512 × 192, no averaging, 9 slices 1-mm thick) and gated FLASH (TR=8.9 ms, TE=1.2 ms, 24 reps, 128 × 128, flip angle (FA) 15°) images of the tumour (prostate only) were captured using a 1 H volume resonator (Bruker, 300 MHz, 1 kW max, outer diameter 118 mm/inner diameter 72 mm). Once complete, relaxometry using multi-slice multi-echo (TE 10 ms, echo spacing 10 ms, 16 echoes, TR 2 s, matrix size 256 × 256) and multiple gradient echo (TE 2.5 ms, echo spacing 3.7 ms, 12 echoes, TR 10 s, matrix size 128 × 128, FA 90°) was performed to assess the transverse relaxation rates. After treatment, animals were killed and tissues, including tumours, kidney, liver, lungs and spleen, were either paraffin wax embedded and fixed for immunohistochemistry or analysed by flow cytometry to determine macrophage uptake (see Supplementary Files for details).

Vascular permeability

A further study was performed to assess vascular permeability in mice. Mice were administered with 3 million SPIO-loaded MDM one group underwent MRT and the other remained in the scanner as described above. Immediately after targeting mice were injected iv with a 100 μl mixture of FITC-conjugated Lycopersicon esculentum (tomato) lectin (1 mg ml −1 ; Vector Laboratories) and Ricinus communis agglutinin I (2.5 mg ml −1 ; Vector Laboratories). Perfusion-fixation with 4% paraformaldehyde was performed 10 min following lectin administration. Harvested tissue was post-fixed in 4% paraformaldehyde, processed through graded sucrose and embedded in OCT medium (Tissue-Tek). Sections at ∼ 40 μm were counterstained with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (0.05 mg ml −1, Invitrogen) and confocal image stacks were acquired by confocal microscopy (Nikon). Measurement of vascular volumes was performed on images from tumour-bearing mice with and without MRT targeting ( n =3 mice per group and 5–10 fields of view).

In addition, vasculature leakage was also assessed using the contrast agent Gd-DPTA 31, 32 . Mice receiving SPIO-loaded MDM with and without MRT were removed from the scanner and injected (via tail vein) with a 0.1 mmol Kg −1 dose of Gd-DPTA (Magnevist) ( N =3 mice per group). Mice were then returned to the scanner and T1-weighted imaging (TR=100 ms, TE=3.7 ms, FA=30 degs, matrix size=256 × 256) was performed for 15 min (50 repetitions) post injection. Data were used to assess pooling of the contrast agent over time as an indicator of a leaky, damaged vasculature. Experiments were repeated with Gd-DPTA alone (no iron-labelled macrophages or MRT). Uptake of Gd-DTPA was monitored in tumour tissue over the 15-min period; any pooling would result in increased signal over this time period. We also monitored GD-DTPA uptake in the muscle surrounding the spinal cord (vertically away from the – y gradient targeted tumour region) as a control region where we expect no vascular disruption due to MRT. Direct comparisons in changes in signal intensity were made between these two regions to investigate any vascular damage in the targeted region. Finally, if there is no vascular damage, Gd-DTPA should enter the renal system; to confirm this in our groups, we imaged the kidneys.

Estudis terapèutics

HSV1716 in vitro studies are described in the accompanying Supplementary Files. In vivo studies were performed as follows. Tumour-bearing mice received tail-vein injections of either 3 million MDM alone or armed with Seprehvir at MOI 50, 1 × 10 7 Seprehvir only or PBS ( n =5 mice per group). Of note, three groups of mice were administered with MDM+OV, one group underwent MRT for 1 h, one sat in the MRI scanner but had no MRT (MDM+OV no MRT) and another group did not enter the MRI scanner (MDM+OV). Tumour size was monitored by IVIS Lumina II imaging (IVIS, Caliper Life Sciences). Animals were killed once tumours reached the maximum volume (>10 10 photons per second) permitted by UK Home Office Regulations. Excised tissues including tumours, kidney, liver, lungs and spleen were embedded in OCT or paraffin wax for immunocytochemical/histological labelling studies.

Anàlisi de teixits

Tissues were divided into two; one part was formalin fixed for immunohistological analysis and the other was dissected free of adherent fibrous and fatty tissue and treated with collagenase. Flow cytometry. Cell viability was determined using LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Invitrogen). All FACS data were analysed on an LSR II flow cytometer (BD Biosciences) using FlowJo software (Tree Star). Histology . Five-micron sections of all organs were incubated with specific antibodies for target antigens; for the vasculature we used CD31 (1:100; AbD Serotec) and for macrophages human CD68 (Dako, Ely, UK) at 1:100. A biotinylated secondary antibody system was used in conjunction with a streptavidin-conjugated horseradish peroxidase. Peroxidase activity was localized with diaminobenzidine (Vectastain Elite ABC kit, Vector Labs). To detect iron in the tumours (where cell densitites were high), sections were stained with Perls Prussian blue and counterstained with eosin for improved contrast. To detect cancer cells in the lungs, all lung sections were stained with epithelial cell adhesion molecule or haematoxylin and eosin. All immune-localization experiments were repeated on multiple tissue sections and included isotype-matched controls for determination of background staining. To assess necrosis, the area of necrosis within the whole-tumour section was determined visually, and the proportion of necrotic nonviable tumour areas over the whole section was calculated using ImageJ software (National Institute of Health). For each group, the mean percentage of necrosis and standard error were calculated. The results are presented as the mean tumour necrosis (%) for all tumours (five slices per each tumour) in each treatment group. Immunofluorescence . harvested tissue was post-fixed in 4% paraformaldehyde, processed through graded sucrose and embedded in OCT medium (Tissue-Tek) and stored at −80 °C. Frozen sections were dried for 10 min at room temperature and blocked in 5% horse serum+0.5% saponin in PBS for 30 min. Sections at ∼ 40 μm were stained with anti-GFP 1:200 (ab290 abcam, UK) and CD68 (1:100) for 1 h and then secondary antibodies donkey anti-rabbit alexa fluor 488 and goat anti-mouse 540 at 1:100 dilution (Invitrogen, Paisley, UK) and finally counterstained with prolong gold-antifade mountant with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (0.05 mg ml −1, Invitrogen). Images of macrophage infiltration into primary and pulmonary LNCaP tumours were captured using a spinning disc confocal microscope (Olympus IX81, PerkinElmer, UK). Confocal image Z-stacks of tumours were captured at 1-μm increments at × 20 magnification.

Anàlisi estadística

Data are means±sem (Prism 5; GraphPad Software). Two-tailed Student's t -test was used to analyse the statistical significance of the data unless otherwise stated. Differences were termed significant with a P value of <0.05.

Historial de canvis

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

    Supplementary Figures 1-4

Comentaris

En enviar un comentari, accepteu complir els nostres Termes i Directrius de la Comunitat. Si trobeu alguna cosa abusiva o que no compleix els nostres termes o directrius, marqueu-la com a inadequada.