Desregulació dels components bàsics del complex scf en trastorns de la glutamina mort i malaltia cel·lular

Desregulació dels components bàsics del complex scf en trastorns de la glutamina mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • La malaltia de Huntington
  • Neurodegeneració
  • Patologia

Resum

Les malalties de poli-glutamina (polyQ) són trastorns neurodegeneratius caracteritzats per repeticions CAG expandides en els gens causants les proteïnes formen cossos d’inclusió. Diverses lligases ubiquitines E3 estan implicades en trastorns neurodegeneratius. Informem que la disfunció del complex SCF (proteïna Skp1-Cul1-F-box), un dels lligases d'ubiquitina més ben caracteritzats, està associada a patologia en malalties de poliQ com la malaltia de Huntington (HD) i la malaltia de Machado – Joseph (MJD) . Vam trobar que Cullin1 (Cul1) i Skp1, components bàsics del complex SCF, es redueixen en el cervell de ratolins HD. També es va observar una reducció dels nivells de Cul1 en el model cel·lular d’HD i mosca tant d’HD com de MJD. Mostrem que Cul1 és capaç de modificar genèticament els agregats de la caça mutant perquè el seu silenciament produeix una major càrrega agregada en cèl·lules cultivades. A més, demostrem que silenciar dCul1 i dSkp1 a Drosophila produeix una major càrrega agregada i una major toxicitat induïda per poliQ. Els nostres resultats impliquen que els nivells reduïts de complex de SCF poden contribuir a la patologia de la malaltia de PolyQ.

Principal

La malaltia de Huntington (HD) és un trastorn neurodegeneratiu relacionat amb l’edat, que es manifesta com un deteriorament motor, psiquiàtric i cognitiu. 1 Pertany a un grup de malalties anomenades malalties de poli-glutamina (polyQ), totes elles que han expandit les repeticions de trinucleòtids (codificant glutamina) en els seus gens causants. L’HD és autosòmic dominant i es manifesta quan el nombre de CAG que es repeteix a l’exon1 del gen Huntingtin supera els 37. 2 La malaltia Ataxio spinocerebel·lar 3 / La malaltia de Machado – Joseph (SCA3 / MJD) també pertany a aquesta categoria de malalties neurodegeneratives i és causada per una expansió del CAG. es repeteix en el gen Ataxin3 . 3 Gairebé totes les malalties neurodegeneratives, incloses les malalties polyQ, es caracteritzen per la presència d’agregats proteics, que es creu que són tòxics i causen la mort neuronal. 4

S’utilitzen diversos sistemes de models per estudiar la base molecular de la patologia d’HD amb l’esperança d’elucidar objectius terapèutics putatius. 5 sistemes no mamífers com Drosophila i models cel·lulars són útils per analitzar possibles modificadors genètics dels agregats de caça mutant. Per exemple, la sobreexpressió del gènere humà de Huntingtin exon1 amb repeticions CAG expandides a Drosophila es tradueix en la formació d’agregats de proteïnes i posterior neurodegeneració. 6, 7 Quan s'expressa en les neurones fotoreceptores de les mosques, la degeneració de la retina relacionada amb l'edat és visible a l'ull. En el model cel·lular, l’expressió del gen mutant Huntingtin dóna lloc a la formació d’agregats peri-nuclears. 8 El model de ratolí transgènic R6 / 2 per a HD és un model murí ben establert que expressa l'exó humà mutant de Huntingtin amb 150 repeticions de CAG. 9 Aquests ratolins mostren una neurodegeneració severa relacionada amb l’edat segons es valora la determinació de paràmetres bioquímics i de comportament.

El sistema de proteosoma ubiquitina (UPS) és un dels sistemes de control de qualitat utilitzats per mantenir la integritat cel·lular. S'ha demostrat que els agregats proteics de diverses malalties neurodegeneratives són positives per a la ubiquitina i es creu que el funcionament dels SAI està compromès en aquestes malalties. 10, 11 El SAI implica el funcionament de tres enzims - E1, E2 i E3, en cascada, que etiqueten proteïnes desplegades amb ubiquitina i es tradueix en la seva degradació posterior a través del proteosoma. D'aquestes, les lligases E3 són responsables de l'especificitat del substrat. A més, les lligases E3 han estat implicades en la patogènesi de diverses malalties neurodegeneratives, incloses les malalties poliQ. 12, 13, 14, 15, 16, 17 El complex SCF (proteïna Skp1-Cul1-F-box) és un dels lligades E3 més ben caracteritzats. En aquest complex, Cullin1 (Cul1) actua com una proteïna bastida la regió N-terminal que uneix Skp1 i la regió C-terminal uneix una proteïna RING-dit anomenada Rbx1. Skp1, al seu torn, pot unir una varietat de proteïnes de la caixa de F, que proporcionen especificitat del substrat al complex. 18 Per exemple, se sap que quan el complex SCF s’uneix a la proteïna F-box β- TrCP1, es degrada β -catenina. A més, recentment s'ha demostrat que Nedd8, una proteïna de 8 kDa, uneix Cul1 i aquesta neddilació de Cul1 és important per a la seva activitat. El paper del complex SCF com a regulador del cicle cel·lular a les cèl·lules que divideixen activament ja està ben establert. Tot i això, Cul1 i Skp1 també estan presents a les cèl·lules neuronals post-mitòtiques i encara no s'ha d'elucionar la seva funció. 22, 23 S'ha demostrat que la derrota de Cul1 en el nucli primari del ratolí, així com el cultiu cortical, fa que les neurones siguin susceptibles de mort, cosa que suggereix que Cul1 pot tenir un paper en el manteniment de la integritat de les neurones post-mitòtiques. 24 Això implica que la seva disfunció podria donar lloc a neurodegeneració.

