La comunicació entre els bons fomenta l'apoptosi depenent del tipus de connexina | mort i malaltia cel·lular

La comunicació entre els bons fomenta l'apoptosi depenent del tipus de connexina | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Nombres breus
  • Proteïnes de membrana

Resum

Les juntes Gap (GJs) s'han descrit per modular la mort i la supervivència de les cèl·lules. Encara no se sap si aquest efecte requereix canals GJ funcionals o depèn d'efectes independents del canal de les connexines (Cx), els constituents de les GJs. Per tant, es va analitzar la resposta apoptòtica a streptonigrina (SN, via apoptòtica intrínseca) o a α- Fas (via apoptòtica extrínseca) a cèl·lules HeLa que expressen Cx43 en comparació amb cèl·lules buides amb transsectors vectorials (CTL). L'apoptosi avaluada per la tinció d'isotiocianat de fluidièceina i iodur de l'annexina V-fluoresceïna va ser significativament més alta en HeLa-Cx43 en comparació amb cèl·lules HeLa-CTL. D'altra banda, la divisió de la caspasa-7 o Parp es va produir abans en HeLa-Cx43 que en les cèl·lules HeLa-CTL. L'anàlisi comparativa de l'efecte de dues Cx (endotelials) més (Cx37 i Cx40) sobre l'apoptosi va revelar que l'apoptosi era la més alta a les cèl·lules HeLa-Cx43 i la més baixa a les cèl·lules HeLa-Cx37 i es va correlacionar amb la permeabilitat GJ (avaluada mitjançant la propagació d'una GJ- colorant permeable i senyals de Ca 2+ induïts localment). La inhibició farmacològica de la formació de GJ en cèl·lules HeLa-Cx43 va reduir significativament l’apoptosi. El paper de la comunicació GJ es va analitzar amb l'expressió de proteïnes truncades Cx43 amb i sense capacitat de formació de canals. L'activació de les caspases va ser més alta en les cèl·lules que expressaven la part de construcció de canals (HeLa-Cx43NT-GFP) que en les cèl·lules que expressen la part C-terminal del canal incompetent de Cx43 (només HeLa-Cx43CT-GFP). Un alliberament depenent de l’hemicàntil i, per tant, un efecte paracrí dels senyals proapoptòtics es podria excloure ja que l’addició d’un hemicanals dependent de Cx43 (però no GJs) bloquejant un pèptid (Pep), no va reduir l’apoptosi a les cèl·lules HeLa-Cx43. El tractament amb SN va produir un augment significatiu de la concentració intracel·lular de Ca 2+ lliure en cèl·lules HeLa-Cx43 i HeLa-Cx43NT-GFP en comparació amb les cèl·lules HeLa-CTL o HeLa-Cx43CT-GFP, cosa que suggereix que Ca 2+ o Ca 2 L’agent de neteja + podria tenir un paper de senyalització. El bloqueig dels receptors d’inositol trifosfat va reduir l’augment de Ca 2+ induït pel SN i també l’augment de l’apoptosi. Les nostres observacions suggereixen que Cx43 i Cx40, però no Cx37, promouen l’apoptosi mitjançant la transferència entre intersecció de senyals pro-apoptòtiques entre cèl·lules.

Principal

Un conjunt creixent d’evidències demostra que les connexines (Cx) són capaces de modular processos cel·lulars essencials com la proliferació, la diferenciació i la migració. Així mateix, s’ha demostrat que la supervivència i l’apoptosi són processos parcialment dependents de Cx. 1, 2, 3 Tanmateix, encara no està clar si Cx exerceix les seves funcions de manera que depèn de la seva capacitat de formar canals de cruïlla (GJ) o si les propietats independents del canal de Cx tenen un paper com ara el observat en la migració cel·lular. i la proliferació. 4, 5, 6, 7 Aquesta qüestió continua sent discutida amb controvèrsia. Hi ha uns quants estudis que suggereixen que Cx, i en particular Cx43, tenen efectes sobre la mort i la supervivència de les cèl·lules mitjançant mecanismes independents de la comunicació entre juntures. La majoria d’aquests efectes s’han relacionat amb el paper potencial dels hemicanals que poden permetre el pas de factors proapoptòtics o de supervivència des de l’espai intracel·lular fins a l’extracel·lular o viceversa . 8, 9, 10, 11, 12 De forma alternativa, es va trobar que els efectes reguladors de Cx jugaven un paper en els gens pro i antiapoptòtics. De fet, les 1 matrius d'ADN de ratolins Cx43-null i de tipus salvatge mostraven diferències clares en l'expressió gènica. Per exemple, en les cèl·lules del glioblastoma que expressen Cx43, s’ha descrit una expressió disminuïda de bcl-2 i es va observar una supressió de l’activitat de Src en cèl·lules del mesotelioma malignes que expressen Cx43. 14, 15 A més, s'ha demostrat que la localització intracel·lular de Cx43 a les membranes mitocondrials 16, 17, 18, 19 o nuclears de 20 nuclears té un paper en aquest context. Altres informes fan referència a un paper diferenciat de la comunicació entre les interseccions en la promoció de l'apoptosi. Per exemple, els experiments realitzats amb ions pesats 21 o el citocrom C 22, 23 com a inductors de l’apoptosi van demostrar la mort cel·lular en cèl·lules veïnes no tractades, cosa que apunta cap a un paper de les GJ en la modulació de l’apoptosi. No només s’han proposat transferir els signes de mort, sinó també factors de supervivència cel·lular a través de GJs. 24, 25, 26 No obstant això, en la majoria dels casos no s'ha estudiat si els canals GJ o els efectes independents del canal eren importants. Així, encara no se sap quina de les dues vies potencials relacionades amb Cx és quantitativament més important i si l’efecte modulador de Cx sobre l’apoptosi depèn del tipus de Cx expressat. També no se sap quins senyals o molècules petites, capaces de passar GJs, podrien estar implicades en la promoció de l'apoptosi.

Per aclarir aquestes preguntes, es va estudiar l’apoptosi en cèl·lules HeLa transfectades amb Cx sense expressió de fons de Cx en estat salvatge. Els nostres resultats mostren que la millora de l’apoptosi depenent de Cx requereix una comunicació entre joncacions i que aquest efecte varia amb el tipus de Cx expressat.

