Identificació de gens que confereixen resistència a les cèl·lules tumorals a l’aurora b kinasa inhibidora, azd1152 | la revista farmacogenòmica

Identificació de gens que confereixen resistència a les cèl·lules tumorals a l’aurora b kinasa inhibidora, azd1152 | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

AZD1152 és un inhibidor de la cinasa Aurora B altament selectiva que actualment està en fase de valoració clínica de la Fase I i II en pacients amb leucèmia mielogènica aguda i amb malalties sòlides malignes avançades. Hem establert dues línies cel·lulars resistents a AZD1152 procedents de línies de carcinoma pancreàtic pancreàtic SW620 i MiaPaCa, que són> 100 vegades resistents al metabolit actiu d’AZD1152, AZD1152 HQPA i interessant, resistents a l’inhibidor de la panasa Aurora kinasa, VX- 680 / MK0457. Utilitzant l’anàlisi de microarray de tot el genoma i la hibridació genòmica comparativa, es va poder identificar MDR1 i BCRP com a gens causants que subjauen a la resistència HQPA AZD1152 en aquests models. A més, la regulació de qualsevol d'aquests gens és suficient per fer que el creixement del tumor in vivo sigui insensible a AZD1152. Finalment, la regulació de MDR1 o BCRP és predictiva de la sensibilitat de les cèl·lules tumorals a aquest agent, tant in vitro com in vivo . Les dades proporcionen una base genètica per a la resistència als inhibidors de l'Aurora kinasa, que es podrien utilitzar per predir la resposta clínica a la teràpia.

Introducció

La família Aurora kinasa és una col·lecció de serines / treonines quinases que funciona com a reguladors clau de la divisió cel·lular. Tres Aurora kinases (conegudes com Aurora A, Aurora B i Aurora C) s’expressen en cèl·lules de mamífers, cadascuna de les quals desenvolupa una funció biològica diferent. 1, 2 Aurora A es localitza en pals de cargol i té un paper crucial en la formació de cargol bipolar. 3 Aurora B, una proteïna del passatger cromosòmica, es localitza a centròmers en mitosi primerenca i després a la zona mitjana del cargol en anafase i es necessita per a la fosforilació de la histona Hòtica mitòtica, la biorientació del cromosoma, el punt de control del muntatge del cargol i la citocinesi. L' Aurora C és també una proteïna del passatger cromosòmica i, en cèl·lules normals, la seva expressió està restringida als testicles, on actua principalment en la gametogènesi masculina. 5 Com que l'Aurora kinases compleix funcions essencials en la mitosi, s'ha prestat una atenció considerable a l'orientació d'aquesta família de cinases a la teràpia contra el càncer. S'han desenvolupat diversos inhibidors de molècules petites inclosos Hesperadin, ZM447439, VX-680 / MK0457, AZD1152 i MLN8054. 6, 7, 8, 9

AZD1152 és un nou fàrmac substituït per pirazol-aminoquinazolina substituït per acetanilida que es converteix ràpidament al fàrmac actiu, AZD1152 HQPA, al plasma humà. 10 AZD1152 HQPA és un inhibidor molt potent i selectiu d’Aurora B (K i de 0, 36 n M) en comparació amb l’Aurora A (K i de 1369 n M) i està inactiu contra un panell de 50 cinases més. 11 AZD1152 inhibeix poderosament el creixement de xenografts de tumors humans de còlon, pulmó i hematològics en ratolins immunodeficients. Una anàlisi farmacodinàmica detallada en rates atímiques portadores de tumors colorectals SW620 tractats iv amb AZD1152 va revelar una seqüència temporal d'esdeveniments fenotípics en tumors: supressió transitòria de la fosforilació d'histona H3, acumulació de cèl·lules amb ADN 4n, seguida d'un augment de la proporció de poliploides (> 4n ADN) cèl·lules. L'anàlisi histològica ha mostrat una divisió cel·lular aberrant concurrent amb un augment de l'apoptosi en tumors tractats amb AZD1152. La mielosupressió transitòria es va observar secundàriament a la inhibició de la proliferació de la medul·la òssia, tot i que aquest efecte va ser totalment reversible després de la cessació del tractament amb AZD1152. 11

