Hemoglobina fetal en anèmia falciforme: determinants genètics de la resposta a la hidroxiurea | la revista farmacogenòmica

Hemoglobina fetal en anèmia falciforme: determinants genètics de la resposta a la hidroxiurea | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

L’augment de l’hemoglobina fetal (HbF) en resposta a la hidroxiaurea (HU) varia entre els pacients amb anèmia falciforme. Es van estudiar vint-i-nou gens candidats dins de loci prèviament relacionats amb el nivell de HbF (6q22.3 – q23.2, 8q11 – q12 i Xp22.2 – p22.3), implicats en el metabolisme de la HU i relacionats amb la proliferació dels progenitors eritroides. en 137 pacients amb anèmia cel·lular de falç tractats amb HU. A partir de les dades de HapMap, es van seleccionar tres-cents vint polimorfismes d’un sol nucleotidi (SNPs) marcats per a genotipar. Es va utilitzar la regressió lineal múltiple i el mètode de regressió no lineal Random Forest per investigar l'associació entre SNPs i el canvi del nivell de HbF després de 2 anys de tractament amb HU. Ambdós mètodes van revelar que els SNP en gens dins dels pics d’enllaç 6q22.3–23.2 i 8q11 – q12, i també els gens ARG2 , FLT1 , HAO2 i NOS1 estaven associats amb la resposta de HbF a HU. Els polimorfismes en gens que regulen l’expressió de HbF, el metabolisme de la HU i la proliferació dels progenitors eritroids poden modular la resposta del pacient a la HU.

Introducció

L’hemoglobina fetal (HbF) inhibeix la polimerització de l’hemoglobina falç (HbS). 1 Com que moltes de les complicacions de l’anèmia falciforme (homozigositat per HBB , glu6val), com l’osteonecrosi, la síndrome aguda del tòrax i l’episodi dolorós, estan associades al nivell d’HbF i, mentre que, l’HbF està inversament associat a la mortalitat, els investigadors han buscat assíduament farmacològic un mitjà per augmentar la producció de HbF. 2, 3, 4, 5, 6

La hidroxyurea (HU), un inhibidor del ribonucleòtid reductasa, és un medicament que augmenta la concentració de HbF en pacients amb anèmia falciforme 7, 8, 9, 10 i és l’únic agent aprovat per la FDA per tractar l’anèmia de les falciformes. La majoria, però no tots els pacients responen al tractament amb HU amb un augment de la HbF, però, com passa amb la concentració de HbF basal, que varia àmpliament entre els pacients, la magnitud de la resposta de HbF a HU també és variable. 10, 11, 12, 13

La regulació del nivell de HbF podria ser un tret genètic complex regit per elements genètics vinculats al cúmul com a gen del β -globina i els lògics quantitatius (QTL) presents als cromosomes 6, 8 i al cromosoma X; És probable que existeixin altres loci reguladors i també hi poden tenir funcions reguladores factors epigenètics i cel·lulars. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 És possible que aquests i altres elements reguladors modulin també la resposta de HbF a HU.

D’acord amb això, es va plantejar la hipòtesi que els polimorfismes de nucleòtids únics (SNPs) en gens candidats o QTL amb papers putatius en la regulació de la producció de HbF podrien modular la resposta de HbF al tractament amb HU. Per tant, hem estudiat l’associació de SNPs en aquests loci amb resposta a la HU en pacients que van participar en l’estudi multicèntric d’Hidroxyurea (MSH), un assaig dissenyat per avaluar l’eficàcia d’aquest fàrmac en l’anèmia de la falç.

Resultats

La distribució de HbF per a 137 pacients inscrits en aquest estudi es mostra com a Figura 1. El canvi d’HbF després del tractament amb HU no va seguir una distribució normal i s’assemblava a una distribució bimodal amb una gran part de persones amb un canvi menor o sense (mitjana = 0 ) i una petita part de persones amb un canvi extrem (mitjana >> 0). Aquesta distribució va suggerir que la classificació d’aquestes dades, com dividir els subjectes en quartils pel canvi HbF, i comparar els pacients del grup quartil més baix amb els pacients amb el quàntil més alt de canvi, podria ser un enfocament alternatiu per a l’anàlisi d’aquestes dades. Tot i això, tenint en compte la mida de mostra relativament petita del nostre estudi, aquest enfocament proporciona un poder molt limitat per detectar associacions genètiques.

