El factor de creixement del fibroblast dissenyat 19 protegeix de les lesions hepàtiques induïdes per acetaminofen i estimula la regeneració hepàtica envellida en els ratolins | mort i malaltia cel·lular

El factor de creixement del fibroblast dissenyat 19 protegeix de les lesions hepàtiques induïdes per acetaminofen i estimula la regeneració hepàtica envellida en els ratolins | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Senyalització del factor de creixement
  • Malalties del fetge
  • Enginyeria molecular
  • Regeneració

Resum

El fetge mostra una notable capacitat regenerativa desencadenada a la lesió o resecció dels teixits. Tanmateix, la regeneració hepàtica es pot veure desbordada per una destrucció parènquima excessiva o disminuïda per condicions preexistents que dificulten la reparació. El factor de creixement del fibroblast 19 (FGF19, rosegador FGF15) és una enterokina que regula el metabolisme dels àcids biliars i dels lípids, i estimula la síntesi i la proliferació de proteïnes hepatocel·lulars. La FGF19 / 15 també és important per a la regeneració hepàtica després de l’hepatectomia parcial (PH). Per tant, l'FGF19 recombinant seria una molècula ideal per estimular la regeneració hepàtica, però la seva aplicabilitat es pot veure reduïda per la seva curta vida mitjana. Hem desenvolupat una molècula quimèrica anomenada Fibapo en la qual FGF19 s'acobla covalentment a la IA d'apolipoproteïna. Fibapo conserva les activitats biològiques de FGF19, però ha augmentat significativament la semivida i l'hepatotropisme. Aquí es va avaluar l’activitat pro-regenerativa de Fibapo en dos models clínicament rellevants en què es pot deteriorar la regeneració hepàtica: intoxicació amb acetaminofen (APAP) i PH en ratolins envellits. L’única teràpia aprovada per intoxicacions amb APAP és la N- acetilcisteïna (NAC) i no hi ha medicaments disponibles per estimular la regeneració hepàtica. Demostrem que Fibapo va reduir les lesions hepàtiques i va augmentar la regeneració en ratolins intoxicats amb APAP. Fibapo va millorar la supervivència dels ratolins enverinats amb APAP quan se'ls va donar en punts posteriors, quan el NAC no té efecte. Mecànicament, Fibapo va accelerar la recuperació dels nivells hepàtics de glutatió, va potenciar les vies relacionades amb el creixement cel·lular i va augmentar la massa hepàtica funcional. Quan Fibapo es va administrar a ratolins vells abans del PH, la regeneració hepàtica es va incrementar notablement. Es va atenuar la lesió exacerbada que es va desenvolupar en aquests ratolins després de PH i es va augmentar la capacitat biosintètica hepàtica. Fibapo va revertir alteracions metabòliques i moleculars que impedeixen la regeneració de la fetge envellida. Va reduir l’esteatosi hepàtica i va disminuir els nivells de p21 i el factor nuclear d’hepatòcits 4 α ( Hnf4α ), mentre que va estimular l’expressió gènica Foxm1b . Els nostres resultats indiquen que les variants de FGF19 que mantenen els efectes metabòlics i de foment del creixement d'aquesta enterokina poden ser valuoses per a l'estimulació de la regeneració hepàtica.

Principal

El fetge compleix un paper essencial en la desintoxicació de metabòlits i compostos exògens. En aquest procés es poden generar estímuls nocius, que causen la mort hepatocel·lular. Per fer front a aquesta situació, el fetge ha desenvolupat una extraordinària capacitat regenerativa sense igual entre altres òrgans. 1 La regeneració hepàtica també es manifesta com una resposta vigorosa després de l'eliminació quirúrgica d'una part del teixit. 2, 3 Per tant, en el context de danys parenquimàtics o de resecció de teixits es desencadena una reacció hepatoprotectora i regeneradora potent dins del fetge i també de forma sistemàtica. 1, 4 La regeneració hepàtica comporta mecanismes de supervivència i pro-mitogenic activats per fluctuacions de metabòlits, citocines i factors de creixement en un entrestat cel·lular i molecular. 1, 2 La resposta regenerativa sol concloure amb la restauració de la integritat histològica i la funció hepàtica, essencial per a l’homeòstasi i la supervivència. 5, 6 Tanmateix, hi ha circumstàncies en què la capacitat regenerativa del fetge es veu desbordada per l'extensió de la destrucció del parènquim o disminuïda per condicions preexistents que amplifiquen la lesió i dificulten la reparació de teixits. 7

En el context clínic, es poden produir lesions hepàtiques agudes que causen deteriorament de la funció hepàtica i la capacitat regenerativa en diferents situacions. Entre ells, la intoxicació per drogues és la primera de les causes de la sobredosi en acetaminofen (APAP) que suposa gairebé el 50% de tots els casos del món occidental. Actualment, l’únic medicament aprovat per tractar la intoxicació amb APAP és la N- acetilcisteïna (NAC). 8, 9 L’eficàcia del NAC es basa principalment en els seus efectes positius sobre els nivells de glutatió hepàtic (GSH), que s’exhaureixen pel metabolit NAPacetilp tòxic NAP-benzoquinona (NAPQI). El NAPQI desencadena disfunció mitocondrial, estrès oxidatiu i necrosi massiva d’hepatòcits. La mort hepatocel·lular desenllaça l’activació del sistema immune innat, una reacció cada vegada més reconeguda com a protectora i pro-regenerativa en lloc de resposta nociva. 9 Les observacions clíniques indiquen que la regeneració de noves cèl·lules parènquimals sembla essencial per a la supervivència després de la insuficiència hepàtica aguda induïda per APAP. Per tant, comprendre els mecanismes endògens de protecció i regeneració hepàtica pot permetre la identificació d’estratègies terapèutiques. 12, 13 En aquesta línia de pensament, la millora de la resposta regenerativa natural mitjançant l'administració experimental de factors de creixement i citoquines ha mostrat recentment efectes prometedors sobre la toxicitat per APAP. 14, 15, 16, 17, 18 L’ exploració de nous enfocaments terapèutics és important, ja que el NAC només és eficaç quan s’administra precoçment després de la intoxicació amb APAP i el trasplantament hepàtic és l’única alternativa terapèutica en casos greus. 10, 13

