Assaig de resistència a l’aspirina exploratòria en voluntaris japonesos sans (j-art) que utilitzen l’agregació de plaquetes com a mesura de trombogenicitat | la revista farmacogenòmica

Assaig de resistència a l’aspirina exploratòria en voluntaris japonesos sans (j-art) que utilitzen l’agregació de plaquetes com a mesura de trombogenicitat | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

L’aspirina impedeix la producció de tromboxà A 2 (TXA 2 ) en inhibir irreversiblement la ciclooxigenasa plaquetària, presentant accions antiplaquetàries. Segons aquest mecanisme d’acció, s’ha evitat que aquest agent previngui la recaiguda en pacients amb malaltia cardíaca isquèmica o infart cerebral. Tot i això, hi ha diferències individuals en aquesta acció, i l’aspirina no és efectiva en alguns pacients, la qual cosa es coneix com a “resistència a l’aspirina”. En aquest estudi, es va analitzar la resistència a l’aspirina de laboratori mitjançant l’agregació de plaquetes en 110 homes masculins adults japonesos sans amb 24 polimorfismes d’un nucleòtid (SNP) de nou gens implicats en l’agregació / hemorràgia plaquetària. Entre els SNP implicats en l’agregació de plaquetes, l’aspirina era menys efectiva per l’homozigot 924T d’un receptor TXA 2, 924T> C i homozigot 1018C d’un glicoproteïna amb membrana plaquetària GPIb α , 1018C> T, cosa que suggereix que els al·lels 924T i 1018C participen en la resistència a l’aspirina .

Introducció

El 1897, Felix Hoffman, de la companyia Bayer, va sintetitzar primer àcid acetilsalicílic. L’aspirina com a nom comercial de l’àcid acetilsalicílic va estar disponible comercialment el 1899. Des d’aleshores, l’aspirina s’ha prescrit habitualment com a agent analgèsic antipirètic. El 1953 es van notificar inicialment els efectes antitrombòtics de l'aspirina. 1 El 1967 es van trobar les accions antiplaquetàries de l’aspirina. 2 El 1971, Smith i Willis 3 i Vane 4 van proposar independentment que el mecanisme d'acció de l'aspirina implicés la inhibició de la ciclooxigenasa 1 (COX-1). A més, el 1991, Funk et al. S'ha trobat l'acetilació relacionada amb l'aspirina i la inactivació del lloc actiu de COX-1, Ser en la posició 529. A les plaquetes, l'aspirina inhibeix la producció d'una potent substància agregadora de plaquetes, la tromboxana A 2 (TXA 2 ), mitjançant la inhibició de COX-1, suprimint l’agregació plaquetària. A partir d’aquesta acció farmacològica, un assaig clínic a gran escala va demostrar els efectes preventius de l’aspirina sobre les malalties cardíaques isquèmiques recurrents i l’infart cerebral. En la metaanàlisi de la col·laboració de antitrombòtics assajos, la incidència d’esdeveniments vasculars, incloent infart miocàrdic / cerebral no mortal i mort vascular relacionada amb esdeveniments, en aproximadament 60 000 pacients que prenien aspirina era un 25% inferior a la dels controls. A més, hi va haver diferències individuals en els efectes antiplaquetaris de l’aspirina: inhibició de la formació de trombes, prolongació del temps d’hemorràgia, inhibició de l’agregació plaquetària ex vivo i inhibició de la producció de tromboxà a les plaquetes. Es va proposar l’entitat de “resistència a l’aspirina”, que representa un estat en què l’aspirina no és efectiva o menys efectiva. Eikelboom et al. 7 van realitzar un seguiment de 4, 5 anys a 976 pacients sotmesos a teràpia amb aspirina i van associar una associació entre l'excreció urinària d'un metabolit TXA 2 i els esdeveniments cardiovasculars. Gum et al. 8 van administrar aspirina a 326 pacients amb malaltia coronària o infart cerebral i van investigar la relació entre l’agregació plaquetària i el desenvolupament d’esdeveniments cardiovasculars. En un grup resistent a l'aspirina en el qual no es va inhibir l'agregació plaquetària, la proporció de risc dels esdeveniments cardiovasculars va ser de 4, 1 vegades superior a la d'un grup sensible a l'aspirina.

