Diversitat genètica i funció en les sulfotransferases citosòliques humanes | la revista farmacogenòmica

Diversitat genètica i funció en les sulfotransferases citosòliques humanes | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

Les substitucions d'aminoàcids, que resulten de polimorfismes no sinònims (NS) comuns, poden alterar dràsticament la funció de la proteïna codificada. Obtenir coneixement sobre com alteren les funcions és un pas cap a l’adquisició de la previsibilitat. En aquest estudi, hem incorporat la reciclatització genètica, la genòmica funcional, la caracterització d’aminoàcids i l’anàlisi de l’estructura de cristalls per a les sulfotransferases citosòliques (SULTs) per intentar obtenir predicció respecte a la funció d’al·lozims variants. Anteriorment, es van cercar quatre gens SULT en 118 mostres d'ADN. Amb un cercat posterior dels vuit membres restants de la família SULT en les mateixes mostres d'ADN, es van revelar un total de 217 polimorfismes. De 64 polimorfismes identificats a 8785 pb de regions de codificació dels gens SULT examinats, 25 eren sinònims i 39 eren NS. En general, la proporció de canvis sinònims era més gran del que s’esperava d’una distribució aleatòria de mutacions, cosa que suggereix la presència d’una pressió selectiva contra les substitucions d’aminoàcids. S'han publicat prèviament dades funcionals de variants comunes de cinc gens SULT. Aquestes dades, juntament amb les dades d’al·lozim de la variant SULT1A1 presentades en aquest treball, van demostrar que el mecanisme major pel qual els canvis d’aminoàcid alteren la funció alterada en un sistema d’expressió transitòria era mitjançant disminucions de proteïnes immunoreactives en lloc de canvis en cinètica d’enzims. Una anàlisi addicional sobre els mecanismes mitjançant els quals els polimorfismes de nuclis nuclears únics alteren la funció mitjançant l'anàlisi de la conservació evolutiva, les propietats fisicoquímiques de les substitucions d'aminoàcids i l'anàlisi de l'estructura de cristalls. Ni les característiques individuals d’aminoàcids ni els models estructurals van ser capaços de predir amb precisió i fiabilitat la funció de les al·lòzimes variants. Aquests resultats suggereixen que les substitucions comunes d’aminoàcids no poden alterar dràsticament l’estructura proteica, però afecten les interaccions amb l’entorn cel·lular que actualment no s’entenen bé.

Introducció

El genoma humà conté aproximadament 11 milions de canvis comuns de nucleòtids únics amb freqüències d’al·lels superiors a l’1%. 1 Es creu que una gran majoria d'aquestes variacions seqüencialment són neutres, però un subconjunt altera l'estructura d'un producte gènic. Aquests canvis estructurals sovint són perjudicials per al seu funcionament, però algunes proteïnes variants tenen un funcionament normal, o fins i tot augmentat. Amb els objectius de comprendre millor com influeix l’evolució molecular en la funció d’al·lozims variants i com afecten les substitucions específiques a la funció proteica, hem incorporat dades de recanquimentació, genòmica funcional, caracterització d’aminoàcids i anàlisi d’estructures de cristall per analitzar les relacions estructura-funció dins de l’ésser humà. La família de gens de la sulfotransferasa citosòlica (SULT).

Els membres de la família de gens SULT juguen un paper important en la biotransformació de diversos substrats, incloent hormones esteroides, neurotransmissors, fàrmacs i altres xenobiòtics. 2, 3, 4 Fins a la data, s'han identificat 12 gens SULT humans. 5 Els membres de la família comparteixen un alt grau d’identitat de seqüències i es troben en grups en cromosomes. 5 Degut a la importància de la sulfatació en el metabolisme d’una gran varietat de substrats, s’ha treballat molt en la caracterització de la variació genètica i les conseqüències funcionals de les substitucions d’aminoàcids a la família SULT 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 i estructures de cristall s'han resolt per a nou dels dotze membres. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22

Anteriorment, es van cercar quatre gens SULT - SULT1A3 , 1A4 , 1E1 i 2A1 - de mostres d'ADN de 59 caucàsics-americans (CA) i 59 afroamericans (AA). 6, 8, 11, 12 Per determinar la naturalesa i el grau de variació de la seqüència dins de tota la família de gens per a les anàlisis que es descriuen aquí, els membres restants de la família de gens SULT - SULT1A1 , 1A2 , 1B1 , 1C2 , 1C4 , 2B1 , 4A1 i 6B1 - es van cercar en les mateixes mostres d’ADN (taula 1). En total, es van analitzar més de 8, 5 milions de parells de bases de seqüències de regions de sis cromosomes.