Resultats

L’expressió de Cx43 augmenta la taxa d’apoptosi

Per examinar l'efecte de l'expressió de Cx43 sobre l'apoptosi, es van utilitzar cèl·lules HeLa transfectades de manera estable amb Cx43 o cèl·lules HeLa (CTL) buides amb vectors CX43 com a controls. L'apoptosi va ser induïda per streptonigrina (SN; via intrínseca) o α- Fas (via estimulada pel receptor extrínsec). El tractament amb SN (1, 10 μ M) o α- Fas (10, 100 ng / ml) va durar 5 h i la velocitat d’apoptosi es va determinar mitjançant una tinció d’annexina V-fluoresceina isotiocianat (FITC) / iodur de propidi (PI). En ambdues condicions, l’apoptosi va ser significativament més elevada en les cèl·lules HeLa-Cx43 en comparació amb les cèl·lules HeLa-CTL (figura 1b). Així mateix, el tractament amb SN (10 μ M) va donar lloc a un augment més gran i anterior de productes de clivatge de Parp (cl. Parp) i caspasa-7 (cl. Cas7) quan Cx43 estava present (figura 1c). De la mateixa manera, l'estimulació amb α- Fas (100 ng / ml) va donar lloc a Parp i caspase-7 ja despres de 2 h a les cèl·lules HeLa-Cx43, mentre que a les cèl·lules HeLa-CTL, va començar només després de 4 h (Figura 1c).

Image

L’expressió Cx43 millora l’apoptosi de les cèl·lules HeLa. ( a ) Parcel·les representatives del contorn de cèl·lules HeLa-Cx43 tractades i α- Fas (100 ng / ml, 5 h) tractades. La quantitat de cèl·lules apoptòtiques es va determinar mitjançant una tinció de l'annexina V-FITC / PI i es mostra al quadrant inferior dret (gris). ( b ) La mort de cèl·lules apoptòtiques induïdes per SN o o α -Fas de cèl·lules HeLa augmenta significativament amb l'expressió de Cx43. L’apoptosi de cèl·lules HeLa-Cx43 i HeLa-CTL no tractades o tractades amb concentracions creixents de SN o α -Fas durant 5 h es va detectar mitjançant l’etiquetatge de l’annexina V-FITC / PI. Mitjana ± SEM, * P <0, 05 versus no tractat (NG); # P <0, 05 versus cèl·lules CTL (NG); n ≥8 en almenys tres cultius cel·lulars diferents. ( c ) Les taques occidentals representatives mostren que la divisió apoptòtica de Parp (cl. parp) i la divisió de la caspasa-7 (cl. cas) (induïda per 10 μ M SN i 100 ng / ml α- Fas) depèn del temps i anteriors detectable en cèl·lules HeLa-Cx43 en comparació amb cèl·lules HeLa-CTL

Imatge a mida completa

L’efecte Cx sobre l’apoptosi varia amb el tipus Cx i es correlaciona amb el colorant de junció o la transferència de calci

Per dilucidar l'efecte d'altres proteïnes Cx i les seves propietats del canal sobre el desenvolupament de l'apoptosi, es van comparar cèl·lules HeLa que expressaven Cx37 o Cx40 o Cx43. L’expressió de les diferents proteïnes Cx es va analitzar mitjançant western blot (Figura 2a). Immunocitoquímicament, les cèl·lules van mostrar el patró d’expressió típic amb una localització més gran als contactes cèl·lula-cèl·lula (figura 2b). Com a controls es van utilitzar cèl·lules HeLa-CTL amb deficiència de Cx. L'apoptosi es va induir amb SN (1 μ M, 3 h) i es va mesurar per l'annexina V-FITC / PI. L’augment de cèl·lules apoptòtiques després de l’estimulació amb SN va ser més baix a les cèl·lules HeLa-CTL i més alt a les cèl·lules que expressaven Cx43 (Figura 2c). L’augment indicat per SN en les cèl·lules apoptòtiques va ser significativament més gran en les cèl·lules que expressaven Cx43 en comparació amb les cèl·lules HeLa-Cx37.

Image

La taxa d'apoptosi depèn del tipus Cx expressat i es correlaciona amb la permeabilitat GJ. ( a ) Anàlisi del blot occidental per a l'expressió de Cx37, Cx40 i Cx43 en cèl·lules HeLa transfectades de forma estable en comparació amb HeLa (CTL) bufet amb vector transfectat. ( b ) Les coloracions d'immunofluorescència de proteïnes Cx en cèl·lules HeLa transfectades de manera estable demostren una localització típica a la membrana de les cèl·lules adjacents. Les cèl·lules HeLa-CTL es van utilitzar com a controls i no van mostrar cap expressió de Cx43 mitjançant la tinció de Cx43. ( c ) L'apoptosi (induïda per 1 μ M SN, 3 h) de cèl·lules HeLa transfectades de forma estable depèn del tipus Cx expressat i augmentat significativament per expressió de Cx40 o Cx43 en comparació amb HeLa-CTL. L’apoptosi es va determinar mitjançant l’etiquetatge de l’annexina V-FITC / PI i l’augment del plec de cèl·lules apoptòtiques s’expressa com a mitjana ± SEM; * P <0, 05 vers CTL; # P <0, 05 vers Cx37; n ≥5 en almenys tres cultius cel·lulars diferents. ( d ) L'acoblament de cèl·lules de junció entre les cèl·lules HeLa varia amb el tipus Cx expressat i es correlaciona amb la taxa d'apoptosi. L’acoblament cel·lular es va mesurar mitjançant difusió de colorants (Alexa Fluor 488). El nombre de cèl·lules tenyides de tint es mostra com a mitjana ± SEM ( n ≥18 injeccions de colorants en ≥3 cultius de cèl·lules diferents; * P <0, 05 vers CTL; # P <0, 05 vers Cx37; NG). GAPDH, gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa

Imatge a mida completa

Per esbrinar si les diferències en l’augment de cèl·lules apoptòtiques induïdes pel SN van estar associades a diferents permeabilitats del canal GJ, es va valorar l’acoblament cel·lular mitjançant la difusió intercel·lular d’un colorant fluorescent permeable a GJ després de la injecció d’una sola cèl·lula (figura 2d). Les cèl·lules HeLa-CTL no van mostrar cap ( n cel·les tacades, mitjana ± SEM: 0, 1 ± 0, 1) i només una petita transferència de colorant HeLa-Cx37 (2 ± 1). En canvi, l'acoblament cel·lular de cèl·lules HeLa que expressen Cx40 i Cx43 (Cx40: 9 ± 1; Cx43: 17 ± 2) va ser significativament elevat en comparació amb les cèl·lules HeLa-CTL. Així, es va observar el major nombre de cèl·lules veïnes tacades en cèl·lules HeLa-Cx43. A més, es va analitzar la difusió intercel·lular d’un senyal de Ca 2+ després d’estimulació mecànica d’una sola cèl·lula. De nou, el senyal es va estendre a les cèl·lules HeLa-Cx43 en comparació amb les cèl·lules HeLa-Cx37 i HeLa-CTL ( n cèl·lules amb Ca 2+ elevades; mitjana ± SEM - Cx43: 21 ± 3; Cx37: 12 ± 2; CTL: 0 ± 0; P <0, 05; dos cultius de cèl·lules diferents, n = 10–14).