Quinn et al. 9 han indicat que, en aproximadament el 30% dels pacients amb diferències en la resposta plaquetària als agents antiplaquetaris, està associada a l’herència, cosa que suggereix la importància del polimorfisme genètic. Quant a les glicoproteïnes de la membrana plaquetària, s'ha informat que els polimorfismes genètics de GPIa, 10 GPIb α , 11 GPIIIa 12, 13 i GPVI 14 influeixen en l'eficàcia de la resposta a l'aspirina o les plaquetes. A més, Halushka et al. 15 van informar sobre l’associació d’agregació plaquetària amb mutació genètica de COX-1, Papafili et al. 16 l'associació amb mutació genètica de COX-2, Higuchi et al. 17 l'associació amb mutació genètica de receptors TXA 2 (TP), Stafforini et al. 18 l’associació amb mutació genètica del factor activador plaquetari acetilhidrolasa (PAFAH) i Undas et al. 19 l'associació amb mutació genètica del factor de coagulació XIII (FXIII).

Així, molts estudis han investigat la resposta plaquetària a l’aspirina en els caucàsics a nivell de gens. Tot i això, pocs estudis han informat d’aquest problema en pacients japonesos o voluntaris sans. En aquest estudi, ens vam centrar en la cascada d’àcid araquidònic i els gens implicats en l’agregació plaquetària i vam valorar la resistència a l’aspirina en japonès en funció del grau supressor d’agregació plaquetària abans i després de l’administració d’aspirina. Aquí, el baix grau supressiu d’agregació plaquetària després de l’administració d’aspirines es va definir com a resistència a l’aspirina.

Aquest estudi va ser dissenyat pel Consorci de Farmacogenòmica del Japó (JPG). Aquesta organització està formada per 11 empreses relacionades amb productes farmacèutics al Japó. Des de juliol de 2003 fins a juliol de 2005, aquestes empreses van organitzar entorns col·laboratius i van establir tècniques bàsiques per a estudis de farmacogenòmica (PG) al Japó per promoure la investigació i desenvolupament d'agents al Japó. Recentment, s'ha proposat que les dades sobre PG seran enviades a les autoritats relacionades amb el desenvolupament de medicaments al Japó, els Estats Units i Europa. En el futur, els estudis de PG poden conduir a pràctiques mèdiques individualitzades, és a dir, l’objectiu essencial de la pràctica mèdica, “s’administra un agent necessari a una dosi requerida als pacients que ho requereixin durant un període requerit”.

Resultats

Antecedents del pacient

Els subjectes van ser 110 voluntaris japonesos masculins adults sans (26 anys de 9 a 6, 3 anys (mitjana ± sd, mínim: 20, màxim: 45 anys)). L’inici d’aquest estudi es va determinar l’estat de salut normal per la història mèdica, l’examen físic i el cribratge bioquímic i hematològic. En dos dels subjectes, aquest estudi no es va completar i es van investigar paràmetres diferents de la freqüència dels al·lels en 108 subjectes. Els factors de fons dels subjectes es mostren a la taula 1. Cap subjecte va mostrar cap valor anormal de l’índex de massa corporal (21, 6 ± 2, 4 kg / m 2 (mínim: 16, 5, màxim: 27, 2)). Les dades hematològiques i bioquímiques estaven dins dels intervals normals. No es van trobar anormalitats en els nivells de colesterol total ni en triglicèrids, que poden influir en l’agregació plaquetària i en el temps de sagnat; els valors mitjans van ser de 170 ± 28 i 89 ± 56 mg / dl, respectivament. Es va examinar la presència o absència d’una història de fumar; 44 assignatures tenien antecedents, però 64 assignatures no.

Taula completa

Freqüència dels al·lels

En els 110 subjectes, vam realitzar genotips de 24 polimorfismes d’un sol nucleòtid (SNPs), presents en nou gens, COX-1 (PTGS1), COX-2 (PTGS2), TP (TBXA2R), GPIa (ITGA2), GPIb α (GP1BA), GPIIIa (ITGB3), GPVI (GP6), FXIII (F13A) i PAFAH, que poden estar relacionats amb la resposta a les plaquetes i es calcula la freqüència dels al·lels (taula 2). En nou dels 24 SNP, la freqüència d'al·lels menors va superar el 10%. Els 24 SNP van adaptar-se a l'equilibri de Hardy-Weinberg. La freqüència dels al·lels es mostra a la taula 2. Hi havia forts desequilibris d’enllaç entre COX-2 −163C> G i COX-2 10T> G (D ′ = 1.000, r 2 = 1.000), entre GPIa 807C> T i GPIa 873G > A (D ′ = 1.000, r 2 = 1.000), entre TP 795T> C i TP 924T> C (D ′ = 1.000, r 2 = 0.375), entre GPVI 19871A> G i GPVI 21908A> G (D ′ = 0, 912, r 2 = 0, 808), entre GPVI 19871A> G i GPVI 22630A> T (D ′ = 0, 938, r 2 = 0, 807), i entre GPVI 21908A> G i GPVI 22630A> T (D ′ = 0, 970, r 2 = 0.887).