Un altre escenari clínic en què la regeneració hepàtica pot fallar és quan es realitza hepatectomia parcial (PH) en fetges malaltes o envellides per a l’eliminació de tumors primaris o metàstàsics o després d’un trasplantament segmentari de fetge. 7 Per exemple, els pacients amb fetge grasa, una malaltia generalment acompanyada de colestàsia, solen presentar pitjor resultat després de la resecció. 19, 20 Aquesta resposta deteriorada ha estat àmpliament validada en models experimentals d’hepatosteatosi. 21, 22 Igualment, la regeneració hepàtica es veu compromesa en pacients grans i rosegadors envellits. 23, 24, 25 Els mecanismes subjacents a la disminució de la capacitat regenerativa dels fetges envellits no són completament coneguts, tot i que s’han exposat alguns mecanismes de senyalització epigenètics i intracel·lulars que provoquen alteracions del cicle cel·lular. 23, 26, 27, 28, 29, 30 El desplegament d’aquests processos fonamentals pot conduir al desenvolupament de teràpies farmacològiques per alleujar defectes de regeneració hepàtica relacionats amb l’edat, com s’ha demostrat experimentalment en estudis recents. 23, 29, 31 Amb una població cada vegada més envellida, és important idear aquestes teràpies.

Nosaltres i d’altres hem mostrat recentment el paper significatiu del factor de creixement del fibroblast enterokine 19 (FGF19; FGF15 en rosegadors) 32, 33 i el seu receptor FGFR4 en la regeneració hepàtica després del PH. El 34, 35, 36 FGF15 / 19 controla l’homeòstasi dels àcids biliars (BA), redueix l’acumulació de greix hepàtic i millora la supervivència i la proliferació dels hepatòcits. El lliurament de FGF15 / 19 a partir de vectors virals millora la supervivència del ratolí després d’una extensa resecció hepàtica, 22, 34 i FGF19 recombinant protegeix de lesions hepàtiques i de la lipotoxicitat. 22, 37, 38 Des d’una perspectiva translacional, aquestes característiques identifiquen FGF15 / 19 com una eina prometedora per millorar la regeneració hepàtica en condicions desfavorables. Tot i això, FGF15 / 19 té una semivida molt curta amb una alta taxa de filtració glomerular. 38 Per evitar aquesta limitació, recentment hem desenvolupat una molècula quimèrica basada en la fusió de FGF19 amb apolipoproteïna AI (ApoA-I) anomenada Fibapo. 22 El fragment ApoA-I confereix a Fibapo una major estabilitat biològica i l’adreça al fetge mitjançant la interacció del fragment ApoA-I amb el receptor de l’hepatòcit de la classe B tipus I. 22 Aquí, demostrem l’aplicabilitat de Fibapo per al tractament de Lesió hepàtica induïda per APAP i en l'estimulació de la regeneració hepàtica envellida.

Resultats

Fibapo protegeix de la toxicitat APAP i millora la regeneració hepàtica

Per analitzar l'efecte de Fibapo sobre la toxicitat per APAP, els ratolins van rebre tres dosis de la proteïna recombinant 2, 10 i 24 h després de la injecció APAP (300 mg / kg). Els nivells de transaminases sèriques i la necrosi hepàtica centrilobular es van reduir mitjançant l’administració de Fibapo (figures 1a i b). La lesió hepàtica provocada per APAP va seguida d’una resposta regenerativa compensatòria. 39 Es va observar un clar augment de la proporció de pes hepàtic / pes corporal (figura 1c), la mida de les cèl·lules dels hepatòcits i la proliferació hepatocel·lular (etiquetatge de Ki-67) al tractament amb Fapo (figura 1d i figura suplementària 1). Consistentment, es va induir l'expressió de gens reguladors del cicle cel·lular Foxm1b , Cdc25b , Ccne1 i Ccnb2 (Figura 1e i Figura 2 Suplementària). En gran mesura, la FGF19 regula la proliferació i el creixement de les hepatocel·lulars mitjançant l’activació de l’objectiu mecanicista de la via cinasa del complex 1 de rapamicina (mTORC1) -p-70S6 kinasa (p70S6K). 22, 40 Vam observar que els ratolins tractats amb Fibapo després de l'administració APAP mostraven un augment dels nivells de p-p70S6K (figura 1f). Els nivells d’expressió hepàtica d’interleucina 10, una citocina implicada en la resposta hepatoprotectora endògena a la intoxicació amb APAP, 41 també es va induir de manera marcada (figura suplementària 3).

Image

L’administració de fibapús protegeix de lesions hepàtiques induïdes per APAP. ( a ) Nivells sèrics de ALT i AST en ratolins control (C), ratolins que van ser tractats amb APAP (A) (300 mg / kg) o ratolins que 2, 10 i 24 h després de la injecció APAP van rebre tres dosis de Fibapo (A + FA) ( n = 7 ratolins per grup). Les mostres de sang i teixit es van prendre 36 h després de l’administració d’APAP, quan es van matar ratolins. ( b ) Seccions de teixit hepàtic tenyides amb H i E representants de ratolins tractats tal com es descriu. S’indica zones necrotògiques (N). El gràfic mostra la quantificació de les zones necroses dels teixits. ( c ) Relació pes pesant hepàtic / pes corporal (índex hepàtic) en ratolins dels diferents grups de tractament descrits. ( d ) El tauler esquerre mostra la mida mitjana dels hepatòcits i el quadre dret mostra la quantificació dels hepatòcits amb nuclis positius Ki-67 en seccions de teixit hepàtic a partir de ratolins tractats com es descriu. ( e ) Anàlisi quantitativa de PCR de l'expressió de gens relacionats amb el cicle cel·lular en teixits hepàtics de ratolins tractats tal com es descriu. ( f ) Anàlisi Western blot de fosfo-p-70S6K (pp-70S6K) i nivells totals de p70S6K en mostres de teixit hepàtic de ratolins tractats com es descriu. Es mostren taques representatives. * P <0, 05 i ** P <0, 01 contra ratolins tractats amb APAP. AU: unitats arbitràries

Imatge a mida completa

Per provar més els efectes hepatoprotectors de Fibapo, vam tractar ratolins amb una dosi més alta d’APAP (500 mg / kg), que indueix una mortalitat important (vegeu més avall). Dues hores després dels ratolins d’injecció d’APAP van rebre una dosi única de Fibapo i van morir 6 i 10 hores després. En l'hepatotoxicitat APAP, el primer pas crític consisteix en l'esgotament de la GSH per conjugació amb NAPQI, el metabolit reactiu de l'APAP. 10 L'enzim principal en la formació de NAPQI és el citocrom 2E1 ( Cyp2E1 ). 9 L'expressió CYP2E1 no va ser modificada per Fibapo (figura 2a). Tot i que Fibapo no va impedir l'esgotament precoç de la GSH hepàtica, el contingut de GSH es va restablir als nivells de control durant 10 h (figura 2b). Aquestes observacions suggereixen que Fibapo no afectaria el metabolisme APAP ni les fases inicials de la toxicitat per APAP 10, però pot ajudar a la recuperació funcional dels hepatòcits tal com indiquen els nivells de GSH.

