Expressió de gens relacionats amb gemcitabina i cisplatina en càncer de pulmó de cèl·lules petites no | la revista farmacogenòmica

Expressió de gens relacionats amb gemcitabina i cisplatina en càncer de pulmó de cèl·lules petites no | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

L’objectiu d’aquest estudi va ser investigar la influència de la histologia i el lloc d’anàlisi (tumor primari versus gangli limfàtic) en l’expressió de gens implicats en l’activitat de gemcitabina i cisplatina en càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC). Reparació d’excisió-complement complement creuat-1 (ERCC1), transportador de nucleòsids d’equilibri humà-1 (HENT1), desoxicitidina quinasa (dCK), 5’-nucleotidasa (5’-NT), citidina deaminasa (CDA) i subunitats reguladores de ribonucleotides-reductasa ( RRM1 i RRM2) es van analitzar mitjançant la transcripció inversa quantitativa-PCR en 88 mostres microdisegudes de 69 pacients quimionaus. Els resultats van mostrar diferents patrons d’expressió per a tots els gens estudiats, cosa que suggereix una possible estratificació dels pacients. No es va observar cap diferència entre metàstasi del tumor primari i dels ganglis limfàtics, així com en els exemplars d’adenocarcinoma i carcinoma de cèl·lules escamoses, mentre que es va trobar una correlació entre el polimorfisme CDA- A79C i els nivells d’expressió gènica. Aquestes dades suggereixen una susceptibilitat genètica similar als esquemes de gemcitabina-cisplatina per a cèl·lules escamosas i adenocarcinoma i donen suport a l’ús tant de ganglis com de tumor primari per a l’expressió del perfil de NSCLC.

Introducció

El càncer de pulmó de cèl·lules petites (NSCLC) és la principal causa de mort per càncer a tot el món. 1 La majoria dels pacients presenten malaltia avançada en el diagnòstic i el tractament estàndard per a una malaltia que no es pot detectar consisteix en una quimioteràpia basada en platí associada amb un agent de tercera generació, com la gemcitabina. 2

En els darrers anys, s'han realitzat diversos estudis biològics moleculars per triar agents quimioterapèutics a partir del perfil d'expressió gènica dels pacients.

Determinants prometedors com ara la reparació d’excisió complementària transversal-1 (ERCC1) i ribonucleòtids-reductasa reguladora de la subunitat M1 (RRM1) d’ARNm i / o nivells d’expressió de proteïnes per a gemoterapia-cisplatina teràpia en pacients amb NSCLC estan guanyant impuls. Tanmateix, altres estudis van mostrar resultats controvertits i tractaments adaptats a la base de perfils d’expressió estan molt lluny d’ésser normalitzats. 4, 5

En el nostre estudi hem investigat si la histologia del tumor, l’etapa de la malaltia i els polimorfismes seleccionats podrien influir en l’expressió de gens implicats en l’activitat farmacològica.

Els candidats possibles a predir quins pacients probablement responguin a aquest tractament són gens que codifiquen enzims del metabolisme dels medicaments, el transport de medicaments a través de les membranes o proteïnes diana. 6, 7 La gemcitabina és transportada a les cèl·lules majoritàriament per transportador de nucleòsids d'equilibri humà-1 (HENT1). 8 nivells d’expressió basal d’HENT1 es van correlacionar significativament amb els valors IC 50 de gemcitabina en 22 línies cel·lulars NSCLC, 9 i els pacients amb càncer amb expressió hENT1 més alta van tenir una supervivència més llarga després de la quimioteràpia de gemcitabina. 10, 11 Com a produt, la gemcitabina ha d’estar fosforilada amb els seus metabolits actius de di- i trifosfat que, respectivament, inhibeixen la ribonucleòtida reductasa (RR) i la síntesi d’ADN. 12 La desoxicitidina kinasa (dCK) és l’enzim limitant de la velocitat d’aquesta biotransformació i diversos estudis van informar que la seva deficiència està implicada de manera crítica en la resistència adquirida per gemcitabina en cèl·lules NSCLC. 9, 13 A més, s'ha demostrat una clara correlació entre l'activitat del dCK i la sensibilitat a la gemcitabina en diversos xenografts del tumor, inclòs el NSCLC. 14 La quantitat de metabòlits fosforilats de gemcitabina pot reduir-se per la nucleotidasa 5'-cel·lular (5'-NT), mentre que la gemcitabina mateixa es desactiva per desaminació mitjançant la citidina desaminasa (CDA); S'ha trobat una alta expressió d'aquests enzims catabòlics en les línies de cèl·lules tumorals resistents als anàlegs de nucleòsids i a la gemcitabina. 15 Un estudi immunohistoquímic realitzat en 43 pacients amb NSCLC quimionaus localment avançats o metastàtics va demostrar que el 5'-NT és un factor pronòstic independent en pacients tractats amb gemcitabina i que els nivells baixos de 5'-NT es correlacionen amb una pitjor supervivència global. 16 estudis recents van avaluar també polimorfismes d’un nucleòtid específics (SNPs) dins del gen CDA , 17 i van trobar que el CDA A79C era un marcador predictiu de resposta, toxicitat, temps a progressió i supervivència en pacients avançats amb NSCLC tractats amb gemcitabina i cisplatina . 18, 19