Taula completa

Agregació de plaquetes

Abans de l’administració d’aspirina, vam mesurar l’agregació màxima a nivells de col·lagen de 0, 125, 0, 25, 0, 5, 1, 0, 2, 0 i 4, 0 μ g / ml. L’agregació màxima va ser de 4, 8 ± 8, 0, 15, 9 ± 21, 9, 54, 9 ± 26, 4, 81, 9 ± 9, 4, 87, 5 ± 6, 4 i 90, 8 ± 6, 1%, respectivament. Després de l’administració d’aspirina, es va mesurar l’agregació màxima a nivells de col·lagen de 0, 5, 1, 0, 2, 0, 4, 0, 6, 0 i 8, 0 μ g / ml; la màxima agregació va ser de 6, 1 ± 3, 6, 13, 6 ± 8, 5, 30, 0 ± 13, 2, 53, 9 ± 12, 5, 66, 8 ± 9, 7 i 72, 8 ± 8, 6%, respectivament. La figura 1 mostra la màxima agregació (%) abans i després de l'administració d'aspirina respecte als nivells de col·lagen.

Image

Reactivitat plaquetària abans i després de l’administració d’aspirina (màxima agregació). Es presenta l’agregació màxima (%) a diverses concentracions de col·lagen ( μ g / ml) abans i després de l’administració d’aspirina. Els cercles oberts representen els valors de pretractament i els quadrats oberts representen els valors després de l'administració. Cada punt indica la mitjana, i cada barra indica la desviació estàndard ( n = 108).

Imatge a mida completa

Per examinar els efectes de l’aspirina, l’agregació màxima (%) abans i després de l’administració d’aspirina a un nivell de col·lagen d’1, 0 o 4, 0 μ g / ml, la relació de canvi en l’agregació màxima (%) entre abans i després de l’administració d’aspirina, la zona sota la corba (AUC) per a l’agregació màxima a nivells de col·lagen que oscil·la entre 0 i 4, 0 μ g / ml abans i després de l’administració d’aspirina, i es va determinar la relació de canvi de l’AUC entre abans i després de l’administració d’aspirina i aquests paràmetres eren en comparació a cada grup SNP. L’agregació màxima a nivells de col·lagen d’1, 0 i 4, 0 μ g / ml es va suprimir al voltant d’un 83% (81, 9 a 13, 6%) i un 41% (90, 8 a 53, 9%), respectivament, per administració d’aspirina. A més, la AUC després de l'administració era inferior a la d'abans de l'administració i la taxa de disminució era d'aproximadament el 44% (abans de l'administració: 309 ± 29 unitat arbitrària (AU) vs després de l'administració: 174 ± 44 AU, P <0, 0001).

Es va analitzar l’associació entre l’agregació de plaquetes i els SNP per test de t d’ estudiants o l’anàlisi de la variància (ANOVA). TP 924T> C i GPIb α 1018C> T presentaven diferències significatives. La figura 2 mostra les estructures de les proteïnes TP i GPIb α i les posicions dels SNP.

Image

Estructures de TP i glicoproteïna de membrana plaquetària GPIb α , i les posicions dels SNP. L’esquerra representa el terminal amino, i la dreta representa el terminal carboxí. L’ombra de llum indica regions de transmembrana i l’ombra fosca indica pèptids de senyal. El claudàtor uneix unió disulfur. Les fletxes CHO representen els llocs de glicosilació. La punta de fletxa blanca indica el lloc del splicing. Kozak representa la seqüència de Kozak. LRR representa una regió rica en leucines. La unió vWF indica la regió d'unió vWF. Els fulls de fletxa tancats representen la posició dels SNP.

Imatge a mida completa

Relació entre l’agregació de plaquetes i TP 924T> C. Pel que fa a TP SNP (924T> C), hi va haver diferències significatives en la taxa de canvi de la màxima agregació a nivells de col·lagen d’1, 0 i 4, 0 μ g / ml entre els dos grups (grup TT vs grup TC + CC); al grup TT, els valors eren més alts ( P = 0.0076 i 0.0121, respectivament). Al grup TT, els valors eren baixos abans de l’administració d’aspirina i alts després de l’administració d’aspirina (figures 3a i b). A més, hi va haver diferències significatives en la taxa de variació de l’AUC entre els dos grups; al grup TT, el valor era més gran ( P = 0.0059) (figures 3c). Aquests resultats suggereixen la implicació del grup TT en la resistència a l’aspirina. Hi va haver un desequilibri en el lligam entre la TP 795T> C i la TP 924T> C. Quant a 795T> C, es van obtenir resultats similars (no es mostren dades).

