L’inhibidor d’estrès er atén la pèrdua auditiva i la mort de les cèl·lules del cabell en ratolins mutants cdh23erl / erl | mort i malaltia cel·lular

L’inhibidor d’estrès er atén la pèrdua auditiva i la mort de les cèl·lules del cabell en ratolins mutants cdh23erl / erl | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Cèl·lula del pèl
  • Manifestacions neurològiques

Resum

La pèrdua auditiva és una de les alteracions sensorials més freqüents en humans. Els models mutants del ratolí ens van ajudar a comprendre millor els mecanismes de pèrdua auditiva. Recentment, hem descobert que la mutació erlong ( erl ) del gen cadherin23 ( Cdh 23) condueix a una pèrdua auditiva per l’apoptosi de les cèl·lules del pèl. En aquest estudi, es va voler revelar les vies moleculars a l’apoptosi a les cèl·lules del pèl per explotar terapèutiques més efectives que una estratègia anti-apoptosi. Els nostres resultats suggereixen que l'estrès del reticle endoplasmàtic (ER) és el primer fet molecular que condueix a l'apoptosi de les cèl·lules del pèl i a pèrdua auditiva en ratolins erl . També informem que l’inhibidor d’estrès ER, Salubrinal (Sal), podria retardar la progressió de la pèrdua auditiva i preservar les cèl·lules del pèl. Els nostres resultats proporcionen evidència que les teràpies dirigides a vies de senyalització en el desenvolupament d’estrès ER permeten que l’apoptosi de les cèl·lules capil·lars es trobi en una fase inicial i condueixi a millors resultats que els que s’orienten a factors aigües avall, com la degeneració de l’enllaç de punta i l’apoptosi.

Principal

La proteïna cadherina 23 (CDH23) es localitza a la part superior de l’enllaç de punta en les cèl·lules del pèl, on funciona com a component clau. 1, 2, 3 En humans, les mutacions de Cdh 23 causen sordesa recessiva autosòmica no sindroma (DFNB12) i síndrome Usher tipus 1D, USH1D, caracteritzada per sordesa associada a la retinitis pigmentosa i disfunció vestibular. 4, 5, 6 En els ratolins, les mutacions de Cdh 23 condueixen a pèrdua auditiva amb o sense disfunció vestibular. 7, 8, 9 Recentment, hem identificat una nova mutació puntual (T208C) de Cdh 23 i hem anomenat aquesta mutació erlong (erl). 10 Els ratolins Cdh23 erl / erl (ratolins erl ) van resultar ser models animals de DFNB12. Anteriorment, vam demostrar que l’apoptosi de les cèl·lules del pèl és un dels mecanismes patològics que condueixen a pèrdua auditiva d’aquest mutant. 10 A continuació, hem volgut revelar que la senyalització d’estrès ER és la via amunt que porta a l’apoptosi de cèl·lules capil·lars en ratolins amb mutació erl , i hem buscat trobar possibles terapèutics.

La perturbació de l’homeòstasi del reticle endoplasmàtic (ER) condueix a l’acumulació de proteïnes desplegades o desplegades en el lumen ER, provocant estrès ER. La resposta de proteïna desplegada (UPR) es desencadena posteriorment per alleujar aquest estrès i restaurar l’homeòstasi ER, promovent l’adaptació i la supervivència cel·lulars. Per contra, si l’estrès s’allarga o si la resposta adaptativa falla, s’iniciarà la via d’apoptosi. 11, 12, 13 La UPR està mediada a través de tres receptors transmembrana ER: proteïna quinasa ER kinasa similar a RNA (PERK); activant el factor de transcripció-6 (ATF6); i enzim 1 que requereix inositol (IRE1). 11, 12, 13, 14 Aigües amunt d’aquesta xarxa, la proteïna que uneix la immunoglobulina (BiP) de chaperona ER funciona com a regulador principal en dissociar-se dels dominis luminals PERK, ATF6 i IRE1 i activar així les respostes d’estrès d’aquests efectors. Com a senyal aigües avall, es considera que el CCAAT / proteïna que homologa la proteïna que homologa (CHOP) és un indicador molt sensible de les condicions d’estrès ER, i la seva inducció promou majoritàriament la mort cel·lular. 11, 13

Un estudi recent sobre mutants del peix zebra va revelar que les proteïnes Usher, inclòs el CDH23, formaven un complex i després es van assemblar a la ER. 15 Els defectes de les proteïnes Usher van interrompre la formació complexa, van induir els defectes del trànsit de proteïnes i finalment van desencadenar l'estrès ER i l'apoptosi. Per tant, el bloqueig de factors pro-apoptosi d’estrès ER podria reduir la mort cel·lular en els mutants del peix zebra. 15 Com que la mutació d’ erl afecta a Cdh 23, el mateix gen que causa l’USH1D en humans, és raonable especular que la proteïna ERL-CDH23 pot suportar el tràfic defectuós, provocant així l’estrès ER i provocant apoptosi de les cèl·lules del cabell i deficiència auditiva en mutants erl. . En el present estudi, es va provar l'expressió de la chaperona ER BiP i el factor pro-apoptòtic CHOP en els cochleae de ratolí C57BL / 6 J (B6). Les nostres dades mostren que l’estrès ER i la resposta d’UPR van ser les causes subjacents a l’apoptosi en els cochleae erl, i la senyalització PERK va ser col·laboradora. Més important encara, informem aquí que el petit compost molecular de l’inhibidor d’estrès ER Salubrinal (Sal) podria alentir la progressió de la pèrdua auditiva i la mort de les cèl·lules del pèl en ratolins erl . Aquests resultats ofereixen una teràpia potencial per a DFNB12 humans i possiblement protegeixen la funció visual d’individus amb síndrome d’Usher.