Un dels principals obstacles que ha de fer front durant la quimioteràpia contra el càncer és el desenvolupament de resistències creuades de tumors a agents citotòxics, fins i tot a fàrmacs als quals les cèl·lules tumorals mai van estar exposades. Aquest fenotip, conegut com a resistència a diversos medicaments (MDR), és freqüentment observat després del tractament amb fàrmacs anticancerosos. Tot i que la base molecular del MDR és sovint complexa, la regulació generalitzada dels membres de la superfamília del transportador de la cassette que uneix ATP (ABC) ha sorgit com un nucli, un mecanisme autònom cel·lular utilitzat per les cèl·lules tumorals per escapar de l’activitat d’una sèrie de fàrmacs quimioterapèutics que són generalitzada entre els estàndards d’atenció de primera i segona línia. Com que els individus que han fracassat la quimioteràpia anterior són els més propensos a rebre medicaments experimentals més nous, la susceptibilitat a l’RMD representa un obstacle important en el desenvolupament de fàrmacs en oncologia. El transportador ABC prototípic, resistència multidroga 1 (MDR1; també conegut com a P-glicoproteïna o P-gp; codificat per ABCB1) està compost per dos dominis transmembrana i dos dominis d’unió a nucleòtids, que, mitjançant la hidròlisi d’ATP, transporta soluts en contra un gradient de concentració a l’espai extracel·lular. Altres transportadors d’ABC, com la proteïna de resistència al càncer de mama (BCRP, que és codificada per ABCG2) s’expressen com a semitransportadors i dimeritzen per produir una unitat madura i funcional. Tot i que la contribució de la resistència del BCRP a la quimioteràpia encara no és clara, la regulació de la MDR1 ha estat constantment pronòstic de fracàs de la quimioteràpia i mala supervivència en individus amb leucèmia mielògena aguda o síndrome mielodisplàsic. 12, 13 A més, MDR1 està associat a una resposta reduïda a la quimioteràpia en una metaanàlisi de 31 assaigs de càncer de mama. 14 Com a resultat, s'ha invertit un gran esforç en el desenvolupament de substàncies que inhibeixen o modulen un o més transportadors ABC. De fet, els inhibidors de la segona i tercera generació d’aquest tipus s’estan avaluant com a quimiosensibilitzadors en assajos clínics. 15

Tot i que AZD1152 ha mostrat una efectivitat preclínica desitjable i s’està avaluant en assaigs clínics de Fase I / II en leucèmia mielògena aguda i tumors sòlids, no s’ha explorat el potencial de desenvolupament de resistència a AZD1152. En el present estudi, hem generat dos models de cultiu de cèl·lules resistents a l’HQPA AZD1152 mitjançant el cultiu de cèl·lules de carcinoma de còlon i pancreàtiques en presència d’altes concentracions de HQPA AZD1152 durant un període de 3 mesos. Utilitzant l’anàlisi de microarrays a tot el genoma, hem identificat un gen de resistència HQPA resistent HQPA de cada model: ABCB1 (que codifica MDR1) i ABCG2 (que codifica BCRP). D'altra banda, la hibridació genòmica comparativa (CGH) va revelar un nombre de còpies augmentat del locus ABCB1 en la variant resistent de SW620. La sensibilitat a AZD1152 HQPA es restableix en el derivat altament resistent al fàrmac mitjançant l'esgotament de MDR1 o BCRP mediat per siRNA o per inhibidors de molècules petites de MDR1 o BCRP. Quan es xenograften, aquests models són refractaris a la teràpia AZD1152 com són els xenografts HCT-15 i AsPC1, que expressen nivells alts de MDR1 o BCRP, respectivament. Aquestes dades suggereixen que la regulació de MDR1 o BCRP eludeix l'activitat biològica de AZD1152 i podria limitar la resposta clínica a aquest compost, particularment en pacients que han estat sotmesos a quimioteràpia prèvia o que són alternativament propensos a la MDR.