Taula completa

S'han completat estudis genòmics funcionals per a 14 polimorfismes de nucleòtids únics no sinònims (NS) com a pas per comprendre com la variació de la seqüència de nucleòtids es tradueix en variació de la funció enzimàtica de la família de gens SULT. 6, 7, 8, 9, 11, 12 Aquests estudis anteriors van demostrar que les alteracions en la seqüència d'aminoàcids poden causar disminució de l'activitat enzimàtica degut a la disminució dels nivells de proteïna immunoreactiva. En aquest estudi, es van realitzar estudis genòmics funcionals addicionals per a tres al·lozims variants de SULT1A1 per determinar les conseqüències funcionals de les substitucions d'aminoàcids en un sistema d'expressió recombinant. Els estudis anteriors de correlació de genotip-fenotip en mostres de fetge humà i plaquetes van demostrar que un al·lel variant comú, SULT1A1 * 2 (Arg213His), estava associat a una baixa activitat enzimàtica. 9, 10 El present treball amplia aquesta anàlisi a variants addicionals de SULT1A1 i presenta noves dades sobre nivells de proteïnes immunoreactives per a totes les variants SULT1A1.

La família de gens SULT és un candidat ideal per estudiar la relació entre la variació de la seqüència, l'estructura i la funció combinant dades genòmiques funcionals amb la caracterització d'aminoàcids i el modelatge estructural. La comprensió de les conseqüències dels canvis d'aminoàcids pot ajudar a caracteritzar els mecanismes responsables de la disminució de la funció enzimàtica i, finalment, obtenir previsibilitat sobre aquests efectes. Els nostres resultats suggereixen que els mètodes d'ús comú per predir l'efecte de les substitucions d'aminoàcids sobre la funció proteïna només tenen una utilitat limitada quan s'apliquen a allozymes SULT i es necessiten millors "eines" per predir com la variació a nivell de nucleòtids es tradueix en una funció alterada de variant al·lòzims dins de l’entorn cel·lular.

Resultats

Variació genètica a la família de gens SULT

Tots els gens humans SULT es van cercar en mostres d’ADN de poblacions d’AA i CA (236 al·lels en total) per catalogar la diversitat genètica dins d’aquesta família de gens. Es van amplificar un total de 36 259 pb a partir dels gens SULT humans a cada mostra d'ADN, incloent 8785 pb (24%) de codificació i 27 474 pb (76%) de seqüències que no codificaven (taula 2). L'anàlisi de seqüències va identificar 212 SNPs i cinc insercions i esborracions amb una freqüència general d'al·lel menor (MAF) de 0, 102. Dels 217 polimorfismes identificats, 64 (29, 5%) es van localitzar en regions codificants i 153 (70, 5%) eren variants de seqüències que no codificaven (taula 2). De mitjana, es va identificar un polimorfisme cada 167 pb de seqüència total. El gen SULT més polimòrfic va ser SULT1A2 , amb una mitjana d’un canvi de nucleòtids per cada 111 pb que es va analitzar. En contrast amb SULT1A2 , l’anàlisi de seqüències de 3558 pb corresponent a SULT4A1 només va detectar cinc polimorfismes: una mitjana d’un polimorfisme cada 712 pb. Tots els polimorfismes SULT4A1 es troben a les regions intròniques (Taula 1). L’abast de la variació de nucleòtids trobada en membres de la família de gens SULT va ser similar a la observada per a altres grups de gens humans. 23, 24, 25, 26, 27

Taula completa

Diversitat genètica entre les regions gèniques

La teoria neutra preveu que els canvis de nucleòtids es produeixen de forma aleatòria a tot el genoma sense cap pressió selectiva quant a la ubicació. 28, 29 En general, això semblava ser vàlid per a les regions dels gens SULT analitzats, amb la proporció de parells de bases seqüenciades aproximadament igualant la proporció de polimorfismes identificats per a la població total (figura 1) ( χ 2 = 9.13, df = 5, P = 0, 104). La notable desviació d’aquest patró va ser pels canvis de nucleòtids dins de la regió codificant dels gens. Tot i que el 80% dels nucleòtids de la regió codificant eren llocs de NS on els canvis de nucleòtids tenen el potencial de canviar la seqüència de proteïnes, només el 61% dels polimorfismes observats a la regió codificadora realment van conduir a un canvi en l'aminoàcid codificat. Aquest excés de canvis sinònims (S) suggereix que alguna pressió selectiva està treballant contra la substitució d’aminoàcids a les proteïnes SULT en ambdues poblacions ( χ 2 = 64, 5, df = 1, P <0, 0001). A més, la mitja de MAF per als polimorfismes S va ser un 60% superior a la observada per a canvis de NS (9, 85 i 6, 04% per a canvis de S i NS, respectivament). La inspecció de la distribució de MAF també va indicar un desplaçament cap a un augment de la presència d'al·lels de freqüència al·lel de baixa freqüència (<0, 01) a intermèdia (0, 01-0, 10) en comparació amb els polimorfismes de les dues poblacions.