Image

Efectes de Fibapo sobre les primeres respostes hepàtiques a dosis letals d’APAP. ( a ) Anàlisi Western blot de l'expressió CYP2E1 al fetge de ratolins ( n = 7 per grup) tractats amb APAP (A) (500 mg / kg) que dues hores després van rebre una sola dosi de Fibapo (FA). Els ratolins van morir 6 i 10 h després de la injecció de l'APAP. Es mostren taques representatives. ( b ) Nivells de glutatió total (GSH) en els fetges de ratolins tractats tal com es descriu i es mata a les 6 h i les 10 h després de la injecció APAP. ( c ) Anàlisi del blot occidental de la fosfo-JNK (p-JNK) i els nivells totals de JNK en fraccions mitocondrials obtingudes de fetges de ratolins tractats tal com es descriu i es van matar a les 6 i 10 h després de la injecció APAP. Els nivells de proteïna COX IV es van analitzar com a control de càrrega. Es mostren taques representatives. ( d ) Anàlisi del blot occidental de fosfo-ERK1 / 2 (p-ERK1 / 2) i nivells totals de ERK1 / 2 en homogenats de fetge obtinguts de ratolins tractats tal com es descriu i es van matar a les 6 i 10 h després de l'administració APAP. Es mostren taques representatives. ( e ) Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells d'ARNm de Bcl-xL al fetge de ratolins tractats tal com es descriu i es va matar a les 10 h després de l'administració APAP. ( f ) Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells d'ARNm de IL-6 i IL-22 al fetge de ratolins tractats tal com es descriu i es va matar a les 6 hores i les 10 h després de l'administració APAP. ( g ) Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells d'ARNm dels receptors FGF19 FGFR4, FGFR1c i co-receptor Klb en macròfags murins de cultiu primari. AU: unitats arbitràries. ND: no detectat. * P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001 enfront de ratolins tractats amb APAP (A)

Imatge a mida completa

L’activació sostinguda i la translocació mitocondrial de la proteïna quinasa c-jun- N- terminal (JNK), que porta a la pèrdua del potencial mitocondrial i la producció d’ATP, ha estat relacionada mecànicament amb l’hepatotoxicitat d’APAP. 9, 42 Consistentment, vam observar que APAP augmentava la fosforilació de JNK i la translocació mitocondrial (figura 2c). Tot i que a les 6 h després de l’administració d’APAP els nivells de p-JNK no van ser afectats per Fibapo, aquests es van reduir significativament en 10 h (Figura 2c). Paral·lelament, es va observar un augment de l’activació de la quinasa extracel·lular regulada per quinasa 1/2 (ERK1 / 2), considerada part de la senyalització pro-regenerativa compensadora desencadenada per toxicitat APAP, 39, 43 en ratolins tractats amb fibromap (figura 2d). L'expressió de Bcl-xL , un inhibidor de la mort cel·lular depenent de les mitocondrials implicada en l'hepatoprotecció per lesió induïda per APAP, 14, 42 es va millorar en el tractament amb Fibapo (figura 2e).

La regulació d'IL-6 es detecta en ratolins intoxicats amb APAP i es considera part de la resposta protectora endògena. 41 En ratolins tractats amb l’expressió de IL-6 de Fibapo hepàtiques es va potenciar notablement (figura 2f). L'expressió de la citocina hepatoprotectora relacionada amb la IL-6 IL-22 41 també es va mantenir en el tractament amb Fapo (figura 2f). La inducció d'IL-6 per administració de FGF19 s'ha informat recentment en ratolins db / db . La font cel·lular de IL-6 en aquests animals eren cèl·lules mieloides infiltrades en el fetge, no obstant això, no es va avaluar el mecanisme precís amb el qual FGF19 va provocar la producció de IL-6. 44 senyals FGF19 a través de la isoforma C FGFR4 i FGFR1 (FGFR1c), i la coexpressió de la proteïna de membrana β- Klotho (Klb) és necessària per a una senyalització efectiva. 45 Es va examinar l’expressió d’aquests receptors en els macròfags de ratolí de cultiu primari. Curiosament, hem descobert que aquestes cèl·lules expressaven FGFR1c i Klb, però no FGFR4 (figura 2g).

L’administració tardana de Fibapo protegeix de les dosis letals d’APAP i estimula la regeneració parènquima

Per imitar millor la situació clínica, en què els pacients són tractats en èpoques tardanes després de la intoxicació amb APAP, els ratolins van rebre Fibapo o NAC a les 6 i les 24 h després de l'APAP. En aquest cas hem utilitzat 500 mg / kg d’APAP, una dosi que provoca mortalitat important i pot comprometre la resposta regeneradora endògena. 39 En aquestes condicions, el tractament NAC no va millorar la supervivència del ratolí, mentre que els ratolins que rebien Fibapo mostraven menys mortalitat i menors nivells d’enzims hepàtics circulants (figures 3a i b). També es va observar una major proliferació hepatocel·lular (etiquetatge de Ki-67) (figura 3c i figura suplementària 4) i el pes del fetge al pes corporal (figura 3d).