Image

Reactivitat plaquetària en dos genotips (TT, TC + CC) a TP 924T> C. ( a ) L’agregació màxima a un nivell de col·lagen d’1, 0 μ g / ml, ( b ) l’agregació màxima a un nivell de col·lagen de 4, 0 μ g / ml i ( c ) AUC, respectivament. Les columnes obertes mostren l’agregació màxima (%) o AUC abans de l’administració i les columnes tancades mostren l’agregació màxima o AUC després de l’administració. Les columnes a l’ombra mostren la taxa de canvi de l’agregació màxima o la de l’AUC després de l’administració al valor de pretractament. Cada columna representa la mitjana ± sd ( n = 76 i 32 dels grups TT i TC + CC, respectivament). L’asterisc indica P <0, 05, i l’asterisc doble denota P <0, 01. L'anàlisi estadística es va avaluar mitjançant el test t de l'alumnat.

Imatge a mida completa

Relació entre l’agregació plaquetària i GPIb α 1018C> T. Pel que fa a GPIb α SNP, 1018C> T, hi va haver una diferència significativa en la taxa de canvi de l'agregació màxima a un nivell de col·lagen de 4, 0 μ g / ml entre els dos grups (grup CC vs grup CT + TT); el valor va ser més elevat en el grup CC ( P = 0, 0130) (figura 4b). Al grup CC, el valor va ser elevat després de l’administració d’aspirina ( P = 0.0044). A més, es va observar una diferència significativa en la taxa de variació de l'AUC entre els dos grups; al grup CC, el valor va ser més gran ( P = 0, 0418) (figura 4c). Aquests resultats suggereixen que el grup CC en GPIb α 1018C> T està implicat en la resistència a l'aspirina.

Image

Reactivitat plaquetària en dos genotips (CC, CT + TT) en GPIb α 1018C> T. ( a ) L’agregació màxima a un nivell de col·lagen d’1, 0 μ g / ml, ( b ) l’agregació màxima a un nivell de col·lagen de 4, 0 μ g / ml i ( c ) AUC, respectivament. Les columnes obertes mostren l’agregació màxima (%) o AUC abans de l’administració i les columnes tancades mostren l’agregació màxima o AUC després de l’administració. Les columnes a l’ombra mostren la taxa de canvi de l’agregació màxima o la de l’AUC després de l’administració al valor de pretractament. Cada columna representa la mitjana ± sd ( n = 95 i 13 en els grups CC i CT + TT, respectivament). L’asterisc indica P <0, 05, i l’asterisc doble denota P <0, 01. L'anàlisi estadística es va avaluar mitjançant el test t de l'alumnat.

Imatge a mida completa

Relació de la combinació de genotipos TP 924T> C i GPIb α 1018C> T amb agregació plaquetària. Per investigar els efectes de la combinació de genotips, vam realitzar ANOVA i la prova honestament significativa de Tukey (Tukey's HSD) entre subgrups en què es va combinar un genotip TP 924T> C amb un genotip GPIb α 1018C> T. En l’anàlisi ANOVA, es van observar diferències significatives en la taxa de canvi de l’agregació màxima a nivells de col·lagen d’1, 0 i 4, 0 μ g / ml i la taxa de canvi de l’AUC entre els quatre grups, 1: 924TT i 1018CC ( n = 69), 2: 924TT i 1018CT + TT ( n = 7), 3: 924TC + CC i 1018CC ( n = 26) i 4: 924TC + CC i 1018CT + TT ( n = 6) ( P = 0, 0282, 0, 0109 i 0, 0078, respectivament) (figura 5). Els grups TP TT i GPIb α CC van mostrar la taxa de canvi més elevada de l’agregació màxima a un nivell de col·lagen de 4, 0 μ g / ml, i la taxa de canvi en la ASC. Els grups TP TC + CC i GPIb α CT + TT van mostrar els valors més baixos; hi va haver diferències significatives entre el grup 1 i el grup 4 ( P = 0.0325 i 0.0092, respectivament) en la prova HSD de Tukey.