Mandel i els seus companys 25, 26, 27, 28 han demostrat que silenciar Skp1 en models de la malaltia de Parkinson condueix a un deteriorament del funcionament i la supervivència de les neurones dopaminèrgiques i es tradueix en la formació d’agregats similars als cossos de Lewy, que són segments distintius de la malaltia. Tot i això, hi ha poca informació sobre l’estat del complex SCF en trastorns de poliQ com HD, tot i que els components bàsics i els socis interactius del complex SCF com cul1 , Skp1 i nedd8 es troben entre els molts gens identificats com a modificadors d’agregats de caça mutant a Drosophila. , en dues pantalles RNAi de conducció independent. 29, 30

En aquest estudi, hem investigat l'estat de Cul1 i Skp1 del complex SCF en models HD cel·lulars, voladors i murins. També hem manipulat genèticament Cul1 i Skp1 a Drosophila i s'ha mostrat una modulació conseqüent del fenotip de la malaltia. Els nostres resultats en alta definició s'han confirmat en models de mosca tant per a repeticions MJD / SCA3 com per a repeticions de poliQ expandides. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que l'activitat reduïda del complex SCF agreuja la patogènesi de la malaltia PolyQ.

Resultats

Els nivells de proteïnes Cul1 i Skp1 es redueixen en el model de ratolí transgènic HD de R6 / 2

Després d’investigar l’estat dels components bàsics del complex SCF al cervell dels ratolins de tipus salvatge, vam trobar que les proteïnes endogèniques Cul1 i Skp1 eren detectables en immunoblot de lisats fets a partir de còrtex i cerebel dels 6–8- i 12-14. ratolins de setmanes. Quan es van comparar nivells de proteïna Cul1 entre els ratolins HD i els controls de tipus silvestre igualats amb l'edat, es va observar una reducció significativa del 30% en ratolins HD a les dues edats (les figures 1a i b; només es van mostrar entre 6 i 8 setmanes). ratolins). En HD, es considera que nombroses proteïnes es redueixen en el citosol perquè es recluten en àrids insolubles. Quan es tallen seccions cerebrals per aquestes proteïnes, els agregats són visibles com a estructures denses al nucli (figura suplementària 1). Per comprovar si la reducció de Cul1 soluble també es va deure al seu reclutament en agregats, es va fer una immunohistoquímica en seccions de cervell de ratolins mitjançant anticorp Cul1 (Figura 1c). Tot i que es va evidenciar una expressió reduïda de proteïna Cul1 en seccions corticals i cerebeloses, no es va trobar que Cul1 co-localitzés amb agregats de caça mutants mutants.

Image

Cul1 endògena en ratolins HD transgènics R6 / 2 transgenics. ( a ) Immunoblot de Cul1 en lisats de còrtex i cerebel de ratolins de tipus salvatge i HD de 6 a 8 setmanes. GAPDH usat com a control de càrrega. ( b ) Quantificació de Cul1 en el còrtex i el cerebel dels cervells de ratolí HD. La quantificació es va fer mitjançant el programa d'anàlisi d'imatges NIH. Els valors són mitjans ± SEM de tres ratolins diferents en cada grup. * P <0, 05 respecte al control (ANOVA unidireccional). ( c ) Immunohistoquímica en seccions de cervell de ratolins de 6 a 8 i 12 a 14 setmanes amb anticorp Cul1. Hi ha una reducció dels nivells de proteïna Cul1 en el cervell de ratolins HD, però no hi ha co-localització en els agregats de caça. GCL, capa cel·lular granular; PL, capa de Purkinje. Les imatges es van prendre amb × 40 objectiu (barra d’escala: 20 μ m)

Imatge a mida completa

A més, com que Skp1 és conegut com a part integrant del complex SCF i que interactua amb Cul1, vam analitzar els seus nivells en ratolins de tipus salvatge i HD. De forma similar a Cul1, es va observar una reducció significativa del 30% dels nivells de Skp1 en còrtex i cerebel de ratolins HD de 6 a 8 setmanes en immunoblot (figures 2a i b) i en immunohistoquímica en seccions cerebrals (figura 2c). Els nivells reduïts de membres del complex SCF haurien de produir una acumulació dels seus substrats. D'acord, es va trobar que la β- catenina s'acumula en un còrtex de ratolins HD de 6 a 8 setmanes (figura 2 addicional).