Resultats

El CDH23 no va aconseguir parcialment arribar al capdamunt dels feixos de pèl i es va co-localitzar amb BiP a les regions subapicals de les OHC en ratolins erl

Es va mesurar la distribució de CDH23 en cèl·lules exteriors de pèl coclear (OHCs) en ratolins erl i ratolins B6. A la P4, la proteïna CDH23 es va localitzar específicament a la part superior dels OHCs en ratolins B6, tal com es revela amb imatges 3D confocals, que indica la localització dels enllaços de punta en els estereòcilis de pèl (Figura 1a). En canvi, la proteïna CDH23 localitzada des de l’estereocília als nuclis dels OHCs en ratolins erl. Les porcions de les proteïnes CDH23 no van arribar a la part superior dels feixos del pèl i es van mantenir al citoplasma OHC. Immunostaining va demostrar que la chaperona ER BiP es va detectar més fàcilment a gairebé la mateixa regió i es va co-localitzar amb CDH23 citoplasmàtic en els OHCs del ratolí erl a P6 (Figura 1b), mentre que no es va detectar cap senyalització BiP específica en el citoplasma dels OHCs del ratolí B6. . Els gràfics de línies van confirmar la major expressió de BiP i la seva co-localització amb CDH23 en el citoplasma erl OHC (Figura 1c) en comparació amb la intensitat de fluorescència de CDH23 i BiP.

Image

Expressió i co-localització de CDH23 amb BiP en cochleae de ratolí erl. ( a ) Les seccions de pila confocal superior i inferior i la reconstrucció en 3D de les imatges confocals (x63) van revelar la ubicació de CDH23 a la B6 (mida de voxel 512 × 512 × 0, 045 μ m 3 i volum total 23, 2 × 23, 2 × 14, 9 μ m 3 ) i erl (mida de voxel 1024 × 1024 × 0, 027 μ m 3 i volum total 27, 2 × 27, 2 × 27, 2 μ m 3 ) OHC a P4. En els ratolins B6, es va localitzar específicament la proteïna CDH23 a la punta de l’estereocília dels OHC. Els ratolins OHC van mostrar una àmplia gamma d'expressions CDH23 (des de l'estereocília fins al nucli). Al voltant dels nuclis, no es va trobar cap senyal de CDH23 detectable en els ratolins B6, mentre que en els ratolins erl es van detectar molts punts del senyal CDH23 en aquesta regió ( n = 3 ratolins per grup). Barres d’escala, 5 μ m. ( b ) La localització i co-localització de BiP i CDH23 a la B6 i els cochleae erl a P6. Els ratolins B6 mostraven senyals BiP febles i senyals clars CDH23, particularment a la part superior de les OHC. El biP es va detectar molt als OHCs, SG i StV dels ratolins erl , i es va co-localitzar amb CDH23 a les regions subapicals dels OHCs ( n = 3 ratolins per grup). Barres d’escala, 50 μ m (esquerra); 20 μ m (dreta). ( c ) Els gràfics de línies mostren gràfics bidimensionals de les intensitats de fluorescència en brut de les fletxes blanques dibuixades als panells a l'esquerra, segons s'ha analitzat amb el programari Image J. La X -axis representa la distància (píxels) al llarg de la línia, i la Y -axis és la intensitat del píxel. Els senyals BiP van ser altament expressats en ratolins erl i parcialment solapats amb els senyals CDH23 ( n = 3 ratolins per grup)

Imatge a mida completa

El braç PERK d'UPR es va activar a les còclees de ratolí erl

El marcador d’estrès ER BiP es va regular en les orelles interiors dels ratolins erl , en comparació amb els dels ratolins B6. En les mesures de mRNA aïllats dels cochleae de ratolí erl, BiP es va regular a P12, però es va regular a P30 (Figura 2a). Immunostaining no només va mostrar una major expressió de BiP en OHCs, sinó que també es va expressar BiP a nivells més elevats en cèl·lules de ganglió en espiral (SG) i en estria vascularis (StV) a les erl cochleae P6 i P12 (figura 2b i c). En consonància amb les imatges tridimensionals confocals (3D), els senyals BiP es van localitzar principalment en el citoplasma OHC i van formar un patró similar al barret per sobre dels nuclis dels OHCs (Figura 2b i c). L’objectiu de la kinasa del PERK de l’efector d’estrès ER, la subunitat alfa subforçada fosforilada del factor d’iniciació eucariota (eIF2α), també va mostrar una forta localització a les regions perinuclears de les OHCs a l’erl cochleae (figura 3).

Image

Expressió BiP en els cochleae del ratolí B6 i erl. ( a ) Els nivells de mRNA de Bip a les còclees del ratolí B6 i els ratolins erl a P12 i P30. El nivell de mRNA de Bip va ser significativament més elevat en els ratolins erl a P12, però va disminuir a P30, en comparació amb els cocleus B6. Les barres d'error representen SEM (* P <0, 05, n = 3 ratolins, t- test). ( b, c ) La BiP va mostrar intensitats més elevades en la STV, la SG i sobretot els OHC dels ratolins erl, formant un patró similar al barret a la part superior dels nuclis dels OHC a P6 i P12. Una anàlisi d’intensitat de línia va revelar que els senyals de BiP s’expressaven a l’àrea OHC de l’erl coclear ( n = 4 ratolins per grup). Barres d’escala, 50 μ m (esquerra); 20 μ m (dreta)

Imatge a mida completa

Image

La fosforilació eIF2α a les coclees B6 i erl a P30 . L’etiquetatge d’immunfluorescència de fosfo-eIF2α va mostrar una forta localització citoplasmàtica i perinuclear a les còclees dels ratolins erl. L’anàlisi de la intensitat de la línia al llarg de la fletxa que es mostra als plafons a l’esquerra va revelar que els senyals p-eIF2α s’expressaven a les zones OHC i stria vascularis (StV) i es detectaven fortament al voltant dels nuclis de l’erl cochleae ( n = 3 ratolins per grup). Barres d’escala, 50 μ m (superior); 20 μ m (inferior)

Imatge a mida completa

Aigües avall del braç PERK, el factor pro-apoptòtic CHOP també es va expressar a nivells més elevats en les cochleae erl (figura 4). A nivell de mRNA, Chop va mantenir una expressió més alta en les cochleae erl en comparació amb les cochleae B6 a P12 i P30 (Figura 4a). L’immunostaining realitzat a la mateixa edat va demostrar que el CHOP es va detectar molt als OHCs, SG i StV de ratolins erl i es va detectar principalment a les regions perinuclears dels OHCs (Figura 4b i c). Tot i això, un senyal CHOP nu estava present en les cochleae del ratolí B6.