Image

Distribució del polimorfisme SULT. ( a ) Proporció de parells de bases seqüenciades corresponents a cada regió gènica (codificació, no codificació, NS, S, intró, 5′-UTR, 3′-UTR, 5′-FR i 3′-FR). ( b ) Proporció de polimorfismes identificats en la població combinada d'AA i CA de cada regió gènica. ( c ) Proporció de polimorfismes identificats en mostres d'ADN AA a cada regió gènica. ( d ) Proporció de polimorfismes identificats a la població de CA a cada regió gènica.

Imatge a mida completa

La diferència en el nombre de polimorfismes NS i S identificats pot ser un resultat directe de la longitud de la seqüència seleccionada. Per tant, les relacions entre polimorfismes S i NS i parells de bases seqüenciades es van analitzar mitjançant anàlisi de regressió. Per als polimorfismes, més del 61% de la variació es pot explicar per longitud ( R 2 = 0, 614, F (1, 9) = 12, 75, P = 0, 0073). En comparació, la longitud no va ser un factor significatiu per explicar la variació present als llocs de NS ( R 2 = 0, 0067, F (1, 9) = 0, 054, P = 0, 8216), cosa que suggereix encara que hi ha alguna pressió selectiva contra les substitucions d'aminoàcids. en els gens SULT.

Anàlisi genètica poblacional de la diversitat a la família de gens SULT

Per obtenir coneixement de l'evolució molecular de la família de gens SULT, es va calcular la diversitat de nucleòtids ( π ), el paràmetre neutre ( θ ) i l'estadística D de Tajima. 30 Els valors π estimats per a la família SULT eren gairebé idèntics per a la població combinada, la població AA i la població CA, amb valors de 8, 6, 8, 4 i 8, 3, respectivament (Taula 2). El IC del 95% dels valors D de Tajima va incloure zero per a tots els càlculs, cosa que suggereix que l'evolució global de la família de gens era neutra. No obstant això, hi va haver una marcada diferència entre la diversitat de nucleòtids observada pels llocs NS en comparació amb els llocs S. El valor de π era més que quatre vegades superior per als llocs S que els llocs NS, mentre que els valors θ eren de 2, 5 vegades més alts per als llocs S en comparació amb els llocs NS de la població total. Això va indicar que els llocs S van ser capaços de suportar un major grau de variació de la seqüència en comparació dels llocs NS (Taula 2).

Genòmica funcional de la família SULT

Les substitucions d'aminoàcids poden afectar notablement la funció proteica. Per determinar les conseqüències funcionals dels SNP SULT NS, estudis anteriors van caracteritzar 14 canvis d'aminoàcids. Set de les variants alozimes van mostrar reduccions significatives de la funció enzimàtica (taula 3). 6, 7, 8, 11, 12 En el present estudi, també hem analitzat els tres allozims variant SULT1A1 presents a les poblacions de CA i AA estudiats aquí per a nivells d’activitat enzimàtica i proteïna immunoreactiva, utilitzant el mateix sistema d’expressió que s’utilitza per al estudis anteriors d’altres variants SULT. La figura 2 mostra els resultats de l’activitat de l’enzim i l’anàlisi de Western blot.

Taula completa

Image

Genòmica funcional SULT1A1. Nivells mitjans d’activitat enzimàtica ( a ) i proteïna immunoreactiva ( b ) per al·lozims SULT1A1 humans expressats en cèl·lules COS-1 (mitjana ± sem, n = 6). Els nivells s’expressen en relació amb l’alozim WT i es corregeixen per l’eficiència de transfecció.

Imatge a mida completa

Prenent totes les variants SULT que s’han estudiat utilitzant aquest assaig com a grup, va existir una correlació significativa entre els nivells d’activitat enzimàtica i la proteïna immunoreactiva per a tots els 17 SNS SULT NS (Figura 3, R P = 0, 692, P = 0, 0015). Aquests resultats van indicar que el principal - encara que no l'únic - mecanisme responsable de la disminució de l'activitat enzimàtica va ser una disminució corresponent de la proteïna enzimàtica.