Image

Les distribucions de HbF canvien ( a ) en percentatge (%) i ( b ) en grams (g / dl).

Imatge a mida completa

Es van examinar tres-cents vint SNP marcats en 29 gens candidats (taula 1) en 137 pacients amb anèmia falciforme tractats amb HU. Vam considerar que un SNP tenia una associació significativa amb resposta al tractament HU quan el valor P era 0.01, tret que hi hagués més d’un SNP en un gen que mostrés una associació quan el valor P per significació es va establir en 0, 05. Les taules 2 i 3 presenten els resultats estadísticament significatius de l’anàlisi quantitativa de trets per a l’associació SNP única amb el canvi de nivell de HbF després d’un tractament de 2 anys, expressat en percentatge d’hemoglobina total i com a nivell absolut de HbF, expressat en g / dl, respectivament. També es va realitzar una anàlisi que expressa l'increment en HbF després del tractament amb HU com a cèl·lules F.

Taula completa

Taula completa

Taula completa

Disset SNPs es van associar significativament amb el canvi en el percentatge de HbF (taula 2). Inclouen dos a MAP3K5 , cinc a TOX , dos a NOS1 , tres a FLT1 , dos a ARG2 i dos a NOS2A. L’associació més significativa es va observar amb SNP rs2182008 ( P = 0.003) a FLT1 (tirosina quinasa relacionada amb Fms), un factor de creixement endotelial vascular, que està implicat en la proliferació i diferenciació cel·lular. Vint SNP es van associar significativament amb el canvi d’HbF absolut (taula 3); es va observar un patró d’associació similar i l’associació més significativa va ser en SNP rs10483801 ( P = 0.0013) en ARG2 (arginasa tipus II, implicada en el metabolisme dels medicaments de HU). L'ús de cèl·lules F com a mesura de resultat va donar resultats similars (dades no mostrades).

Per a gens candidats amb associació significativa en diversos SNPs, es van explorar associacions haplotiposes utilitzant Haplo.stats (versió 1.2.1) tal com es dóna a la biblioteca R (disponible a //cran.us.r-project.org). Tanmateix, com aquests SNP estudiats aquí estan etiquetant SNPs i la majoria d’ells no estan en desequilibri d’enllaç (LD) els uns amb els altres, no hem trobat una associació millorada per l’anàlisi de l’haplotip en cap gen (dades no mostrades).

Els resultats de l’anàlisi conjunta de tots els SNP i covariates (edat, sexe i haplotips del cluster del gen α -i β- globin) mitjançant l’anàlisi de Forest Random es mostren a les figures 2 i 3. La importància relativa d’una variable independent (un SNP) es mesura en% IncMSE (vegeu Materials i mètodes per obtenir més detalls) i, com més gran sigui el valor de% IncMSE, més importància té aquesta variable per predir correctament la resposta de HbF a HU. Aquesta anàlisi va revelar que les variables més importants per predir el canvi de nivell de HbF van coincidir amb la majoria dels SNP identificats per l’anàlisi d’associació SNP. Curiosament, es va observar que els SNPs de ASS (argininosuccinate sintetasa) i ARG1 (arginasa, fetge) van tenir un gran efecte sobre el canvi de nivell de HbF, que no va ser detectat per una anàlisi d'associació única de SNP. Això suggereix que aquests dos gens podrien estar implicats en interacció amb altres gens per regular la resposta al tractament amb HU.

Image

Anàlisi conjunta de diversos SNP amb canvi en HbF en percentatge (%): només es mostren aquí els predictors que tenen un valor d’importància relativa (% IncMSE)> 3.0; * : SNPs en x-QTL.

Imatge a mida completa

Image

Anàlisi conjunta de múltiples SNP amb canvi d’HbF en grams (g / dl): només es mostren els predictors que tenen un valor d’importància relativa (% IncMSE)> 3.0; * : SNPs en x-QTL.

Imatge a mida completa

El SNP rs2182008 en FLT1 va mostrar un fort efecte en la resposta al tractament HU. Aquest SNP es va associar significativament amb el canvi d’HbF sota un model dominant (valor P = 0, 003 per a HbF en percentatge i 0, 002 per a HbF en g / dl) i també va ser un pronòstic altament qualificat per a la resposta a HU de l’anàlisi del Random Forest. (segon per HbF en percentatge i tercer per HbF en g / dl). L’al·lel A d’aquest SNP es va associar amb un augment del nivell de HbF després del tractament amb HU; no hi ha diferències entre els genotips AA i AG i l'augment de HbF en els subjectes amb aquests genotips va ser, de mitjana, 5, 9 vegades superior al dels subjectes amb el genotip GG (figura 4).