Image

Expressió CHOP als cochleae del ratolí B6 i erl. ( a ) Els nivells d'ARNm de Chop a les còclees del B6 i els ratolins erl a P12 i P30. El nivell de mRNA de Chop va ser significativament més alt a P12 i P30 a les còclees erl que a les còclees B6. Les barres d’error representen SEM (* P <0, 05, n = 3 ratolins, prova t ). ( b, c ) CHOP va mantenir majors intensitats en estria vascularis (StV), ganglió en espiral (SG), especialment a la regió perinuclear entre nucli i feixos de pèl dels OHCs als ratolins erl a P12 i P30 ( n = 3 ratolins per grup). Barres d’escala, 50 μ m (esquerra); 20 μ m (dreta)

Imatge a mida completa

Disrupció de l’audició protegida del gen Chop i dels OHCs en ratolins erl

Per confirmar encara més la implicació de Chop en l’apoptosi induïda per l’estrès ER en els ratolins erl , es van utilitzar ratolins de doble mutació que contenien la mutació erl al gen Cdh 23 i una interrupció del gen Chop . Els ratolins consagrats es van obtenir creuant els ratolins Chop - / - amb els ratolins Cdh23 erl / erl . Es van generar nou genotips de ratolins que compartien el mateix fons genètic (C57BL / 6): Cdh23 + / + Chop + / + ; Cdh23 + / + Picar +/– ; Cdh23 + / + Chop - / - ; Cdh23 + / erl Picar + / + ; Cdh23 + / erl Picar +/– ; Cdh23 + / erl Chop - / - ; Cdh23 erl / erl Picar + / + ; Cdh23 erl / erl Picar +/– ; i Cdh23 erl / erl Chop - / - . La figura 1 complementària mostra el genotipat dels ratolins Cdh23 erl / erl de doble mutant Chop - / - . Es van mesurar l’audició i els citocleogrames del Cdh23 erl / erl Chop - / - ; erl ( Cdh23 erl / erl Chop + / + ); i ratolins Chop - / - ( Cdh23 + / + Chop - / - ). A les deu setmanes, els llindars de resposta cerebral evocats auditivament (ABR) en els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - dobles mutants van ser significativament millors que els dels ratolins erl (figura 5a). La preparació superficial realitzada a la mateixa edat va revelar una menor pèrdua de OHC en els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - de doble mutació en comparació amb els ratolins Cdh23 erl / erl . En els ratolins erl , es van mostrar diversos punts de pèrdua de OHC a les voltes basal i mitjana, i es van mostrar algunes pèrdues de OHC en els torns apicals de la còclea. No obstant això, en els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - de doble mutació, no es va trobar pèrdua de OHC a tota la longitud de les còclees (figura 5b). L'estudi quantitatiu va demostrar que el percentatge mitjà de pèrdua de OHC en els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - va ser significativament inferior al dels ratolins erl (Figura 5c).

Image

L’audició i la preservació de l’HHC als ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - . ( a ) Els llindars ABR en els ratolins Cdh23 de doble mutant erl / erl Chop - / - ratolins, ratolins Chop - / - (Cdh23 + / + Chop - / - ) i ratolins erl ( Cdh23 erl / erl Chop + / + ) a Estímuls de 8, 16 i 32 k Hz a les 10 setmanes. Els ratolins Chop - / - mostraven nivells auditius normals. Els ratolins erl mostraven deficiència auditiva durant tots els estímuls. Els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - de doble mutant mostraven llindars ABR inferiors als ratolins erl durant tots els estímuls. Les barres d'error representen SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 8 ratolins, t- test). ( b ) Les preparacions de muntatge sencer de les voltes basals, mitjanes i apicals de la còclea es van tacar per a actina F als ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - i ratolins erl a les 10 setmanes. Els ratolins erl van mostrar algunes pèrdues de OHC al torn apical i una evident pèrdua de OHC a les voltes mig i basal. No es va observar cap pèrdua de OHC a les longituds completes de les còclees Cdh23 erl / erl Chop - / - dobles mutants. Barra d’escala, 20 μ m. ( c ) Els percentatges mitjans de pèrdua de OHC a les regions apicals, mitjanes i basals de la còclea als ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - i erl a les 10 setmanes. Els ratolins erl mostraven percentatges significativament superiors de pèrdua de OHC que els ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - . Les barres d'error representen SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 5 ratolins, t- test)

Imatge a mida completa

Sal va evitar la pèrdua auditiva en els ratolins erl

Després de rebre els tractaments corresponents, els ratolins errònics de la prova, els vehicles i els grups de control es van sotmetre a proves d’ABR i d’emissió otoacústica de producte de distorsió (DPOAE) a les mateixes edats. Els llindars ABR del grup de prova van ser significativament inferiors als del vehicle i grups de control en resposta a 16 (figura 6a i b), 8 i 32 kHz estímuls de ràfega i clic (figura suplementària 2). No es va trobar cap diferència significativa entre el vehicle i els grups de control. L’efecte otoprotector es va confirmar encara més per les majors amplituds de DPOAE. A les 8 setmanes, les amplituds de DPOAE al grup de proves van ser significativament majors en freqüències elevades (figura suplementària 3a). A les 12 setmanes, el grup de prova va mostrar amplituds de DPOAE molt més elevades a gairebé totes les freqüències (figura 6c). A les 16 setmanes, els ratolins dels tres grups van mostrar amplituds més baixes de DPOAE, mentre que les amplituds del grup de prova es van mantenir més elevades a freqüències baixes (figura suplementària figura 3b).