Image

L’administració tardana de Fibapo protegeix de les dosis letals d’APAP i estimula la regeneració hepàtica. ( a ) Els ratolins van ser tractats amb APAP (A) (500 mg / kg) i després 6 i 24 hores van rebre dues dosis de NAC (A + NAC) o Fibapo (A + FA). El gràfic mostra la supervivència total del ratolí a les 48 h després de la intoxicació amb APAP. ( b ) Els nivells sèrics d'enzims hepàtics en els ratolins tractats tal com es descriu i es mesuren a les 24 i 48 h després de la intoxicació amb APAP. ( c ) Quantificació d'hepatòcits amb nuclis positius de Ki-67, determinada per anàlisi immunohistoquímica realitzada en seccions de teixit hepàtic a partir de ratolins tractats com es descriu. Les mostres de teixit hepàtic es van obtenir de ratolins supervivents 48 h després de l’administració d’APAP. ( d ) Relació pes pesant hepàtic / pes corporal (índex hepàtic) en ratolins dels diferents grups de tractament descrits. Aquest paràmetre es va mesurar en ratolins que van sobreviure 48 hores després de l'administració APAP. a P <0, 05 vers A, b P <0, 05 vers A + NAC, ** P <0, 01 vers A + NAC, *** P <0, 001 contra A + NAC

Imatge a mida completa

Fibapo millora la regeneració hepàtica en ratolins envellits

Recentment vam informar que Fibapo millora significativament la regeneració de la fetge estetòtica. Els ratolins envellits també presenten una regeneració deteriorada, de manera que es va provar l'efecte de Fibapo en els ratolins vells que patien PH. Fibapo es va administrar durant 3 dies consecutius abans de la resecció. Tal com es va descriure, vam observar que el post de regeneració hepàtica es va reduir notablement en els ratolins vells, 46 mentre que aquesta resposta va ser significativament millorada per Fibapo (figures 4a i b). Les lesions parenquimàtiques, que s'agreuren en rosegadors envellits després de PH, 46, 47, també es va reduir per Fibapo (figura 4c). Curiosament, la capacitat biosintètica hepàtica també es va millorar notablement, tal com indiquen les concentracions d’albúmina sèrica (figura 4c). Consistentment, en la injecció de Fibapo vam detectar un augment dels nivells de p-p70S6K i una forta activació de la fosforilació S6, que enllaça la senyalització de FGF19 a la síntesi de proteïnes de les cèl·lules del fetge (figura 4d). 32, 40

Image

Fibapo millora la regeneració hepàtica en ratolins envellits. ( a ) Recuperació de la massa hepàtica després del 66% de PH en ratolins joves, ratolins envellits i ratolins envellits que van rebre tres injeccions de Fibapo (FA) tres dies consecutius abans de la cirurgia ( n = 6 ratolins per grup). ( b ) Quantificació d’hepatòcits amb nuclis positius de Ki-67 determinats per anàlisis immunohistoquímics realitzats en seccions de teixit hepàtic de ratolins envellits i ratolins envellits tractats amb Fibapo (FA) en els punts de temps indicats després del PH. ( c ) Circulant els nivells d'enzims hepàtics i albúmina en sèrum de ratolins joves, ratolins envellits i ratolins envellits tractats amb Fibapo (FA) mesurats en els punts de temps indicats després de PH. ( d ) Anàlisi Western blot dels nivells de fosfo-S6 (p-S6) (plafó esquerre) i nivells p-p70S6K (plafó dret) en els fetges de ratolins joves, ratolins envellits i ratolins envellits tractats amb Fibapo (FA). Les mostres de fetge es van analitzar 3 h després de l'administració de Fibapo. Es mostren taques representatives. ND: no detectat. * P <0, 05 davant de ratolins envellits tractats amb Fibapo

Imatge a mida completa

El tractament amb fibapo corregeix els defectes bioquímics i moleculars associats a la deterioració de la regeneració hepàtica en ratolins envellits

L’estereosi, que es troba habitualment en la fetge envellida, 47, 48 i la presència de colestàsia 22 i 49 associada a la esteatosi estan relacionades amb la regeneració deteriorada després del PH. 19, 20 En conseqüència, els ratolins envellits havien augmentat els nivells de triglicèrids intrahepàtics (TG) i BA total en comparació amb els ratolins joves (figura 5a). D'acord amb els efectes reguladors de Fibapo sobre el líquid hepàtic i el metabolisme BA, es van reduir significativament els nivells de 22, 33 de TG i BA intrahepàtics (Figura 5a). Mecànicament, Fibapo va inhibir l'expressió del receptor γ variant activat per proliferador de peroxisomes i gens del citocrom 7a1, mediadors clau de l'acumulació de TG hepàtica i síntesi de BA, respectivament 50, 51 (Figura 5a).

Image

Fibapo millora els paràmetres metabòlics i les alteracions moleculars associades a la deterioració de la regeneració hepàtica en ratolins envellits. ( a ) Anàlisi dels nivells intrahepàtics de triglicèrids (TG) i àcids biliars (BA) en ratolins joves, controlar ratolins envellits i ratolins en edat que van rebre tres injeccions de Fibapo (FA) tres dies consecutius abans de la cirurgia ( n = 6 ratolins per grup). Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells de ARNm de Pparg2 i Cyp7a1 en el fetge de ratolins joves, envellits i envellits tractats com es descriu. ( b ) Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells d' ARNm de Hgf , c-met, p21 i p16 en el fetge de ratolins joves, envellits i envellits tractats com es descriu. ( c ) Anàlisi quantitativa de PCR dels nivells de mRNA de Foxm1b , Dhfr i Cdc25b al fetge de ratolins joves, envellits i envellits tractats com es descriu. * P <0, 05, ** P <0, 01 i *** P <0, 001 versus ratolins de control

Imatge a mida completa

La regeneració hepàtica en edat deteriorada s'ha relacionat amb l'expressió defectuosa de gens implicats en la senyalització de factors de creixement i en la regulació del cicle cel·lular. 23, 30 Vam observar que la reducció expressió del factor de creixement dels hepatòcits ( Hgf ) i el seu receptor c-met que es trobava en els fetges de ratolins de 25 anys, 46 va ser revertida per Fibapo (figura 5b). Tal com es descriu, també es va detectar un augment dels nivells d’ARNm dels inhibidors del cicle cel·lular p21 i p16 en els fetges envellits. La sobreexpressió 46, 52 p21 va ser corregida de forma significativa per Fibapo, tot i que p16 va quedar sense alteració (figura 5b i figura suplementària 5). Entre els mecanismes més ben caracteritzats implicats en la deterioració de la regeneració hepàtica envellida, hi ha la repressió transcripcional de gens dependents de l'E2F. 23 Això es va demostrar en gens relacionats amb la proliferació de cèl·lules clau com Foxm1b i Dhfr . 53, 54 Expressió Foxm1b i Dhfr es va incrementar notablement en ratolins en edat tractats amb Fibapo (figura 5c). Consistent amb la forta inducció de l’expressió de Foxm1b, també es va induir Cdc25b , una fosfatasa Cdk important per a la progressió del cicle de cèl·lules de l’hepatòcit i un objectiu transcripcional de Foxm1b, 55 (figura 5c). D’acord amb això, també es va augmentar l’expressió de l’antigen nuclear cel·lular proliferador (PCNA) (figura 5 addicional).