Image

Skp1 endògena en el cervell de ratolins HD. ( a ) Immunoblot de Skp1 en lisats de còrtex i cerebel de ratolins de tipus silvestre i HD de 6 a 8 setmanes. GAPDH usat com a control de càrrega. ( b ) Quantificació de Skp1 en el còrtex i el cerebel de ratolins de tipus silvestre i HD. Els valors són mitjans ± SEM; n = 3. * P <0, 05 respecte de ratolins de tipus salvatge (ANOVA unidireccional). ( c ) Tinció immunohistoquímica de Skp1 en seccions de cervell de ratolins de tipus salvatge de 6 a 8 setmanes i HD. GCL, capa cel·lular granular; PL, capa de Purkinje. Les imatges es van prendre amb × 40 objectiu (barra d’escala: 20 μ m)

Imatge a mida completa

Els nivells de cul1 es redueixen en model HD cel·lular i la seva sobreexpressió té un efecte dominant-negatiu sobre l’agregació mutant de caça

Hem utilitzat un model cel·lular de HD ben establert, on s'expressava inductiblement la caça trincada de N-terminal de caça (tNhtt) amb repeticions 150Q fusionades a GFP. 8 La línia cel·lular es va anomenar HD-150Q. Es van assajar nivells endògens de Cul1 en cèl·lules HD-150Q en les quals es va induir la caça mutant durant 12 hores mitjançant 1 μ M de ponasterona A i es va comparar amb controls no induïts. Es va observar una reducció molt significativa dels nivells de Cul1 (60%) en la inducció de la caça mutant (Figures 3a i b). Aquesta reducció també va ser visible a través de l’immunostaining perquè les cèl·lules amb agregats van revelar nivells reduïts de Cul1 en comparació amb els que no tenien (figura 3c). Com es va veure a les seccions del cervell de ratolins, no es va localitzar Cul1 endògena localitzada amb agregats de caça.

Image

Cul1 en un model mòbil HD. ( a ) Anàlisi immunoblot de Cul1 en cèl·lules HD-150Q en què la caça mutant es va induir durant 12 h amb ponasterona A (1 μ M). GAPDH usat com a control de càrrega. ( b ) La quantificació de Cul1 mostra una reducció significativa ( * P <0, 001; n = 5) dels nivells de proteïnes endògenes a la inducció de la caça mutant en comparació amb les cèl·lules de control no induïdes. ( c ) La tinció de fluorescència de Cul1 en cèl·lules HD-150Q mostra una disminució del seu nivell. Barra d’escala: 10 μ m. ( d ) Les cèl·lules HD-150Q es van transfectar amb hCul1 etiquetat per micè durant 24 hores. La caça mutant es va induir durant 12 hores i després es va sotmetre a una tinció d’immunofluorescència de mic per detectar hCul1 sobreexpressat. Barra d’escala: 10 μ m. ( e ) El recompte dels agregats demostra que el percentatge de cèl·lules transfectades amb hCul1 que contenen agregats és significativament més ( * P = 0.015; n = 3, la prova t de l'alumne) que les cèl·lules control

Imatge a mida completa

S'ha informat que els truncats sobreexpressats i els Cul1 de longitud completa actuen de manera dominant-negativa i redueixen l'activitat de la proteïna endògena en Drosophila C. elegans , així com en el cultiu cel·lular de mamífers. 31, 32 Per tant, vam transfectar cel·les HD-150Q amb Cul1 humà de longitud completa (Figura 3d) per comprovar si la càrrega agregada està afectada després de l’augment del nivell de Cul1. Per a això, es va comptabilitzar manualment el nombre d'àrids en cèl·lules transfectades i es va comparar amb el de cèl·lules transfectades amb vector buit. Es va trobar que el percentatge de cèl·lules transfectades que contenen agregats és significativament superior al dels controls (figura 3e). El fet de sobreexpressar hCul1 augmenta la càrrega agregada en el cultiu cel·lular implica, d’acord amb estudis anteriors, 25, 26, que actua en forma dominant-negativa i Cul1 és efectivament capaç de modificar genèticament els agregats de caça mutant. Per tant, hem investigat aquesta possibilitat mitjançant el model Drosophila HD.

Modulació dels nivells de dCul1 i dSkp1 a Drosophila

Per comprovar l'efecte que sobreexpressa el cul1 humà de longitud completa a les mosques, hem generat mosques transformants clonant hCul1 des de pcDNA3 en pUASTattB i realitzant la transformació dirigida al lloc (vegeu Materials i mètodes). En paral·lel, es van obtenir línies RNAi de VDRC, Viena, per silenciar les expressions endògenes dCul1 i dSkp1. L’ expressió transmesa per GMR-GAL4 d’aquests transgens d’una manera específica dels ulls no va causar letalitat (taula 1a), però en ambdues modificacions de dCul1, els ulls van mostrar fenotip rugós en comparació amb els controls parentals adequats (figura 4a). Sorprenentment, silenciar dSkp1 als ulls mitjançant RNAi no va donar lloc a una retina arruïnada. La morfologia externa de l’ull és visible tant a les fotografies com a les impressions d’esmalt d’ungles. Les empremtes dels ulls normals representen un arranjament organitzat organitzat, que es trenca en les mosques que regulen el dCul1 o la sobreexpressió hCul1, però no en les que regulen el dSkp1 (Figura 4a). Les proteïnes extretes dels caps de les mosques van revelar l’augment o disminució esperats dels nivells de Cul1 en comparació amb el tipus salvatge (OregonR + ) (figura 4b), i també la reducció esperada dels nivells dSkp1 sobre el RNAi en comparació amb els controls (Figura 4c).