La resistència a la gemcitabina també es va associar amb la sobreexpressió del RR en diverses cèl·lules canceroses. 20, 21 En particular, un augment de l’expressió de la RRM1 s’ha associat a la resistència a la gemcitabina a les línies cel·lulars NSCLC, 22 mentre que els estudis clínics van demostrar que els pacients amb NSCLC amb baixa expressió d’ARNm beneficiaven de la quimioteràpia gemcitabina-cisplatina. 23, 24 En canvi, l’alta expressió de la proteïna RRM1 es va associar significativament amb una supervivència més llarga en NSCLC que només va rebre tractament quirúrgic, cosa que suggereix l’ús de RRM1 per seleccionar pacients a tractar amb quimioteràpia adjuvant basada en gemcitabina. Tanmateix, es necessita més feina per dilucidar millor el control transcripcional de RRM1. De fet, els al·lelotips del promotor RRM1 RR37CC - RR524TT es van associar amb la supervivència total i lliure de malalties en pacients amb NSCLC resectats, però no es va trobar cap correlació amb l’expressió del tumor RRM1. 26, 27 De manera similar, no es va detectar cap associació significativa entre l’expressió d’ARNm RRM1 i l’ RPM1 G2464A SNP, que aparentment s’associa amb quimiosensibilitat a gemcitabina en 62 línies cel·lulars de càncer. Un polimorfisme mostra una associació amb la quimiosensibilitat a gemcitabina en les línies cel·lulars canceroses. Farmacogenet Genòmica 2006; 16: 429–438. "Href = / articles / tpj200953 # ref28 aria-label =" Referència 28 "data-track = click data-track-label = link> 28 Aquest SNP, juntament amb el polimorfisme A2455G es va associar amb el resultat clínic. després d’un tractament amb gemcitabina en pacients amb càncer de mama, però no es van realitzar anàlisis sobre els nivells d’expressió RRM1 en els teixits.

Diversos estudis sobre compostos de platí també ofereixen exemples sobre com poden afectar les característiques farmacogenètiques a la resposta dels fàrmacs, que inhibeixen la proliferació cel·lular perjudicant l'ADN a través de la formació de reticulacions intra i inter-filals. La resistència als fàrmacs es produeix principalment a causa de la desintoxicació o reparació eficient del DNA danyat pels membres del sistema de reparació d’excisió de nucleòtids, inclòs ERCC1. 30 Estudis in vitro van demostrar que la regulació d’ERCC1 està associada a la resistència cisplatina 31 i els estudis clínics van demostrar que la resposta i la supervivència de pacients amb NSCLC avançat es milloraven en presència d’expressió baixa d’ERCC1. 32, 33 Una expressió ERCC1 baixa també es va relacionar amb un millor resultat a la quimioteràpia basada en cisplatina adjuvant en pacients amb NSCLC completament reseccionada. 34

En canvi, la tinció immunohistoquímica d’ERCC1 no era predictible per a la resposta i supervivència del tumor després de la quimioteràpia en pacients amb NSCLC seleccionats d’un assaig aleatori de fase III comparant cisplatina-gemcitabina i epirubicina-gemcitabina, 4 i no hi va haver cap correlació entre l’expressió de mRNA d’ERCC1 i quimiosensibilitat. cisplatina, carboplatina i gemcitabina en un plafó de 20 línies cel·lulars de càncer de pulmó, incloses 15 línies cel·lulars NSCLC. 5

Molts estudis han documentat la relació entre l’histologia d’adenocarcinoma i una millor resposta als inhibidors d’EGFR, 35 mentre que s’ha aprovat l’addició de bevacizumab a paclitaxel més carboplatina per al tractament de pacients amb NSCLC avançat en un bon estat de rendiment, excloent els pacients amb proves histològiques de predomini. càncer de cèl·lules escamoses, per evitar una toxicitat severa. 36 Un recent procés de fase III va reportar una diferència important de supervivència a favor del tractament amb cisplatina / pemetrexed en pacients amb NSCLC que acollien l’adenocarcinoma o un grup histològic de carcinoma de cèl·lules grans. 37

Tot i això, hi ha poques dades sobre la influència de la histologia del tumor i l’expressió gènica de determinants moleculars de l’activitat de la gemcitabina i el cisplatí. 38 De manera similar, no hi ha dades disponibles sobre les diferències en els nivells d’expressió gènica d’aquests gens objectiu que tenen un paper crític en la sensibilitat del tumor i la resistència als fàrmacs anticancerígens en els teixits NSCLC primaris i metastàtics.

Com que l’elecció de diversos règims de quimioteràpia depèn de la histologia del tumor, mentre que la disponibilitat i l’ús de teixits tumorals primaris o metastàtics són essencials per a les anàlisis d’expressió gènica, la caracterització de l’expressió de gens claus en exemplars de tumor amb origen i histologia diferents pot representar una nova via per a l’ús òptim de fàrmacs i augmentar l’èxit terapèutic ja sigui mitjançant la selecció de pacients sensibles o per la modulació d’efectes del fàrmac amb combinacions de medicaments seleccionats racionalment.

