Distingint la patologia molecular diferencial de lesions proliferatives de l'oïda mitjana mitjançant espectroscòpia de raman informes científics

Distingint la patologia molecular diferencial de lesions proliferatives de l'oïda mitjana mitjançant espectroscòpia de raman informes científics

Anonim

Temes

  • Biofísica
  • Ptica i fotònica

Resum

Malgrat la seva prevalença generalitzada, la patologia de l’oïda mitjana, especialment el desenvolupament de lesions proliferatives, continua essent en gran mesura inexplorada i mal entesa. L'avaluació diagnòstica encara es basa en un índex elevat de sospita clínica en l'examen otoscòpic de característiques morfològiques grosses. Informem de la primera tècnica que pot identificar de manera no invasiva dues lesions claus, a saber, el colesteatoma i la meringosclerosi, proporcionant informació en temps real de molècules expressades de manera diferent. A més de revelar signatures coherents amb la patobiologia coneguda d’aquestes lesions, les nostres observacions proporcionen la primera evidència de la presència de substitucions de carbonat i silicats en les plaques de fosfat de calci que es troben en la meringosclerosi. Col·lectivament, aquests resultats demostren el potencial de l’espectroscòpia Raman per no només proporcionar una nova comprensió de l’etiologia d’aquestes condicions mitjançant la definició de marcadors moleculars objectius, sinó que també ajuden en l’avaluació del marge per millorar el resultat quirúrgic.

Introducció

El reconeixement morfològic sota examen otoscòpic de llum blanca segueix sent el patró d'or per als diagnòstics de la majoria de patologies de l'oïda mitjana. Tot i això, les estratificacions que utilitzen la morfologia per si soles comporten una variabilitat interobservadora important i proporcionen una visió limitada de la bioquímica definidora de la malaltia 1, 2 . En conseqüència, un motiu habitual en la patologia de l'oïda mitjana és el sobre-tractament de pacients amb el pitjor supòsit 3 . La incapacitat de definir bioquímicament les patologies és particularment evident en el maneig del colesteatoma i la meringosclerosi que en la inspecció bruta presenten característiques gairebé idèntiques 4, 5 . Mentre que el colesteatoma es caracteritza per la queratinització de l’epiteli escamós i el creixement agressiu del teixit a l’orella mitjana i a la cavitat mastoide, la meringosclerosi està marcada per la calcificació i la hialinització a la membrana timpànica. L’etiologia d’aquestes condicions patològiques (especialment, la mirringosclerosi) s’entén malament amb una visió limitada disponible sobre la possible associació i coexistència d’aquestes dues condicions. No obstant això, donada l'expectativa a priori de teixit anormal, la diferenciació precisa d'aquestes patologies és tan crítica com la distinció del teixit no implicat.

Des d'una perspectiva clínica, encara es resolen dos problemes particulars: 1) la naturalesa recurrent del colesteatoma per la dificultat d'assegurar un marge quirúrgic clar durant la cirurgia i 2) la incapacitat de predir quina butxaca de retracció es convertirà en un colesteatoma. En aquest entorn, els mètodes moleculars, que proporcionen biomarcadors objectius per als diagnòstics, poden permetre la detecció de malalties abans de les manifestacions morfològiques i permetre una segmentació patològica més sensible. Mitjançant la detecció no invasiva del medi de l’oïda mitjana, els mètodes moleculars poden informar no només de l’anatomia de la malaltia, sinó també de la seva fisiologia subjacent, possiblement predint el seu comportament futur 6 . Si bé nosaltres i altres hem utilitzat recentment imatges de reflectància i autofluorescència multicolors per visualitzar i caracteritzar les lesions de l'oïda mitjana, la manca d'especificitat molecular d'aquests enfocaments impedeix la definició de la bioquímica subjacent 7, 8, 9 . L’objectiu d’aquest estudi és, per tant, desenvolupar classificadors diagnòstics que diferencien amb precisió les patologies pertinents centrant-se en característiques discriminatòries específiques i biològicament rellevants.