Image

Sal millora l’audició en els ratolins erl . ( a ) A les 12 setmanes, els ratolins tractats amb vehicles presentaven llindars ABR molt més elevats que els ratolins tractats amb Sal a estímuls de 16 kHz. Les línies i les fletxes de colors representen formes d'ona de llindar. ( b ) Els llindars ABR estimulats a 16 kHz en els ratolins tractats amb Sal eren significativament inferiors als del DMSO i els ratolins no tractats de 4 (W) a 16 setmanes. No es va trobar cap diferència significativa entre els grups no tractats i DMSO. ( c ) Les amplituds de DPOAE en els ratolins tractats amb Sal eren molt superiors a les de 12 setmanes amb ratolins no tractats i tractats amb DMSO. No es va trobar cap diferència significativa entre els grups no tractats i DMSO. Les barres d'error representen SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 5 per grup, ANOVA d'un sol sentit)

Imatge a mida completa

Sal protegida contra la mort de OHC en ratolins erl

Es va realitzar una preparació de superfície coclear a ratolins erl a la prova, vehicles i grups de control a les 12 setmanes. La deterioració de l’HOC era evident en el vehicle i els grups de control, mentre que la pèrdua d’HOC era molt mínima en el grup de prova (Figura 7a). En els vehicles i grups de control, es van observar diversos punts contigus substancials de pèrdua de OHC a les voltes basal i mitjana, i es va observar alguna pèrdua de OHC en els girs de l’àpex. En canvi, els ratolins del grup de prova només van mostrar petites quantitats de pèrdua de OHC al torn basal i una pèrdua rara de OHC a la volta mitjana. El percentatge mitjà de pèrdua d’HHC en el grup de prova va ser significativament inferior al del vehicle i els grups de control (figura 7b). No es va trobar cap diferència significativa entre el vehicle i els grups de control.

Image

Sal va evitar la pèrdua de OHC als ratolins erl . ( a ) Els preparats de muntatge complet a partir de les voltes basals, mitjanes i apicals de la còclea als ratolins no tractats, tractats amb DMSO i amb tractament de Sal a les 12 setmanes. En els grups de vehicles i control, es va observar una pèrdua de OHC en els girs basals i mitjans, i aquestes pèrdues van ser més destacades en el torn basal. Al torn apical, els vehicles i grups de control mostraven patrons OHC desorganitzats, però gairebé sense pèrdues cel·lulars. El grup de prova va mostrar petites quantitats de pèrdua de OHC a les voltes basal i mitjana i una disposició normal al torn apical. Barra d’escala, 20 μ m. ( b ) Els percentatges mitjans de pèrdua de OHC a les regions apicals, mitjanes i basals de la còclea als ratolins tractats amb Sal van ser significativament inferiors als de ratolins no tractats i tractats amb DMSO a les 12 setmanes. No es van observar diferències significatives entre el DMSO i els grups no tractats. Les barres d’error representen SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, n = 4 per grup, ANOVA unidireccional). ( c ) La morfologia OHC i les estructures subcel·lulars escanejant el microscopi electrònic a partir de les voltes basals de les còclees de ratolins erlats no tractats i tractats amb Sal a les 12 setmanes. Els ratolins no tractats van mostrar una pèrdua gairebé total de OHC i una lleugera pèrdua de cèl·lules interns en el torn basal. Els ratolins tractats amb Sal mostraven poca pèrdua de OHC i una disposició gairebé normal de feixos de pèl. Estrelles marquen les pèrdues d'OHC. Barres d’escala, 10 μ m (esquerra); 1 μ m (dreta)

Imatge a mida completa

Es va utilitzar un microscopi electrònic d’escaneig per analitzar la morfologia OHC i les estructures subcel·lulars a les 12 setmanes (figura 7c). Les imatges mostraven que els ratolins erl no tractats presentaven una pèrdua gairebé total de OHC i cap estructura subcel·lular detectable de feixos de pèl al torn basal. En canvi, els ratolins tractats amb Sal van mostrar petites quantitats de pèrdua de OHC i arranjaments normals aproximats de feixos de pèl.

Sal va suprimir l’apoptosi induïda per l’estrès ER en ratolins erl

Després dels tractaments de Sal, es van descartar els gens i proteïnes relacionats amb l'estrès ER i amb l'apoptosi. Els nivells d’expressió de mRNA dels gens BiP , Chop, caspase-3 i caspase-12 es van provar a la P30 i a les 12 setmanes. Els resultats van demostrar que Bip i Chop van disminuir en el grup Sal ​​enfront del grup de vehicles a P30, i la caspasa-3 es va descartar a les 12 setmanes (figures 8a i b). Tanmateix, no es va trobar cap diferència significativa en l’expressió gènica caspasa-12 (figura suplementària 4). La proteïna BiP i la proteïna caspase-3 extreta de les còclees de ratolí erl al vehicle i els grups de prova es van mesurar mitjançant Western blot a P30. Els resultats van mostrar que BiP i la caspasa escindida 3 eren molt menys abundants en les còclees tractades amb Sal que en les còclees tractades amb vehicles (Figures 8c). A més, el CHOP es va etiquetar immunomarcat en el vehicle i grups de proves a P30. Els resultats van mostrar que els senyals CHOP dels OHCs, SG i StV en cochleae tractats amb DMSO estaven força afeblits pel tractament Sal, i la diferència més significativa en l’expressió CHOP es va veure a les regions perinuclears dels OHCs (Figures 8d).