Image

Canvi de HbF per SNP rs2182008 ( a ) en percentatge (%) i ( b ) en grams (g / dl). mediana; Δ: mig.

Imatge a mida completa

Discussió

La HU pot augmentar la concentració de HbF en la majoria dels individus amb anèmia falciforme, però alguns pacients que prenen el fàrmac exactament segons les indicacions de metges experimentats, o bé no responen o tenen una resposta de HbF que pot no ser clínicament significativa. Fins i tot entre els pacients amb un augment d’HbF, la magnitud d’aquest augment varia. 10, 11, 12, 13 La causa d’aquesta variabilitat no està ben entesa. 11, 12, 29, 30

La concentració de HbF en sang està determinada per les interaccions entre activitats de remodelació de cromosomes, factors de transcripció, gens que modulen l’eritropoiesi, elements genètics vinculats al clúster del gen β- globina, la cinètica de la diferenciació de cèl·lules eritroides i la supervivència diferencial dels glòbuls vermells (per a revisions, veure Bank 31 i Stamatoyannopoulos 32 ). Aquest complex entorn regulador ofereix una àmplia oportunitat de modulació genètica de la producció d’HbF. A causa de l'evidència que suggereix que l'heterogeneïtat en elements genètics modula la concentració inicial de HbF, vam raonar que una heterogeneïtat similar podria donar compte de la resposta variada en HbF entre pacients amb anèmia falciforme tractats amb HU.

Hem trobat associacions estadísticament significatives de la resposta de HbF a HU amb múltiples SNPs en diversos gens. TOX (proteïna de caixa de grup de gran mobilitat) es troba dins del pic d’enllaç 8q11 – q12 que Garner et al. , 16, 33 van interaccionar amb el gen SNP −158 CT 5 ' G γ -globina i això també podria afectar el canvi del gen γ - a β -globina. Un membre de la família de proteïnes de caixa de gran mobilitat (HMG), TOX conté un únic motiu de caixa HMG i uneix l'ADN de manera específica a una seqüència. Totes les proteïnes de la caixa de HMG són capaces d'induir una forta flexió en l'ADN. Múltiples SNPs en PDE7B (fosfodiesterasa 7B) dins de Qq 6q22-q23 també es van associar amb la resposta de HbF a HU. Els SNP d’aquest gen es van assenyalar prèviament associats amb el nivell de HbF inicial en pacients amb anèmia falciforme. 21

L’òxid nítric (NO) s’uneix i activa el sGC, fet que augmenta la producció de cGMP. cGMP interacciona amb factors de transcripció augmentant l’expressió dels gens γ -globina. 34 ASS (argininosuccinate sintetasa) és un enzim que catalitza el penúltim pas de la via biosintètica de l’arginina. L’arginina és el substrat de les sintaxis NO. Els SNP del gen ASS van ser predictors forts per a la resposta de HbF a HU. També es van trobar associacions significatives amb SNPs en ARG2 i ARG1 , gens que codifiquen els enzims que hidrolitzen l’arginina a l’ornitina. Els SNP al NOS1 (12q24.2-q24.31, NO neurasa sintasa) i NOS2A , una NO sintasa expressada al fetge, també es van associar amb la resposta de HbF a HU.

El FLT1 (factor de creixement endotelial vascular (VEGF) / receptor del factor de permeabilitat vascular) és un receptor de VEGF. El SNP rs2182008 d'aquest gen es va associar fortament amb la resposta de HbF a HU. Aquest gen té una activitat de proteïna cinasa tirosina que és important per al control de la proliferació i diferenciació cel·lular. 35

La majoria dels SNP associats amb la resposta de HbF al tractament HU estaven en porcions dels gens gens no traduïdes o en introns. Molt probablement, les associacions que hem trobat estan en LD amb els elements funcionalment importants. Tot i que la majoria d’associacions tenen mecanismes biològicament plausibles mitjançant els quals poden influir en l’expressió dels gens γ- globina o en la concentració d’HbF, els nostres estudis generen hipòtesis més que mecànics, i no hem pogut fer estudis funcionals per la naturalesa del nostre estudi. mostres. No obstant això, aquests SNP es van associar a la concentració de HbF, per exemple, l’augment d’HbF en els subjectes que portaven un al·lel de SNP rs2182008 va ser gairebé sis vegades superior al dels subjectes amb genotip de GG.