A més, es va investigar si el tractament amb SN té una influència en l'acoblament entre juntures. La transferència de colorants mitjançant GJs es va mesurar a les cèl·lules HeLa-Cx43, la població cel·lular amb més quantitat d'apoptosi. Després del tractament amb SN durant 1 o 3 h, les cèl·lules encara van ser capaces de formar GJ funcionals, tot i que la taxa d'acoblament va disminuir amb el pas del temps ( n cèl·lules tacades; mitjana ± SEM - cèl·lules no tractades: 17 ± 2; 1 μ M SN per 1 h: 11 ± 2; 1 μ M SN durant 3 h: 6 ± 1; n ≥7 en tres cultius cel·lulars diferents).

Per a l'apoptosi es necessita una comunicació entre les juntes necessàries

El paper de les comunicacions GJ per a l’apoptosi augmentada es va investigar en primer lloc mitjançant l’ús de l’àcid meclofenàmic bloquejador GJ (M; 100 μ M) i heptanol (H, 0, 25 mM). La quantitat de cèl·lules apoptòtiques HeLa-Cx43 apoptòtiques induïdes per SN o o α -Fas (mitjana ± SEM - 1 μ M SN: 15, 5 ± 4, 7%; 100 ng / ml Fas: 24, 1 ± 3, 6%) es va reduir significativament sota tractament amb bloquejadors de GJ (1 μ M SN + MH: 7, 1 ± 0, 4%; 100 ng / ml Fas + MH: 11, 8 ± 1, 1%; Figura 3). Els bloquejadors GJ sols no van afectar la taxa basal d'apoptosi (cèl·lules no tractades: 6, 4 ± 0, 6%; cèl·lules tractades només amb els bloquejadors GJ - MH: 6, 0 ± 0, 7%).

Image

Impacte de la comunicació d'unió entre bretxes sobre l'apoptosi de cèl·lules HeLa. L’apoptosi induïda per SN (1 μ M, 5 h) o α- Fas (100 ng / ml, 5 h) a les cèl·lules HeLa-Cx43 es redueix significativament bloquejant els canals GJ amb àcid meclofenàmic (M, 100 μ M) i heptanol (H, 0, 25 mM). L'apoptosi es va mesurar mitjançant una tinció de l'annexina V-FITC / PI i es va quantificar mitjançant citometria de flux. El percentatge de cèl·lules apoptòtiques del nombre total de cèl·lules s’expressa com a mitjana ± SEM * P <0, 05; NG; n ≥3 en almenys tres cultius cel·lulars diferents

Imatge a mida completa

Per analitzar més si una funció de canal intacta entre cèl·lules era necessària per a l’apoptosi millorada en cèl·lules que expressaven Cx43, vam comparar l’apoptosi en cèl·lules HeLa que expressen la part de construcció del canal N-terminal de Cx43 (Cx43NT-GFP) amb les cèl·lules que expressen la citoplasmà C -Partal terminal (CT) de Cx43 (Cx43CT-GFP), que no pot formar GJs ni hemicanals sinó que exerceix funcions independents del canal de Cx43. 5 Com a controls, hem utilitzat cèl·lules HeLa que expressen Cx43 de longitud completa (Cx43-GFP). Per determinar la velocitat d'apoptosi induïda per SN en aquestes cèl·lules, es va mesurar la quantitat de caspases activades (caspasa-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9) (unió d'una inhibidor marcat amb fluorescència vermella a les caspases actives), ja que l'expressió de GFP va interferir amb l'anàlisi de l'annexina V-FITC / PI que s'utilitzava d'una altra manera. La intensitat de fluorescència (unitats de fluorescència vermella (RFUs)), que indica les caspases activades, va ser significativament més alta a les cèl·lules HeLa-Cx43-GFP formadores de canals (mitjana ± SEM: 21 422 ± 1494) i HeLa-Cx43NT-GFP (22 546 ± 2031) en comparació amb les cèl·lules incompetents HeLa-Cx43CT-GFP del canal (14 543 ± 758; Figura 4).

Image

La part de construcció de canals de Cx43 media una apoptosi millorada. L’apoptosi induïda per SN (1 μ M, 16 h) de cèl·lules HeLa que expressen proteïnes fluorescents verdes (GFP) marcades amb proteïnes Cx43 o truncades Cx43 es va determinar mitjançant l’activació de la caspasa. L'apoptosi induïda per SN de cèl·lules HeLa que expressa Cx43 de longitud completa (Cx43-GFP) o la part de construcció de canals de Cx43 (Cx43NT-GFP) es va millorar significativament en comparació amb les cèl·lules que expressaven la part citoplasmàtica de Cx43 (Cx43CT-GFP). Les RFU que indiquen l’activació de caspases en cèl·lules apoptòtiques es mostren com a mitjana ± SEM; * P <0, 05 versus Cx43CT-GFP, NG; n ≥3 en diferents cultius cel·lulars

Imatge a mida completa

Els hemicanals no estan involucrats en l’apoptosi augmentada de cèl·lules que expressen Cx43