A més, l’anàlisi de correlacions genotip-fenotip pot dilucidar si els polimorfismes relacionats amb el resultat clínic després de règims de gemcitabina afecten els nivells d’expressió gènica en els teixits, o poden tenir un efecte funcional sobre l’activitat de gemcitabina independentment de les diferències d’expressió gènica.

Per tots aquests motius, aquest estudi aborda l’anàlisi de transcripció d’HENT1, dCK, 5′-NT, CDA, RRM1, RRM2 i ERCC1 en teixits NSCLC primaris i metastàtics amb histologia diferent per dilucidar patrons discrets d’expressió gènica que poden convertir-se en marcadors útils. d’eficàcia de gemcitabina – cisplatina. A més, es van estudiar variants polimòrfiques específiques de RRM1 i CDA per avaluar la seva correlació amb l’expressió gènica.

Resultats

Variabilitat de l’expressió gènica segons la histologia del tumor

Hem avaluat un total de 89 mostres microdissegudes congelades de 69 pacients amb NSCLC en diferents etapes de la malaltia (taula 1). Entre aquests pacients, 45 (60, 8%) es van veure afectats per adenocarcinoma i 25 (33, 8%) per carcinoma de cèl·lules escamoses. Els quatre pacients amb carcinoma de cèl·lules grans (5, 4%) no van ser inclosos en la nostra anàlisi estadística a causa del nombre reduït de casos. En 14 pacients, hem pogut recollir mostres tant del tumor (ganglis limfàtics primaris o metastàtics) com del teixit normal, i en cinc d’aquests pacients es va realitzar un mostreig de teixit a partir d’un tumor primari, dels ganglis i dels teixits normals (Taules 2 i 3).

Taula completa

Taula completa

Taula completa

L’amplificació gènica va tenir èxit a la gran majoria de mostres, mentre que només un subjecte inscrit a l’estudi no tenia ARN adequat per a l’anàlisi de l’expressió gènica (que es va realitzar en 88 dels 89 casos).

Per conèixer si el tipus histològic diferent podria influir en l’expressió gènica, es van avaluar els nivells d’expressió de dCK, 5′-NT, CDA, RRM1, RRM2, hENT1 i ERCC1, normalitzats a β-actina o GAPDH, en adenocarcinomes i cèl·lules esquamoses. carcinomes (Taules 4 i 5). Tenint en compte els resultats obtinguts amb el normalitzador, el 5'-NT va ser l'únic gen expressat de manera diferent en els dos histotips diferents ( P = 0, 018; taula 5). No obstant això, per mantenir com a mínim la probabilitat de trobar una diferència estadísticament significativa purament per casualitat, el nivell nominal habitual ( α = 0, 05) s'ha reduït a 0, 00238 mitjançant l'ajust de Bonferroni per a comparacions múltiples. Per tant, després de l’ajustament de Bonferroni, no es van detectar diferències estadísticament significatives en els nivells d’expressió entre adenocarcinoma i mostres de carcinoma squamocel·lular.

Taula completa

Taula completa

Variabilitat de l’expressió gènica segons l’etapa

En utilitzar β-actina com a gen de la neteja (taula 4), l'estudi va revelar diferències estadísticament significatives en l'expressió gènica entre els teixits normals i els tumors per a diversos determinants de l'activitat de la gemcitabina. En particular, analitzant el conjunt de teixits tumorals (tumor primari i ganglis limfàtics), vam observar una expressió més alta de dCK i hENT1 ( P = 0.036 i 0.002, respectivament) i una expressió inferior significativa de RRM1 i RRM2 ( P = 0.001 i 0.038 ) comparat amb els teixits normals. Tanmateix, després de l’ajust de Bonferroni, només els nivells d’expressió RRM1 i hENT1 eren significativament diferents entre el tumor i les mostres normals. Curiosament, utilitzant GAPDH com a neteja, també es va observar la diferència més alta entre el tumor i els teixits normals per a RRM1, encara que no fos significativa estadísticament.

Finalment, l'anàlisi d'expressió ERCC1 no va demostrar diferències significatives entre el tumor i les cèl·lules metastàtiques.

A més, per investigar si l’etapa de la malaltia té algun efecte en l’expressió gènica, es va analitzar el nivell d’expressió dels gens d’interès en un conjunt de 51 tumors primaris i 23 ganglis. De nou, després de l’ajustament de Bonferroni, no es va observar cap diferència estadística significativa en l’expressió gènica entre el lloc primari i els ganglis metastàtics, almenys per als gens implicats en el metabolisme de cisplatina i gemcitabina.

Heterogeneïtat entre teixits normals i tumorals

L’anàlisi de mostres normals va revelar una variabilitat d’expressió gènica més elevada respecte a les mostres de tumor per a cada gen analitzat, amb coeficients de variació per cent de valors que van des del 14, 5 (RRM2, taula 4) al 27, 5% (hENT1, taula 4) per als teixits normals versus 5.4. (5′-NT, taula 4) al 12, 8% (dCK), utilitzant β-actina. La mateixa tendència es va observar considerant GAPDH com a gen de la neteja (taula 5).