Image

Sal va restringir l'estrès ER i els gens i les proteïnes relacionats amb l'apoptosi. ( a ) L' ADNm de BiP i Chop es va regular en els ratolins tractats amb Sal a la P30. Tot i això, no es va trobar cap diferència significativa en els nivells d'ARNm de Caspase-3 (** P <0.01, * P <0.05, NS, no significativa, n = 3, t- test). ( b ) A les 12 setmanes, els nivells d'ARNm de Caspase-3 es van registrar notablement en els ratolins tractats amb Sal, en comparació amb els ratolins tractats amb DMSO; tanmateix, no es van trobar diferències significatives en els nivells d’ARNm de BiP i Chop (** P <0.01, * P <0.05, NS, no significatius, n = 3, t- test). ( c ) Els nivells de proteïna BiP i clivellats de caspasa-3 a les còclees dels ratolins tractats amb Sal eren molt inferiors als dels ratolins tractats amb DMSO a P30. Es van trobar diferències significatives entre el DMSO i els ratolins tractats amb Sal en les seves quantitats de BiP i la caspasa-3 escindida. Les barres d'error representen SEM (** P <0, 01, * P <0, 05, NS, no significatiu, n = 3, t- test). ( d ) Els senyals CHOP es van detectar més fortament als OHCs, SG i StV dels ratolins tractats amb DMSO, mostrant una alta concentració a la regió perinuclear entre nuclis i pèls de cabells de OHCs però atenuats per Sal ( n = 3 ratolins per grup) . Barres d’escala, 50 μ m (esquerra); 20 μ m (dreta)

Imatge a mida completa

Discussió

Com a nova mutació del gen Cdh 23, els ratolins mutants erl van mostrar l'aparició postnatal de la pèrdua auditiva a partir de P27, que va avançar fins a la sordesa total a ~ P100. Es considera que és un model animal per a la DFNB12 humana. 10 Tenint en compte la seva finestra temporal des de la iniciació de la pèrdua auditiva inicial fins a la sordesa total, aquests ratolins mutants són eines ideals per provar nous medicaments otoprotectors. Abans vam revelar que els ratolins erl tractats amb eritropoietina i Z-VAD-FMK podrien protegir-se significativament contra la mort de OHC i rescatar-se de la pèrdua auditiva mitjançant el bloqueig de la via d’apoptosi en ratolins erl . 10, 16 En el present estudi, es va descobrir que la resposta d’apoptosi a l’interior de l’erl còclea era rellevant per a l’estrès ER i la UPR.

Sota la vigilància del control de qualitat de la ER, només les proteïnes plegades correctament poden ser transferides pel complex Golgi i enviades a les seves destinacions finals, mentre que les proteïnes desplegades o desplegades es conserven a la ER i finalment es degraden per la via proteolítica o autofàgia depenent de la ubiquitina. . 17, 18 L’acumulació i l’agregació de proteïnes desplegades o no replegades en el lumen ER augmenten la càrrega d’ER i alteren l’homeòstasi ER, provocant finalment l’estrès ER. 19, 20 Sota l'estimulació lleu-a-moderada, l'estrès ER és una resposta adaptativa i restaurativa que condueix a l'adaptació cel·lular. En canvi, si la tensió està més enllà de la capacitat adaptativa dels ER, la senyalització de protecció canviarà a respostes pro-apoptòtiques. L’estrès d’ER s’ha relacionat amb la patogènesi de malalties neurodegeneratives, com la malaltia d’Alzheimer i la malaltia de Parkinson, així com amb la patogènesi de la mort cel·lular, com les lesions del tòbul renal en la diabetis. 21, 22, 23 En els mutants del peix zebra, les proteïnes CDH23 defectuoses a les cèl·lules del pèl no van ser transferides i van contribuir a la formació de complexos proteics Usher, per tant van provocar estrès ER. En conjunt, aquests resultats ens van oferir una visió nova dels mecanismes patològics i de les teràpies potencials per a la sordesa sensorial. Utilitzant un model animal per a mamífers, es va qüestionar si defectes similars de plegament de proteïnes i l'activació de l'estrès ER van passar en ratolins amb la mutació Cdh 23.

Vam proporcionar proves que una part de la proteïna ERL-CDH23 presentava una localització anormal en el OHC (des de l'estereocília fins al nucli, figura 1a), que no va arribar a la part superior dels feixos de pèl i va provocar una migració reduïda als enllaços de punta. D'altra banda, la proteïna ERL-CDH23 a la regió subapical del OHC va ser co-localitzada amb la chaperona ER BiP (Figures 1b i c). Es va trobar que la proteïna BiP es troba altament expressada en OHCs, SG i StV en els cochleae erl a P6 i P12, i l'ARNm BiP es regulava a P12, però es regulava a P30 (Figura 2). Tenint en compte la via UPR, aquests resultats suggereixen que BiP es va dissociar amb el receptor transmembrana ER i després es va combinar amb CDH23 defectuós en la fase inicial d'aquesta resposta. Aigües avall d’aquesta via, es va detectar la fosforilació d’eIF2α a l’erl coclear (figura 3), i l’ARNm de Chop i la proteïna van ser regulades a P12 i P30 (figura 4). Aquests resultats indiquen que el braç PERK de la UPR es va activar. CHOP va ser un mediador clau quan la senyalització d’UPR induïda per l’estrès ER va progressar fins a l’apoptosi. 24, 25 Els resultats de la prova auditiva, la preparació de la superfície i el recompte de OHC en els nostres ratolins Cdh23 erl / erl Chop - / - ratificats amb doble mutant confirmen encara més que la supressió del gen Chop podria protegir parcialment l’oïda i preservar l’HHC en ratolins amb la Cdh23 mutació erl / erl (Figura 5). Tenint aquestes dades juntament amb l’estudi anterior sobre la inducció de gens relacionats amb l’apoptosi en els cochleae de ratolí erl, 10 suggerim que l’apoptosi és un esdeveniment avall de la inducció de la UPR, amb la via efectiva de la senyalització PERK com a contribuent. Així, vam seleccionar el braç PERK de la UPR com a objectiu terapèutic.

És interessant assenyalar que CHOP no presenta localització nuclear en OHCs, tal com s’esperava per a un factor de transcripció (figures 4 i 8). Tot i això, CHOP no té cap senyal de localització nuclear. La seva interacció amb altres factors de transcripció induïts per l'estrès media la seva localització nuclear. Per tant, és possible que en els OHCs, CHOP quedi exclòs del nucli a causa de l'absència de socis relacionats amb el factor de transcripció. També es va informar que les cèl·lules amb CHOP citoplasmàtiques i nucleades localitzades van donar perfils d'expressió gènica diferents. Es va demostrar que aquell CHOP citoplasmàtic inhibia la migració, mentre que la CHOP nuclear provocà una aturada del cicle cel·lular G1. 27 En aquest model erl, particularment en OHCs, CHOP es localitza a les regions perinuclears entre els nuclis i els feixos capil·lars dels OHC. Un OHC desenvolupa un paquet d’estereocília polaritzada que és important per a la mecanotransducció. 28 Moltes proteïnes de paquets de pèls migren cap al paquet; així, especulem que el CHOP citoplasmàtic pot regular l'expressió de gens relacionats amb la migració de proteïnes. Es demana un estudi addicional sobre el paper de CHOP, a part d'induir apoptosi per degeneració i funcionalitat de OHC.