Fibapo regula l'expressió gènica del factor nuclear 4 α (HNF4 α ) de l'hepatòcit

HNF4 α és un factor clau de transcripció per a la preservació de la diferenciació i quiescència dels hepatòcits. 5 HNF4 α knockdown en el fetge del ratolí produeix una resposta hepatoproliferativa forta. 56, 57, 58, 59 Notablement, s'ha informat recentment que l'expressió hepàtica de Hnf4α s'incrementa en rates envellides. 60 Hem validat aquesta observació en ratolins envellits, i també hem trobat que Fibapo reduïa HNF4 α mRNA i proteïnes (Figura 6a). L’activitat transcripcional HNF4 α es reprimeix en les primeres hores després del PH, permetent la inducció de gens primerencs mitjançant l’aparició de la regeneració hepàtica. 61, 62 En conseqüència, es va avaluar l'expressió HNF4 α poc després de PH i es va trobar una baixada però significativa regulació de l'expressió Hnf4α durant la resposta regeneradora normal en els ratolins joves (figura 6b). Aquestes observacions suggereixen que la regulació descendent de Hnf4α també pot contribuir a l'activitat pro-regenerativa de Fibapo en els fetges de ratolins envellits. Els mecanismes que regulen l’expressió de HNF4 α en el fetge adult són probablement complexos i no es coneixen del tot. 5 Anteriorment, vam informar que el regulador d’empalmament SLU7 és un factor fonamental en la preservació de la diferenciació i quiescència hepatocel·lular i un efectiu positiu de l’expressió del gen HNF4 α en el fetge del ratolí. 63 Per tant, es va determinar l'expressió de SLU7 en els fetges de ratolins joves i envellits, així com en ratolins envellits tractats amb Fibapo. Tal com s’observava per HNF4 α, vam trobar que els nivells d’ARNm de SLU7 eren més elevats en el fetge de ratolins envellits i es van reduir significativament després de l’administració de Fibapo (figura suplementària 6a).

Image

Efecte de la senyalització de Fibapo i FGF19 / FGFR4 sobre l'expressió del gen HNF4 α . ( a ) Els nivells de ARNm de Hnf4α i proteïnes en els fetges de ratolins joves, envellits i envellits que van rebre tres injeccions de Fibapo (FA) durant 3 dies consecutius ( n = 6 ratolins per grup). Els nivells de mnr de Hnf4α es van analitzar mitjançant nivells de PCR quantitativa i proteïna de Hnf4α mitjançant la taquillació occidental. Es mostren taques representatives. ( b ) Anàlisi quantitativa de PCR de mnrn de Hnf4α i Western blot anàlisi de nivells de proteïnes Hnf4α en el fetge de ratolins joves en punts primerencs després de PH ( n = 5 per punt i condició). S’utilitzen mostres de teixit hepàtic de ratolins que van patir laparotomia però que no van ser hepatectomitzats (ratolins operats de forma veritable, SH) com a controls. Es mostren taques representatives. ( c ) El quadre esquerre mostra els nivells d'ARNm de HNF4α analitzats per PCR quantitativa en cèl·lules Hep3B tractades durant 12 h amb les concentracions indicades de Fibapo. El tauler dret mostra els nivells de proteïna HNF4 α determinats per Western blot a les cèl·lules Hep3B tractades amb 50 ng / ml de Fibapo durant els períodes de temps indicats. Es mostren taques representatives. ( d ) Efecte de Fibapo sobre els nivells de proteïna HNF4 α a les cèl·lules Hep3B en presència de l'inhibidor de senyalització MEK-ERK UO126 analitzat per western blot. Les cèl·lules es van tractar prèviament amb UO126 (10 μ M) durant 45 min abans de l'addició de Fibapo (50 ng / ml) i es van lisar després de 8 hores de tractament. Es mostren taques representatives. ( e ) Efecte del Fibapo sobre els nivells de proteïna HNF4 α a les cèl·lules Hep3B en presència de l'inhibidor del proteasoma MG-132. Quan les cèl·lules indicades es van pre-tractar amb MG-132 (10 μ M) durant 45 min i després es van estimular amb Fibapo durant 8 hores. Es mostren taques representatives. ( f ) El tauler esquerre mostra l'efecte de la senyalització basal de FGFR4 sobre els nivells de proteïna HNF4 α a les cèl·lules Hep3B. Es van tractar les cèl·lules amb les concentracions indicades de l’inhibidor específic de FGFR4 BLU9931 durant 8 h i es van determinar els nivells de proteïna HNF4 α . El tauler dret mostra els nivells de proteïna HNF4 α en cèl·lules Hep3B transfectades amb un siRNA específic de FGF19 (siFGF19) o un siRNA de control (siGL) determinat per western blotting 72 h després de les transfeccions. Es mostren taques occidentals representatives

Imatge a mida completa

A continuació, es va avaluar si Fibapo podia regular directament l’expressió de HNF4 α a les cèl·lules del fetge. Els nivells de HNF4 α ARNm i proteïnes es van reduir a les cèl·lules Hep3B després del tractament amb Fibapo (Figura 6c), i això va ser parcialment depenent de la senyalització de la proteïna kinasa cinasa (MEK) de mitogen activada amb mitogen (figura 6d i figura suplementària 6b). De manera consistent, FGF19 també va reduir els nivells de proteïna HNF4 α i els nivells de proteïnes a les cèl·lules Hep3B (figura suplementària 6c). Curiosament, la regulació descendent de HNF4 α mediada per Fibapo era en gran mesura dependent del proteasoma (Figura 6e). L’especificitat d’aquestes troballes, i la importància del sistema de senyalització FGF19 / FGFR4 en la regulació de l’expressió α de HNF4, van ser recolzats en l’observació que tant la inhibició de FGFR4 amb BLU9931, un inhibidor de molècules petites específics de FGFR4, 64 o FGF19 col·locació per transfecció de siRNA, augment dels nivells basats de proteïnes HNF4 α basals (figura 6f i figura suplementària 6d).