El potencial alliberament de senyals proapoptòtics mitjançant hemicanals de Cx, que poden actuar de manera paracrina, es va investigar mitjançant el bloqueig específic de hemicanals de Cx43 utilitzant un Pep inhibidor (50 μ M), 27 que no afecta la comunicació entre junciós (gap cèl·lules HeLa-Cx43; Propagació de Ca 2+ per estimulació mecànica; no tractada: 25 ± 2 cèl·lules; pèptid control (ConPep): 28 ± 3 cèl·lules; Pep: 27 ± 2 cèl·lules; n = 9 en tres pous de cultiu cel·lular diferents). La quantitat d'apoptosi de cèl·lules HeLa-Cx43 amb SN (10 μ M) o α- Fas (100 ng / ml) no es va canviar sota tractament amb Pep bloquejant l'hemichannel (SN + Pep; Fas + Pep; Figura 5a). L’apoptosi de cèl·lules incubades amb el Pep inhibidor només era tan baixa com la de les cèl·lules no tractades o de les cèl·lules incubades amb el ConPep (figura 5a). Es va provar l'eficàcia del Pep que bloqueja el hemichannel mitjançant la mesura de l'absorció de PI mitjançant hemichannels a les cèl·lules HeLa-Cx43. Tant les cèl·lules no tractades com les tractades amb SN (10 μ M) van mostrar una captació basal de PI basal, que es va incrementar significativament en presència de l’obridor d’hemicanel ATP (figura 5b). Aquesta millora induïda per ATP es va abolir després del pretractament amb el inhibidor Pep (50 μ M). El ConPep no va reduir la presa de PI induïda per ATP a les cèl·lules HeLa-Cx43 (fluorescència mitjana de cèl·lules simples (gris mitjà) no tractada: 149 ± 1; SN: 155 ± 1; ATP: 194 ± 3; ATP + Pep: 155 ± 1; ATP + ConPep: 207 ± 2; en tres cultures diferents, n ≥80–160; P <0, 001 ATP / ATP + ConPep versus no tractat i SN).

Image

Efecte dels hemicanals sobre l’apoptosi. ( a ) La inhibició dels hemichanals de Cx43 amb un Pep bloquejador (50 μ M, Pep) no afecta la velocitat d'apoptosi induïda per SN (10 μ M, 5 h) o α- Fas (100 ng / ml, 5 h) a les cèl·lules HeLa-Cx43. Es va utilitzar com a control un ConPep no inhibidor (50 μ M). L'apoptosi es va mesurar mitjançant una tinció de l'annexina V-FITC / PI i es va quantificar mitjançant citometria de flux. El percentatge de cèl·lules apoptòtiques del nombre total de cèl·lules s’expressa com a mitjana ± SEM; n ≥6 en almenys tres cultius cel·lulars diferents. ( b ) La presa de PI (fluorescència mitjana vermella de cèl·lules úniques) per part de les cèl·lules HeLa-Cx43 del medi de cultiu es podria estimular obrint els hemicanals amb ATP (50 μ M) i es va bloquejar eficientment per preincubació amb un Pep bloquejant hemichannel. (50 μ M). El tractament amb SN (10 μ M) no va afectar la presa de PI. Es va utilitzar com a control un Pep (ConPep) no inhibidor. La presa de PI de cèl·lules úniques es mostra com a mitjana ± SEM; n ≥80–160 cèl·lules en almenys tres cultius de cèl·lules diferents * P <0, 001 versus no tractats, SN i ATP + ConPep, NG

Imatge a mida completa

Els canals GJ milloren la quantitat de cèl·lules que responen a SN amb un augment de Ca 2+ i

Es coneix que el Ca 2+ i l’inositol trifosfat (IP 3 ) representen molècules potencials de senyal proapoptòtic, prou petites com per passar per GJs. Per tant, vam analitzar els canvis de calci lliure intracel·lular (Ca 2+ i ) en cèl·lules sense GJs (CTL i Cx43CT-GFP) i en cèl·lules amb GJ funcionals (Cx43, Cx43NT-GFP) després del tractament amb SN. El SN (10 μ M) va augmentar el Ca 2+ i en el 84 ± 5% de les cèl·lules que expressaven Cx43 de longitud completa i el 59 ± 8% de les cèl·lules que expressen la part de construcció del canal N-terminal de Cx43 (Cx43NT-GFP; Figura 6a). En canvi, només el 27 ± 7% de les cèl·lules HeLa que no expressaven Cx (CTL) o el 28 ± 7% de les cèl·lules HeLa que expressen el TC citoplasmàtic incompetent del canal de Cx43 (Cx43CT-GFP) van reaccionar a SN amb un augment de Ca 2+ i .

Image

La resposta immediata de Ca 2+ i s’incrementa en cèl·lules que expressen canals funcionals Cx43. ( a ) El nombre de cèl·lules que responien en 3 minuts amb un augment de Ca 2+ i a causa del tractament SN (10 μ M) es va millorar significativament en les cèl·lules HeLa que expressen Cx43 i Cx43NT en comparació amb les cèl·lules HeLa-CTL o HeLa-Cx43CT. El percentatge de cèl·lules amb un augment de Ca 2+ i respecte al nombre total de cel·les s’expressa com a mitjana ± SEM; * P <0, 05 vers CTL / Cx43CT, n ≥8 en almenys tres cultius de cèl·lules diferents. En una altra sèrie d’experiments ( b ), l’augment de Ca 2+ induït per SN (10 μ M) es va bloquejar per preincubació (15 min) amb xestospongina C (xesto, 40 μ M). El percentatge de cèl·lules amb un augment de Ca 2+ i respecte al nombre total de cel·les s’expressa com a mitjana ± SEM; * P <0, 05, NG; n = 8 en tres cultius cel·lulars diferents. ( c ) La inhibició de l'alliberament de Ca 2+ mediada per IP 3 (per xesto, 40 μ M) redueix significativament l'apoptosi induïda per SN (10 μ M, 5 h) de les cèl·lules HeLa-Cx43, però no afecta les cèl·lules de control deficients de Cx. L’apoptosi es va determinar mitjançant l’etiquetatge de l’annexina V-FITC / PI i l’augment del plec de cèl·lules apoptòtiques s’expressa com a mitjana ± SEM; * P <0, 05 versus corresponents no tractats; # P <0, 05 enfront de Cx43 SN; n = 6 en tres cultius cel·lulars diferents

Imatge a mida completa

La inhibició de l'alliberament de Ca 2+ mediada pel receptor IP 3 disminueix l'apoptosi en cèl·lules HeLa-Cx43 acoblades a GJ

En un altre conjunt d’experiments (Figura 6b), la preincubació (15 min) amb el bloqueador del receptor IP 3 xestospongina C (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Alemanya; 40 μ M) va restringir l’augment de Ca 2+ induït pel SN fins al 36 ± 12% de les cèl·lules (Cx43 + SN: 99 ± 1, P <0, 001, n = 8, en 3-4 cultius diferents). Aquest nombre es correspon bé amb la quantitat de cèl·lules deficients de GJ que responen a un augment de Ca 2+ i per estimular amb SN (figura 6b). La inhibició dels receptors IP 3 per xestospongina C va reduir la taxa d'apoptosi induïda per SN només en HeLa-Cx43 però no en cèl·lules HeLa-CTL (Figura 6c).