Resultats

Generació i caracterització de línies de carcinomes resistents a l'HQPA AZD1152

Es poden identificar alteracions genètiques en funció de la funció prognòstica de la resistència clínica a les molècules petites mitjançant un primer aïllament de cèl·lules que sobreviuen i proliferen en una concentració de droga altrament letal seguida per elucidació dels canvis moleculars subjacents. Per descobrir els mecanismes potencials que les cèl·lules canceroses poden utilitzar de manera autònoma a les cèl·lules per subvertir l’activitat dels inhibidors de les aurores cinases, es va intentar generar línies cel·lulars que fossin intrínsecament resistents al HQPA AZD1152. El carcinoma de còlon SW620 i les cèl·lules del carcinoma pancreàtic MiaPaCa es van propagar en presència de 1 μ M AZD1152 HQPA (50 vegades el valor IC 50 ) durant un període de 3 mesos. Menys del 0, 01% de les cèl·lules van sobreviure a aquest tractament després de cinc passatges (dades no mostrades). Les cèl·lules que van sobreviure a la fase inicial de selecció es van mantenir o bé en presència d’1 μ M AZD1152 HQPA durant 3 mesos addicionals o es van propagar en absència de fàrmac durant el mateix període. La seqüenciació directa d’ADN del gen Aurora B en les dues línies resistents als medicaments va confirmar que no s’havia produït cap mutació durant la selecció (no es mostren dades) com s’ha reportat per a les variants HCT116 resistents a ZM447439. A continuació, es va realitzar una anàlisi de microarrays a tot el genoma de les cèl·lules parentals i resistents a fàrmacs per identificar canvis d’expressió gènica que podrien estar correlacionats amb la resistència a l’HQPA AZD1152. Al derivat resistent al fàrmac SW620 (en endavant SW620 MDR1 / 3 ), ABCB1, que codifica MDR1, era el gen més altament sobreexpressat de la matriu i es va identificar per dos conjunts de sondes diferents (figura 1a). També vam observar que un segon gen, ABCB4, que codifica MDR3, també es regulava en SW620 MDR1 / 3, encara que no en la mesura de ABCB1. Entre els conjunts de gens que codifiquen els transportadors de molècules petites coneguts, ABCB1 i ABCB4 són els dos únics que mostren una expressió altament diferencial (figura 1b). L’aparent co-regulació d’ABCB1 i ABCB4 era curiós donat que aquests gens es troben juxtaposats dins d’un lloc genòmic comú al braç llarg del cromosoma 7 (7q21.1). Això va suggerir que la regió genòmica que compren ABCB1 i ABCB4 podria haver estat amplificada durant la selecció en AZD1152 HQPA, donant lloc a la sobreexpressió en tàndem d'aquests gens transportadors. Es va observar un augment en el nombre de còpies d’ADN tant per ABCB1 (cinc còpies) com per ABCB4 (tres còpies) en SW620 MDR1 / 3 en relació amb SW620 parental mitjançant anàlisi CGH (figura 1c). En SW620 MDR1 / 3, es van mantenir les alteracions del nombre de còpia d’ambdós gens als tres mesos després de la retirada de AZD1152 HQPA del medi de cultiu (figura 1c), cosa que indica que el fenotip de resistència implicava un esdeveniment genètic sostingut consistent amb l’amplificació gènica. El MDR1 estava altament regulat a nivell de proteïna en cèl·lules propagades en presència de AZD1152 HQPA i va persistir fins i tot després de treure la pressió de selecció (figura 1d).

Image
Image

Identificació de MDR1 i MDR3 com a gens amplificats en un derivat SW620 seleccionat per a resistència a la HQPA AZD1152. ( a ) Es van determinar els valors d’expressió de mRNA per a més de 14 000 gens més els EST (∼ 22 000 conjunts de sondes) mitjançant Generatoris d’Affymetrix HG-U133A. Les dades es presenten com el canvi de plec en l'expressió gènica de les cèl·lules SW620 MDR1 / 3 en comparació amb les cèl·lules SW620 parentals per a tots els gens la expressió dels quals augmenta de 10 vegades o més. ( b ) valors d'expressió de mRNA per ABCB1 i ABCB4 en comparació amb altres transportistes de soluts. ( c ) El nombre de còpies de ABCB1 i ABCB4 va ser determinat per CGH mitjançant xips Affymetrix 100 K SNP en SW620 parental, SW620 MDR1 / 3 i SW620 MDR1 / 3 després de 3 mesos en cultiu en un medi sense fàrmacs. La línia groga vertical indica la posició del locus ABCB1 i la línia rosada horitzontal indica el número normal de còpia d’ADN (dues còpies). Cinc còpies de l’ABCB1 van ser detectades per tres sondes, i tres còpies de l’ABCB4 van ser detectades per una sola sonda. ( d ) L’expressió relativa de la proteïna MDR1 es va determinar mitjançant l’anàlisi d’immunoblots. La β-actina es va utilitzar com a control de càrrega.

Imatge a mida completa

En el derivat MiaPaCa resistent al fàrmac (en endavant MiaPaCa BCRP ), ABCG2, que codifica BCRP, va mostrar una inducció de 98 vegades per anàlisi de microarray en comparació amb les cèl·lules parentals (figura 2a) i va ser l’únic transportador de molècules petites que mostrava una expressió diferencial substancial (figura 2b). Tot i que per CGH no es va detectar cap amplificació del gen ABCG2 (figura 2c), es va observar una inducció estable de la proteïna BCRP (figura 2d), que probablement fos funcional ja que s’expressava a nivells elevats a la superfície cel·lular de MiaPaCa. BCRP en comparació amb CD44, que era similar entre les línies parentals i resistents a les drogues (Figura 2e).