Aquí es presenta una nova plataforma de detecció espectroscòpica de Raman per a anàlisis bioquímiques de gran rendiment sense etiquetes de la patologia de l'oïda mitjana. El sistema de detecció es basa en el perfil molecular mitjançant l’anàlisi de modes vibracionals que proporcionen una “empremta dactilar” de les condicions fisiopatològiques 10, 11 . Atesa l’exquisida especificitat molecular d’aquesta tècnica, els marcadors espectrals poden proporcionar noves rutes per al reconeixement dels tipus cel·lulars dins dels teixits, així com per a la detecció i classificació objectiva que superin les capacitats actuals 12 . A més, vam raonar que es podia utilitzar directament la informació espectroscòpica vibracional per identificar les calcificacions prevalents en la meringosclerosi a causa dels seus modes vibratoris únics i forts. La nostra hipòtesi de detecció de la calcificació es recolza en les nostres observacions prèvies de microestructures calcificades similars al pit, on la presència d'aquests components incrustats a la matriu de teixit és un important indicador de lesions subjacents 13, 14 .

Investiguem la viabilitat d’utilitzar espectroscòpia Raman per a la identificació de la patologia de l’oïda mitjana mitjançant una exploració ràpida de la mostra d’orella mitjana acabada d’extirpar. Aquesta plataforma d’escaneig, per tant, alleuja significativament les limitacions de mostreig associades a una ràpida avaluació histològica. Les nostres mesures espectroscòpiques revelen que, a més de la presència de calcificacions, la meringosclerosi presenta marcadors espectrals nous que col·lectivament es poden utilitzar per construir un algorisme de decisió precís. Es proposa un model de substitució de silicats en les calcificacions per explicar aquests nous marcadors espectrals que representen una part bioquímica no reportada en la patologia de l'oïda mitjana. Es preveu que els avantatges substancials de l’espectroscòpia Raman en termes d’especificitat molecular i la seva capacitat per unir-se a una sonda de fibra per a l’ adquisició in vivo sense etiquetes permetrà la seva traducció llesta a la pràctica d’otorinolaringologia, reduint així el nombre de cirurgies repetides no desitjades i millorant la qualitat de vida del pacient.

Resultats i discussió

La figura 1 mostra imatges de llum blanca representativa d’un colesteatoma i una lesió de micringosclerosi in situ abans de l’excisió quirúrgica. La figura 2 mostra els espectres Raman representatius adquirits a partir d’exemplars de teixit clínic després de la resecció. L’especificitat de l’espectroscòpia Raman en la detecció de fenotips moleculars del teixit revela clares diferències en les signatures espectrals entre les lesions de colesteatoma i alguns dels llocs de la mirringosclerosi. Això és coherent amb el consens mèdic sobre aquestes dues condicions patològiques, on la primera es caracteritza per intrusions d’epiteli esquamós estratificat queratinitzant recolzat per sota de teixit connectiu solt (constituït en gran part per col·lagen i elastina), mentre que el segon està format per plaques calcificades enmig de dipòsits de col·lagen. . Atès que les lesions de micringosclerosi mostren una heterogeneïtat significativa en la distribució espacial de les estructures calcificades, tractar el conjunt espectral adquirit a partir d’exemplars de teixit com a galleda homogènia proporcionaria una representació imprecisa. Així, basant-nos en les diferències dins del conjunt de micringosclerosi (particularment en la característica de Raman ben caracteritzada a 960 cm- 1 ), vam separar els llocs mineralitzats (Fig. 2 (B)) del teixit brutament no implicat (Fig. 2 (C) )) Utilitzant el codi d'identificació de punta d'una banda de 20 cm -1 centrada en aquesta funció. Val la pena assenyalar que els conjunts de dades mostren una mesura de solapament que es pot atribuir a un model de patologia contínua des d’un teixit no implicat a un lloc amb alta concentració d’estructures calcificades. Les diferències, si n’hi ha, entre les mostres de colesteatoma i el conjunt de micringosclerosi no mineralitzada són més subtils i les variacions dins de la classe del conjunt de dades espectrals impedeixen la possibilitat d’elucidar aquestes diferències només amb l’anàlisi d’un sol tret.

Image

Imatges de llum blanca representativa del colesteatoma ( A ) i ( B ) meringosclerosi in situ abans de l’excisió quirúrgica de les lesions.