Sal és un petit compost molecular (480 Da) que impedeix la mort de les cèl·lules per l’apoptosi induïda per l’estrès ER mitjançant la inhibició selectiva de la defosforilació de eIF2α. 29 Estudis demostren que Sal resisteix a la mort de cèl·lules induïda per l’estrès ER, millora la supervivència cel·lular i retarda els processos de malalties. 30, 31, 32, 33, 34 Les nostres proves auditives van confirmar la nostra hipòtesi que Sal podria protegir l'audició inhibint l'apoptosi de cèl·lules de pèl induïda per l'estrès en els ratolins erl . En un treball anterior, vam informar que la pèrdua auditiva progressiva començava a P27 en ratolins erl . 10 En aquest estudi, fins a les quatre setmanes postnatal, els llindars ABR evocats per estímuls de 32 kHz en el grup de prova eren 10 dB millors que en els grups de control i vehicles (figura suplementària 1b). En tots els punts posteriors, els ratolins tractats amb Sal van mostrar millors llindars ABR en tots els estímuls. En referència a la correspondència entre altes i baixes freqüències i al gradient basal-apical de la membrana basilar, 35, 36 les proves auditives indiquen que la mort de l’HOC va començar específicament a les voltes basals i després es va estendre per tot el còclea, que es podria remeiar. per tractament de Sal. Els nostres estudis anteriors dirigits a tractaments anti-apoptosi també van mostrar efectes otoprotectors, 10, 16, però Sal va mostrar una durada prolongada (fins a 16 setmanes). En el nostre examen histològic, es van observar pèrdues substancials contigües i aïllades de OHC en el vehicle i grups de control; en canvi, els ratolins tractats amb Sal només van mostrar petites quantitats de pèrdua de OHC (figura 7). Aquest resultat proporciona una bona correlació entre les nostres observacions anatòmiques i proves funcionals.

Després del tractament amb Sal, l'ARNm regulat de Bip i Chop va disminuir a P30 i la caspasa-3 va disminuir a les 12 setmanes (Figura 8a), cosa que indica que Bip i Chop es van veure afectades pel tractament Sal a una edat primerenca i que la caspasa Posteriorment es va influir en 3 ARNm. Tanmateix, es va trobar que les proteïnes escindudes caspasa-3 (detectades per western blot) van disminuir per Sal a P30. El nostre anticòs caspase-3 escindit (Asp175) va ser capaç de reconèixer el gran fragment (17 kDa) de caspasa-3 activat resultant de la divisió contigua a Asp175, però no va ser capaç de detectar la proteïna caspasa-3 de longitud completa. Aquests resultats suggereixen que el clivatge de la caspasa-3 va ser bloquejat a la P30 pel tractament Sal. El mARN de caspasa-12 es va mantenir sense canvis a la P30 i a les 12 setmanes (figura suplementària 4), cosa que indica que la caspasa-12 podria no estar implicada en la retroalimentació del tractament Sal. Les proteïnes BiP (detectades per Western blot) i les proteïnes CHOP (detectades per immunostaining) també van ser regulades després del tractament amb Sal (Figura 8). Aquests resultats, juntament amb les dades anteriors, 10 suggereixen que el CDH23 defectuós s’acumulava a la ER i després augmentava la càrrega ER i destruí l’homeòstasi ER, provocant la dissociació de la BiP de PERK. El CHOP regulat a baix va conduir a l’activació de la caspasa i a l’apoptosi. Si la UPR adaptativa redueix la càrrega de proteïna en la ER, la restauració de la síntesi de proteïnes afavorirà la supervivència cel·lular. En cas contrari, si la síntesi de proteïnes anul·la la restauració de proteòstasis, es produirà la mort cel·lular. 37 Sal inhibeix la desfosforilació de eIF2α, que inhibeix la síntesi de proteïnes quan està fosforilada per PERK. Aquesta fosforilació augmentada d’eIF2α limita la síntesi de proteïnes (inclosa la de CDH23 i CHOP), alleuja la càrrega d’ER i afavoreix la supervivència cel·lular. Recentment s’han descrit els mecanismes potencials de la funció pro-apoptòtica de síntesi de proteïnes incontrolades durant l’estrès ER. 37, 38

Com a model animal de DFNB12, els ratolins erl amb tractament Sal van començar a una edat primerenca (a partir de la P7) i van mostrar una protecció auditiva important durant una llarga durada (fins a 16 setmanes). Si considerem la via de senyalització de l’apoptosi induïda per l’estrès ER, suggerim que les teràpies dirigides a aquesta via de senyalització específica podrien evitar la pèrdua de cèl·lules del pèl en un primer moment i obtenir resultats més efectius i sostinguts. Els pacients USH1D que porten mutacions diferents del mateix gen ( Cdh23 ) com DFNB12 presenten sordesa congènita i ceguesa postnatal. Així, suposem que el tractament precoç amb Sal podria evitar la disfunció oftàlmica en la síndrome d’Usher, destacant així l’aplicació de Sal com a agent terapèutic en el tractament de models animals per a la síndrome d’Usher.

Conclusió

En resum, aquest estudi és el primer que considera l’apoptosi de cèl·lules piloses induïda per l’estrès ER com un paper clau en la pèrdua auditiva i la mort de cèl·lules piloses de ratolins amb la mutació Cdh23 . La síntesi de proteïnes i processos de plegament de proteïnes relacionats són esdeveniments moleculars primerencs en estrès i apoptosi de ER. Per tant, els errors de plegament de proteïna desencadenats per mutacions genètiques haurien de ser considerats els primers objectius terapèutics. Molts medicaments contra l'estrès anti-ER aprovats per a l'admissió d'aliments i drogues (FDA) estan actualment disponibles al mercat i poden ser reapropiats per a una otoprotecció.