Taula completa

Image

Modulació dels nivells de dCul1 i dSkp1 als ulls de Drosophila . ( a ) Tauler superior: la morfologia externa de la superfície ocular de Drosophila que expressa RNAi dCul1 o UAShCul1 als ulls mostra els ulls lleugerament enfosquits en comparació amb el control. El RNAi dSkp1 als ulls no produeix una retina arruïnada. Tauler inferior: La impressió de control d'esmalt d'ungles mostra matrius paral·leles d'omatidia hexagonal i aquesta estructura regular es perd quan es silencia dCul1 o s'expressa hCul1, però no quan es derroca dSkp1. ( b ) Anàlisi immunològica i quantificació del canvi de plecs en dCul1 en extractes de cap de mosques de control (carril 1) en comparació amb sobreexpressió de mosques (carril 2, * P = 0, 0005; n = 3) i dregulant dCul1 (carril 3, * P = 0, 001 ; n = 3) Es va utilitzar una ANOVA unidireccional seguida de la prova post-hoc de Holm-Sidak. β -actina usada com a control de càrrega. ( c ) Immunoblot i quantificació del canvi de plecs en dSkp1 en extractes de cap de mosques de control (carril 1) en comparació amb les mosques que regulen dSkp1 (carril 2, * P = 0.0004 mitjançant la prova t de Student; n = 3). β -actina usada com a control de càrrega

Imatge a mida completa

Els nivells de proteïna dCul1 i d'ARN es redueixen en un model de mosca d'alta definició

El gen exon1 humà de Huntingtin , que conté 93 repeticions poliQ (HTT-EXON1-PQ93), es va expressar als ulls de les mosques mitjançant el controlador GMR-GAL4 . Les mosques van envellir durant 15 dies per permetre la degeneració de la retina. Quan es van sondar lisats de cap d’aquestes mosques per dCul1 endògena, es va observar una reducció significativa (al voltant d’un 30%) dels nivells de proteïna dCul1 en mosques HD en comparació amb els controls GMR-GAL4 igualats amb l’edat (figura 5a). L’ARN dCul1 també es redueix significativament en les mosques HD (figura 5b), cosa que indica que l’expressió de proteïna expandida de poliQ afecta la transcripció del gen dCul1 .

Image

dCul1 en mosques d'alta definició. ( a ) Anàlisi immunoblot de dCul1 endògena en lisats de cap de mosques HD de 15 dies en comparació amb controls adaptats a l'edat. β -actina usada com a control de càrrega. La quantificació de les intensitats de la banda dCul1 mostra una reducció significativa del seu nivell ( * P = 0.0013 mitjançant la prova t de Student; n = 5). ( b ) Anàlisi RT-PCR de la transcripció dCul1 en lisats del cap de mosques HD de 15 dies en comparació amb controls adaptats a l'edat. RP49 utilitzat com a control de càrrega. La quantificació mostra una reducció significativa ( * P <0.001 mitjançant la prova t de Student; n = 5) de la transcripció dCul1. ( c ) Morfologia externa (panell superior) i empremtes d'esmalt (panell inferior) de la superfície ocular de Drosophila amb RNAi dCul1 en presència de Htt- exon1 que conté 93 repeticions polyQ en comparació amb el control. L'ARN de dCul1 millora la degeneració de la retina (fletxa) en mosques HD tan visible a les fotografies dels ulls, com en la interrupció de les matrius ommatidials.

Imatge a mida completa

El silenciament dCul1 accelera la patogènesi de la malaltia en mosques HD

Per tal de comprovar si dCul1 pot modificar la patogènesi de HD en mosques, el RNAi dCul1 va ser coexpressat amb HTT-EXON1-PQ93 sota el control del controlador GMR-GAL4 . Sorprenentment, aquesta creu va donar lloc a la letalitat de les mosques, ja que només el 9% de la descendència que es va alliberar contenia els tres transgens enfront del 25% previst (taula 1b). Així mateix, els ulls de tots els adults supervivents tenien una retina enfosquida amb una degeneració millorada, donant com a resultat una estructura bulbosa a l’ull (fletxa a la figura 5c). Les matrius comunitàries, tal com revelen les empremtes de l'esmalt d'ungles, 33 es van deteriorar molt més que en les mosques de control GMR-GAL4 / UASHTT-EXON1-PQ93 .

La proteïna dCul1 i els nivells d’ARN es redueixen en un model de mosca de MJD i el silenci millora la degeneració de la retina

La MJD és una altra malaltia neurodegenerativa causada per una repetició de polyQ expandida a Ataxin3. La sobreexpressió transmesa GMR- GAL4 de Ataxin3 humana amb 78 poliQ repeteix resultats en degeneració de la retina i serveix de model per a una altra malaltia de poliQ a les mosques (mosques MJD). De manera similar a la HD, tant els nivells de proteïna dCul1 com d’ARN es van reduir en les mosques MJD en comparació amb els controls (figures 6a i b). A més, quan el RNAi dCul1 va ser coexpressat amb UASMJD-PQ78 (s), es va traduir en la letalitat de les mosques (Taula 1b), i els pocs GMR-GAL4 / UASMJD-PQ78; adults UASdCUL1-RNAi que van aparèixer millorats degeneració en comparació amb les mosques de control i l’aparició de taques negres denses a l’ull (figura 6c).

Image

dCul1 en mosques MJD. ( a ) Anàlisi immunoblot de dCul1 endògena en lisats de cap de mosques MJD en comparació amb el control. β -actina usada com a control de càrrega. La quantificació mostra una reducció significativa ( * P <0.001 mitjançant la prova t de Student; n = 3) de la proteïna dCul1. ( b ) Anàlisi RT-PCR de la transcripció de dCul1 en lisats cap de mosques MJD en comparació amb el control. RP49 utilitzat com a control de càrrega. La quantificació mostra una reducció significativa ( * P <0.001 mitjançant la prova t de Student; n = 5) de la transcripció dCul1. ( c ) Morfologia externa (panell superior) i empremtes d'espalt d'ungles (panell inferior) de la superfície ocular de Drosophila amb RNAi dCul1 en presència de 78 repeticions poliQ a Ataxin3 en comparació amb el control. L’ARN de dCul1 millora la degeneració de la retina en les mosques MJD, que és visible com a taques negres fosques als ulls a les fotografies, així com en la interrupció de les matrius ommatidials.