Image

Reactivitat plaquetària respecte a les combinacions de genotips en TP 924T> C i GPIb α 1018C> T. ( a ) L’agregació màxima a un nivell de col·lagen d’1, 0 μ g / ml, ( b ) l’agregació màxima a un nivell de col·lagen de 4, 0 μ g / ml i ( c ) AUC, respectivament. Les columnes obertes mostren l’agregació màxima (%) o AUC abans de l’administració i les columnes tancades mostren l’agregació màxima o AUC després de l’administració. Les columnes a l’ombra mostren la taxa de canvi de l’agregació màxima o la de l’AUC després de l’administració al valor de pretractament. Cada columna representa la mitjana ± sd (1: 924TT i 1018CC ( n = 69), 2: 924TT i 1018CT + TT ( n = 7), 3: 924TC + CC i 1018CC ( n = 26), i 4: 924TC + CC i 1018CT + TT ( n = 6)). L’asterisc indica P <0, 05, i l’asterisc doble denota P <0, 01. ANOVA va avaluar l'anàlisi estadística.

Imatge a mida completa

Nivell sèric de tromboxà B 2

Els nivells sèrics de tromboxà B 2 (TXB 2 ) abans i després de l'administració d'aspirina van ser de 103 470 ± 69 007 pg / ml i 198 ± 152 pg / ml, respectivament; en tots els subjectes, la taxa de disminució va ser del 98% o més. Per tant, l’aspirina va inhibir gairebé per complet la producció de TXA 2 .

Nivells sanguinis d’aspirina i àcid salicílic

El nivell sanguini d’aspirina va assolir un màxim (Cmax) (1, 38 ± 0, 65 μ g / ml) 15 min després de l’administració. La semivida era de 22 min. El nivell sanguini d’àcid salicílic va augmentar amb el metabolisme de l’aspirina i va assolir un Cmax (5, 06 ± 1, 08 μg / ml) 60 min després de l’administració.

Associació

Es van examinar associacions entre la màxima agregació, el nivell de TXB 2, el nivell màxim d’aspirina sanguínia (Cmax) i el Cmax d’àcid salicílic. No hi havia cap associació en cap combinació (dades no mostrades).

Discussió

COX-1 és el primer enzim, a la cascada d'àcid araquidònic, que catalitza la producció de prostaglandines i tromboxanes a partir d'àcid araquidònic. L’aspirina redueix la producció de TXA 2 mitjançant la inhibició irreversible de la plaqueta COX-1. Segons un estudi, 15 la freqüència dels al·lels menors en els SNP COX-1 (−842G, 50T) als caucàsics és de 10, 5 i 8, 6%, respectivament, cosa que suggereix que aquests SNP estan associats a la resistència a l'aspirina en els caucàsics. En aquest estudi, es va analitzar inicialment la freqüència dels al·lels en cinc SNP de COX-1 en subjectes japonesos. No obstant això, no es va detectar cap al·lel menor en cap dels dos SNP anteriors. Per tant, els dos SNP COX-1 poden no estar implicats en els efectes de l'aspirina en els japonesos. Als caucàsics, la freqüència d’al·lels menors en COX-2 SNP (−765G> C) a la regió promotora va ser del 21, 3%; tanmateix, en aquest estudi, el percentatge va ser notablement inferior (1, 8%). Un estudi ha informat que -765G> C està involucrat en l'activitat promotora. No obstant això, la freqüència dels al·lels era notablement baixa en els nostres subjectes japonesos; per tant, pot ser que el COX-2 no estigui involucrat en la resistència a l'aspirina, com s'ha demostrat per a COX-1. Als caucàsics, la freqüència d’al·lels menors en FXIII SNP (100G> T), que pot contribuir a l’activació de FXIII, 19 va ser del 22, 1%; tanmateix, en aquest estudi no hi va haver cap al·lel menor. En aquest estudi, la freqüència dels al·lels en GPIIIa SNP (1565T> C) va ser del 0, 5%. Un estudi ha informat que aquest tipus de SNP és un factor de risc de malalties coronàries agudes, cosa que suggereix l'associació amb la resistència a l'aspirina. En caucàsics, molts estudis han indicat que els SNP COX-1, COX-2, FXIII i GPIIIa estan associats a l’agregació plaquetària o al temps de sagnat, cosa que suggereix l’associació amb resistència a l’aspirina. Tanmateix, en aquest estudi, la freqüència d'al·lels menors en aquests SNP va ser notablement inferior a la dels caucàsics; Aquests SNP poden no estar associats a la resistència a l'aspirina en els japonesos.