Imatge a mida completa

Image

( A ) llocs de lesió de colesteatoma, ( B ) llocs de meringosclerosi que presenten mineralització en avaluació histològica i ( C ) llocs de micringosclerosi que presenten poca o cap mineralització ( és a dir , llocs de teixit no implicats), respectivament.

Imatge a mida completa

Aquí vam utilitzar PCA per reduir la dimensionalitat de les dades espectrals en uns quants components crítics que expliquen la major part de la variació de les dades i per ajudar a identificar “marcadors espectrals” que puguin distingir la patologia del teixit de manera fiable. La figura 3 mostra els primers 7 PC de cadascun d’aquests tres tipus de teixit (colesteatoma, llocs biomineralitzats de meringosclerosi i llocs no implicats de lesions de micringosclerosi) amb l’inset que posa de manifest les característiques de dispersió de Raman en les càrregues pertinents de PC. L’ampli fons d’autofluorescència proporciona una contribució significativa als primers PC, per a cada tipus de teixit, malgrat l’ús de la font d’excitació NIR. Si bé prèviament hem demostrat que l’ús adequat de mètodes quimiomètrics pot ajudar a desacoblar el senyal d’autofluorescència de les característiques d’interès 15 de Raman, el soroll disparat associat al fons d’autofluorescència a la regió visible pot impedir significativament la precisió de classificació destacant així la importància de treballant a la finestra NIR “transparent de teixit”.

Image

( A ) llocs de lesions de colesteatoma, ( B ) llocs de mirringosclerosi que presenten mineralització i ( C ) mirringosclerosi sense cúmuls mineralitzables apreciables. Evidentment, les càrregues de PC indiquen el fort contrast en la bioquímica subjacent entre les diferents patologies tisulars. ( D ) Espectre Raman adquirit a partir d’hidroxiapatita de calci estequiométrica pura per a la seva comparació.

Imatge a mida completa

Les càrregues per PC dels llocs de colesteatoma també presenten característiques Raman de queratina i col·lagen com a components estructurals principals d’aquestes lesions, incloses 1005 cm −1 (vibració d’estirament C – C de l’anell aromàtic a la cadena lateral de la fenilalanina), 1447 cm −1 ( metilè, CH2, banda de deformació (tisora) i 1654 cm −1 (ν (C = O) estirament amida-banda am) (Fig. 3 (A)). Les funcions més febles a 956 cm −1 (roca CH 2 ), 1032 cm 1 (mode de flexió C-H de fenilalanina) i 1128 cm −1 (mode C-C esquelètic, conformació trans) també són visibles. Aquestes característiques observades estan d’acord amb les reportades a la literatura, les tasques i interpretacions detallades de les quals es poden trobar a altres llocs 16, 17, 18 . Val la pena assenyalar que algunes d’aquestes característiques també poden ser indicatives de la presència de lípids ( per exemple, colesterol i èster de colesterol), tal com han postulat Knudsen i col·laboradors 19 . Addicionalment, en relació amb la vibració amida-I, observem interessantment dues característiques potencials, una a 1654 cm −1 (α-hèlix) com es va assenyalar anteriorment i una altra a ca. 1680 cm −1, cosa que suggereix l'existència de conformacions alternatives de les proteïnes estructurals en la lesió. Això no és sorprenent, atès que la degradació continua del col·lagen i els processos de reabsorció òssia durant la progressió d’aquesta lesió proliferativa 20 .