Imatge a mida completa

El silenciament dSkp1 en mosques HD i MJD millora la degeneració de la retina

Per tal de confirmar que la millora de la patogènesi de HD i MJD després de la manipulació en nivells de dCul1 va ser a causa del seu paper en el complex SCF, dSkp1, es va silenciar un altre component principal de SCF mitjançant RNAi. El RNAi dSkp1 en model de mosca HD va donar lloc a letalitat (taula 1b), i els adults supervivents van millorar la degeneració de la retina (figura 7a). En les mosques MJD no es va observar cap letalitat dràstica, en canvi totes les mosques GMR-GAL4 / UASMJD-PQ78; les mosques UASdSKP1-RNAi que van aparèixer tenien punts negres als ulls (figura 7b). Així, la derrota dSkp1 també millora la toxicitat de les malalties PolyQ, cosa que indica la implicació del complex SCF en la patogènesi d’aquestes malalties.

Image

Efecte de silenciar dSkp1 en mosques HD i MJD. ( a ) El silenciament dSkp1 en mosques HD comporta una degeneració millorada en forma de grans punts negres, la qual cosa és visible a la morfologia externa (panell superior) i a les impressions d’esmalt d’ungles (panell inferior) de l’ull. ( b ) El silenciament dSkp1 en les mosques MJD millora la degeneració i els punts negres són visibles als ulls. Es mostra la morfologia externa (panell superior) i les impressions d’esmalt d’ungles (panell inferior) de l’ull

Imatge a mida completa

La silenciació dCul1 i dSkp1 augmenta la càrrega agregada i millora la toxicitat de polyQ

Volíem comprovar si l’efecte perjudicial de silenciar dCul1 i dSkp1 està limitat a HD i MJD o possiblement es pot estendre a malalties de poliQ en general. Per a aquest propòsit, el dCul1 actiu es va reduir en sobreexpressar hCul1 dominant-negatiu o utilitzar RNAi dCul1 en mosques que expressaven 127 repeticions de glutamina marcades amb HA (127Q) sota el control del controlador GMR-GAL4 . De la mateixa manera, dSkp1 es va reduir per RNAi en mosques GMR-GAL4.UAS127Q . Aquests creuaments van donar lloc a un fenotip més extrem. Es va trobar que molt pocs (0–4% en lloc del previst 50%) de la descendència contenien els tres transgens (taula 1c). La robusta eclosió de mosques amb el RNAi o transgene amb sobreexpressió i cromosoma equilibrador del mateix cross-servi com a control intern de les condicions de creixement.

L'examen d'ulls de les GMR-GAL4.UAS127Q supervivents ; UASdCUL1-RNAi i GMR-GAL4.UAS127Q; mosques UASdSKP1-RNAi (sense GMR-GAL4.UAS127Q; adults UAShCUL1 eclosionats) van revelar una exageració de danys als ulls en comparació amb GMR-GAL4 Controls .UAS127Q (Figura 8a). Aquest dany va ser visible tant a nivell de morfologia ocular externa grossa com de disposició ommatidial. Es va analitzar l'efecte de silenciar dCul1 i dSkp1 sobre els agregats de poliQ mitjançant la tinció dels discos oculars larvaris de la tercera instància amb anticorp HA. La càrrega agregada va ser significativament més gran quan es van reduir els nivells actius de dCul1 o bé amb RNAi dCul1 o sobreexpressió hCul1, o dSkp1 es va reduir per RNAi (Figura 8b). Aquestes observacions indiquen una dependència de la càrrega i toxicitat de l’agregat de poliQ pel funcionament del complex SCF a Drosophila .

Image

Efecte de la modulació dels nivells de dCul1 i dSkp1 sobre les mosques transgèniques que expressen polyQ. ( a ) Morfologia externa (panell superior) i empremtes d’esmalt (un quadre inferior) de la superfície ocular de Drosophila amb RNAi dCul1 o dSkp1 en presència de 127 repeticions polyQ en comparació amb els controls GMR-GAL4.UAS127Q . La regulació tant de dCul1 com de dSkp1 millora la toxicitat de poliQ com es veu en el deteriorament dels ulls degenerats i l’aparició de taques negres. ( b ) Immunització de 127 agregats poliQ marcats amb HA (utilitzant anticorp HA) en el disc imaginari dels ulls en desenvolupament de les larves de la tercera instar. La baixada de dCul1 o dSkp1 i la sobreexpressió de hCul1 produeixen un augment de la càrrega agregada. Barra d’escala: 10 μ m

Imatge a mida completa

Discussió

Recentment, dCul1, juntament amb dCul3, s’ha implicat en el desenvolupament de l’ull a Drosophila . 35 No és estrany, doncs, que silenciar dCul1 als ulls de les mosques doni lloc a una retina una mica endurida. Tanmateix, intrigantment el dSkp1-RNAi a l'ull no va resultar en l'aspecte de l'ull. En la seva obra, Ou et al. 35 han abordat el paper de dCul1 i dNedd8 en el disc imaginari dels ulls en desenvolupament mitjançant anàlisi mutant i clonal, però no han reportat danys als ulls dels adults. En aquest treball no hem analitzat cap defecte en el desenvolupament de discos imaginaris dels ulls i, per tant, el nostre treball no exclou un paper de dSkp1 en el desenvolupament dels ulls. Tot i això, tampoc exclou el fet que dCul1 pogués actuar independentment de dSkp1 en el procés de desenvolupament de l'ull amb les mosques.