Image
Image

BCRP és el principal transportador d’eflues xenobiòtics regulat en un derivat MiaPaCa seleccionat per a la resistència a l’ HQPA AZD1152 . ( a ) Es va determinar l'expressió d'ARNm global en cèl·lules BCRP de MiaPaCa i es presenta tal com es descriu a la llegenda de la figura 1a. ( b ) valors d'expressió de mRNA per ABCG2 en comparació amb altres transportadors de soluts. ( c ) El nombre de còpia de ABCG2 va ser determinat per CGH mitjançant xips SNP Affymetrix 100 K en MiaPaCa parental, MiaPaCa BCRP i MiaPaCa BCRP després de 3 mesos en cultiu en un medi sense fàrmacs. La línia groga vertical indica la posició del locus ABCG2 i la línia rosada horitzontal indica el número normal de còpia d’ADN (dues còpies). Tres sondes es van detectar dues còpies de l’ABCG2. ( d ) Es va utilitzar com a control de càrrega de proteïnes l'expressió relativa de la proteïna BCRP detectada per immunitzats lisats de cèl·lules totals preparades a partir de cèl·lules de MiaPaCa o MiaPaCa BCRP β-actina. ( e ) L'expressió de BCRP a la superfície cel·lular de cèl·lules MiaPaCa i MiaPaCa BCRP es va determinar mitjançant la citometria de flux mitjançant l'anticòs primari anti-BCRP conjuntament amb un anticòs secundari anti-ratolí de cabra marcat amb PE (panell a l'extrema dreta). El marcatge PE en segon pla es va determinar mitjançant cèl·lules tenyides només amb anticossos secundaris marcats amb PE. L’anticòs anti-CD44 conjugat amb PE es va utilitzar com a taca general de la superfície cel·lular.

Imatge a mida completa

La sobreexpressió de MDR1 i BCRP són suficients per a la resistència de les cèl·lules tumorals al HQPA AZD1152

El derivat SW620 MDR1 / 3 requeria aproximadament 100 vegades més HQPA AZD1152 per inhibir la fosforilació del substrat Aurora B, la histona H3, que la línia parental (figura 3a). Com que el MDR1 és un transportador xenobiòtic de l’ATP, vam racionalitzar que AZD1152 HQPA pot ser eliminat per efluència del compartiment intracel·lular del SW620 MDR1 / 3, i això permetrà estalviar la fosforilació d’histona H3. Un medicament significatiu menys es va mesurar al citosol de la línia resistent en comparació amb les cèl·lules SW620 parentals mitjançant anàlisi LC-MS (figura 3b). PSC-833, un inhibidor de molècules petites de MDR1, 17, 18 i MDR3, 19 va ser eficaç per revertir la resistència de les cèl·lules SW620 MDR1 / 3 a AZD1152 HQPA (Figura 3c). Assumpció parcial de MDR1 (75%) amb siRNA parcialment restaurada inhibició de la fosforilació d'histona H3 per AZD1152 HQPA en SW620 MDR1 / 3 (Figura 3d), cosa que suggereix que la regulació de MDR1 és necessària per a una resistència completa a AZD1152 HQPA en aquest model. En comparació amb les cèl·lules parentals MiaPaCa, MiaPaCa BCRP també va requerir concentracions significativament més altes de HQPA AZD1152 per produir un nivell similar d'inhibició de la fosforilació d'histona H3 (Figura 4a). Fumitremorgin C, un inhibidor selectiu de BCRP, 20 va ser suficient per revertir la resistència a la HQPA AZD1152 en el derivat de MiaPaCa BCRP (Figura 4a). La supressió de BCRP amb siRNA també va revertir la resistència intrínseca de MiaPaCa BCRP a AZD1152 HQPA (Figura 4b) que indica que la regulació de BCRP està causada vinculadament a la resistència HQPA a AZD1152. Generalment, vam trobar que la supressió de MDR1 i BCRP mediada per siRNA era menys efectiva que la inhibició farmacològica per restablir la sensibilitat HQPA a AZD1152. Això pot explicar-se mitjançant la derrota incompleta de l'objectiu o per la presència de mecanismes addicionals no MDR1 o BCRP.

Image

La inhibició del MDR1 reverteix la resistència a la HQPA AZD1152 al derivat SW620 MDR1 / 3 . ( a ) SW620, SW620 MDR1 / 3 i SW620 MDR1 / 3 després de 3 mesos en cultiu en medis sense fàrmacs es van tractar amb AZD1152 HQPA en resposta a dosi durant 90 minuts. La fosforilació de l'histona H3 a Ser 10 es va determinar mitjançant una anàlisi immunoblot. ( b ) SW620 o SW620 MDR1 / 3 es van tractar amb 1 μ M AZD1152 HQPA durant 4 h. Les cèl·lules es fraccionaven i la concentració de HQPA de AZD1152 es va determinar mitjançant l’anàlisi LC-MS a la fracció de mostra respectiva. ( c ) Les cèl·lules SW620 MDR1 / 3 es van tractar durant 2 h amb DMSO o 1 μ M PSC-833 abans de AZD1152 HQPA en resposta a dosi durant 90 min. La fosforilació de la histona H3 es va determinar després per immunobloqueig. ( d ) L'efecte del derrocament de MDR1 en el derivat SW620 MDR1 / 3 es va avaluar transfectant Luciferasa (siLuciferasa) o MDR1 siRNA (siMDR1) seguida d'un tractament de les cèl·lules transfectades amb AZD1152 HQPA durant 90 min. L’anàlisi d’immunoblot de MDR1 indica que els nivells de proteïnes es van reduir al voltant d’un 75% amb siMDR1 en comparació amb siLuciferasa.