Discussió

En aquest estudi, hem demostrat que l'efecte millorat de l'expressió de Cx sobre l'apoptosi en cèl·lules HeLa depèn de la seva capacitat formadora de canals i de la seva influència en la permeabilitat del canal. En canvi, no es van poder observar efectes independents del canal, com el que ha tingut un paper en la migració en el mateix tipus de cèl·lules 5 o en la proliferació cel·lular com es mostra a les cèl·lules de Neuro2a, 28 . Així, el nostre estudi confirma i amplia informes anteriors sobre un paper decisiu de la comunicació entre juntures i bretxes sobre l’augment d’apoptosi en línies de cèl·lules tumorals com ara BC31 (una línia de cèl·lules de carcinoma de bufeta de rata) 29 o cèl·lules de glioma C6, 30 i en cèl·lules neuronals, per exemple, cèl·lules dels astròcits 31 i Neuro2a. 32

La nostra conclusió de que la comunicació entre joncs és un requisit previ per a l’apoptosi augmentada es basa en diverses línies d’evidència. En primer lloc, la inhibició farmacològica de les GJ va disminuir l'extensió de l'apoptosi induïda per SN o α -Fas. D’acord amb una acció inhibidora de l’àcid meclofenàmic i l’heptanol sobre l’acoblament de GJ, 33 hem demostrat que els GJ continuen oberts durant el desenvolupament de l’apoptosi i això concorre amb resultats d’altres grups. 30, 34 Tot i que els inhibidors utilitzats, l’àcid meclofenàmic i l’heptanol, poden tenir efectes no específics, no van interferir directament en els processos de senyalització apoptòtics ja que no van afectar la taxa d’apoptosi en cèl·lules no tractades. En segon lloc, el paper decisiu de la comunicació entre junció sense desfasament, però no dels efectes independents del canal de Cx43, es podria confirmar amb els nostres resultats obtinguts a les cèl·lules HeLa que expressen variants troncoconades de Cx43. Hem demostrat abans que les cèl·lules que expressen la part N-terminal (NT) de Cx43 són capaces de formar GJ funcionals, mentre que les cèl·lules que expressen el terminal C de Cx43 no. 5 D’acord, l’apoptosi induïda per SN només es va augmentar en les cèl·lules que expressaven la part de construcció del canal N-terminal, però no en les cèl·lules que expressen la part citoplasmàtica del terminal C de Cx43. Arribem a la conclusió que l’expressió dels canals funcionals de Cx43 GJ és necessària per millorar l’apoptosi.

Es pot deduir una altra evidència que la comunicació entre junciós de bretxa millora l’apoptosi de l’observació que la taxa d’apoptosi depenia clarament de la permeabilitat de les unions d’escletxa determinada per les Cx s estudiades aquí: Cx43≥Cx40≥Cx37> Cx-deficient controls. Aquestes diferències que depèn de Cx en les permeabilitats GJ estan d’acord amb les observacions anteriors pròpies 35 i un altre estudi publicat recentment, que mostra la transferència de colorant més alta per als canals compostos per Cx43, seguida dels canals Cx40 i la transferència més baixa per als canals Cx37. Cal destacar que els nostres resultats es basen en l’ús del colo permeant GJ Alexa Fluor 488. Tot i que l’intercanvi cel·lular de colorants permeants GJ entre cèl·lules pot diferir respecte a la seva mida i càrrega superficial i pot no representar la permeabilitat de cap la molècula potencial proapoptòtica, 36, 37, fonamenta una estreta connexió entre la permeabilitat de la unió entre bretxes i l'augment d'apoptosi en els experiments aquí informats. No obstant això, la constatació que la propagació de senyals de Ca 2+ a través de GJs va mostrar un comportament similar al d’Alexa Fluor 488 suggereix que les diferents permeabilitats no són úniques per a aquest colorant.

El nostre estudi mostra un paper de la comunicació entre les interseccions entre apoptosi tant per la via exògena com per la endògena induïda per dos estímuls diferents. Tot i que el nostre estudi no permet arribar a la conclusió que hi ha un paper general de la comunicació d'unió entre bretxes en el control de l'apoptosi, no es limita a un únic estímul. A més, l'observació de que les cèl·lules d'un cúmul són més susceptibles a la inducció d'apoptosi que les cèl·lules simples. 29, 31 Tanmateix, els nostres experiments també mostren clarament que la comunicació entre les interseccions no és un requisit indispensable per al desenvolupament de l'apoptosi, sinó que millora el seu desenvolupament.

Diversos estudis han implicat un paper dels hemicanals en la supervivència cel·lular i la mort. 8, 10, 38, 39 Tot i que Cx s pot formar hemicanals que podrien permetre l’alliberament de senyals pro-apoptòtics independents de les juntes d’escletxa, no hem trobat cap evidència per a un mecanisme d’aquest tipus en la nostra configuració experimental. Un Pep que bloqueja hemichannel, 27 que no afectava l'acoblament entre juntures no podria disminuir l'apoptosi induïda per SN o α -Fas en cèl·lules HeLa que expressen Cx43. El fet que la captació cel·lular de la PI en presència d'ATP, tal com es va informar en altres llocs 40, es podria bloquejar per preincubació amb el bloqueig de l'hemichannel, va confirmar la seva acció inhibidora prevista en el nostre entorn experimental.

Evidentment, el requisit de GJ funcionals per a l’augment de l’apoptosi suggereix que es poden intercanviar alguns senyals proapoptòtics entre cèl·lules apoptòtiques i els seus veïns. Aquests senyals no poden incloure caspases ni proteïnes reguladores proapoptòtiques com bad o bax, ja que aquestes molècules són massa grans per passar GJs, que permeten el pas només a molècules de fins a 1, 8 kDa. Els candidats a molècules petites que s'han suggerit que poden ser mediadors de morts potencials en ser transferits mitjançant GJs són Ca 2+, IP 3 i cAMP. 1, 42 Es coneixen diversos estímuls que indueixen l’apoptosi que afecten Ca 2+ i . Els senyals de Ca 2+ al seu torn poden conduir a l’activació de les caspases, als botxins d’apoptosi principal i a l’obertura de porus de transició de permeabilitat mitocondrial (PTPs). La formació i obertura de PTP tenen com a resultat l’alliberament del citocrom C , que al seu torn té un paper en l’activació de la cascada de la caspasa i d’altres proteïnes proapoptòtiques. 1, 43 L’impacte de la molècula IP 3 permeable a GJ sobre l’apoptosi està relacionat amb l’alliberament de Ca 2+ registrat per IP 3, de manera que contribueix a la inducció d’esdeveniments cel·lulars apoptòtics. 1, 42 La importància del Ca 2+ com a senyal proapoptòtic ha estat demostrada pel tractament de cèl·lules amb ionomicina d’ionòfor càlcic o amb tpsigargina. Aquesta elevació sostinguda induïda de Ca 2+ era suficient per desencadenar apoptosi sense cap altre estímul que induís l'apoptosi. 44, 45