El silenciament de dCul1 per RNAi o la sobreexpressió de hCul1 dominant-negatiu i el silenciament dSkp1 per RNAi als ulls no afecta la eclosió de mosques adultes, cosa que indica que aquestes construccions no són letals quan s’expressen a ells mateixos. Per tant, va ser sorprenent notar que silenciar dCul1 i dSkp1 als ulls en models de malaltia PolyQ de HD, SCA3 i una construcció artificial de poliQ etiquetada amb HA van provocar la letalitat de les mosques. Aquesta letalitat indica que es millora la toxicitat amb poliQ i això es confirma pel fet que els adults que sobreviuin mostren una degeneració de la retina empitjorada que els controls. També es coneix que la millora de la toxicitat de poliQ transmesa per GMR- GAL4 en altres genotips produeix una alta letalitat pupal. Els discos imgainals dels ulls larvaris mostren una major càrrega agregada en reduir Skp1 per RNAi i dCul1 per RNAi o sobreexpressió de hCul1 dominant-negatiu, que paral·lela a la degeneració de la retina exagerada observada en les mosques adultes supervivents. Una càrrega agregada millorada en expressar una construcció hCul1 dominant-negativa també s’observa en el cultiu cel·lular, cosa que indica que aquest efecte del complex SCF sobre els agregats de caça mutant no és únic del model de mosca.

En aquest treball, hem establert que la proteïna Cul1 endògena es redueix en models murins, cel·lulars i voladors d’HD. També es redueix en un model de vol de MJD. Aquesta reducció dels nivells de proteïnes es produeix probablement a nivell transcripcional, ja que l’abundància de transcripció d’ARNm dcul1 es va trobar reduïda molt en els models de mosca d’ambdues malalties. Es creu que la desregulació transcripcional és una característica distintiva de les malalties de poliQ possiblement a causa del fet que diversos grups de transcripció són segrestats pels agregats. 36 S’espera que la interrupció de la funció SCF en HD i MJD, tal com s’informa en aquest treball, resulti en una acumulació dels seus substrats. El complex SCF té una àmplia xarxa de substrats pel fet que es pot unir amb fins a 70 proteïnes de caixa F. 18 També, la majoria dels seus substrats coneguts, com la β -catenina, la P21, la P27 i la ciclina E, participen en la regulació del cicle cel·lular. 37 Es creu que en malalties neurodegeneratives, la desregulació del cicle cel·lular també contribueix a l’apoptosi i a la mort neuronal. 38 Com s'esperava a causa del reduït nivell de components de la lligasa E3, SCF i la posterior acumulació de proteïnes relacionades amb el cicle cel·lular objectiu, s'ha notificat un augment en els nivells de β- catenina en pacients amb HD, així com en cel·lulars, models mosca i murí d’HD i altres malalties neurodegeneratives. 39 A més, Godin i els seus col·laboradors 19 van demostrar que l'efecte perjudicial dels agregats de caça mutant es pot eliminar en Drosophila sobreexpressant Slimb , l'homòleg de Drosophila de β-TrCP , que, en conjugació amb el complex SCF, es tradueix en la degradació de β- catenina. . El nostre treball suggereix que diversos altres substrats de SCF acumulats també poden contribuir a la toxicitat i la mort neuronal i, per tant, també podrien estar orientats a efectes terapèutics.

Alguns estudis anteriors han suggerit una correlació entre SCF i malalties neurodegeneratives, incloent malalties polyQ com MJD i atròfia dentatorubral-pallidoluysiana. Per exemple, Nedd8, una proteïna indispensable per a l’activitat de Cul1, s’ha trobat en co-localització amb cossos d’inclusió en seccions cerebrals de diversos pacients amb malalties neurodegeneratives. 40, 41 A més, s'ha informat que silenciar cul1 , skr1 i rbx1 ( C. elegans homòlegs de components del complex SCF) milloren la paràlisi induïda per polyQ en els nematodes. 42 En aquest treball, mostrem que Cul1 i Skp1 modifiquen la neurodegeneració en HD, MJD i expansió artificial PolyQ en models de mosca. A la vista dels informes d’altres models de malaltia PolyQ, i de les nostres dades reportades aquí, és probable que tant Cul1 com Skp1 participin en altres malalties neurodegeneratives. L'exploració del paper del complex SCF en la mosca i altres models d'aquestes altres malalties podria proporcionar una visió detallada dels aspectes comuns de la seva patogènesi.

Materials i mètodes

Ratolins transgènics en HD

Les dones d’ hemizigot transplantades d’ovari que portaven htton exon1 amb aproximadament 150 repeticions de CAG (nom de soca - B6CBA-Tg (HDexon1) 62Gpb / 3J) es van obtenir del laboratori Jackson (Bar Harbor, ME, EUA) i es van mantenir creuant-se amb mascles B6CBAF1 / J. . Tots els experiments amb animals es van realitzar d’acord amb l’aprovació del Comitè d’Ètica Animal Institucional del Centre Nacional d’Investigació del Cervell, Manesar. El genotipat es va realitzar mitjançant un mètode descrit anteriorment. 9 animals van ser assassinats mitjançant luxació cervical, els cervells van ser dissecats amb cura i emmagatzemats a -80 ° C.