Aquesta alta variabilitat de l’expressió gènica en teixits normals pot reflectir l’heterogeneïtat de cèl·lules que formen un teixit. Per contra, la baixa variabilitat de les cèl·lules tumorals podria ser conseqüència de l’homogeneïtat important dels teixits tumorals microdissectats.

A més, es va observar una correlació significativa (figura 1) en els valors d’expressió de cada gen estudiat respecte a RRM1 en teixits normals (mitjana de Spearman ρ = 0, 885), però no en els teixits tumorals (mitjana de Spearman ρ = 0, 421). No obstant això, el major valor de correlació en els teixits normals podria ser només la conseqüència de l'heterogeneïtat anteriorment esmentada del teixit.

Image

( a ) Parcel·la de tots els marcadors amb RRM1 normalitzada a β-actina. ( b ) Nivells d'expressió gènica de hENT1 i RRM1 en cèl·lules A549 i H1703 transfectades amb petits ARN interferidors (siRNAs) dirigits contra hENT1 i RRM1 i en control de cèl·lules transfectades de siRNA, respecte al control de cèl·lules no transferes. ( c ) La viabilitat de les cèl·lules després del tractament amb gemcitabina durant 48 h en cèl·lules A549 i H1703 transfectades amb hENT1 i RRM1 diferia significativament de la de cèl·lules transfectades o si no transfectades de SiRNA ( P <0.05 amb el test t aparellat en comparació amb cèl·lules no controlades).

Imatge a mida completa

Variabilitat de l’expressió gènica segons el genotip

Per avaluar la correlació entre els polimorfismes RRM1 G2464A i A2455G i l’expressió RRM1, així com entre l’ expressió CDA A79C SNP i CDA, hem extret ADN de 31 dels exemplars microdissectats congelats dels quals anteriorment hem extret ARN. Entre aquests, 17 (54, 8%) procedien de pacients afectats per adenocarcinoma i 14 (45, 2%) de pacients afectats per carcinoma de cèl·lules escamoses. En 21 pacients, vam tenir mostres dels tumors, mentre que en 10 casos el mostreig de teixits es va realitzar a partir de ganglis. Tot i això, es van realitzar estudis preliminars en 25 mostres parellades de DNA de càncer de línia germinal i de pulmó, mostrant genotips interindividuals idèntics entre teixits normals i malignes.

El genotipat va tenir èxit en totes les mostres, però en un dels casos no es va detectar l’expressió CDA del teixit corresponent. Per al polimorfisme 2464 del codó RRM1 , les freqüències dels genotips GG , GA i AA van ser del 6, 4, el 19, 6 i el 74, 2%, respectivament. El polimorfisme RRM1 A2455A tenia una freqüència del 35, 5%, mentre que l'heterozigot AG i les variants GG homozigoses tenien una freqüència de 45, 2 i 19, 3%, respectivament. Pel que fa al polimorfisme CDA A79C , la variant de tipus salvatge ( AA ) es va trobar en el 45, 2% dels casos, mentre que les variants heterozigotes AC i CC es van observar en el 45, 2 i el 9, 6% dels casos, respectivament. Les distribucions d’aquests polimorfismes es mostren a la taula 6, que també mostra les seves freqüències al·lèliques.

Taula completa

Tots els polimorfismes van seguir l'equilibri de Hardy-Weinberg i les freqüències de genotips del CDA A79C SNP van ser comparables amb les reportades en un estudi anterior en caucàsics afectats per NSCLC, 19 segons es calcula amb la prova χ 2 ( P = 0.836).

Es va investigar si aquests diferents genotips podrien influir en l’expressió gènica (taula 6) i no es va trobar una associació significativa entre els polimorfismes RRM1 i l’expressió gènica, utilitzant el dos costats de Wilcoxon per a dues mostres per al RRM1 G2464A ( és a dir, AA versus GG) i la prova de Kruskal – Wallis per al RRM1 A2455G (per als grups AA , AG i GG ). D'altra banda, es va detectar una diferència significativa entre l'expressió mitjana de CDA en teixits de pacients que acollien el genotip CDA A79A i el genotip CDA A79C ( P = 0.031).

Efectes del silenciament hENT1 i RRM1 en cèl·lules NSCLC

Per investigar si la variabilitat de l’expressió gènica observada entre el teixit normal i el tumor pot afectar l’activitat citotòxica de la gemcitabina, es va utilitzar siRNA contra hENT1 i RRM1 en les línies cel·lulars A549 i H1703. Aquestes cèl·lules contenen els mateixos genotips CDA A79A i RRM1 A2464A , mentre que l’expressió basal de hENT1 i RRM1 va ser de 1.011 i 1.003 (H1703) i 1.280 i 0.891 (A549), respectivament. Per avaluar l'alteració de l'expressió hENT1 i RRM1 després de la transfecció de siRNA, es van collir cèl·lules 48 h després de la transfecció i es van analitzar extractes d'ARN mitjançant PCR quantitativa. Els nivells d’expressió dels gens hENT1 i RRM1 a les concentracions de siRNA més baixes es van reduir fins a valors mitjans de 0, 966 i 0, 801 a A549 i a 0, 902 i 0, 885 a les cèl·lules H1703, respectivament (Figura 1b).