Es va analitzar si es podrien implicar canvis de Ca 2+ i en la taxa de apoptosi més gran observada a les cèl·lules acoblades per unions gap. De fet, el tractament amb SN va donar lloc a un ràpid augment de Ca 2+ i . S'ha descrit anteriorment un augment de Ca 2+ i després del tractament amb SN en cèl·lules limfoblastoides. Tanmateix, a les cèl·lules sense acoblament joncional, només una part menor va respondre amb un augment de Ca 2+ i, mentre que pràcticament totes les cèl·lules van respondre quan es van acoblar. Curiosament, el pretractament amb l'inhibidor del receptor IP 3 de la xestospongina C 47 va limitar la resposta de calci a una fracció de cèl·lules, la qual cosa era numèricament idèntica a la fracció de cèl·lules que responien en absència de jonccions gap. Hem demostrat abans que la xestospongina C abolia de forma fiable les respostes de Ca 2+ mediates per IP 3 . 33 Per tant, els nostres resultats són consistents en el punt de vista que SN va induir un augment independent de Ca 2+ i IP a les cèl·lules sensibles a la SN 3. Aquest senyal de Ca 2+ podria haver-se estès a les cèl·lules veïnes mitjançant GJs, la qual cosa també és coherent amb les nostres troballes que part de les cèl·lules van respondre amb un augment de Ca 2+ i retardat (fins a 30 s) al tractament amb SN (dades no mostrades). Com s’ha mostrat anteriorment, un augment de Ca 2+ i pot induir una alliberació secundària de calci mitjançant receptors IP 3, 48 que en la nostra configuració pot haver-se estès a través de GJs a cèl·lules veïnes que no responen al SN per induir augment de Ca 2+ i com bé. Així, tant l’absència de comunicació entre junció i la inhibició dels receptors IP 3 poden restringir l’apoptosi per la mateixa quantitat que s’observa aquí. Recentment hem descrit que un mecanisme similar té un paper pivot en la resposta de Ca 2+ de les cèl·lules endotelials a l'estimulació amb histamina o ATP. També es van reportar 49 augments de Ca 2+ i per a l’apoptosi iniciada per Fas amb un augment sostingut de Ca 2+ i que va començar entre 1 i 2 h després del tractament. 50, 51

D’acord amb el nostre estudi, s’ha informat que el bloqueig de la comunicació intercel·lular mitjançant GJs va atenuar l’extensió de l’apoptosi, per exemple, en cèl·lules BC31, 29 cèl·lules de granulosa 52 o astròcits. 53 S’ha descrit una cridada mort de bystander induïda per la difusió entre juntures i bretxes de senyals mortals de cèl·lules procedents de cèl·lules en apoptosi a cèl·lules circumdants sanes per a diverses condicions que indueixen l’apoptosi. 21, 22 Tot i que el paper fisiològic d’una difusió de senyals d’apoptosi a cèl·lules veïnes potencialment sanes segueix sent un tema de debat, el pas de “senyals de mort”, per exemple, des de cèl·lules irradiades letalament fins als seus veïns passant per GJ 54, 55, sembla ser. molt prometedor per a teràpies contra el càncer. També es descriuen 56 efectes de bystander mediats per GJ per a algunes malalties, per exemple, la retinitis pigmentosa 57 o la infecció per VIH-1, 58 i poden representar un principi terapèutic potencialment important en aquests estats de malaltia.

En conclusió, el nostre estudi ha demostrat que l'expressió Cx millora la inducció de l'apoptosi. Aquest no és un efecte de classe, però varia considerablement en funció del tipus de Cx tal com s’ha estudiat aquí per a que Cx s’expressa en teixit vascular. Els nostres resultats suggereixen que aquest efecte es deu a la transferència de senyals proapoptòtics, entre els quals la IP 3 pot tenir un paper important. Així doncs, la comunicació entre juntures i escombraries i el control de la permeabilitat entre juntes per variació de l’expressió Cx poden ser un objectiu potencial per al control terapèutic de l’apoptosi.

Materials i mètodes

Cultius cel·lulars

El Dr. Klaus Willecke (Universitat de Bonn, Bonn, Alemanya) va proporcionar les cèl·lules HeLa que es van transfectar de manera estable amb Cx37 murina, Cx40 murina o rata Cx43. Cèl·lules HeLa transfectades amb el vector buit pBEHpac18 (CTL; ​​proporcionat amablement pel doctor Willecke, Bonn, Alemanya) amb SuperFect (Qiagen, Hilden, Alemanya), que servia com a controls. Es va descriure anteriorment la generació de cèl·lules HeLa transfectades de manera estable que expressen el NT (aminoàcids (aa) 1-257, Cx43NT-GFP) o el TC de Cx43 (aa 257-382, Cx43CT-GFP). 5 cèl·lules es conreaven en el medi modificat de l'Eagle (DMEM; Invitrogen, Life Technologies, Darmstadt, Alemanya) de Dulbecco amb un sèrum de vedell nou nascut al 10% (Biochrom, Berlín, Alemanya), penicil·lina (100 U / ml; Sigma Aldrich) i estreptomicina (100 μ g / ml; Sigma Aldrich) a 37 ° C i 5% CO 2 . El medi de creixement de HeLa-CTL, HeLa-Cx37, HeLa-Cx40 i HeLa-Cx43 transfectats de manera estable es va suplementar amb puromicina (1 μ g / ml; Sigma Aldrich) i de HeLa-Cx43NT-GFP i HeLa-Cx43CT-GFP amb zeocina ( 200 μ g / ml; Invitrogen, Tecnologies de la vida). L'apoptosi es va induir amb l'anticòs SN (Sigma Aldrich) o α- Fas (Millipore Merck, Schwalbach, Alemanya), tal com es va indicar.