Immunohistoquímica

Els ratolins transgènics (R6 / 2) i de tipus salvatge de 6 a 8 i 12 a 14 setmanes d'anestesia van ser anestesiats i perfusats amb un 4% de PFA. A continuació, es van disseccionar els cervells i es van processar per a la criosectació per obtenir seccions amb un gruix de 20 μm. A continuació, es van processar les seccions per a la immunohistoquímica mitjançant reactius de Vector Laboratories (Burlingame, CA, EUA). Breument, després de la recuperació de l’antigen per incubació de 45 minuts a 70 ° C, les seccions es van bloquejar i sondar amb conill anti-Cul1 (1: 100, Abcam, Cambridge, MA, EUA), conill anti-Skp1 (1: 100, cèl·lula Senyalització, Danvers, MA, EUA o anti-ubiquitina de conill (1: 500, Dako, Glostrup, Dinamarca). Es van utilitzar anticossos secundaris biotinilats amb una dilució d'1: 250, i es va millorar el senyal amb el kit ABC (Vector Laboratories). La tinció es va visualitzar mitjançant el substrat de IMPACT Novared Peroxidase (Vector Laborations). Les imatges es van fer en un camp lluminós mitjançant un microscopi DM RXA2 Leica (Wetzlar, Alemanya) i × 40.

Cultiu cel·lular

Ja s'ha descrit una línia cel·lular estable HD-150Q, que conté una construcció pIND-tNhtt-150Q-GFP inductible per l'ecdysone. Es van obtenir 8 medis de cultiu cel·lular i sèrum boví fetal (FBS) de Gibco. Es van mantenir les cèl·lules amb DMEM complementades amb antibiòtics FBS 10% i inactivats per calor (0, 4 mg / ml Zeocina i 0, 4 mg / ml G418). Es van transfectar de forma transitòria amb un reactiu pcDNA3-myc-CUL1 o pcDNA3.1 (vector buit) amb Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. La producció d’agregats tNhtt-150Q marcats amb GFP es va induir per al temps indicat mitjançant 1 μ M de ponasterona A (Invitrogen).

Immunostaining i quantificació d’àrids

Les cèl·lules es van fixar en un 4% de PFA durant 30 min a temperatura ambient i després es van processar per a la immunofluorescència tal com es va descriure anteriorment. 43 Cul endogenous es va tacar amb conill anti-Cul1 (1: 1000, Abcam) i transfectar Cul1 amb ratolí anti-c-myc (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califòrnia, EUA). Com a anticossos secundaris es va utilitzar com a anticorp conjugat Alexafluor 594 o anti-ratolí (1: 500, Invitrogen). Per comptar els agregats, es van cultivar cèl·lules en diapositives de cambra de dos pous, es van transfectar amb myc-hCUL1 i es van induir àrids amb ponasterona A durant 12 hores. Les imatges aleatòries es van prendre a través de les regions de cada cambra, de manera que es podien comptabilitzar almenys 75 cel·les transfectades i de control cadascuna per habitació. Es van utilitzar quatre cambres independents per comparar el percentatge de cèl·lules transfectades que contenen agregats a controlar.

Accions de mosca

Les poblacions de mosca es van mantenir a 25 ± 1 ° C en incubadores de BOD en aliments de llevat estàndard que contenien nipagina i àcid propiónic per evitar contaminacions bacterianes i fúngiques. Les existències RNAi es van obtenir a partir de VDRC (números de borsa - 42445, 108558, 33406 per a dCul1 i 46605, 46607 per a dSkp1 ). En aquest estudi es van generar mosques que sobreexpressen hCul1 ( w - ; +; UAShCUL1 / TM6B ). Altres existències utilitzades en aquest estudi van ser: OregonR +, w - ; GMR-GAL4; +, w - ; UASHTT-EX1-PQ93 / CyO; +, w - ; UASMJD-PQ78 (s); + i w - ; GMR-GAL4 UAS127Q / CyO; + .

Generar mosques que sobreexpressen hCul1

pcDNA3-myc-CUL1 (número de plasmidi 19896, Addgene, Cambridge, MA, EUA) conté la seqüència de codificació de tots els 752 aminoàcids de Cul1 humans (aproximadament 87 kDa proteïnes) juntament amb l'etiqueta de myc a l'extrem N-terminal. El vector de transformació de Drosophila , pUASTattB , es va obtenir a partir de FlyC31. L’inserit hCul1 (sense l’etiqueta myc) fou digerit a partir de pcDNA3-myc3-CUL1 mitjançant Bam HI (Roche, Penzberg, Alemanya). pUASTattB es va alinear amb Bgl II (Roche) per proporcionar extrems compatibles amb Bam HI. Els dos fragments van ser purificats en gel mitjançant un kit d’extracció de gel Qiagen i es van lligar mitjançant liga ADN ligasa T4 (Invitrogen). Després de la transformació, es va comprovar l’orientació de la placa mitjançant la digestió de restricció i es va enviar el clon correcte a la facilitat de transgènica vol (TFF, C-CAMP, Bangalore) per generar línies transgèniques.