Image

Activitat de l'al·lozima variant SULT i correlació del nivell de proteïnes. Correlació entre el nivell d’activitat de l’enzim i la proteïna immunoreactiva per a 17 alozimes variants SULT en comparació amb l’alozima WT. R P és el coeficient moment-producte Pearson per a l’anàlisi de correlació.

Imatge a mida completa

Prediccions de l'estructura-funció basades en la caracterització de substitucions d'aminoàcids

S'han desenvolupat diverses tècniques que caracteritzen la substitució d'aminoàcids com una forma d'entendre com poden afectar les funcions de substitució. Es van aplicar quatre mètodes d’ús comú basats en la conservació evolutiva i / o propietats fisicoquímiques a 17 de les substitucions trobades en els SULT humans. Primer es van realitzar alineacions d'aminoàcids dins de les subfamílies SULT per a humans, ximpanzés, rata i ratolí per determinar quins llocs es van conservar a través de l'evolució dels mamífers. De les 17 localitzacions de SNS de NS, només tres es van conservar a les quatre espècies de mamífers: SULT1A1 * 2, SULT1C2 * 4 i SULT1E1 * 4 (Taula 4). D'aquests, només la variant SULT1C2 * 4 (Arg73Gln) va mostrar una disminució de l'activitat enzimàtica superior al 50% del tipus salvatge (WT). Cal destacar que la posició 73 de SULT1C2 era l’únic lloc entre les variants SULT que hem estudiat que es conservava en totes les espècies examinades fins ara, incloent peixos ( Danio rerio i Fugu rubripes ) i aus ( Gallus gallus ).

Taula completa

Entre les 14 substitucions que vam estudiar, que es produeixen en residus que no s’han conservat a través de l’evolució dels mamífers, vuit tenien activitats enzimàtiques que eren almenys el 50% de les produïdes pel residu WT, però els sis allozims restants tenien activitats que van de 0 a El 28% de l'observat amb l'al·lel WT. Així doncs, la manca de conservació evolutiva no preveu clarament l’absència de conseqüències per a la funció enzimàtica SULT.

Els nombres de Grantham es determinen a partir de les diferències de propietats fisicoquímiques entre dos aminoàcids. 31 Un nombre elevat de Grantham (> 100) indica que la substitució seria un canvi "radical" i s'esperava que canviés la funció de la proteïna. Cinc de les 17 substitucions d'aminoàcids tenien números de Grantham> 100, però dues d'aquestes alozimes (SULT1A1 * 5 i SULT1A3 / 4 * 5) tenien activitat comparable a WT (taula 4). De les 12 substitucions amb valors de Grantham inferiors a 100 (cosa que suggereix menys impacte en la funció) quatre tenien activitats enzimàtiques inferiors al 50% del WT. Per tant, l'ús del número de Grantham tampoc era un mètode fiable per predir amb exactitud la funció d'alozim variant.

Diversos estudis han utilitzat els valors de BLOSUM62 per ajudar a predir l'efecte dels SNP de NS sobre la funció proteica basada en les propietats fisicoquímiques dels aminoàcids. 32 Per als SNP SULT NS, es va considerar que gairebé la meitat de les substitucions d'aminoàcids no eren conservadores basades en un valor negatiu de BLOSUM62. Aquestes designacions només es van correlacionar moderadament amb l’activitat funcional i el nivell de proteïna immunoreactiva de la variant dels allozims, demostrant de nou que l’anàlisi de les propietats fisicoquímiques de les substitucions no era suficient per predir amb precisió i fiabilitat la conseqüència dels SNS SN.

Finalment, es va utilitzar SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) per caracteritzar les substitucions d’aminoàcids SULT. El SIFT utilitza propietats fisicoquímiques d'aminoàcids juntament amb l'alineació de seqüències similars per predir els efectes funcionals dels SNPs de NS. 33 Altres estudis que utilitzen SIFT han tingut èxit en la predicció de les conseqüències funcionals dels canvis associats a la malaltia en distingir les substitucions neutres i les alteracions de proteïnes no neutres. 34 Per als polimorfismes SULT, el 59% dels SNP de NS (10 de 17) tenien puntuacions SIFT <0, 01 i es preveia que fossin mal tolerades i que alteressin la funció proteica. Un percentatge similar (41%, set de 17) de la variant dels allozims mostren una disminució significativa de l’activitat enzimàtica en comparació amb el WT, però la taxa d’èxit de les puntuacions SIFT en predir la disminució era només del 50% (cinc de cada 10). Curiosament, tres dels cinc casos discordants van ser per al·lozims amb una activitat propera o superior a la del WT. S'ha de tenir molta cura en la interpretació d'aquests resultats, ja que vuit de les 17 prediccions del SIFT es van fer amb poca confiança (com s'indica en negreta a la taula 4) com a resultat de la diversitat restringida dins del conjunt de comparació. Les vuit prediccions de baixa confiança van ser per a substitucions previstes que afectessin la funció proteica.