Quan l’endoteli vascular està malmès, GPIb α té un paper important en el procés inicial d’agregació plaquetària formant un complex en combinació amb GPIX i GPV i unint-se al factor von Willebrand (vWF). GPIb α 1018C> T indueix la substitució d'aminoàcids (T145M) mitjançant mutació no sinònima. Tot i això, un estudi va informar que les proteïnes recombinants 145Thr i 145Met mostraven una activitat similar a la unió a vWF in vitro i que no hi havia diferències funcionals. 21 La regió rica en Leu està present al lloc d’aquest SNP i pot estar implicada en la unió a proteïnes, com ara GPIX, GPV i trombina. Per tant, aquest SNP pot afectar la funció d’aquesta regió, pot haver-hi un desequilibri d’enllaç amb els SNP funcionals, o aquest SNP pot influir en el grau de transcripció i traducció de GPIb α .

En aquest estudi, hi va haver una associació entre el genotip TP 924T> C i la resposta plaquetària a l’aspirina. 924T> C reflecteix una mutació sinònima. Aquest tipus de mutació no influeix directament sobre la funció del receptor; tanmateix, tal com es va suggerir la participació en la resistència a l'aspirina, 924T> C pot afectar l'estabilització de l'ARNm i l'eficiència de la traducció, o pot haver-hi un desequilibri en un mutament associat a la funció contigua a aquest SNP. Immediatament aigües avall del lloc SNP, el lloc del splicing alternatiu està present, i el receptor tipus α i el tipus β apareixen a través del splicing. No hi va haver diferències marcades en l'activitat d'unió al lligand TXA 2 o l'activació de fosfolipasa C entre els dos receptors. Tot i això, el tipus α activa l’adenil ciclasa, però el tipus β inhibeix l’activitat. 22 Aquest SNP pot influir en el splicing. En aquest estudi, l’administració d’aspirina va inhibir marcadament la producció de TXA 2 de plaquetes en tots els subjectes. Tot i això, hi va haver diferències individuals en els efectes inhibidors de l’aspirina sobre l’agregació de col·lagen. Per tant, la resistència a l'aspirina relacionada amb la TP pot produir-se per:

  1. Hipersensibilitat de TP als nivells extremadament baixos de TXA 2 ;

  2. Quant a la influència sobre la TP, es pot implicar com a via alternativa una isoprostana, que no es sintetitza no enzimàticament mitjançant una resposta radical O2 de l’àcid araquidònic que s’acumula mitjançant la inhibició de la plaqueta COX-1; Isoprostan pot unir-se a TP, activant la ruta. Tanmateix, es poden associar diferències individuals d’acumulació d’isoprostan amb resistència a l’aspirina. 23

    A més, les plaquetes s’activen a través de diversos receptors incloent la TP. L’activació de les plaquetes mitjançant l’activació de factors diferents del TXA 2, com la trombina, l’ADP, l’epinefrina i el col·lagen, pot disminuir els efectes de l’aspirina, provocant resistència a l’aspirina.

    En aquest estudi, vam trobar que dos SNP van estar associats amb la resposta plaquetària a l’aspirina. Es va analitzar la combinació dels genotips dels dos SNP. Hi va haver un efecte additiu entre la resistència a l'aspirina i la quantitat de TP 924T i els al·lels GPIb α 1018C. Per tant, els dos SNP poden induir resistència a l'aspirina a través de diferents rutines.

    A més, es considera que un alt nivell sanguini d’aspirina és un factor etiològic implicat en la resistència a l’aspirina; per tant, es van mesurar els nivells d’aspirina i el seu metabolit després de l’administració d’aspirina. Aquests nivells no es van associar amb l’agregació de plaquetes; una disminució del nivell sanguini d’aspirina pot no reflectir la resistència a l’aspirina.

    Estudis anteriors han informat que la resistència a l'aspirina es va produir en el 5, 55, 68% dels pacients en diversos grups de pacients. 24 En el tractament per a la supressió de la recidiva en pacients amb malalties cardíacs isquèmiques o infart cerebral en fase estable, el diagnòstic de resistència a l’aspirina és clínicament important. L’anàlisi d’associació entre genotip i fenotip amb gens candidats inclosos els SNP detectats en aquest estudi en pacients amb aquestes malalties en un estadi estable ajudarà a identificar marcadors vàlids de resistència a l’aspirina.