Discussió

Es va avaluar el potencial terapèutic de Fibapo, una versió dissenyada de FGF19 amb una farmacocinètica millorada 22 en dos models clínicament rellevants d’insuficiència hepàtica aguda i deterioració de la regeneració. En la lesió hepàtica induïda per APAP, Fibapo va reduir la necrosi parènquima i va promoure una resposta regeneradora robusta. Fisiològicament, l’expressió de FGF19 és induïda per enterocits il·legals per BA durant la seva circulació enterohepàtica, i recentment FGF15 va ser identificada com a mediadora endògena important de la regeneració del fetge del ratolí i de la protecció parenquimàtica després del PH. 34, 35, 36 Es desconeix el paper de la FGF15 / 19 endògena en la toxicitat per APAP. No obstant això, la inhibició de l’expressió ilegal de FGF15 eliminant BA de la circulació enterohepàtica, o la seva regulació alimentant ratolins amb una dieta suplementada amb colat, van estar, respectivament, associades amb una augment o reduïda de lesions hepàtiques mediades per APAP. 65 Aquestes troballes, juntament amb les nostres observacions actuals sobre els efectes beneficiosos de Fibapo suggereixen un paper citoprotector i regeneratiu per a FGF15 en l’hepatotoxicitat de l’APAP. És probable que els mecanismes que medien l'hepatoprotecció amb Fibapo siguin diversos. Tot i que no va impedir l'esgotament precoç de la GSH hepàtica, la recuperació dels nivells de GSH va ser més ràpida en els ratolins tractats. Curiosament, es va observar un efecte similar sobre els nivells de GSH en ratolins intoxicats amb APAP tractats amb factor de creixement endotelial vascular. 15 En el cas de Fibapo, això pot reflectir una millora de les capacitats metabòliques hepàtiques generals, que concordaria amb els efectes positius de la FGF19 sobre el metabolisme de nutrients, la síntesi de proteïnes i les energies hepatocel·lulars. 32, 40 En suport d’aquesta noció, es va observar un augment de fosforilació p70S6K en ratolins tractats amb fibromap. S'ha informat recentment de l'activació de la via mTORC1-p70S6K per FGF19 al fetge. 22, 40 Aquesta via media efectes anabòlics robustos, incloent l'estimulació del creixement i la proliferació cel·lular. 66 A més de p70S6K, també es va detectar l’activació millorada d’ERK1 / 2, una cinasa fortament lligada a la proliferació d’hepatòcits. 32, 67 Curiosament, Fibapo va augmentar l’expressió de Foxm1b , un factor de transcripció essencial per a la proliferació d’hepatòcits, però també associat a la hipertròfia hepatocel·lular. 55, 68 D’acord, hem observat una resposta hiperproliferativa i hipertròfica en ratolins que van rebre Fibapo després de la intoxicació amb APAP. Aquests efectes combinats poden ser rellevants mecànicament, ja que el creixement i la regeneració del fetge estan sorgint com a determinants clau del resultat de la intoxicació amb APAP. De forma coherent, s’ha demostrat recentment que la inhibició del receptor del factor de creixement epidèrmic, un mediador clau de la regeneració hepàtica després del PH, 69 resulta en una regeneració deteriorada, una lesió hepàtica exacerbada i una alta mortalitat per intoxicació amb APAP. 70

Els efectes pro-regeneratius de Fibapo van anar acompanyats de lesions parènquimals reduïdes. La translació perllongada de la JNK activa a la mitocondria és un esdeveniment central en la mort hepatocel·lular induïda per APAP. 9, 42 Es va observar una reducció de l’activació de JNK mitocondrial després de l’administració de Fibapo. Actualment es desconeixen els mecanismes implicats en aquesta resposta. L’activació de JNK durant una lesió hepàtica mediada per APAP està fortament relacionada amb l’estrès mitocondrial i la producció d’espècies reactives d’oxigen. 10, 42 Podríem especular que una recuperació millorada dels nivells de GSH per Fibapo podria reduir l'estrès oxidatiu, atenuar l'activació de JNK i, per tant, limitar la seva translocació mitocondrial. No obstant això, es requereixen més estudis per definir els mecanismes precisos d'aquesta resposta. La reproducció de Bcl-xL també pot contribuir als efectes protectors de Fibapo, ja que Bcl-xL s'ha relacionat amb l'activitat hepatoprotectora del factor de cèl·lules mare i el kit-c en lesions hepàtiques induïdes per APAP. 14

L’activació del sistema immune innat després de la intoxicació amb APAP es considera cada cop més part d’una reacció protectora endògena. 9 En particular, l'expressió IL-6 sembla necessària per a la regeneració hepàtica. 71 Intrigant, vam observar que l’administració de Fibapo a ratolins tractats amb APAP millorava notablement l’expressió IL-6. Això suggereix que Fibapo també podria promoure la regeneració hepàtica mitjançant vies autònomes no cel·lulars. Els nostres resultats són consistents amb un informe recent que mostra la regulació hepàtica de IL-6 després de l'administració de FGF19 a ratolins db / db . En aquest estudi, la font d'IL-6 desencadenada per FGF19 eren cèl·lules mieloides infiltrants al fetge, encara que no es va examinar el mecanisme exacte de la inducció IL-6 mediada per FGF19. 44 A la vista d’aquestes i de les nostres observacions actuals, es va avaluar l’expressió dels receptors FGF19 FGFR4, FGFR1c i el co-receptor obligat Klb 45 en macròfags murins. Hem trobat que els macròfags de ratolí expressen FGFR1c i Klb, però no l’RNAm FGFR4. Segons sabem, aquesta és la primera descripció de l'expressió d'aquests receptors de les cèl·lules immunes innates i, i suggereix que els objectius cel·lulars de FGF19 i Fibapo podrien ser més amplis del que es pensava inicialment.