La citotoxicitat a la gemcitabina va ser més elevada per a les cèl·lules exposades a gemcitabina transfectades amb siRNA dirigides contra RRM1 (IC 50, 15, 47 ± 1, 12 i 21, 50 ± 1, 66 n M a les cèl·lules A549 i H1703, respectivament) que a les cèl·lules no transfectades (21, 13 ± 0, 91 i 26, 53 ± 0, 93 a les cèl·lules A549 i H1703, respectivament) i a les cèl·lules transfectades amb siRNA de control negatiu (figura 1c). En canvi, la transfecció amb siRNA dirigit contra hENT1 va augmentar els valors IC50 fins a 31, 00 ± 2, 19 i 34, 13 ± 1, 18 n M a les cèl·lules A549 i H1703, respectivament. Com que el siRNA de control negatiu, que no va afectar l’expressió hENT1 i RRM1, no va alterar el creixement cel·lular en ambdues línies cel·lulars, aquests resultats indiquen que la pertorbació de l’expressió de HENT1 i RRM1 per siRNAs específics va modular significativament la citotoxicitat a la gemcitabina.

Discussió

Aquest estudi és el primer que aborda les diferències potencials en el patró d’expressió de determinants de l’activitat de gemcitabina i cisplatina, segons la localització del tumor i el subtipus histològic en NSCLC. En particular, l'objectiu d'aquesta investigació era la comparació del nivell d'expressió de gens implicats en l'activitat de gemcitabina i cisplatina en mostres de NSCLC amb histologia diferent, així com en tumors pulmonars primaris versus metastàtics. De fet, els principals subtipus histològics de NSCLC tenen orígens embrionaris diferents i sorgeixen en diferents llocs anatòmics (centrals versus vies perifèriques) i, per tant, poden tenir diferents capacitats per al transport de medicaments, la unió, la bioactivació i el metabolisme, que poden afectar l'activitat del fàrmac.

Utilitzant les anàlisis estadístiques adequades per a l'ajust de comparació múltiple, hem observat una concordància de l'expressió gènica mitjana entre el tumor primari i la metàstasi del node respecte a tots els gens estudiats. De la mateixa manera, en els nostres exemplars no es va observar cap diferència estadística significativa en la comparació dels nivells d’expressió gènica entre adenocarcinoma i carcinoma de cèl·lules escamoses. A més, l'amplificació gènica va mostrar diferents models d'expressió per a tots els gens estudiats, cosa que suggereix una possible estratificació dels pacients a partir dels nivells d'expressió dels teixits dels gens objectiu.

Aquestes troballes tenen diverses conseqüències rellevants. La concordança entre el tumor primari i el gangli limfàtic suggereix que, almenys en el quadre dels gens estudiats, es poden obtenir exemplars de tumor per a estudis farmacogenètics indistintament de llocs metastàtics o primaris.

A més, la manca de diferències en els valors d’expressió mitjans en els exemplars d’adenocarcinoma i carcinoma de cèl·lules esquamoses suggereix una susceptibilitat genètica similar a l’adenocarcinoma i el carcinoma pulmonar de cèl·lules esquamoses a cisplatí i gemcitabina. Aquestes dades són coherents amb la resposta heterogènia dels pacients a aquest règim de combinació, 2 i, en conseqüència, posen de manifest la necessitat d’adaptar el tractament en funció de les característiques d’expressió individuals, i no del tipus histològic.

Els nostres resultats estan d’acord amb un estudi recent que no mostra diferències en el resultat després del tractament amb gemcitabina-cisplatina en pacients que acollien un adenocarcinoma o un histotip de carcinoma de cèl·lules escamoses. Al contrari, els pacients amb adenocarcinoma van tenir un millor resultat en el règim que contenia pemetrexed en associació amb cisplatina, possiblement a causa dels nivells d'expressió més baixos del principal objectiu de pemetrexed, timidilat sintasa en adenocarcinoma que en el carcinoma de cèl·lules escamosas. 39, 40 El paper predictiu de la histologia per pemetrexed es va recolzar en estudis de fase II i en una revisió retrospectiva de dos grans assaigs aleatoris en fase III. 38

Una revisió recent de 408 publicacions va informar que 11 estudis de població d'un sol braç o en grup van mostrar una associació pronòstica entre histologia i resultats clínics. 41 Només set estudis van suggerir que el subtipus histològic era predictiu dels resultats en pacients amb NSCLC avançat tractats amb esquemes de quimioteràpia, però el disseny d’aquests estudis i / o tipus d’anàlisis no va permetre distingir clarament entre una associació pronòstica o predictiva i l’anàlisi genètica. mancaven determinants de l’activitat farmacològica.