    Materials i mètodes

    Estudiar disseny

    En aquest estudi obert, vam administrar 81 mg d’aspirina simple (Nakakita Co. Ltd., Nagoya, Japó) a voluntaris japonesos d’adults masculins sans una vegada al dia durant 7 dies. Van agafar aquest agent a la sala els dies 1 i 7, i a casa els dies 2-6. El primer dia es van recollir mostres de sang per mesurar l’agregació plaquetària i la producció de tromboxà i els subjectes van prendre una pastilla d’aspirina després de prendre un àpat lleuger. Entre els dies 2 i 6, van prendre un comprimit d’aspirina amb 150 ml d’aigua després d’esmorzar. El dia 7, aquest agent es va administrar després del dejuni. Per mesurar els nivells d’aspirina i àcid salicílic, es va recollir sang immediatament abans de l’administració i 15, 30, 45, 60 i 75 min després de l’administració. A més, es va recollir sang per determinar l’agregació plaquetària i la producció de tromboxà als 60 minuts després de l’administració.

    Temes

    Entre els inscrits al grup de voluntaris de prova gestionat per l'Hospital Maruyama, els subjectes eren 110 voluntaris dels quals es va obtenir el consentiment informat per escrit i que es va considerar que eren elegibles per l'investigador principal o els co-investigadors basats en les conclusions de cribratge. Hem exclòs les persones amb hipersensibilitat al medicament, aquelles amb antecedents d’asma relacionades amb l’aspirina, aquelles amb tendència a l’hemorràgia i aquelles que havien pres agents inclosos medicaments OTC dins de les dues setmanes abans de l’administració de l’agent de prova. Els paràmetres hematològics i bioquímics estaven dins dels intervals normals. Aquest estudi va ser aprovat per la Junta de revisió de prova i la Junta de revisió ètica a l’hospital que participa en aquest estudi i es va realitzar d’acord amb la Declaració de Principi d’Hèlsinki. Per millorar el compliment a casa, es va utilitzar un dispositiu de control electrònic 25 de recent disseny. No hi va haver cap medicament residual ni sobredosi; El compliment a casa va ser bo en els 108 temes.

    Anàlisi genètica

    Per a l’anàlisi SNP, es van recollir 7 ml de sang 1 h abans de l’administració d’aspirina el primer dia i es va emmagatzemar sang sencera a 4 ° C. Els DNA es van purificar de sang sencera mitjançant un kit QIAamp Blood Blood Maxi (QIAGEN Inc., Tòquio, Japó). Es van determinar els genotips de 24 SNPs en nou gens.

    Les regions SNP es van amplificar per reacció en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR es va realitzar mitjançant un kit d’amplificació de Takara PCR (Takara Bio Inc., Otsu, Japó). En 12 dels 24 SNPs, es van utilitzar RFLP i seqüenciació directa per genotipar. En els SNP restants, el genotip es va determinar per seqüenciació directa. Els productes de PCR es van purificar i es van determinar les seqüències d’ADN mitjançant un kit de seqüenciació de cicles Big Dye Terminator i un seqüenciador ABI prism 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Es va provar el desequilibri d’enllaç mitjançant el programari Hitagene (Hitachi Europe, Dublin, Irlanda).

    Anàlisi estadística

    Dos dels 110 subjectes van abandonar aquest estudi; un no va poder consultar aquest hospital per motius personals i l’altre va desenvolupar gastritis aguda relacionada amb aquest agent després de la dosificació inicial. Es va analitzar la freqüència dels al·lels en els 110 subjectes i es va analitzar l’associació amb SNP en els 108 subjectes, exceptuant els dos abans esmentats. Tots els valors eren mitjans ± sd tret que s'especifiqui el contrari. El significat entre genotips va ser avaluat pel test de Student o ANOVA. Es van realitzar comparacions post hoc en parella amb la prova HSD de Tukey. Totes les anàlisis es van realitzar amb un paquet estadístic disponible comercialment (SAS ver.9.02, SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). S'han rebutjat hipòtesis nul·les a nivell de significació P <0, 05.