També es va demostrar el potencial terapèutic de Fibapo en el context de la regeneració hepàtica envellida. Curiosament, els nivells basals de FGF19 circulant són menors en persones grans en comparació amb els joves sans. 72 Tenint en compte l’important paper regulador de la FGF19 en el metabolisme dels greixos hepàtics, 22, 33, la seva reduïda disponibilitat en persones grans pot estar a l’abast de l’esteatosi habitualment trobada en aquesta població. 47, 48 L’ estereosi representa un obstacle important per a una bona regeneració hepàtica. 19, 20 La seva atenuació per part de Fibapo pot explicar en part la disminució de lesions i la millora de la regeneració hepàtica trobada en ratolins envellits. Tot i així, creiem que aquesta molècula també té accions més directes sobre els gens implicats en la proliferació hepatocel·lular. La restauració dels nivells d’expressió d’ Hgf i c-met , que es troben deprimits en fetge envellida, 25, 46 pot ser un efecte important de Fibapo donat el paper crucial del sistema HGF / c-Met en la regeneració del fetge. 69

Una de les barreres moleculars importants en la regeneració de la fetge envellida és la formació de complexos repressius en els promotors dependents de l'E2F, com els dels gens Foxm1b i Dhfr , essencials per a la proliferació cel·lular. 23 Vam observar que l’administració de Fibapo va induir una regulació robusta de Foxm1B i Dhfr . L’estimulació de l’expressió de Foxm1b per Fibapo pot ser un mecanisme d’acció clau. Certament, l’expressió hepàtica forçada de Foxm1b , ja sigui a partir d’un transgè o d’un vector adenoviral, millora la regeneració hepàtica en ratolins vells, 30, 73 i els efectes beneficiosos de l’hormona del creixement i els agonistes del receptor farnesoide X sobre la regeneració del fetge del ratolí envellit s’han relacionat amb la regulació de Foxm1b. . 26, 31, 53 A més, la inhibició de p21 i l'activació de l'expressió gènica Cdc25b provocada per Fibapo també poden dependre de l'estimulació de Foxm1b . 55 En paral·lel a la regulació de Foxm1b, vam trobar que Fibapo també va reduir els nivells de HNF4 α , un factor clau per a la preservació de la diferenciació i quiescència hepatocel·lular. 5, 56, 58 La major expressió de HNF4 α recentment trobada en fetges en edat, 60 i confirmada per nosaltres, podria suposar, certament, una barrera per a la regeneració hepàtica en animals vells. De fet, estudis recents han demostrat que poc després del PH hi ha una reducció de l’activitat reguladora transcripcional de HNF4 α en el fetge de ratolins joves. 61, 62 Tot i que aquesta disminució de l’activitat de HNF4 α pot ser deguda a la seva redistribució física sobre el genoma, tal com ocorre durant el desenvolupament del fetge, 74 es va observar una baixada regulació de l’expressió del gen HNF4 α en les primeres hores després del PH. Aquesta resposta prèviament no reconeguda pot formar part dels mecanismes moleculars que permeten l’entrada d’hepatòcits quiescents d’una altra manera al cicle cel·lular.

És probable que els mecanismes responsables de la regulació superior a HNF4 α en els fetges de ratolins envellits siguin diversos. Per exemple, s’ha informat que l’hipòxia tisular, una malaltia que es desenvolupa en el fetge d’animals vells, estimula l’expressió de HNF4 α en els hepatòcits. Ara, hem descobert que els nivells de SLU7, un gen que promou l'expressió de HNF4 α en el fetge adult, 63 es van incrementar en el fetge de ratolins envellits i es va interessar de baixar després de l'administració de Fibapo. Val a dir que l’expressió SLU7 també es redueix ràpidament en el fetge del ratolí poc després de PH, 63 amb cinètica que es superposa a les de l’expressió α de HNF4 reportades aquí.

Tot i que actualment es desconeix la identitat dels senyals endògens que medien la regulació descendent de HNF4 α després del PH, podríem induir aquest efecte en el fetge de ratolins envellits mitjançant tractament amb Fapo. Els nostres experiments in vitro van demostrar que Fibapo pot regular directament l’expressió gènica HNF4 α , tant a nivell transcripcional com postcripcional, promovent la degradació proteasomal de HNF4 α . Aquests resultats són consistents amb la inhibició descrita anteriorment de l’expressió del gen HNF4 α després de l’activació farmacològica de la via MEK-ERK a les cèl·lules parenquimals del fetge. Curiosament, també vam observar que la interferència amb la senyalització autocrina FGF19 / FGFR4 a les cèl·lules Hep3B va augmentar l'expressió HNF4 α . Aquesta resposta admet l’especificitat dels efectes Fibapo. Tanmateix, també pot tenir implicacions més àmplies en el context de l'hepatocarcinogènesi, on l'expressió HNF4 α està regulada constantment i la FGF19 sovint es sobreexpressa. 5, 76

Col·lectivament, les nostres observacions demostren l’eficàcia de molècules basades en FGF19 com Fibapo com a agents hepatoprotectors i pro-regeneratius. Els dos models experimentals implementats en aquest estudi reprodueixen situacions clíniques per a les quals manquen tractaments efectius. Per tant, la validació d'aquestes troballes en models de lesions agràries i de regeneració hepàtica amb animals més grans es justifica.

Materials i mètodes

Models animals

Tots els protocols experimentals van ser aprovats i realitzats segons les directrius del Comitè de cures d’animals de la Universitat de Navarra. Per a tractament amb APAP, es van injectar intraperitonealment ratolins a ratolins C57 / BL / 6 J, mascles d’entre 8 i 12 setmanes) amb 300 mg / kg o 500 mg / kg del compost després d’un dejuni nocturn. APAP (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) es va dissoldre en PBS càlid (55 ºC) i es va refredar a 37º abans de la injecció, tal com es descriu. 77 Quan es van matar ratolins indicats i es van extreure els fetges per ser incrustats en parafina o congelats en N2 líquid. Es van realitzar dos terços de PH en joves (entre 8 i 12 setmanes d’edat) i vells (entre 12 i 14 mesos) en mascles C57 / BL / 6 J, tal com es va descriure prèviament. En el model APAP, i en els punts de temps indicats per a cada experiment, els ratolins van rebre una injecció intravenosa de Fibapo (2 mg / kg), sintetitzada a petició de GenScript (Piscataway, NJ, EUA), una injecció intraperitoneal de NAC ( 600 mg / kg) (Sigma-Aldrich), o el mateix volum de solució salina (300 μl ). Els ratolins masculins envellits C57 / BL / 6 J van rebre una sola injecció subcutània diària de Fibapo (2 mg / kg) o salina durant tres dies abans del PH. Es van realitzar hepatectomies 24 h després de la darrera injecció tal com es va descriure anteriorment. 22 Per a l'anàlisi de la fosforilació hepàtica, S6 i p70S6K, se li va injectar per via intravenosa Fibapo (2 mg / kg) a ratolins que havien estat dejunats durant la nit.