En aquest estudi, es va observar l'única variabilitat significativa de l'expressió gènica mitjana per a RRM1 i HENT1 en teixits normals i tumorals. Aquests resultats concorden amb les dades obtingudes en estudis anteriors sobre diferències entre el teixit neoplàstic i el teixit normal o entre el teixit neoplàstic i la inflamació crònica, cosa que suggereix que la microdissecció per làser és crucial per obtenir dades més precises i abordar preguntes anteriorment no contestables derivades de mostres caracteritzades per diferents cel·lulars. poblacions. 42, 43 En efecte, a mesura que es desenvolupen nous procediments i instruments analítics d'expressió quantitativa d'avantguarda, també s'han de plantejar demandes més rigoroses sobre tècniques de preparació de mostres, inclosa la microdissecció làser. La successiva anàlisi quantitativa de PCR validada va ser una tècnica fiable, sensible i específica per avaluar l’expressió gènica de l’ARNm, fins i tot quan el material de la mostra era limitat, com en la metàstasi del ganglio limfàtic. Això va permetre la mesura de l’expressió gènica d’ARNm en 88 de 89 mostres microdissectades, i cal destacar que les tècniques utilitzades en aquest estudi van permetre l’anàlisi exacta de l’expressió gènica de teixit en les 6 h després de l’entrega de mostres al laboratori.

Per avaluar si la modulació de l’expressió gènica similar a la variabilitat de l’expressió gènica detectada en els teixits pulmonars pot afectar l’activitat citotòxica de la gemcitabina, es van realitzar experiments específics amb el silenci del gen SiRNA contra hENT1 i RRM1 en un adenocarcinoma i un carcinoma de cèl·lules escamoses NSCLC. . En aquests experiments, es van obtenir diferències d’expressió comparables a les detectades en les mostres clíniques i els assajos de citotoxicitat van mostrar una modulació significativa de la sensibilitat de la gemcitabina. En ambdues línies cel·lulars, els siRNAs amb destinació RRM1 i hENT1 van causar un augment significatiu i disminució de la sensibilitat de la gemcitabina, respectivament. Com que el siRNA de control negatiu, que no va afectar l’expressió hENT1 i RRM1, no va alterar el creixement cel·lular, aquests resultats indiquen que la modulació de la citotoxicitat de gemcitabina va ser determinada per la pertorbació de l’expressió de hENT1 i RRM1 per siRNA específics. Aquests resultats concorden amb estudis anteriors que mostren una major sensibilitat a la gemcitabina després del siRNA contra el RRM1 en les línies cel·lulars de càncer de pàncrees i pulmó. 44, 45 En canvi, el siRNA orientat a hENT1 no va afectar la sensibilitat de gemcitabina a les cèl·lules de càncer de pàncrees, 44 suggerint una sensibilitat diferent en diferents línies cel·lulars.

Les variants genètiques com les mutacions i els polimorfismes també poden afectar l’expressió gènica i hem avaluat la correlació entre els nivells d’expressió gènica i els polimorfismes específics que s’han associat al resultat clínic en pacients tractats amb règims de gemcitabina-cisplatí. 19, 27, 29 No es van detectar associacions significatives tant per als polimorfismes RRM1 G2464A i A2455G com per a l’expressió gènica RRM1. Aquests resultats estan d’acord amb un estudi anterior que no mostra una associació significativa entre els nivells d’ARNm de tipus silvestre i els tipus polimòrfics només en RRM1 G2464A ( P = 0.301), o una combinació de diversos tipus de RRM1, inclòs el RRM1 A2455G , en 62 càncer humà es van utilitzar línies cel·lulars, incloses sis línies cel·lulars de càncer de pulmó. Un polimorfisme mostra una associació amb la quimiosensibilitat a gemcitabina en les línies cel·lulars canceroses. Farmacogenet Genòmica 2006; 16: 429–438. "Href = / articles / tpj200953 # ref28 aria-label =" Referència 28 "data-track = clic data-track-label = link> 28 En el mateix estudi, el polimorfisme RRM1 G2464A va demostrar una associació amb sensibilitat a la gemcitabina, 30 mentre que juntament amb el polimorfisme A2455G es va associar amb neutropènia després del tractament amb gemcitabina en pacients amb càncer de mama 29 Per tant, es necessiten altres estudis funcionals que avaluen gens coexpressius, així com un assaig clínic prospectiu per a la seva aplicació com a biomarcador predictiu.

Es va detectar una diferència significativa entre els nivells mitjans d'expressió de CDA en teixits de pacients que acollien el CDA A79A i el genotip CDA A79C ( P = 0.031). Segons el nostre coneixement, aquest és el primer estudi que informa aquesta correlació en teixits NSCLC, que podria tenir conseqüències clíniques importants. De fet, estudis anteriors van mostrar una correlació entre l’expressió de l’ARNm de CDA en cèl·lules mononuclears de la medul·la òssia i la toxicitat hematològica, 46, així com amb el resultat clínic en pacients tractats amb gemcitabina, 47, però no hi havia dades sobre els teixits tumorals. Els nostres resultats també s’ajusten a estudis ex vivo que demostren que l’activitat enzimàtica de CDA era significativament inferior en els subjectes que acollien el genotip A79A, cosa que suggereix que la variant del tipus salvatge codifica per a una proteïna amb una activitat reduïda. 48 Aquestes dades podrien explicar la correlació del genotip A79A amb benefici clínic, temps a progressió i supervivència global en pacients avançats amb NSCLC tractats amb cisplatina més gemcitabina. 19