Si bé la inspecció grossa de les lesions de micringosclerosi va revelar algunes diferències respecte als casos de colesteatoma, la PCA dels llocs de micringosclerosi amb i sense mineralització posa de manifest diferències dramàtiques en la bioquímica subjacent. Fora de l’ampli fons d’autofluorescència, els llocs de mirringosclerosi constituïts per racons mineralitzats presenten poc en comú amb les característiques esmentades del colesteatoma, tot i que tots dos semblen gairebé idèntics sota un examen otoscòpic de llum blanca. En particular, els PC destaquen un pic intens a ca. 1044 cm −1 amb un altre pic fort a 960 cm 1 i una característica menys intensa a 748 cm 1 (Fig. 3 (B)). Atès que la formació de plaques de fosfat de calci a la làmina pròpia de la membrana timpànica és coneguda en la micringosclerosi, la presència del pic de 960 cm −1, el mode d'estirament v 1 (PO 4 ) totalment simètric del fosfat tetraèdric "lliure" ió, s'espera. Finalment, les càrregues PC i 6 també presenten característiques Raman a 1447 i 1654 cm –1, tot i que a intensitats molt menors que per als cims abans esmentats observats en els PC 3-5, cosa que indica la presència de teixit connectiu solt. D'altra banda, la Fig. 3 (C) mostra que les càrregues de PC corresponents a llocs amb poc o gens components minerals (tal com es verifica en un examen histològic) mostren perfils més sorolls. No obstant això, la presència de les característiques febles a 960 i 1048 cm 1 en PC7 indica que el teixit no implicat morfològicament, particularment als marges de lesió, pot ser bioquímicament diferent del teixit normal, és a dir , les modificacions moleculars en els marges poden ser els precursors del desenvolupament de lesions.

És de gran interès la presència dels 1044 cm −1 que fins ara no s'ha identificat a la literatura en el context de la patogènesi de l'oïda mitjana. Tenint en compte la intensitat d’aquests pics, especialment la característica de 1044 cm –1, es pot raonar que es deriva d’un constituent mineralitzat actiu Raman en contraposició a la matriu proteica circumdant. De fet, l’apatita biològica és un material no estoequiomètric poc cristal·lí (relació molar Ca: P <1, 67) que pot contenir ions addicionals en l’estructura com Na +, SiO 4−, CO 3 2 –, Zn 2+ i Mg. 2+ 21, 22, 23, 24, 25 . Per examen dels espectres adquirits i la seva comparació amb la de l’hidroxiapatita de calci estequiométrica pura (Fig. 3 (D)), és evident que les estructures d’aquestes lesions no estan compostes únicament d’apatita. Per exemple, hi ha una ampliació considerable de la banda de 960 cm –1 en els espectres adquirits en relació amb la característica nítida obtinguda de l’apatita pura fins al punt que un altre mode fosfat v 1 que es produeix a 948 cm −1 queda enfosquit per l’ampli fosfat. mode d'estirament a 960 cm −1 . S'ha reportat un descobriment anàleg de l'ampliació del pic de fosfat en microcalcificacions de tipus II en el teixit mamari, on la introducció d'ions carbonats a les estructures d'apatita s'ha relacionat amb l'augment de malignitat de la lesió 13, 26 .

Hipotitzem que les substitucions aniónicas similars predominen en les plaques de fosfat de calci en la mirososclerosi. El pic de 1044 cm –1 es pot atribuir a la presència d’estiraments asimètrics ( v 3 ) de l’enllaç P – O observat en el fosfat substituït amb carbonat i silicat, tal com es detalla a Chaudhury et al. 27, amb la força relativa d’aquest pic en relació a 960 cm −1 segons el grau de substitució. A més, basant-se en l'absència de cims forts de carbonat a 912 i 1477 cm –1, estem de la opinió que les substitucions de silicats dominen els constituents biomineralitzats en aquestes lesions. En aquest moment, és important tenir en compte el possible origen (es) d’aquestes estructures d’apatita i, críticament, la presència de substitucions de silicats des d’una perspectiva fisiopatològica. Tal com han assenyalat Creusy i col·laboradors, la condició més imperativa per a la formació d’apatita és la superació del nivell de supersaturació crític per part dels ions a la microescala 28 . Aquí, la supersaturació crítica significa un valor proper al producte de solubilitat més enllà del qual els ions components del cristall no romanen en solució sinó que precipiten i formen agregats 28 . Els líquids cartílags estan marginalment sobresaturats amb CaPO 4, el principal component de l’apatita biològica, però no cristal·litzen en condicions fisiològiques a causa de la presència de diversos quelants i inhibidors de la cristal·lització 29, 30, 31, 32 . Tanmateix, una condició patològica com l’otitis mitjana crònica o la inserció sobtada d’un tub de timpanostomia (grommet) podria desplaçar el nivell de supersaturació cap a un desequilibri iònic més elevat, produint un entorn que afavoreix la formació d’apatita. A més, les dades emergents d’estudis de model in vitro sobre mineralització de cèl·lules mamàries suggereixen que la presència de cristalls d’hidroxiapatita a la matriu extracel·lular podria, al seu torn, millorar la proliferació de la lesió 33 .