Per identificar factors genètics que regulen l’expressió de HbF en anèmia de cèl·lula falç a la línia inicial i en absència de tractament amb HU, es va estudiar una mostra de 327 subjectes i un grup independent de 987 subjectes. Vam replicar en part el nostre treball anterior 21 mitjançant aquesta mostra ampliada de pacients i una cobertura més densa de SNP, en trobar múltiples SNPs marcats en gens situats al QTL 6q22.3 – q23.2. També hem trobat una associació significativa de HbF amb SNPs a TOX i dins EGFL6 , GPM6B i FIGF a XT22.2 – p22.3 QTL (dades no publicades).

Segons la hipòtesi de la variant comuna de malaltia, s'espera que moltes de les variants genètiques causants de malalties complexes o fenotips només tinguin un efecte reduït en el resultat de la malaltia. La potència d'obtenir llindars típics de significació de valor P després d'aplicar diverses correccions de prova és limitada per a aquests marcadors, perquè la significació és una funció de la mida de la mostra, la freqüència de l'al·lel i la mida dels efectes. Tenint en compte la nostra mida de mostra relativament petita, que tanmateix constitueix el major nombre de pacients amb anèmia de cèl·lules falç que prenen HU en condicions controlades, vam validar les troballes mitjançant un mètode analític diferent, però no vam aplicar múltiples correccions de proves per informar els nostres resultats. A més, a mesura que vam seleccionar SNPs d’etiquetatge d’haplotips que etiqueten diferents blocs LD i gairebé totes les nostres associacions es troben amb més d’un SNP únic en un gen, és poc probable que el resultat amb un SNP només reflecteixi el mateix senyal d’associació amb altres SNP. Per tant, dels 320 SNPs testats, és menys probable que molts cops amb SNPs del mateix gen siguin un esdeveniment casual. Una posterior replicació amb menys gens candidats i una cobertura més densa de SNP pot ser una manera més pràctica de reduir falsos descobriments i confirmar els nostres resultats.

Materials i mètodes

Pacients

Es van analitzar mostres d’ADN i dades de laboratori d’afroamericans adults amb anèmia de cèl·lules falç que van participar al MSH. Es tracta d’un assaig aleatori, controlat amb placebo, de doble cec dissenyat per provar si la HU podia reduir el nombre d’esdeveniments vasoocclusius en adults amb anèmia de cèl·lules falcioses de moderada a severa. Es va administrar 37 HU diàriament, en una única dosi a partir de 15 mg / kg, i es va augmentar en 5 mg / kg cada 12 setmanes fins a una dosi màxima tolerada de 35 mg / kg, tret que es desenvolupi toxicitat. Quan es va produir la toxicitat, el tractament es va aturar fins que es van recuperar els recomptes de sang. A continuació, es va reprendre HU a una dosi 2, 5 mg / kg inferior a la dosi tòxica. La MSH va inscriure 299 pacients, dels quals 152 van ser assignats aleatòriament a HU. La durada mínima de l’avaluació de seguiment per a pacients amb HbF mesurada al final de l’estudi va ser de 21 mesos (màxim, 38 mesos; mitjana, 28). Es van disposar mostres d’ADN i es va mesurar HbF en 137 dels 152 pacients aleatoritzats per rebre HU. Tot i que el recompte de píndoles i les mesures dels nivells sèrics de HU es van utilitzar per avaluar el compliment del tractament, la ràpida eliminació de HU de la circulació va impedir saber amb certesa si un pacient prenia tota la medicació prescrita. Els estudis aquí informats van ser aprovats per l’IRB del Boston Medical Center.