Examen de l'estructura d'ulls de mosca

La morfologia bruta externa de l’ull es va imaginar en un microscopi Leica DM RXA2 mitjançant un objectiu × 5. L’estructura de ommatidia es va analitzar mitjançant empremtes d’esmalt. 33 Breument, les mosques anestesiades es van decapitar i es van submergir els caps en una gota d’esmalt i es van deixar assecar. A mesura que el vernís s’endureix, forma una empremta de l’ull i aquesta impressió es va deslligar i es va fer una imatge mitjançant microscòpia de camp brillant.

Immunostenció i microscòpia amb òrgan complet

Els discs imaginaris dels ulls de les larves de tercera instar dels genotips desitjats es van disseccionar en PBS i es van fixar en 4% PFA durant 45 min. A continuació, es van processar per immunodeposició mitjançant protocols estàndard. El anti-HA (ratolí) de ratolí es va utilitzar com a anticòs primari amb una dilució d'1: 1000. L'anticòs secundari anti-ratolí, conjugat a AlexaFluor 594 (Invitrogen), es va utilitzar amb una dilució d'1: 1000. El teixit es va muntar a Medi de muntatge DAPI (Vector Laboratories). Les imatges de la sèrie Z es van prendre en un microscopi ApoTome (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanya) mitjançant un objectiu oli x 63 (1, 4 NA) i es van processar mitjançant ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA) i Adobe Photoshop (Adobe Systems, San Jose, CA, EUA). En comparar la càrrega agregada entre genotips, es van mantenir constants totes les configuracions del microscopi.

Immunoblotting

La proteïna es va extreure dels caps de Drosophila en un tampó de lisi que contenia 20 mM HEPES, 0, 1 M KCl, 10 mM EDTA, 0, 1% TritonX-100, 1 mM DTT, 5% glicerol i un còctel inhibidor de proteasa complet (Roche). Les cèl·lules HD-150Q es van pelletitzar i lisar en tampó de lisi NP-40 (Tris de 50 mM, pH 8, 0, NaCl 150 mM, NP-40% 1 i còctel inhibidor de proteasa complet) i es van sonar breument. Les parts del cervell de ratolins van ser dissecades amb cura i homogeneïtzades en el tampó de lisi NP-40. Totes les mostres de proteïnes lisades es van centrifugar a 15 000 × g durant 10 minuts i es va utilitzar el sobrenedant per a la immunoblot. Els anticossos primaris utilitzats eren el conill anti-Cul1 (1: 1000, Invitrogen), el conill anti-Skp1 (1: 500, Senyalització cel·lular), el ratolí anti-c-mic (1: 1000, Santa Cruz Biotecnologia), el conill anti- β - catenina (1: 1000, biotecnologia de Santa Cruz), β -actina del ratolí (1: 5000, Abcam) i anti-GAPDH del ratolí (1: 5000, Biotecnologia de Santa Cruz). Es van utilitzar anticossos secundaris conjugats per HRP (Vector Laboratories) i es van desenvolupar blots mitjançant Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Billerica, MA, EUA). ImageJ es va utilitzar per quantificar el senyal a partir d’immunoblots. El valor obtingut per a la proteïna d'interès (Cul1 o Skp1) es va normalitzar al control de càrrega (GAPDH o β -actina). El canvi de plec representat s'ha calculat en comparació amb el control de cada experiment.

RT – PCR

L’ARN total es va extreure dels caps de mosques mitjançant el reactiu Trizol (Sigma) i seguint les instruccions del fabricant. Es va quantificar l’ARN total i es van utilitzar 75 ng en cada reacció RT-PCR. L' ADN dcul1 es va amplificar mitjançant els primers primer - Primer endavant 5'-AGCGCCGAATTAACATCAAC-3 '; Imprimació inversa 5′-ACAGCCCCTGCAGAAGTCTA-3 ′. El 44 RP49 es va utilitzar com a control de càrrega i es va amplificar mitjançant un imprimador endavant 5′-AGCGCACCAAGCACTTCATCCGCCA-3 '; Imprimació inversa 5′-GCGCACGTTGTGCACCAGGAACTTC-3 ′. La RT-PCR 45 es va fer mitjançant el kit Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen) d'un sol pas. El producte PCR es va fer servir amb un gel d’agarosa de bromur d’etidium i es va quantificar la intensitat de la banda mitjançant ImageJ.

Anàlisi de dades

Totes les imatges es van organitzar mitjançant Adobe Photoshop, els gràfics es van fer a SigmaPlot i les taules a Microsoft Word. Totes les dades estadístiques es van obtenir mitjançant la realització d'ANOVA de sentit únic seguit d'un test post-hoc o de proves de dos estudiants de dues cues, tal com s'indica a les llegendes de la figura. Els valors s'expressen com a mitjana ± SEM P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

Glossari

SCF

Proteïna Skp1-Cul1-F-box

HD

La malaltia de Huntington

MJD

Malaltia de Machado – Joseph

SCA3

Ataxia espinocerebel·lar 3

poliQ

poli-glutamina

SAI

sistema de proteosoma ubiquitina

tNhtt

Troncada de caça N-terminal

Contribucions d'autor

SB i NRJ van dissenyar els experiments; SB, AD i MM van realitzar els experiments; SCL va aportar reactius / materials; i SB, SCL i NRJ van escriure el manuscrit.

La informació complementària acompanya el document del lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)