Imatge a mida completa

Image

La inhibició de BCRP reverteix la resistència a HQPA AZD1152 al derivat BCRP de MiaPaCa . ( a ) Les cèl·lules parentals MiaPaCa o MiaPaCa BCRP van ser tractades durant 2 h amb DMSO o 10 μ M de fumitremorgina C abans de AZD1152 HQPA en resposta a dosi durant 90 minuts segons es va indicar. La fosforilació de la histona H3 es va determinar després per immunobloqueig. ( b ) Les cèl·lules de MiaPaCa BCRP es van transfectar amb siLuciferasa o BCRP siRNA (siBCRP) seguit d'un tractament amb AZD1152 HQPA en resposta a dosi. El siRNA BCRP va disminuir l'expressió de BCRP en més del 90% en comparació amb la siLuciferasa.

Imatge a mida completa

La regulació MDR1 fa que el creixement del tumor sigui refractari a AZD1152

Es va estimar la concentració mínima d’intratumor de HQPA AZD1152 necessària per a la inhibició d’Aurora B mitjançant el càlcul del producte de la potència intrínseca de HQPA AZD1152 en SW620 o SW620 MDR1 / 3 (0, 02 o 2 μ M, respectivament) i la pèrdua de plecs en potència d’AZD1152 HQPA quan s’analitza en presència d’un 50% (v / v) de plasma de ratolí (la pèrdua de potència es deu probablement a la unió a proteïnes plasmàtiques; no es mostren dades). Basant-nos en aquesta predicció, cal assolir una concentració de llindar mínima de AZD1152 HQPA de 0, 1 o 10 μ M en els xenografs SW620 o SW620 MDR1 / 3, respectivament, per produir la inhibició de la fosforilació d'histona H3 (figura 5a, panell superior). La farmacocinètica del tumor es va avaluar després d’una administració única ip de AZD1152 HQPA durant un període de 24 hores després de la dosi. Aquesta anàlisi va demostrar una reducció del tumor global AUC de 0 a 24 h en els xenografs SW620 MDR1 / 3 (155 μ M h) en comparació amb la cohort parental (319 μ M h). A partir de la predicció esmentada, les concentracions de HQPA AZD1152 als tumors SW620 MDR1 / 3 van superar la concentració llindar mínima només per un període breu (∼ 6 h), mentre que en els tumors SW620 es van assolir concentracions superiors al llindar durant almenys 24 h (figura 5a, plafó inferior). De manera corresponent, només es va observar una inhibició transitòria de la fosforilació d'histona H3 a SW620 MDR1 / 3 en comparació amb tumors parentals (figura 5b). Com que la poliploidització és una manifestació de la inhibició de l'Aurora B durant la mitosi, es podria predir que AZD1152 ha d'estar present al llindar mínim de concentració prou llarg per permetre que les cèl·lules proliferades del tumor intentin una sola mitosi o, un període aproximadament equivalent a un cicle cel·lular ( 15-20 h). La inhibició sostinguda d’Aurora B en els xenografts SW620 parental és concomitant de l’activitat altament eficaç observada en aquest model, mentre que la inhibició transitòria observada en tumors SW620 MDR1 / 3 produeix poc o cap efecte antitumoral a qualsevol dosi (vegeu la figura 5b davant les figures 5c i d). Malauradament, les propietats tumorigèniques de MiaPaCa BCRP es van atenuar d’alguna manera durant la selecció in vitro i, per tant, ens van impedir valorar encara més la seva resposta a AZD1152 in vivo.