Tot i això, l’anàlisi de genòmica funcional va mostrar una disminució moderada de l’activitat de CDA en la variant de C79C respecte al genotip de tipus salvatge, 49 i no es van observar efectes d’aquest polimorfisme en farmacocinètica de gemcitabina en un estudi realitzat en 256 pacients japonesos tractats amb gemcitabina. 50 Aquests resultats conflictius suggereixen que la correlació genotip-fenotip de la CDA, així com el paper d’aquest SNP en la farmacocinètica / farmacodinàmica de la gemcitabina encara no és clara, i s’hauria d’avaluar encara més amb estudis retrospectius i prospectius adequats incloent l’anàlisi del genotip, l’expressió gènica. i l’activitat en teixits, farmacocinètica i correlació amb el resultat clínic després de la teràpia amb gemcitabina.

En conclusió, caldria tenir en compte diverses troballes d’aquest estudi per a la traducció de dades relacionades amb l’expressió gènica i el genotipat a la pràctica clínica, i els nostres resultats podrien conduir a aplicacions clínicament rellevants. En particular, atès que els nivells d’expressió gènica d’ERCC1 i per als gens implicats en l’activitat de gemcitabina no estan afectats per l’origen i la histologia del tumor, els futurs estudis haurien d’inscriure pacients amb NSCLC independentment de la diferent histologia i utilitzar tècniques de microdissecció i làser PCR en el tumor. teixits tant de les reseccions quirúrgiques com de la biòpsia de ganglis per adaptar el tractament del pacient.

Materials i mètodes

Característiques i tractament del pacient

Del juny del 2004 al setembre del 2006, es van inscriure un total de 69 pacients afectats per NSCLC. Cap d’ells va rebre cap tractament de quimioteràpia previ. Es van recollir els teixits durant els procediments de mediastinoscòpia o de resecció pulmonar. Tots els pacients van donar el seu consentiment per escrit i l'estudi va ser aprovat pel Comitè d'ètica institucional.

Processament i mostreig de teixits

Es van descongelar seccions de teixit congelat (5 μm), es van fixar en 75% etanol i es van deshidratar en 100% etanol i xileno. Les cèl·lules neoplàstiques es van disseccionar mitjançant el microdissector làser Leica AS / LMD (Leica, Wetzlar, Alemanya). Les cèl·lules captades per làser es van agrupar en el tampó de lisi i es va extreure ADN i ARN amb el kit QIAamp ADN i RNA Mini, respectivament (Qiagen, San Diego, CA, EUA). L’ARN i l’ADN es van dissoldre en aigua lliure de DNase / RNase i es van mesurar mitjançant la lectura d’absorbància a 260/280 nm.

Anàlisi quantitativa de PCR

De 50 a 500 ng l'ARN es va transcriure inversament com es va descriure anteriorment. 10 L’ADNc resultant es va amplificar amb el sistema de detecció de seqüències 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Els primers i sondes avançats i inversos es van dissenyar amb Primer Express 2.0 (Applied Biosystems) sobre la base de la seqüència de gen dCK (NM_000788), 5′-NT (NM_012229) i CDA (NM_001785) obtinguts del GenBank, mentre que els primers i sondes per a RRM1 (NM_001033), RRM2 (NM_001034), hENT1 (NM_004955) i ERCC1 es van obtenir dels productes Applied Biosystems Assay-on-Demand (Hs00168784, Hs0035724, Hs00191940 i Hs01012158). Es van realitzar experiments de validació amb ADNc obtingut a partir de l'ARN total QPCR Human Reference (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) per demostrar que les eficiències d'amplificació de la diana i els dos gens de referència GAPDH i β-actina eren aproximadament iguals. Els resultats van mostrar resultats mitjans comparables i variabilitat en la relació de cada objectiu amb els dos gens de neteja diferents, però l’ús de β-actina va permetre la detecció de valors d’expressió més alts en la majoria de mostres. Els exemplars es van amplificar per triplicat amb controls no exemplars adequats, i el coeficient de variació va ser <2% per a totes les rèpliques.

Genotipat dels SNPs

Els polimorfismes RRM1 A2464G i A2455G i CDA A79C (rs1042858, rs3177016 i rs2072671, respectivament) van ser estudiats amb assajos basats en sondes Taqman (C__12053301_10, C___2769876_20 i C__25472931_20, sistema de la versió del sistema IP). (Biosistemes aplicats). Les reaccions de PCR es van realitzar mitjançant 20 ng d’ADN genòmic obtingut a partir de teixits, diluït en 11, 875 μl d’aigua lliure de DNAse-RNAse, 12, 5 µl de TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), amb AmpliTaq Gold ( Aplicats Biosistemes, Foster City, CA, EUA i 0, 625 μl de la barreja d'assaig (primer i revers inversa i les sondes específiques), en un volum total de 25 µl. Després del ciclisme tèrmic, l'instrument 7900HT va determinar el contingut al·lèlic de cada mostra a la placa mitjançant la lectura de la fluorescència generada.