Materials i mètodes

Disseny experimental

Aquest estudi tenia com a objectiu avaluar l’apoptosi de cèl·lules de pèl induïda per l’estrès del ER en el mecanisme de pèrdua auditiva i mort de cèl·lules en el ratolí Cdh23 erl / erl . Les mesures dels indicadors d’estrès d’ER es van realitzar entre els ratolins mutants erd / erl Cdh23 , els ratolins B6 control, així com els ratolins del gen Chop (fons C57BL / 6). L’inhibidor d’estrès ER Salubrinal (Sal) es va donar sistemàticament en ratolins mutants Cdh23 erl / erl per injecció intraperitoneal. Els indicadors d’audició, reserva d’HHC i ER d’estrès es van provar entre ratolins Cdh23 erl / erl tractats amb sal, tractats amb vehicles i Cdh23 no tractats.

Ratolins

Tots els procediments relacionats amb els ratolins van ser aprovats pel Comitè de Recerca en Animals de l'Escola de Medicina de la Western Western Reserve University (protocol R01DC009246). Tots els ratolins es van experimentar en el mateix entorn i cercle de foscor brillant. Els ratolins van ser allotjats per primera vegada al laboratori de Jackson (Bar Harbour, ME, EUA) abans de traslladar-se a aquesta soca mutant a Case Western Reserve University. Els ratolins amb el gen Chop eliminador (fons C57BL / 6) es van introduir al laboratori de Jackson (número d'estoc 005530). Els ratolins homocigots erl ( Cdh23 erl / erl ) van ser creuats amb els mutants homocigots eliminadors del gen Chop ( Chop - / - ), generant F1 amb el genotip de Cdh23 + / erl Chop +/– . Després, es va creuar la F1 ( Cdh23 + / erl Chop +/– ) amb la F1 ( Cdh23 + / erl Chop +/– ) per generar nou genotips de ratolins: Cdh23 + / + Chop + / + ; Cdh23 + / + Picar +/– ; Cdh23 + / + Chop - / - ; Cdh23 + / erl Picar + / + ; Cdh23 + / erl Picar +/– ; Cdh23 + / erl Chop - / - ; Cdh23 erl / erl Picar + / + ; Cdh23 erl / erl Picar +/– ; i Cdh23 erl / erl Chop - / - . A continuació, vam seleccionar els homocigots Cdh23 erl / erl Chop - / - , que es van entrecreuar i es van mantenir com a línia de ratolí de consola. Com que el gen Chop knockout i els ratolins de mutació erl provenen del fons C57BL / 6, hem escollit Cdh23 erl / erl Chop - / - , Cdh23 erl / erl Chop + / + (ratolins erl ) i Cdh23 + / + Chop - / - ( Chop - / - ratolins) per als nostres experiments.

El genotipat per a ratolins erl es va descriure anteriorment. El genotip de Chop - / - es va determinar mitjançant PCR semicantitativa mitjançant l'ús dels primers primers: oIMR3884-5′-ATGCCCTTACCTATCGTG-3 '(comú); oIMR3885 - 5′-AACGCCAGGGTTTTC CCAGTCA-3 ′ (revers mutant); i oIMR3886 - 5′-GCAGGGTCAAGAGTAGTG-3 ′ (revers de tipus salvatge). La reacció del cicle tèrmic es va realitzar de la següent manera: 94 ° C durant 3 min, seguit de 35 cicles a 94 ° C durant 30 s, 61 ° C durant 1 min, 72 ° C durant 1 min i 72 ° C durant 2 min. El tipus salvatge mostrava una banda (544 pb), mentre que els heterozigots mostraven dues bandes (320 i 544 pb) i els mutants mostraven una banda (320 pb). El genotip de Cdh23 erl / erl Chop - / - va ser determinat pel genotipat de Cdh23 erl / erl i el genotipat Chop - / - .

Tractament de sal

Els ratolins erl van rebre diferents tractaments per injecció intraperitoneal. En total, 70 ratolins erl es van dividir en tres grups amb qualsevol dels dos sexes: un grup de prova (tractat amb Sal, 0, 5 mg kg 1, R&D ng Cat # 2347), un grup de vehicles (tractat amb un volum igual de dimetilsulfoxid, DMSO) i un grup de control (no tractat). Tots els tractaments van començar el dia 7 postnatal (P) el dia 7, amb les posteriors injeccions cada dia durant les 12 primeres setmanes, cada 3 dies durant 2 setmanes addicionals, i després un cop cada setmana durant la durada dels experiments. La dosi de Sal es va seleccionar entre dos conjunts d’experiments previs, que van demostrar que era segur i protector auditiu. Es va seleccionar l’edat inicial del tractament per evitar l’aparició de gens apoptòtics en ratolins erl detectats en els nostres treballs anteriors. 10

PCR

Les còclees es van aïllar ràpidament, i després es va utilitzar TRIzol (Invitrogen, Eugene, OR, EUA) per a l’extracció total d’ARN. El sistema de síntesi de primera cadena Super Script III (Invitrogen) es va utilitzar per sintetitzar l’ADNc. PCR quantitativa es va realitzar amb el reactiu de SYBR Green FAST Mastermix (QIAGEN, Germantown, MD, EUA) en un sistema de detecció de seqüències ABI 7300 (Foster City, CA, EUA). Les seqüències de primer es mostren a la taula. S1. La reacció en cicle es va realitzar de la següent manera: 95 ° C durant 10 min, 40 cicles de 95 ° C durant 15 min i 60 ° C durant 1 min, i finalment una corba de dissociació de 95 ° C durant 15 s i 60 ° C durant 15 min. s. L'expressió gènica es va calcular respecte al gen GAPDH de neteja i després es va analitzar mitjançant el mètode 2- CT . La PCR semicantitativa es va realitzar utilitzant el DNA Engine (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) amb la reacció de cicle descrita anteriorment.