Image

Relació de farmacocinètica, farmacodinàmica i eficàcia de AZD1152 HQPA en SW620 vs SW620 MDR1 / 3 xenografts. ( a ) (panell superior) La concentració intratumora de llindar projectada necessària per inhibir la fosforilació histona H3 de xenograft es va calcular calculant el producte de la potència intrínseca de HQPA AZD1152 en un assaig de fosforilació d'histona H3 i la reducció de plecs en la potència de HZPA AZD1152 quan es va analitzar en presència del 50% de plasma (vv −1 ) del ratolí. (plafó inferior) La farmacocinètica intratumora de HQPA AZD1152 es va determinar a 0, 2, 8 i 24 h després de la dosi després d’una sola injecció intraperitoneal (ip) de 100 mg kg −1 . ( b ) Els ratolins de tumor establerts SW620 i SW620 MDR1 / 3 es van obtenir una dosi única de HQPA AZD1152 (100 mg kg −1, ip) i es van collir tres tumors per punt de temps. Es van extreure tumors i es van determinar els nivells de fosfat-histona H3 mitjançant la immunoblotatge del tumor SW620 (blau clar) i SW620 MDR1 / 3 (blau fosc) després del tractament amb AZD1152. Es van quantificar els immunoblots i les dades s’expressen com a zona sota la corba. També es presenten els valors mitjans a partir de punts de temps individuals. ± sem ( c i d ) SW620 i SW620 MDR1 / 3 es van injectar cèl·lules per via subcutània a ratolins scid- bg. Els tumors es van adaptar a la mida aproximadament de 300 mm 3 i es va iniciar el tractament amb AZD1152 el dia 7 després de la inoculació. AZD1152 es va administrar en un esquema qdx2 durant dos cicles (2 dies endavant, 5 dies de descans) a dosis de 50 o 100 mg / kg / d per injecció IP durant 2 setmanes. Cada punt representa la mitjana ± sd de 10 tumors.

Imatge a mida completa

La sobreexpressió de MDR1 o BCRP és pronòstic de la resistència in vitro i in vivo a AZD1152

Tenint en compte que, en aquests models, MDR1 / 3 i BCRP van proporcionar resistència a les propietats anticancerígenes de AZD1152 tant in vitro com in vivo , ens vam proposar constatar si la presència d’aquests gens de resistència inhibidors Aurora putatius era efectivament predictiva del tumor intrínsec. resistència. Primer es va consultar les dades d’expressió gènica interna d’un quadre de xenografts humans (dades no mostrades) per identificar models de tumor que presentaven nivells significativament elevats d’ABCB1, (MDR1) o ABCG2 (BCRP). Entre aquests models, es va confirmar HCT-15 i AsPC1 que expressaven MDR1 i BCRP altament expressats a nivell de proteïnes (Figura 6a). És important tenir en compte que l’HCT-15 no va mostrar cap regulació d’ABCB4 / MDR3 a nivell d’ARNm (dades no mostrades). A continuació, es van avaluar tres inhibidors representatius de l'Aurora kinasa, així com el paclitaxel, un conegut substrat de MDR1 21 però no de BCRP, 22 en formació de colònies i assajos de proliferació cel·lular en un panell de línia cel·lular que va incorporar HCT-15 i AsPC1. En general, la majoria de les línies cel·lulars eren molt sensibles a l’ AZQ1152 HQPA que mostrava valors de IC 50 dins del rang nanomolar baix (4-15 n M; figura 6b). En canvi, SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa BCRP, HCT-15 i AsPC1 van ser significativament resistents a aquest compost (valors IC 50 de 2, 1, 4 i 2, 2, 0, 63 μ M, respectivament). Curiosament, l’inhibidor de la panorà aurinasa, VX-680, va mostrar un perfil d’activitat similar al plafó de la línia cel·lular, tot i que el grau de resistència per SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa BCRP, HCT-15 i AsPC1 era relativament menor. Com es preveia, SW620 MDR1 / 3 i HCT-15, però no MiaPaCa BCRP o AsPC1 eren relativament insensibles al producte natural, el paclitaxel. No es va observar cap pèrdua aparent de potència per al compost selectiu d’Aurora A, MLN8054. És important destacar que totes les línies cel·lulars relativament sensibles a AZD1152 HQPA (SW620, MiaPaCa, HT1080, MDA-MB-231, HCT116, H1299, RS4; 11 i DoHH-2) van expressar quantitats detectables ni de MDR1 ni BCRP mitjançant anàlisi immunoblot. (Figures 6a i dades no mostrades). Vam confirmar que es requeria BCRP i MDR1 per resistència a la HQPA AZD1152 en HCT-15 i AsPC1, respectivament, mitjançant PSC-833 i fumitremorgina C (figures 6c i d).