Al contrari de l’apatita, es pot evitar l’origen bioquímic i la rellevància clínica de les substitucions de silicats a l’oïda mitjana. Hipotitzem que la formació d’aquestes estructures és el resultat final de l’homeòstasi cel·lular greument interromput, el principal factor determinant de la qual és la presència de tubs de timpanostomia de silicona. Quant a l'impacte, s'han trobat ions de silicats solubles que estimulen l'expressió de col·lagen tipus I en cultius de cèl·lules similars a osteoblastos 34 . A més, les avaluacions in vivo han demostrat una bioactivitat més gran de l’hidroxiapatita substituïda per silici sobre l’hidroxiapatita pura 34, indicant que el creixement d’aquestes lesions podria ser més ràpid que les en presència d’apatita purament estequiomètrica.

A més d’identificar un conjunt robust de marcadors espectrals biològicament rellevants, també hem buscat desenvolupar un algoritme de decisió que pogués delimitar ràpidament la patologia del teixit de forma en temps real sense etiquetes. Primer, es va crear un mapa de visualització radial no lineal per traçar les dimensions de les dades de PC en un espai bidimensional per tal de agrupar-se (Fig. 4 (A)) 35 . Aquestes puntuacions de PC es van extreure de tot el conjunt de dades espectral, i no de càrregues separades, tal com s’identifica a la Fig. 4. Les PC que descriuen les característiques bioquímiques del lloc de teixit estan igualment espaiades al voltant del perímetre d’un cercle i proporcionen ancoratges de dimensió, on es troben els valors de cada dimensió (Puntuació PC) s’estandarditzen entre 0 i 1. Cada lloc de teixit es mostra com un punt dins del cercle d’unitat amb la seva ubicació governada per les seves ancoratges de dimensió. La trama de visualització radial revela un cúmul gairebé clarament separable per als llocs de mirringosclerosi biomineralitzats amb un solapament substancial entre els llocs de colesteatoma i els altres llocs de miringosclerosi, derivats de la manca de marcadors espectrals distintius que separen els dos últims. Els pocs llocs de micringosclerosi segregats incorrectament es poden atribuir a l'error de registre d'espectroscòpia-histopatologia. Val la pena assenyalar que es va realitzar un alt grau de reproduïbilitat quan es van realitzar mesures de rèplica en els mateixos llocs de cada exemplar de teixit. Expectablement, les variacions entre mostres eren més grans que els canvis intra-mostrals, cosa que es pot atribuir a l’heterogeneïtat intrínseca d’exemplars de teixit adquirits de diferents individus.

Image

( A ) La trama de visualització radial multidimensional de les puntuacions de components principals seleccionades obtingudes de tot el conjunt de dades espectral. La trama il·lustra el comportament d’agrupament dels punts de dades corresponents als llocs de micringosclerosi que presenten mineralització. ( B ) Corba ROC per algoritme derivat de PLS-DA per al diagnòstic de llocs mineralitzats de micringosclerosi. La corba de ROC en sensibilitat de trames vermelles versus (especificitat 1) per l'algoritme de decisió PLS-DA ja que el llindar de discriminació és variat. Per a la comparació, també es mostra la corba ROC de dues classes indistinguibles (representades per la línia negra sòlida).

Imatge a mida completa

Per quantificar la capacitat de discriminació, es van desenvolupar i provar algoritmes de decisió PLS-DA en una rutina de validació creuada sense sortida. En primer lloc, es va triar aleatòriament un subconjunt d’espectres de colesteatoma per limitar el nombre de punts de dades de cada classe a ser comparable. Es va emprendre per evitar un sobreentrenament que altrament escletegaria els resultats de la predicció. En segon lloc, el 60% de les observacions de cada classe es van utilitzar per a la formació del model PLS-DA i la resta es va utilitzar per constituir un conjunt de proves independent. Aquests dos passos es van iterar 100 vegades cadascun per obtenir una estimació robusta de la capacitat de predicció. Es va calcular la taxa de classificació mitjana correcta per ser ca. El 73%, el 95% i el 76% per al colesteatoma, els llocs de micringosclerosi biomineralitzats i altres llocs de micringosclerosi sense contingut en apatita, respectivament. Com era d'esperar, els llocs de micringosclerosi que mostren biomineralització es classifiquen amb alta precisió a causa de la presència de marcadors espectrals fiables. La robustesa de l'algoritme de decisió derivat de PLS-DA es va provar mitjançant un estudi de control negatiu on es van assignar etiquetes arbitràries a les dades espectrals independentment del seu veritable origen. En aquest cas, es va trobar que la taxa de classificació mitjana correcta és aproximada. 33% que es pot atribuir a la possibilitat d’atzar d’una classe correcta de cada tres. El baix valor de la precisió de classificació en l'estudi de control confirma la robustesa de l'algorisme a correlacions esporeses i d'atzar.