Western blot

Les còclees van ser lisades amb tampó RIPA fred al gel. Quantitats iguals de proteïnes van ser sotmeses a SDS-PAGE i transferides a la membrana PVDF (Bio-Rad). Després, la membrana PVDF es va bloquejar durant 1 h en un agent de bloqueig principal 5% ECL i després es va incubar durant la nit a 4 ° C amb anticossos primaris diluïts 1: 1000: anti-BiP (Cell Signaling 3177, Danvers, MA, EUA), anti- caspasa-3 (Cell Signaling 9661) i anti-β-actin (Santa Cruz sc-130657). Després de rentar-se amb TBST, la membrana es va incubar en anticossos secundaris (1: 5000, anti-conill IgG de cabra, Santa Cruz sc-2054). Les bandes de proteïnes es van visualitzar mitjançant el sistema ChemiDoc MPImaging (Bio-Rad), que emana la quimioluminescència.

Tinció d’immunofluorescència

Les orelles interiors es van fixar en un 4% de paraformaldehid (PFA) durant la nit i després es van descifrar en àcid etilenediaminetetraacètic al 10% (EDTA). Després de ser deshidratat en sacarosa i incrustat al medi de congelació OCT dels teixits a -20 ° C, es van tallar seccions contínues de 6 μ m. Aquestes seccions es van permeabilizar en 0, 5% de Triton X-100 durant 30 min, es van bloquejar en 3% de BSA durant 2 h a temperatura ambient, i després es van incubar durant la nit a 4 ° C amb 1: 200 anticossos primaris diluïts: anti-CDH23 (Santa Cruz sc -26338), anti-BiP (Cell Signaling 3177), anti-CHOP (Santa Cruz sc-575), anti-eIF2a (Cell Signaling 9722) i anti-fosfo-eIF2a (Cell Signaling 3597). Es van afegir anticossos secundaris amb dilució 1: 400 (anti-conill IgG, Invitrogen A31573; IgG anti-cabra de conill, Invitrogen A11078) durant 1 h; a continuació, les seccions es van tacar amb DAPI. Els controls negatius (sense afegir anticossos primaris) no van mostrar cap tinció.

Prova ABR i DPOAE

Un sistema potencial evocat assistit per ordinador (Intelligent Hearing Systems, el programari Smart-EP 3.30, Miami, FL, EUA) es va utilitzar com es va publicar anteriorment. 39 Breument, els ratolins van ser anestesiats i la temperatura corporal es va mantenir a 37 ° C. Es van utilitzar elèctrodes d’agulla subdèrmica. L'elèctrode de gravació es va inserir al vèrtex del crani; l’elèctrode de terra es va inserir a l’àpex del nas; i els elèctrodes de referència es van fixar a prop de cada oïda. El clic i els ràfecs de to de 8, 16 i 32 kHz es van canalitzar a través d’un audiòfon inserit. El llindar ABR es va identificar com el nivell d’estímul més baix al qual es van reconèixer formes d’ona clares i repetibles (figura 2a). La mesura DPOAE es va realitzar per tonalitats pures a freqüències que van des de 4, 4 a 20, 3 kHz mitjançant l’ús del sistema d’audició intel·ligent (Smart EP 3.30 Software). Les freqüències es van adquirir amb la relació F2: F1 de 1, 22 i amb estímul primari de 65/55 dB SPL.

Preparació superficial i recompte de cèl·lules del cabell

Com hem descrit anteriorment, 40 els ossos temporals es van fixar en un 4% de PFA, i la membrana basilar es va disseccionar amb cura i es va tallar en tres fragments separats: el torn apical, el mig i el basal. Els fragments es van permeabilizar en el 2% de Tritó X-100, es van tacar per a l’actina F amb la fal·lidina (Invitrogen) i es van observar amb un microscopi fluorescent (Leica DM4500 B). Es considerava que les cèl·lules del pèl estaven presents si els cossos cel·lulars i els feixos de pèl en forma de V estaven intactes.

Imatge 3D confocal

Per determinar la localització de CDH23 en OHCs, es va realitzar un immunostaining a muntatge complet de membranes basil·lars de l'orella interna de ratolins de 4 dies mitjançant l'anticorpo primari anti-CDH23 (Santa Cruz, sc-26338), IgG anti-cabra de conill secundari, Invitrogen A11078, Alexa 488 (dilució 1: 1000), i després es va tacar contra DAPI. Les imatges confocals es van capturar mitjançant un microscopi confocal SP8 de Leica (Alemanya) amb un objectiu de petroli NA 63/4 NA i una línia làser de 488 nm. Pila d’imatges adquirides amb la mida de voxel 512 × 512 × 0, 045 μ m 3 i 1024 × 1024 × 0, 027 μ m 3, respectivament en funció de les mides dels OHC, totes les deconvolucions es van processar mitjançant el programa Leica Application Suite X (LAS X, LASX).

Microscopi electrònic d’escaneig

Els ratolins es van fixar amb un 2, 5% de glutaraldehid i tot seguit es van disseccionar les còclees senceres. La càpsula òssia, el lligament en espiral i la membrana de Reissner van ser retirades amb cura per exposar tot l’òrgan de Corti. Després, els exemplars es van fixar en 1% de tetròxid d'osmium (OsO4) durant 1 h tres vegades i en 1% tiocarbohidrazida (TCH) durant 1 h dues vegades (la tècnica OTOTO). Els exemplars es van deshidratar en una sèrie d’etanol gradient, es van assecar en punt crític amb CO 2, i finalment es van recobrir en paladiu. A continuació, les mostres es van veure sota un microscopi electrònic d’escanejat d’alta resolució (FEI Helios NanoLab 650, Alemanya).

Anàlisi estadística

Les dades es presenten com a mitjana ± SEM L’anàlisi es va realitzar mitjançant el programari SPSS 18.0. Les dades es van analitzar estadísticament mitjançant les proves t -one ANOVA i Student. Els valors P <0, 05 es van considerar significatius.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Material complementari

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)