Estudis de laboratori

L’HbF es va mesurar per desnaturalització alcalina almenys dues vegades pretractament i dues vegades després del tractament. 10 Els mètodes de laboratori utilitzats per definir el fenotip d’hemoglobina i els haplotips del gènere de tipus β i α- globina es van descriure anteriorment. 11, 38, 39

Selecció i genotipat SNP

La selecció de gens es va basar en pics d’enllaç reportats anteriorment (6q22 – q23, 8q11 – q12 i Xp22.2 – p22. 3) 16, 19, 40 gens implicats en el metabolisme de la HU i gens relacionats amb la proliferació dels progenitors eritroides. En el nostre estudi es van triar trenta-tres gens candidats, i es van seleccionar 320 SNP etiquetadors a partir de les dades del genotip del projecte HapMap (Fase I, mostra de Yoruba) 41 mitjançant Haploview (v3.2) 42 (Taula 1). El genotipat es va realitzar mitjançant un disseny de 384 múltiplex personalitzats mitjançant una plataforma Illumina. A efectes de control de qualitat, aproximadament el 3% de les mostres d'ADN es van re-genotipar i es va valorar l'equilibri de Hardy-Weinberg per a cada SNP. L’equilibri de Hardy – Weinberg es va determinar abans de l’anàlisi i es va realitzar amb finalitats de control de qualitat en lloc d’avaluar si els genotips complien les expectatives mendelianes perquè tots els membres de la nostra població d’estudi tenen malalties de cèl·lules falciformes. No es van considerar en l'anàlisi 43, 44, 45, 46, 47, 48 SNPs que tenien genotips més del 25% o menys del 5% de freqüència d'al·lel menor. D’aquesta manera es van produir 280 SNP provats d’associació.

Anàlisi estadística

L'associació SNP única es va investigar mitjançant anàlisi de regressió lineal múltiple (SAS v9.1) amb ajustament simultani per edat, sexe i haplotips del cluster del gen α i β- globina. Es van provar tres models genètics (codominants, dominants i recessius) que regulaven la modulació de resposta al tractament amb HU. En el sistema codominant, un al·lel fa que la forma homozigota sembli diferent del tipus salvatge i de la forma heterozigota (els tres es veuen diferents entre si). En transmissió dominant, un al·lel fa que les formes homozigotes i les heterozigotes semblin iguals entre elles, però diferents del tipus salvatge. En un model recessiu, un al·lel afecta el fenotip si està present només en estat homozigot. Un dels subjectes que sobrepassava la tercera desviació estàndard superior de tots els valors del canvi en els nivells de HbF es va ometre de l'anàlisi per evitar que els valors extrems biaquessin els resultats.

Es va utilitzar el mètode de regressió no lineal Random Forest per identificar predictors addicionals de resposta al tractament HU i per validar els resultats de l’associació SNP única. 49 Random Forest consisteix en una col·lecció d’arbres de regressió, cada arbre de regressió en si és una funció de regressió. Cadascun d’aquests arbres prediu un valor real mitjançant la consulta d’un nombre determinat de variables i instàncies dins del model de regressió. Així, cada arbre de regressió s’entrena en una mostra d’arrencada diferent tant d’instàncies d’entrenament com de característiques. El bosc aleatori aleshores fa les prediccions fetes pels arbres del bosc per produir el resultat final. El bosc aleatori és una tècnica de reducció de la variància i té propietats demostrables pel que fa a resistir-se a sobre. A més, Random Forest és molt eficient per entrenar i provar, i té mecanismes integrats per estimar l’error de prova i la confiança en cada predicció realitzada. Aquest procediment no és paramètric, no es basa en el model i identifica aquelles variables independents que millor segreguen els subgrups com a predictors importants i identifiquen les interaccions entre variables independents. La importància relativa de les variables independents (per exemple, els SNP en el nostre cas) es defineix a continuació. La mitjana de residus quadrats (MSE) es calcula en les dades fora de borsa de cada arbre, i després es calcula el mateix després de permetre una variable. Les diferències es promedia entre tots els arbres i es normalitzen per l'error estàndard i es repeteix aquest càlcul per a cada variable independent. Una gran diferència en la MSE (% IncMSE) indica que la variable independent és important per a una predicció correcta, mentre que una petita diferència indica que la variable independent és menys important per a una predicció correcta. La importància relativa proporciona una mesura mitjançant la qual es poden classificar els predictors els uns amb els altres. Les nostres anàlisis es van realitzar mitjançant el paquet Random Forest (v 4.5–16) tal com es proporciona a la biblioteca R (disponible a //cran.us.r-project.org), excepte que, com a nombre d’arbres a cultivar a la el bosc es va establir a 2500, hem utilitzat els paràmetres predeterminats d'aquest programa.

Dualitat d’interès

El patrocinador de l’estudi no va tenir cap participació en el disseny de l’estudi, la recollida de dades, l’anàlisi o la interpretació, la redacció del treball ni la decisió de presentar el treball per a la seva publicació.