Tinció d’Annexina V-FITC / PI

El kit de detecció de l’apoptosi de l’annexina V-FITC (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanya) es va utilitzar segons les recomanacions del fabricant. Les cèl·lules es van tractar segons les indicacions, es van separar amb Accutase (PAA Laboratories, Coelbe, Alemanya) i es van recollir per centrifugació (1500 rpm, 5 min). Es van rentar els pellets cel·lulars amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS), es van suspendre en 1 x tampó d’unió (0, 01 M HEPES / NaOH, pH 7, 4, NaCl 140 mM i 2, 5 mM CaCl 2 ) i es van tacar amb annexina V-FITC i PI durant 15 min a temperatura ambient a les fosques. Es van analitzar un total de 10 000 cèl·lules de cada mostra mitjançant la classificació de cèl·lules activades per fluorescència (FACSort; BD Bioscience). Les cèl·lules apoptòtiques es van definir com a cèl·lules positives de l'annexina V-FITC i PI-negatives.

Anàlisi de taquilla occidental

Les cèl·lules buides HeLa amb transsecció vectorial (CTL) o HeLa que expressaven de manera estable Cx37, Cx40 o Cx43 es van sembrar en plaques de 6 pous i es van lisar en el tampó Laemmli 59 l'endemà. Les mostres es van bullir durant 5 min i es van separar a mida mitjançant SDS-PAGE amb gels Tris-glicina del 8-16% (Thermo Scientific, Bonn, Alemanya). Les proteïnes es van transferir electroforèticament a una membrana Hybond-P (Amersham, GE Healthcare, Friburg, Alemanya) a 0, 8 mA / cm 2 durant 1 h i la unió d'anticossos no específica es va bloquejar amb 5% de llet descremada en pols (AppliChem, Darmstadt, Alemanya) a Solució PBS que conté 0, 1% de Tween-20 (Sigma Aldrich) durant 1 h a temperatura ambient. Les membranes van ser incubades amb conill α- Cx37 (1: 1000; Alpha Diagnostic, Biotrend, Koeln, Alemanya), conill α- Cx40 (1: 1000; Alpha Diagnostic) o conill α- Cx43 (1: 1000; Sigma Aldrich) durant la nit. a 4 ° C. Després de rentar-se amb PBS-0, 1% Tween, les taques van ser incubades durant 2 h amb l'anticòs secundari acoblat a la peroxidasa de rave de cavall (1: 1000; Calbiochem, Merck, Darmstadt, Alemanya). Els anticossos primaris es van diluir en 5% d’albúmina sèrica bovina (BSA; AppliChem) en PBS – 0, 1% Tween i anticossos secundaris en 5% llet descremada en pols en PBS – 0, 1% Tween. Els blots es van rentar quatre vegades durant 10 min cadascun i es van detectar anticossos units mitjançant un kit de detecció de quimiiluminiscència per a peroxidasa de rave de cavall (AppliChem).

Per analitzar la divisió apoptòtica de la caspasa-7 i Parp a les cèl·lules HeLa-Cx43 i HeLa-CTL, les cèl·lules es van sembrar en plaques de 6 pou fins a una confluència del 80%. L’endemà, es van tractar les cèl·lules amb 10 μ M de SN (Sigma Aldrich) o 100 ng / ml α- Fas (Millipore) durant els punts de temps indicats i es van lisar en el tampó de Laemmli. 59 Per a la detecció de Parp clivada, un anticòs α -Parp (1: 500; Cell Signaling, NEB, Frankfurt am Main, Alemanya), i per a la caspaza escindida, un anticòs α -caspase-7 (1: 500; Senyalització cel·lular ), fou utilitzat. La detecció de GAPDH ( α -GAPDH, 1: 10000; Chemicon, Merck Chemicals, Schwalbach, Alemanya) es va utilitzar per demostrar la càrrega igualitària.

Tinció d’immunofluorescència

Les cèl·lules HeLa que expressaven Cx37, Cx40 o Cx43 o Cèl·lules HeLa-CTL es van sembrar sobre cobertes de vidre. L’endemà, es van solucionar les cèl·lules amb un 3, 7% de formaldehid en PBS durant 20 min a temperatura ambient. Després d’esbandir amb PBS, es van permeabilitzar les cèl·lules amb 0, 1% de Tritó X-100 (AppliChem) en PBS durant 4 min. La unió a anticossos no específica es va bloquejar amb PBS que contenia 0, 5% BSA durant 1 h. Les cèl·lules van ser incubades amb conill α- Cx37 (Alpha Diagnostic; 1: 100), conill α -Cx40 (Alpha Diagnostic; 1: 100) o conill α -Cx43 (Sigma Aldrich; 1: 100) durant la nit a 4 ° C. Es van rentar i incubar les cèl·lules amb un anticòs secundari (1: 200) acoblat al fluorocrom Alexa Fluor 488 (Invitrogen) durant 1 h a temperatura ambient. Es van muntar coberts i es va analitzar l'expressió i la localització de les proteïnes Cx mitjançant microscòpia confocal (Leica, Wetzlar, Alemanya).

Detecció d’apoptosi a cèl·lules amb un acoblament de junció diferencial inhibit

Per investigar l'impacte de les GJs en la taxa d'apoptosi, les cèl·lules HeLa-Cx43 van ser incubades amb àcid meclofenàmic (M; 100 μ M; Sigma Aldrich) i heptanol (H; 0, 25 mM; Sigma Aldrich), que gairebé va abolir l'acoblament entre junció i minimitzar els efectes secundaris dels fàrmacs. 33 Per induir apoptosi, les cèl·lules es van tractar addicionalment amb 1 μ M SN o 100 ng / ml α- Fas durant 5 h i es va quantificar la quantitat de cèl·lules apoptòtiques per citometria de flux amb tinció de l'annexina V-FITC tal com es descriu anteriorment.

Tinció de FLICA

L’apoptosi es va mesurar amb el kit de detecció de l’apoptosi de la sulforodamina FLICA (Immunochemistry Technologies, Biomol, Hamburg, Alemanya). L’inhibidor fluorescent vermell de les caspases SR-VAD-FMK detecta caspases activades (caspasa-1, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9) de cèl·lules apoptòtiques. No es van tractar ni tractar amb SN (1 μ M, 16 h) Cèl·lules HeLa que expressaven Cx43-GFP, Cx43NT-GFP o Cx43CT-GFP es van separar amb trypsina-EDTA (Sigma Aldrich) i 300 μ l de suspensió cel·lular (5 × 10 6 cel·les per ml) es van tenyir amb reactiu FLICA segons les instruccions del fabricant. Després de la tinció, es van rentar les cèl·lules tres vegades amb 1 x tampó de rentat i es van determinar de nou les concentracions cel·lulars de cèl·lules no tractades i tractades amb SN. Després de l'equilibri de les concentracions cel·lulars, les cèl·lules es van tornar a suspendre en PBS i es va mesurar la intensitat de fluorescència vermella de la sulforodamina (RFU) en un lector de plaques de fluorescència a longituds d'ona d'excitació / emissió de 550/595 nm.