En la seva anàlisi de l'evolució molecular dels gens transportadors de membranes humanes, Shu et al. 35 i Leabman et al. 23 van assenyalar que les variants més comunes dels gens transportadors de membrana estudiades tenien un funcionament normal i que els al·lels no funcionals solien ser rars en les poblacions que van estudiar. Tendències similars eren evidents per als SULT que hem estudiat. Cap de les variants més comunes (freqüències d’al·lels> 5%) no va produir activitats enzimàtiques inferiors al 50% de l’al·lel WT en assajos funcionals. Per la seva banda, tots els canvis NS que van reduir les activitats enzimàtiques per sota del 20% de l'al·lel WT tenien MAFs inferiors al 2, 5%. Tot i això, les correlacions entre la freqüència d’al·lel i la funció enzimàtica no eren perfectes. Tres al·lòzims rars a les nostres poblacions (SULT1A3 / 4 * 4, SULT1E1 * 3 i SULT1E1 * 4) tenien activitats enzimàtiques superiors al 50% de WT i SULT1A3 / 4 * 2 (que tenien una freqüència d'al·lel per sobre del 4% en la nostra AA. població) va donar lloc a un enzim amb només el 25% de funció normal en els nostres assajos.

Anàlisi de l'estructura cristal·lina

El programa PolyPhen, una eina basada en la web que utilitza dades d'estructura de cristalls per predir les conseqüències funcionals de les substitucions d'aminoàcids, va predir que cinc de les 17 substitucions d'aminoàcids serien "possiblement" o "probablement perjudicials". D'aquests, només una variant d'al·lozima - SULT1A3 / 4 * 3 - va mostrar una reducció significativa de l'activitat enzimàtica (taula 5). Per la seva banda, sis allozims que es preveia que eren "benignes" tenien menys del 50% de l'activitat del WT. A més, el programa PolyPhen va fallar malament a l’hora d’obtenir l’estructura de cristall WT correcta de la base de dades PDB a efectes de modelatge. Tot i que el mapatge estructural en tres dimensions (3-D) no és l'únic paràmetre utilitzat per l'algoritme PolyPhen, les prediccions podrien haver estat més precises si s'hagués seleccionat l'estructura de cristall adequada.

Taula completa

El modelat estructural de l’entorn químic i estèric local de cada substitució d’aminoàcids mitjançant la corresponent estructura de cristall WT SULT tampoc va ser capaç de predir amb precisió la funció de la variant dels allozims (taula 5). El modelat va demostrar que la majoria dels llocs de substitució es van localitzar a la superfície de les proteïnes i, com a resultat, els residus codificats van estar exposats al medi cel·lular (figura 4). De les 17 ubicacions de substitució d'aminoàcids, només quatre estaven a prop del lloc d'unió de 3'-fosfoadenosina 5'-fosfosulfat; dos d’ells tenien una activitat disminuïda, la tercera (SULT1E1 * 2) tenia un 7 i un 13% d’activitat i proteïna WT, respectivament, i la quarta (SULT1C2 * 5) no tenia activitat per l’absència de cap proteïna detectable. Tot i que les alteracions de la cinètica enzimàtica no van ser el principal mecanisme pel qual es va alterar la funció de substitució d'aminoàcids, es van observar petites variacions en la cinètica de substrats per a dos d'aquests quatre allozims variants - SULT1E1 * 2 i SULT1E1 * 4. Només es van especular dues substitucions. incompatible amb l'estructura WT; La gran cadena lateral de S1111Phe de SULT1C2 * 5 i les restriccions conformacionals de cadena principal per a l'Ala63Pro de SULT2A1 * 3 només es poden acomplir amb algun canvi conformacional important, que pot ser incompatible amb el plegament i / o l'estabilitat de proteïnes. SULT1C2 * 5 no té proteïnes ni activitats detectables, mentre que SULT2A1 * 3 té un 57 i un 27% d’activitat i proteïna WT, respectivament.