Finalment, es van implementar models de classificació binària utilitzant només les dades de micringosclerosi mineralitzada i de colesteatoma. Això va donar un valor predictiu positiu (PPV) del 99, 02%, un valor predictiu negatiu (VNV) del 95, 63%, una sensibilitat (SE) del 95, 48%, una especificitat (SP) del 99, 06% i una precisió global (OA) del 97, 27%. Quan es va aplicar el mateix algorisme al conjunt de dades de micringosclerosi mineralitzada contra els espectres del colesteatoma i altres llocs de micringosclerosi combinats, es va observar que els valors de PPV, NPV, SE, SP i OA van ser del 90, 32%, 95, 81%, 92, 29%, 94, 68% i El 93, 85%, respectivament. La figura 4 (B) mostra la corba de funcionament del receptor (ROC) corresponent (traça de sensibilitat versus (1-especificitat)), on l’àrea sota la corba es calcula com a 0, 98 (per comparació, l’ATS d’un algorisme perfecte és 1, 00) . La lleugera degradació del rendiment a causa de la fusió dels llocs de colesteatoma amb els llocs de micringosclerosi no mineralitzats dóna suport a la nostra hipòtesi de possibles canvis bioquímics en els llocs no mineralitzats en el teixit de la mirringosclerosi abans de les seves manifestacions morfològiques.

Tot i que el nostre estudi pilot a escala no justifica conclusions biològiques generals, la segmentació aconseguida mitjançant un petit subconjunt de característiques reflecteix la capacitat de l'espectroscòpia Raman en augmentar les tecnologies existents en la biomèdica per proporcionar dades significatives biològicament i clínicament. Les nostres observacions suggereixen un paper potencialment important de l’hidroxiapatita substituïda per silicats en la patogènesi de la meringosclerosi que requereixi més investigacions. S’estan realitzant estudis addicionals per validar les signatures moleculars identificades en una cohort més gran de pacients.

El present estudi proporciona la primera aplicació de l’espectroscòpia Raman en el diagnòstic i la diferenciació del colesteatoma i la meringosclerosi. La identificació dels marcadors espectrals (dianes moleculars) provinents de regions localitzades espacialment ofereixen dades quantificables molt desitjades per permetre la detecció precoç i el seguiment longitudinal de la patologia de l'oïda mitjana no només per millorar el maneig del pacient, sinó també per servir com a eina de recerca mèdica per comprendre millor la processos fonamentals de formació de lesions. En aquest treball, hem reportat les primeres evidències de la presència de substitucions de carbonat i silicat a les plaques de fosfat de calci que es troben en la meringosclerosi. Els nostres esforços representen el primer pas cap al desplegament d’espectroscòpia vibracional com a sonda específica de temps lliure i molecular sense etiquetes per a l’orientació de procediments quirúrgics de l’oïda mitjana. Els estudis actuals in vivo que impliquen cohorts de pacients més grans al Connecticut Medical Medical Center s’utilitzaran per provar la hipòtesi que les mesures espectroscòpiques poden identificar de forma fiable la malaltia residual millorant així l’eliminació quirúrgica i millorant el pronòstic del pacient.