Image

Les línies de cèl·lules que sobreexpressen el MDR1 o el BCRP són resistents a AZD1152 HQPA i VX-680 in vitro. ( a ) La immunoblotització de les línies cel·lulars utilitzades en estudis de xenograft mostra una expressió relativa de MDR1 i BCRP. ( b ) Es va avaluar un plafó de línies cel·lulars per a la sensibilitat relativa a AZD1152 HQPA, VX-680, MLN8054 i paclitaxel en una formació de colònies de 7 dies (línies adherides: SW620, SW620 MDR1 / 3, MiaPaCa, MiaPaCa BCRP, HT1080, MDA -MB-231, HCT116, H1299, HCT-15, AsPC1) o viabilitat (línies no adherents: RS; 411 i DoHH-2). Les cèl·lules es van tractar en dosi-resposta per determinar IC 50 s. ( c ) Les cèl·lules HCT-15 es van tractar amb DMSO o 1 μ M PSC-833 durant 1 h abans de l’addició d’ AZD1152 HQPA a les concentracions indicades durant una hora addicional. La immunofoblació de determinats de la histona H3 total i de la fosfo- (Ser 10 ) es va determinar. ( d ) Les cèl·lules AsPC1 van ser tractades amb DMSO o 10 μ M de fumitremorgina C durant 1 h seguida de AZD1152 HQPA tal com es descriu a c .

Imatge a mida completa

Quan el xenogravat en ratolins, AsPC1 era insensible a AZD1152 a una dosi que va suprimir completament el creixement del tumor SW620 (figures 7a i b). De la mateixa manera, el creixement dels xenografts de carcinoma de còlit HCT-15 no es va aconseguir amb el tractament amb AZD1152 o VX-680 (Figura 6e), mentre que ambdues teràpies van induir una inhibició important del creixement del tumor en HCT116, un model alternatiu de carcinoma de còlon (Figura 6d). com en els xenografts de limfoma de cèl·lules B de DoHH-2 (Figura 6c).

Image

Els xenografts que sobreexpressen BCRP o MDR1 són refractaris a AZD1152 in vivo . ( a i b ) SW620 ( a ) o AsPC1 ( b ) tumors es van adaptar a mida i es van administrar animals AZD1152 en un calendari setmanal de 50 mg / kg / d, ip, q2d. La dosificació es va dur a terme durant un període de tres setmanes durant el qual es va valorar el creixement del tumor. ( c - e ) DoHH-2 ( c ), HCT116 ( d ), o HCT-15 ( e ) els tumors es van coincidir amb la mida, i AZD1152 es va administrar a 100 mg / kg / d, ip, bid × 3 (o dos cicles per HCT-15, 3 dies i 4 dies de descans) o VX-680 a 50 mg / kg / d, ip, oferta per acabar (17 a 21 dies, segons quan s’arribi al punt final del tumor). Es va observar una eficàcia antitumoral significativa en SW620 (66% TGI AZD dia 28 ), DOHH-2 (89% TGI AZD dia 26 ; 64% TGI VX dia 26 ) i HCT-116 (71% TGI AZD dia 35 ; 65% TGI VX dia 35 ) dia 35 ), però no en AsPC1 que expressa BCRP (24% TGI AZD dia 42 ) o HCT-15 que expressa MDR-1 (10% TGI AZD dia 32 ; 5% TGI VX dia 32 ), P <0, 05, contra controls de vehicles . Durant la durada dels estudis mostrats a- e, no es van observar signes significatius de pèrdua de pes significativa, deshidratació, falta de preparació per a la preparació, etc. Les dades representen n = 7-10 ratolins / grup de tractament ± se

Imatge a mida completa

Discussió

Entendre els fonaments moleculars dels fenotips del càncer proporciona la base de medicaments “personalitzats” dirigits molecularment, que exploten susceptibilitat genètiques o epigenètiques identificables a la teràpia. Igual que és crucial comprendre la base genètica de la resistència a la teràpia, que ofereix un filtre addicional per estratificar una població potencial de pacients. A causa de la necessitat omnipresent de proliferar cèl·lules per a la progressió del cicle cel·lular, fins ara hi ha hagut poca evidència sobre una base genètica exquisida per a la sensibilitat als agents neocitotòxics dissenyats per orientar-se a diversos nodes essencials de la maquinària del cicle cel·lular. Les aurores cinases representen una classe d’aquest tipus d’objectius moleculars que són essencials per a la progressió mitjançant la mitosi, i els petits inhibidors de molècules d’aquestes quinases tenen una àmplia eficàcia antitumoral que encara no s’ha demostrat que discrimina sobre una base genètica del càncer. 7, 11 Tot i que s'ha demostrat que les cèl·lules canceroses deficients en p53 mostren una poliploidització accelerada quan es tracten amb VX-680, 23 no sembla que representin susceptibilitat genètica per si ja que les cèl·lules que alberguen p53 tipus salvatge també estan subjectes a cèl·lules mediades per la poliploidització. la mort, encara que potser amb cinètica retardada. Les nostres dades proporcionen evidència genètica per indicar que l’inhibidor d’Aurora kinasa, AZD1152, que actualment està en fase d’avaluació clínica i que potser d’un altre compost clínic, VX-680, pot ser relativament poc efectiu en cèl·lules tumorals que sobreexpressen MDR1 o BCRP. En aquest cas, els factors genètics que confereixen resistència estan relacionats amb la farmacologia del terapèutic en lloc de l'objectiu molecular. Això es basa en la constatació que l'inhibidor d'Aurora kinasa, MLN8054, és equipotent in vitro a concentracions que inhibeixen tant Aurora A com B independentment de l'estat de MDR1 o BCRP (Figura 6b). Recentment, Girdler et al. 16 es va informar de la identificació de diverses mutacions del domini de la cinasa Aurora B que sorgeixen durant la selecció de la línia de carcinoma de còlon defectuosa de la reparació de l'ADN, HCT116, a ZM447439. Aquestes mutacions de domini catalític també van ser suficients per fer que les cèl·lules siguin resistents a AZD1152 i VX-680, indicant que la resistència a aquests agents pot produir-se independentment del MDR.