Image

Distribució de llocs de substitució de variants al plec proteic SULT. L'estructura de cristalls de SULT1A1 humà (PDB ID: 1LS6) es mostra en una representació de cinta grisa (esquerra) o d'esfera (plena). Els residus alterats en les variants SULT es mostren com C α a l'esquerra i acolorits per proteïna als dos panells (cian per a SULT1A1, magenta per a 1A3 / 4, groc per a 1C2, blau per a 1E1, taronja per a 2A1 i verd per a 1C2 i 1E1 ). Com a referència, la PAP enllaçada (3′-fosfoadenosina 5'-fosfat) es mostra de color rosa.

Imatge a mida completa

Discussió

La combinació de reciclatge de genes, genòmica funcional, caracterització d’aminoàcids i modelat basat en l’estructura de cristalls van permetre l’anàlisi completa de la família de gens SULT a diversos nivells. El nostre objectiu era determinar com la variació en les seqüències codificants dels gens SULT es tradueix en variació en la funció i si es podien predir alteracions en la funció basades en la conservació evolutiva, les propietats fisicoquímiques i / o l'estructura 3-D.

En general, l'evolució de la família de gens SULT semblava ser coherent amb la teoria neutra, cosa que indica que la majoria de regions d'aquests gens no estaven sota una pressió selectiva significativa. No obstant això, hi va haver un suggeriment de selecció contra la diversitat als llocs NS en comparació amb els llocs S dins de les regions codificadores dels gens SULT. Aquest canvi cap a la diversitat augmentada als llocs S va ser present per a tots els gens SULT amb l'excepció de SULT6B1 . Hi ha una sorprenent quantitat d’heterogeneïtat en la diversitat genètica dels diferents gens SULT. És interessant que SULT4A1 sigui el més ben conservat a través de l’evolució, amb una identitat de seqüència superior al 97, 5% entre seqüències de ratolí, rata, ximpanzé i SULT4A1 humans. Actualment, no hi ha un substrat conegut per a SULT4A1; de manera que la funció d’aquest enzim no és clara, tot i que està molt expressada al cervell humà. 36

El membre més polimorf de la família és SULT1A2 , amb 36 polimorfismes totals trobats a 4010 bp examinats. Atesa la redundància estructural i funcional de quatre membres de la família SULT1A, no és sorprenent la tolerància per a una major divergència en els gens SULT1A. En general, l'extensió i la naturalesa de la variació genètica dins de la família de gens SULT eren comparables a la variació de seqüència identificada en altres estudis de reciclatge gènic. 23, 24, 25, 26

Molts d'aquests estudis de cercança anteriors no s'han centrat en famílies de gens, però Leabman et al. Es van cercar 23 gens a partir d'una família de transportadors de membrana. Les seves dades suggereixen que les ubicacions gèniques específiques tenien diferents nivells de diversitat de nucleòtids a causa de restriccions evolutives derivades dels requeriments estructurals per a l'associació de membranes. Els SULT són enzims citosòlics i no tenen les restriccions estructurals de les proteïnes unides a membrana. Això pot explicar en part per què s’han conservat menys residus SULT a través de l’evolució dels mamífers del que s’observa per als transportadors de membrana. 23, 35 Només tres de les 17 substitucions d'aminoàcid SULT eren alteracions de residus conservats en humans, ximpanzé, rata i ratolí i dos van donar lloc a enzims que tenien activitats específiques almenys tan altes com l'enzim WT. Tanmateix, el WT Arg a la posició 73 de SULT1C2 * 4 s'ha conservat en peixos i aus i destaca que Gln en aquesta posició comporta una disminució dramàtica de l'activitat enzimàtica. La funció reduïda de SULT1C2 * 4 és coherent amb la hipòtesi que les substitucions d’aminoàcids als llocs més conservats (EC) evolutivament poden ser perjudicials per al seu funcionament. Tanmateix, la manca d’una correlació estesa entre la conservació evolutiva i la funció enzimàtica d’aquest conjunt de dades SULT és una diferència de les observacions de Leabman et al. 23 pel que fa als transportadors de membrana, i destaca que diferents famílies de proteïnes poden estar sotmeses a diferents pressions de selecció.

La reducció de l’activitat enzimàtica com a resultat de la substitució del residu molt conservat 73 en SULT1C2 * 4 es produeix sense una reducció corresponent de la proteïna enzimàtica. En aquest sentit, és una excepció a la regla general d’aquestes variants SULT. Com es mostra a la figura 3, el principal mecanisme mitjançant el qual els polimorfismes comuns i naturals van reduir l’activitat enzimàtica en els SULT (almenys en un sistema d’expressió transitòria) va ser la reducció dels nivells d’estat estacionari de les proteïnes SULT. Aquesta observació reforça les conclusions d’estudis mecanicistes anteriors sobre com afecten l’activitat dels enzims els polimorfismes dels enzims metabolitzadors de la Fase II. 37, 38, 39

Estudis genòmics funcionals realitzats amb proteïna recombinant van revelar que set de 17 variants tenien un descens de l'activitat enzimàtica superior al 50%. La nostra anàlisi va suggerir que les prediccions basades en substitucions individuals d'aminoàcids tenien un valor limitat en la predicció de les conseqüències funcionals de la variant d'al·lozims que hem estudiat. Cadascun dels enfocaments provats en aquest estudi va produir prediccions falses positives i falses negatives.