Estudis in vitro

Drogues i productes químics

La gemcitabina va ser un regal d'Eli Lilly, Indianapolis, IN, Estats Units. El fàrmac es va dissoldre en aigua estèril i es va diluir en medi de cultiu abans de l’ús. RPMI-1640 i el mitjà Eagle modificat de Dulbecco, sèrum boví fetal, penicil·lina (50 UI ml −1 ) i estreptomicina (50 μg ml −1 ) provenien de Gibco (Gaithersburg, MD, EUA). La resta de productes químics eren de Sigma (St Louis, MO, EUA).

Línies cel·lulars

Les línies cel·lulars es van mantenir com a cultius monocapa en RPMI o en el medi Eagle modificat de Dulbecco (que conté 2 m de glutamina ML) complementat amb sèrum boví fetal, penicil·lina i estreptomicina. La línia cel·lular NSCLC humana H1703 es va cultivar en RPMI, mentre que les cèl·lules A549 es van cultivar en el medi modificat per Eagle de Dulbecco. Les cèl·lules H1703 es van originar en un pacient afectat per un carcinoma de cèl·lules escamoses, les cèl·lules A549 eren d’un pacient afectat per l’adenocarcinoma. Les cèl·lules es van conrear en matràs de cultiu de 75 cm 2 (Costar, Cambridge, MA, EUA), a 37 ° C en un 5% de CO 2 i un 95% d’aire, i es van collir amb trypsina-EDTA quan estaven en creixement exponencial.

Caracterització de les línies cel·lulars per determinants de l’activitat del fàrmac

Les cèl·lules NSCLC utilitzades en aquest estudi es van caracteritzar per l’expressió gènica de determinants implicats en l’activitat de gemcitabina i cisplatina, tal com s’ha descrit anteriorment. A més, es van avaluar les variacions genètiques que poden influir en el metabolisme i la sensibilitat de la gemcitabina, com els polimorfismes CDA i RRM1 descrits anteriorment.

Modulació de citotoxicitat per gemcitabina per transfecció de siRNA de RRM1 i hENT1

Les cèl·lules es van placar a 10 cinc cèl·lules per pou en plaques de sis pous (Costar) i, després de 24 h, van ser transfectades amb un petit oligonucleòtid d’ARN interferidor (siRNA) o siRNA de control negatiu utilitzant Oligofectamina (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA, EUA) per obtenir una concentració final d’ARN d’1, 25 i 50 nmol l −1 en un medi lliure de sèrum, segons les instruccions del fabricant. A les 24 h després de la transfecció, canviem de medi a suplementat amb un sèrum boví fetal inactivat per calor del 10%, però sense penicil·lina / estreptomicina. Després de 24 hores addicionals, es va extreure ARN total mitjançant el kit QIAamp RNA Mini i es van tractar les cèl·lules amb gemcitabina (0, 01-100 n M) durant 48 h. Al final del tractament farmacològic, es va estudiar l'efecte inhibidor del creixement cel·lular de la gemcitabina mitjançant el recompte de cèl·lules directes amb el blau de prova. La inhibició del creixement es va expressar com el percentatge de controls no tractats amb gemcitabina (cèl·lules tractades amb siRNA no controlades i amb control negatiu), i la concentració inhibidora del 50% del creixement cel·lular (IC 50 ) es va calcular mitjançant l’ajustament de la corba mínima no quadrada (GraphPad PRISM, Programari intuïtiu per a la ciència, San Diego, Califòrnia, EUA).

Els oligonucleòtids siRNA per hENT1 i RRM1 (predisenyats siRNA, s117290 i s12357, respectivament) es van comprar a Applied Biosystems-Ambion (Foster City, CA, EUA). El siRNA de control negatiu (Silencer-Negative-Control # 1 siRNA), també es va comprar a Applied Biosystems-Ambion.

Mètodes estadístics

La informació demogràfica i clínica es va obtenir a partir dels registres mèdics. Es van tabular estadístiques de resum (mitja, se, mediana i coeficient de variació) per a tota l’expressió gènica normalitzada a GAPDH o β-actina per lloc i histologia, així com la distribució de freqüències de la histologia per lloc del tumor. L'associació entre lloc de tumor i histotip es va provar mitjançant la prova exacta de Fisher. La comparació entre els nivells d’expressió gènica de llocs (primari versus el ganglis limfàtic) i la histologia (normal versus adenosquamós i adeno versus carcinoma esquamós), així com per a genotips (AA, AC, AG i GG) es van realitzar mitjançant una mostra de dues, una prova de dues cares de Wilcoxon o, si escau, la prova de dos no aparellada. La prova de Bonferroni es va ajustar a les comparacions múltiples. Tota l'expressió gènica normalitzada a β -actina o GAPDH es va representar amb els valors de RRM1, ja sigui per a mostres normals i patològiques. També es van calcular les correlacions de Spearman entre tots els gens. Les diferències en la viabilitat cel·lular entre el control i les mostres tractades es van avaluar amb la prova de t f. El nivell de significació es va establir en un 5% mitjançant una anàlisi a dues cares.