    Agregació de plaquetes

    Es va recollir sang (13, 5 ml) dels subjectes mitjançant una agulla d'injecció de 21 G 1 h abans de l'administració d'aspirina el dia 1 i 1 h després de l'administració final. Les mostres de sang es van dividir en tres tubs d’assaig de 5 ml que contenien 0, 5 ml de solució de citrat de sodi al 3, 8% (volum sanguini: 4, 5 ml per proveta) per fer una prova d’agregació de plaquetes. De seguida, la sang es va centrifugar a 80 g durant 10 min per recollir la capa superficial com a plasma ric en plaquetes (PRP). A més, es va centrifugar la sang residual a 2000 g durant 10 min per recollir la capa superficial com a plasma deficient de plaquetes (PPP). Es va mesurar el nombre de plaquetes en PRP. Quan el nombre de plaquetes va superar els 3 × 10 5 / μ l, les mostres de plasma es van diluir amb PPP per preparar una concentració de 2 × 10 5 / μ l a 3 × 10 5 / μ l. Així, es van utilitzar mostres de PRP i PPP per a una prova d’agregació de plaquetes. Aquests procediments es van realitzar a temperatura ambient. Per estabilitzar la resposta plaquetària, es va realitzar la mesura mitjançant aquestes mostres de PRP entre 1 i 2 h després de la recollida de sang. En cada tema, es va mesurar la permeabilitat mitjançant un agregòmetre plaquetari (hematràcer MCM 313-M, MC Medical Inc., Tòquio, Japó), quant a la permeabilitat a la PRP al 0% i a la permeabilitat PPP al 100%. Es van col·locar 26 PRP (200 μ l) i una barra agitadora en una cubeta per a la mesura, preincubats a 37 ° C durant 2 min, i es van barrejar amb 22 µl de solució de col·lagen per preparar les concentracions finals (abans de l’administració d’aspirina: 0, 125, 0, 25, 0, 5, 1, 0, 2, 0 i 4, 0 μ g / ml; després de l'administració d'aspirina: 0, 5, 1, 0, 2, 0, 4, 0, 6, 0 i 8, 0 μ g / ml). L’agregació plaquetària es va mesurar dues vegades. La permeabilitat màxima mitjana superior a 10 min es va considerar com la màxima agregació (%).

    Nivell sèric de TXB 2

    El nivell sèric de TXB 2 (un metabòlit estable de TXA 2 ) es va mesurar per radiimunoassaig. Utilitzant un tub de buit de 5 ml per a la recollida de sang (VP-P050, Terumo Corporation, Tòquio, Japó), es van recollir 4 ml de sang 1 h abans de l'administració d'aspirina el primer dia i 1 h després de l'administració final. Es va incubar sang sencera a 37 ° C durant 1 h, i es va centrifugar a temperatura ambient a 2000 g durant 10 min per aïllar el sèrum. Les mostres de sèrum es van congelar en forma instantània i es van conservar a -20 ºC o menys fins a la mesura. Segons el mètode estàndard, es van recollir fraccions TXB 2 a partir d’1, 0 ml de sèrum i es va mesurar el nivell de TXB 2 mitjançant el mètode de polimetilenglicol radioimmunològic (RIA-PEG) (SRL Inc., Tòquio, Japó). Tal com es descriu al protocol d’un kit RIA TXB 2 - [ 125 I] (Parkin Elmer Japan Co. Ltd., Yokohama, Japó), es va mesurar 125 I mitjançant un comptador gamma ARC-950 (Aloka Co. Ltd., Tòquio, Japó). Utilitzant la corba de calibració, es va calcular el nivell de TXB 2 a partir del nivell enquadernat. El límit de detecció va ser de 150 pg / ml.

    Nivells plasmàtics d’aspirina i àcid salicílic

    Es va recollir sang (2 ml) mitjançant dos tubs de buit de 2 ml per a la recollida de sang (VP-FH052, Terumo Corporation, Tòquio, Japó) abans de l'administració i 15, 30, 45, 60 i 75 min després de l'administració el dia 7 del tractament amb l'aspirina (total: 4 ml), refredat sobre gel. En condicions fredes, es van centrifugar les mostres de sang a 2000 g durant 20 min. El plasma es col·locava en un altre tub, es congelava en forma instantània i es guardava a -80 ºC fins a la mesura. Els nivells d’aspirina i àcid salicílic es van mesurar mitjançant cromatografia líquida d’alt rendiment (HPLC) i el mètode ultraviolat (JCL Bioassay Corporation, Osaka, Japó). Segons el mètode estàndard, el plasma es va extreure amb èter dietílic i aquests agents van ser aïllats mitjançant el mètode de gradient lineal amb 20-80% d'acetonitrilo, utilitzant una columna analítica Inertsil ODS-3 (5 μ m, 4, 6 × 250 mm) (GL Sciences Inc., Tòquio, Japó) en un sistema HPLC (sistema LC-10A, Shimadzu Corporation, Kyoto, Japó), i detectat a una longitud d'ona de 280 nm. Els límits inferiors de detecció d’aspirina i àcid salicílic van ser de 0, 1 i 0, 2 μ g / ml, respectivament.

    Dualitat d’interès

    Cap declarat.