Anàlisi de la transferència independent de GJ de senyals proapoptòtics mitjançant hemicanals

Es va analitzar l’efecte dels hemicanals en la taxa d’apoptosi amb un Pep que bloqueja el hemichannel. Les cèl·lules HeLa-Cx43 es van incubar amb un Pep específic de Cx43 (H-Val-Asp-Cys-Phe-Leu-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu-Lys-Thr-OH; 50 μ M; Biosyntan, Berlín, Alemanya ), que suposa que inhibeix els hemicanals a una concentració de 50 μ M afectant el bucle extracel·lular de Cx43. 27 Per a experiments de control, es van incubar cèl·lules amb 50 μ M de ConPep (H-Gly-Asp-Glu-Gln-Ser-Ala-Phe-Arg-Cys-Asn-Thr-Gln-OH). L'apoptosi es va induir per l'addició de SN (10 μ M) o α- Fas (100 ng / ml) durant 5 h i la quantitat de cèl·lules apoptòtiques es va mesurar mitjançant una tinció de l'annexina V-FITC / PI.

Captació de PI mitjançant hemicanals

Per analitzar l’activitat dels hemicanals, es van incubar cèl·lules HeLa-Cx43 amb imatges PI (20 μ g / ml, 10 min) i fluorescència (excitació: 546 nm; emissió: 570 nm; temps d’exposició 1000 ms; configuració experimental: vegeu mesures de calci) es van prendre immediatament després del rentat de la PI. La fluorescència mitjana (valor gris mitjà) de cèl·lules úniques es va calcular mitjançant el programa Till Vision (Till Photonics, Gräfelfing, Alemanya). Per comprovar que la captura de l'IP no es deu a la mort cel·lular, les cèl·lules es van tacar amb blau Trypan i les cèl·lules tacades de color blau van ser excloses dels càlculs. Els hemicanals van ser activats per ATP (50 μ M).

Mesura del Ca 2+ i

Es van detectar canvis intracel·lulars de Ca 2+ lliures amb el colorant sensible de Ca 2+ Fura2 (Invitrogen). Després de la incubació amb 4 μ M Fura2 resolta en DMEM (30 min a 37 ° C i 5% de CO 2 ), les cèl·lules HeLa (cultivades a coberts) es van rentar dues vegades, transferides a la cambra experimental (que tenia una obertura àmplia a la part superior) ) i incubat en HEPES (pH 7, 4; NaCl 125 mM, KCl 3 mM, 1, 25 mM NaH 2 PO 4, 2, 5 mM CaCl 2, 1, 5 mM MgCl, 10 mM glucosa). La cambra plena de 200 μ l HEPES es va muntar en un microscopi invertit (Axiovert S100; Zeiss, Göttingen, Alemanya).

El colorant sensible de Ca 2+ es va excitar alternativament a 340 i 380 nm i el senyal es va detectar a 505 nm amb un sistema informatitzat (Till Photonics). Les trames a 340 i 380 nm de les àrees analitzades (640 nm × 480 nm) es van emmagatzemar cada 500 ms durant 3 min i la relació de senyal corregida per al fons es va determinar per a cada píxel després de l'experiment. A partir dels canvis de la relació mitjana de cèl·lules simples amb el pas del temps, es va calcular el percentatge de cèl·lules que presenten un augment de Ca 2+ i a causa de l'estimulació (cèl·lules que reaccionen per cèl·lules a la zona visible). No es va intentar calcular la concentració exacta de Ca 2+ i a partir de la relació.

Cells were stimulated mechanically or by the addition of SN (10 μ M). Mechanical stimulation of single cells by touching with glass pipettes (tip diameter 1 μ m) increased the Ca 2+ i of the stimulated cell. In the presence of apyrase (Sigma Aldrich; 50 U/ml), which degraded the ATP released due to the stimulation, the Ca 2+ signal spread to neighbouring cells via gap junctions. The number of cells showing an elevated Ca 2+ level (except of the stimulated cell) was counted. In another set of experiments, SN was solved in double concentration (20 μ M) in HEPES and 200 μ l of this solution was rapidly added to the cells (120±14 cells per visual field were counted). Addition of the solution without stimuli did not change the Ca 2+ i signals. SN did not change the pH of the HEPES solution. IP 3 receptors were inhibited by preincubation (15 min) with xestospongin C (40 μ M).

Dye coupling

Gap junctional coupling was detected by injecting a GJ-permeable, membrane-impermeable fluorescent dye (3.5 mM Alexa Fluor 488 dissolved in 150 mM KCl; Invitrogen) into single cells and analysing the dye spreading within 5 min. The cell incubation unit and experimental settings were the same as for the Ca 2+ i measurement. The dye was injected using a dye-filled borosilicate micropipette (at a tip pressure of 60 mm Hg for 0.6 s, tip diameter <1 μ m) connected to an injecting system (FemtoJet; Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany). The fluorescent dye was excited at 488 nm and fluorescence signals were detected using a long-pass emission filter λ em ≥515 nm. Following dye injection, images were captured using a digital camera (Imago; Till Photonics) that was mounted on the inverted microscope (Axiovert S100; Zeiss). To assess cellular coupling, the total number of dye-stained cells at the 5-min postinjection timepoint was counted.

Estadístiques

Gaussian distributed data were analysed for statistically significant differences by the Student's t -test (two groups, unpaired data). Differences between more than two groups were determined by one-way ANOVA, followed by Student–Newman–Keuls method for multiple comparisons. Error probabilities of P ≤0.05 were considered significant. All values are expressed as means±SEM Non-Gaussian distributed data (indicated as 'NG' in the figure legends) were analysed by the non-parametric Mann–Whitney rank-sum test. For multiple comparisons, the Kruskal–Wallis test on ranks followed by pairwise multiple comparisons with Dunn's method was used. Although these tests do not allow analysing differences of mean values, for descriptive reasons mean values are presented throughout the manuscript. Medians are not displayed as they did not differ from the means more than 20%.

Glossari

GJ

gap junction

Cx

connexin/s

NT

N-terminal part

CT

C-terminal part

SN

streptonigrin

Ca 2+ i

intracellular free calcium

FITC

isotiocianat de fluoresceïna

PI

propidium iodide

aa

amino acids

IP 3

inositol triphosphate

α

anti