També vam provar la hipòtesi que l'ús de dades estructurals en 3-D podria aportar una visió addicional sobre les conseqüències funcionals de les substitucions polimòrfiques. El model estructural de substitucions d'aminoàcids va demostrar que gairebé tots els residus alterats dels SNC NS es van localitzar a les superfícies de les proteïnes i eren compatibles amb l'estructura WT (figura 4). El treball sobre diversos altres enzims farmacogenèticament importants, inclosa la tiopurina N- metiltransferasa (TPMT), la feniletanolamina N- metiltransferasa i SULT1A3 / 4, ha demostrat que les substitucions d'aminoàcids poden produir variants alozimes, que es degraden ràpidament a través del proteosoma. 12, 39, 40, 41 Aquest procés pot implicar diverses proteïnes cel·lulars incloses les chaperones moleculars. 39 A més, variant allozimes poden formar agressomes a la cèl·lula, tal com demostra TPMT * 3A. 42 Els agresomes són complexos de proteïnes descartades i de chaperones, proteïnes microtubulars i histona deacetilasa 6. Pot ser que moltes substitucions d'aminoàcids alterin les interaccions dins del medi cel·lular, i són aquestes interaccions complexes les responsables de la variació en el nivell de proteïnes i així, activitat enzimàtica: no alteracions en l'estructura proteica.

Des d’una perspectiva pràctica de farmacogenòmica, el problema més important per als SULT seria la capacitat d’identificar al·lels d’activitat baixa que puguin deteriorar el metabolisme normal dels fàrmacs i hormones. Les freqüències d'al·lel per als SULT no es correlacionen perfectament amb la funció, però els al·lels variants amb freqüències superiors al 5% es van associar uniformement amb activitats enzimàtiques d'almenys el 50% del WT. Més important encara, totes les al·locimes amb activitat enzimàtica inferior a la meitat de l’al·lel WT tenien freqüències d’al·lel de menys del 2, 5% en el nostre mostreig combinat.

En conclusió, aquest estudi ha incorporat un polimorfisme de nucleòtids, dades genòmiques funcionals, caracteritzacions d'aminoàcids i un model estructural per a una important família de gens humans com a pas cap a la predicció respecte a la funció d'al·lozimes variants. Els resultats van mostrar que tot i que sembla haver-hi pressió contra les substitucions d'aminoàcids de la família SULT, cap mètode predictiu únic (inclòs el modelatge d'estructura de cristalls) és capaç de predir amb precisió i fiabilitat les conseqüències funcionals de les substitucions d'aminoàcids tal com es mesura en aquests genotips -estudi de fenotips de proteïnes recombinants. Es requerirà una comprensió addicional per desenvolupar millors predictors de maneres en què la variació a nivell de nucleòtids es tradueixi en variació en funció de la família de gens SULT. També es necessitarà un treball addicional per comprendre com les diferències amb exactitud de l'estructura i la funció dels gens que es mesuren aquí poden predir les respostes als medicaments en el context dels complexos processos biològics existents en pacients individuals.

Materials i mètodes

Mostres d’ADN

Les mostres d’ADN es van obtenir al Repository Cell Cell Coriell (Camden, NJ, EUA). Concretament, es van utilitzar 59 mostres cadascuna de dos panells de variació humana, HD100CAU i HD100AA. Les dades de recanvi de classificació de mostres de Coriell estan disponibles a través del lloc web de PharmGKB (vegeu més avall). Tots els subjectes havien obtingut el seu consentiment informat per a l'ús del seu ADN amb finalitats de recerca.

Recerca de genes SULT

La PCR es va utilitzar per amplificar cadascun dels gens SULT. Les amplificacions incloïen tots els junts amb exons i empalmes, així com porcions d’introns i regions de flanqueig. Es van seqüenciar els amplicons mitjançant la química de seqüenciació de les primeres tècniques. Tots els polimorfismes observats en una única mostra d’ADN es van verificar per reamplificació i seqüenciació per descartar la presència d’artefactes induïts per PCR. Els al·lels WT es van designar com els al·lels comuns a la població AA en aquest lloc.