Mètodes

Estudis en matèria humana

El protocol del present estudi va ser aprovat per la Institution Review Board del Connecticut Children's Medical Center. La inclusió de pacients en aquest estudi pilot es va limitar a aquells que es van sotmetre a un procediment quirúrgic otològic sota anestèsia general. Es va obtenir el consentiment informat del pacient abans de l'estudi. En aquest estudi pilot, es van treure mostres quirúrgicament a sis pacients després d’un examen otoscòpic de llum blanca per un otorinolaringòleg experimentat (TAV). El conjunt d’exemplars de teixit no fixats i desidentificats, indicant greument el colesteatoma o les lesions de micringosclerosi, respectivament, es van enviar congelats al gel sec i es van descongelar a temperatura ambient abans d’analitzar-los. Per evitar la deshidratació, els teixits es van humitejar amb una petita quantitat de solució salina normal. Els teixits es van col·locar al costat de la plataforma d'exploració per a l'adquisició espectral de Raman, tal com es detalla a continuació. Després de la recol·lecció espectral, les mostres es van fixar en formina tampó neutra al 10% i incrustada en parafina, seccionada i tacada per a anàlisis histopatològiques. Tots els experiments es van realitzar segons les directrius i regulacions aprovades.

Mesures espectroscòpiques de Raman

Les mostres es van col·locar en reixetes de coberta de quars per permetre les mesures d’escaneig en una geometria invertida i reduir la interferència del substrat. Per tal de valorar la viabilitat de mesuraments d’alt rendiment, vam realitzar els experiments amb un escàner pla basat en sonda de fibra construït a casa al Centre de Recerca Biomèdica amb Làser MIT. A partir del disseny original d’un escàner de reflectància difusa i autofluorescència que havíem desenvolupat anteriorment 36, es va aconseguir una imatge espectroscòpica d’àmplia àrea mitjançant la exploració mecànica del feix. El temps de gravació espectral va ser de 100 msec / píxel. Aquí, s’utilitza un làser d’estat sòlid compacte de 785 nm com a font d’excitació i la llum recopilada s’enregistra en un espectrògraf (Holospec f / 1.8i, Kaiser Optical Systems) i un CCD refrigerat termoelèctric, il·luminat a la part posterior i un CCD esgotat profund ( PIXIS: 100BR_eXcelon, Princeton Instruments). La potència de la mostra es va mantenir constant a 70 mW i el temps d’enregistrament espectral va ser de 100 msec / píxel. Els espectres registrats es van corregir per la presència de raigs còsmics abans de més anàlisis i interpretació de dades.

Anàlisi de dades

Es va calibrar el sistema Raman i es va corregir per a la resposta de longitud d'ona del sistema i el fons de sonda de fibra. El conjunt de dades espectral obtingut mitjançant la plataforma d’exploració contenia els espectres de teixit i substrat (on el teixit no hi havia) a l’àrea escanejada. A causa de la possibilitat d'introduir artefactes espectrals, no es va dur a terme cap tractament addicional (per exemple, l'eliminació de la correcció de fons / base de l'autofluorescència). Per visualitzar la capacitat de les mesures espectroscòpiques de Raman per diferenciar els llocs fisiopatològics, es va utilitzar l’anàlisi del component principal (PCA) a tot el conjunt de dades espectral dels teixits mitjançant la Caixa d’eines estadístiques de MATLAB R2014b (Math Works, Natick, MA). PCA és una tècnica d’exploració de dades àmpliament utilitzada i s’utilitza àmpliament per comprendre l’agrupament (o la seva falta) de dades espectroscòpiques d’alta dimensió. Radviz, un component del programari 37 d’ explotació de dades Orange, es va utilitzar posteriorment per traçar les puntuacions contra un conjunt de components principals escollits selectivament (PC) per a una visualització òptima de la separació de classes. Finalment, es va fer una anàlisi parcial de quadrats discriminants (PLS-DA) per construir algoritmes de decisió per quantificar la capacitat de segmentació.

Informació adicional

Com citar aquest article : Pandey, R. et al. Discernir la patologia molecular diferencial de lesions proliferatives de l'oïda mitjana mitjançant espectroscòpia Raman. Cci. Rep. 5, 13305; doi: 10.1038 / srep13305 (2015).

Comentaris

En enviar un comentari, accepteu complir els nostres Termes i Directrius de la Comunitat. Si trobeu alguna cosa abusiva o que no compleix els nostres termes o directrius, marqueu-la com a inadequada.