Tractament i cultiu cel·lular

Es va cultivar la línia cel·lular de l'hepatocarcinoma humà Hep3B (de ATCC) tal com es descriu. Es van tractar 63 cèl·lules amb Fibapo en un medi DMEM lliure de sèrum i es va complementar amb una albumina sèrica bovina del 0, 2%. Quan les cèl·lules indicades van ser pre-tractades amb l’inhibidor MEK1 UO126 (10 μ M) (Promega, Madison, WI, EUA), l’inhibidor del proteasoma MG-132 (10 μ M) (Sigma-Aldrich) o l’inhibidor específic de FGFR4 BLU9931 (100 nM) (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA). 64 Per a la fallada de FGF19, les cèl·lules Hep3B es van transfectar amb siRNAs específics de FGF19 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) o amb siRNAs de control (siGL) durant 48 h com es va descriure anteriorment. Es van realitzar 63 experiments almenys tres vegades per duplicats. Els macròfags derivats de medul·la òssia es van preparar essencialment tal com es descriu. 78 Per induir la proliferació de macròfags, les cèl·lules de medul·la es van xapar en plaques de plàstic amb un sèrum fetal al 10% en RPMI1640 complementat amb un factor estimulant de macròfags i colònies murines recombinants de 100 ng / ml (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA).

Anàlisis de blot occidental

Les cèl·lules i els teixits hepàtics van ser lisats en el tampó RIPA i els homogenats van ser sotmesos a anàlisis Western blot segons es va informar. 34, 63 mitocondris de teixit hepàtic es van aïllar com es va descriure abans. 79 anticossos utilitzats van ser: anti-p-ERK1 / 2 (Thr202, Tyr204), anti-ERK1 / 2, anti-p-JNK (Thr183, Tyr185), anti-p-p70S6K (Thr389), anti-p70S6K, anti- p-S6 (Ser235, Ser236), anti-S6, anti- β -actina i anti-GAPDH (ambdues que es fan servir com a controls de càrrega) de la tecnologia de senyalització cel·lular (Beverly, MA, EUA); anti- α -tambulina, anti-CCNE1, anti-PCNA, anti-p21 i conill policlonal anti-HNF4 α (H-171) eren de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA); el ratolí monoclonal anti-HNF4 α (PP-K9218-00) era de Perseus Proteomics Inc. (Tòquio, Japó); l'anti-CYP2E1 i l'anticitocrom oxidasa IV eren d'Abcam (Cambridge, Regne Unit). Els nombres que es mostren a les imatges de tacte indiquen la quantificació de la intensitat de les bandes (valors mitjans) en relació amb els controls, als quals se'ls donava arbitràriament el valor d'un.

Aïllament de l'ARN i qPCR

Es va extreure ARN total de teixits hepàtics i cèl·lules Hep3B mitjançant el sistema automatitzat Maxwell de Promega. La transcripció inversa es va realitzar tal com es descriu. Es van realitzar 63 PCRs en temps real amb iQ SYBR Supermix Green (BioRad, Hercules, CA, EUA) en un sistema CFX96 de BioRad com es va descriure anteriorment. A la taula complementària es descriuen 63 imprimibles.

Determinació del contingut de triglicèrids hepàtics

La concentració de TG intrahepàtica es va mesurar per saponificació en KOH etanòlic i determinant equivalents de trioleïna mitjançant un kit disponible comercialment (BQ029A-CR, BQ Kits, San Diego, CA, EUA) tal com es descriu. 22

Determinacions histològiques

Les mostres de teixit hepàtic es van fixar en la formalina i es van incrustar en la parafina. Es va realitzar la immunodistenció de Ki-67 tal com es descriu. El nombre d’hepatòcits Ki-67 positius es va determinar en 10 camps hepàtics per ratolins (amplificació × 10) mitjançant el programari ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EUA). Per avaluar el grau de necrosi dels teixits es va realitzar una tinció d’H & E segons es va informar anteriorment. 34 La mida de les cèl·lules de l’hepatocit es va determinar després de la immunoconservació de seccions de β- catenina de seccions de parafina per descriure els hepatòcits individuals, l’anticòs anti- β- catenina era de la tecnologia de senyalització cel·lular. Per calcular la mida de les cèl·lules de l’hepatòcit es van analitzar 10 camps (× 40) per mostra de teixit tal i com hem descrit anteriorment. Segons es va informar, es va determinar el contingut de GSH en els teixits hepàtics. 77 Per a la determinació dels nivells hepàtics de teixits hepàtics BA es van homogeneïtzar a l'aigua (5 mg / 500 μ l), es van sonicar i centrifugar a 10 000 × g durant 10 min. BAs concentrations were determined in supernatants by an enzymatic/colorimetric method using a commercially available kit (Randox Laboratories, Crumlin, UK) as reported. 22

Serum biochemistry

Serum levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase and albumin were measured as previously reported. 22, 34, 63

Anàlisi estadística

Data are means±SEM Data were compared using the Student t -test. A P- value of <0.05 was considered significant. Data analyses were performed using GraphPad Prism software (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) version 7.0 was employed for statistical analyses.

Publisher's Note:

Springer Nature segueix sent neutre pel que fa a reclamacions jurisdiccionals en mapes publicats i afiliacions institucionals.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

  4. 4.

    Figura suplementària 4

  5. 5.

    Figura suplementària 5

  6. 6.

    Figura suplementària 6

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

  2. 2

    Taula suplementària 1

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)