Les dades de classificació prèvia reportades en aquest document s’han dipositat a la base de dades de PharmGKB (www.PharmGKB.org) amb els següents ID d’adhesió: SULT1A1 - PA343, SULT1A2 - PA341, SULT1A3 / 1A4 - PA344, SULT1B1 - PA415, SULT1C1 5 - PA345, SULT1C4 (anteriorment SULT1C2 5 ) - PA414, SULT1E1 - PA340, SULT2A1 - PA346, SULT2B1 - PA36249, SULT4A1 - PA412, SULT6B1 - PA128505849.

Genòmica funcional SULT1A1

Les construccions d'expressió per a tres al·lzims SULT1A1 variants (Arg213His, Met223Val i Phe247Leu) es van utilitzar per transfectar cèl·lules COS-1 que havien estat co-transfectades amb una construcció β- galactosidasa (Promega, Madison, WI, EUA). El lisat cel·lular COS-1 procedent d’aquestes transfeccions es va utilitzar per analitzar els nivells d’activitat enzimàtica utilitzant 4 μ M 4-nitrofenol com a substrat i proteïna immunoreactiva tal com es va descriure anteriorment. 9

Anàlisi de dades

Com que SULT1A3 i SULT1A4 són un 99, 99% idèntics en seqüència, 8 ambdues còpies es van amplificar i seqüenciar simultàniament, de manera que no vam poder assignar els SNPs en aquests dos gens a un lloc específic. Per tant, les dades del polimorfisme d’aquests dos gens es van eliminar de l’anàlisi estadística.

Els llocs NS i S es van calcular a partir del nombre de llocs dobles, dobles i no regenerats descrits per Hartl i Clark. 43 La diversitat de nucleòtids ( π ), el paràmetre neutre ( θ ) - corregit per seqüenciar la longitud - i el D de Tajima es va calcular tal com es descriu per Tajima 30 per a cada gen i regió gènica. Tots els valors π i θ s’expressen com a estimacions de paràmetres × 10 −4 / bp ± se

Caracterització d'aminoàcids

Les alineacions de la seqüència SULT es van crear mitjançant l'eina AliBee des del lloc web GeneBee (www.genebee.msu.su/genebee.html). A la taula 6. es presenta una llista de seqüències de referència utilitzades per a l'anàlisi. Aquests alineaments es van utilitzar per classificar els residus d'aminoàcids com a CE o UE. Els residus CE es van designar com a ubicacions idèntiques en l'alineació de subfamílies per a totes les espècies. Les alineacions de diverses seqüències també es van utilitzar per consultar la base de dades SIFT (//blocks.fhcrc.org/sift/SIFT.html). Es van calcular 33 puntuacions SIFT, números de Grantham i valors de BLOSUM62 per a cada SNP SULT NS identificat durant la investigació de gens. 31, 32

Taula completa

Anàlisi de l'estructura cristal·lina

El programa basat en la web, PolyPhen (//www.bork.embl-heidelberg.de/PolyPhen/), es va utilitzar per predir les possibles conseqüències de les substitucions d'aminoàcids sobre l'estructura i la funció de proteïnes basades en consultes del PDB. Es va realitzar un model de l'estructura de cristalls addicionals de l'entorn químic i estèric local de cada SNN NS mitjançant el programa interactiu de gràfics cristal·logràfics interactius 'O'. 45 El modelat es va realitzar mitjançant mutagènesi computacional mitjançant l'estructura de cristall WT SULT adequada dipositada a la PDB com a bastida, substitució de la cadena lateral per correspondre amb el SNN NS, i anàlisi de la compatibilitat química i estèrica de l'entorn estructural local amb el cadena lateral nova.

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • PA345
  • PA414
  • SULT1A1 - PA343
  • SULT1A2 - PA341
  • SULT1A3 / 1A4 - PA344
  • SULT1B1 - PA415
  • SULT1C1
  • SULT1C2
  • SULT1C4
  • SULT1E1 - PA340
  • SULT2A1 - PA346
  • SULT2B1 - PA36249
  • SULT4A1 - PA412
  • SULT6B1 - PA128505849

Glossari

AA

Afroamericà

CA

Caucàsic-americà

SULT

sulfotransferasa

SNP

polimorfisme d’un nucleòtid únic

NS

no sinònim

S

sinònim

WT

tipus salvatge

MAF

freqüència d'al·lel menor

EC

evolutivament conservats

EU

evolutivament sense conservar

Dualitat d’interès

Cap.