El fenotip MDR observat en SW620 MDR1 / 3 resulta de la sobreexpressió de MDR1 i / o MDR3, associada amb el guany de número de còpia regional al locom genòmic que comprèn ABCB1 i ABCB4. L’associació d’un augment de l’expressió de MDR1 i d’un nombre de còpia augmentat s’ha informat en línies de cèl·lules de càncer de ovari resistents a paclitaxel adquirides 24 i línies cel·lulars de càncer de mama amb resistència a la doxorubicina, 25 i potser no és sorprenent, la co-regulació de MDR3 s’observa freqüentment quan MDR1 l'expressió és impulsada per l'amplificació gènica. 24, 25 Els medicaments utilitzats per produir fenotips de resistència en aquests estudis són efluits a partir de cèl·lules pel transportador MDR1, evidenciant l'avantatge selectiu atorgat per la regulació MDR1. Les dades generades mitjançant MiaPaCa BCRP demostren a més que es pot aconseguir resistència al AZQ1152 HQPA mitjançant una segona via genètica: la regulació de BCRP. És difícil reconciliar si això reflecteix un llinatge o una predisposició genètica, o bé és totalment estocàstica. És curiós, però, que en aquest estudi de les línies de cèl·lules resistents a l’HQPA AZD1152, s’observa la regulació de MDR1 en les línies de carcinoma de còlon (SW620 MDR1 / 3 i HCT-15), mentre que les línies de carcinoma pancreàtiques sobreexpressen BCRP (MiaPaCa BCRP i AsPC1) .

En contrast amb el MDR1, el BCRP ha estat relativament poc estudiat. Tot i que diversos laboratoris van ser identificats originalment com a gen de resistència a fàrmacs, 26, 27, 28, 29, encara no està clar el paper que té en la resistència clínica. Tot i que la selecció de les línies cel·lulars resistents al fàrmac s'ha observat una amplificació del gen ABCG2. L’ anàlisi 30, 31, 32 CGH no indica un canvi en el número de còpia d’ADN al lloc ABCG2 a MiaPaCa BCRP (Figura 2c). La reproducció de BCRP es pot produir independentment de l'amplificació gènica. Per exemple, es va demostrar que BCRP proporciona resistència a la cinasa depenent de la ciclina i a l’inhibidor d’Aurora kinasa, JNJ-7706621, en cèl·lules propagades en presència del fàrmac. Curiosament, tant l’expressió BCRP com la resistència a JNJ-7706621 es van revertir completament després de la retirada del fàrmac, 33 indicant que la resistència mediada per BRCP no necessita una alteració genòmica. L’activació dels receptors d’hormones nuclears 34 i la metilació promotora 35 s’han demostrat per controlar la transcripció de BCRP. Una altra capa de complexitat reguladora deriva d’estudis de resistència a la doxorubicina en què s’ha demostrat que l’especificitat del substrat del BCRP murí s’ha vist alterada per la mutació puntual. 36 La causa precisa de la regulació de BCRP a MiaPaCa BCRP no està clara. Tot i això, les nostres dades suggereixen que un esdeveniment genètic durador que tingui com a resultat l’activació transcripcional d’aquest transportador xenobiòtic podria donar compte de la seva expressió i manteniment estables del fenotip resistent al fàrmac a MiaPaCa BCRP .

Una de les estratègies per superar el MDR ha estat inhibir el transportador (s) rellevant (s) amb antagonistes de molècules petites que competeixen per la unió del substrat. Tot i que històricament aquest enfocament ha donat poc èxit clínic, els primers prototips d'aquesta classe d'inhibidors mostraven interaccions farmacocinètiques imprevisibles amb quimioteràpies administrades, limitant la capacitat de definir la finestra terapèutica de la combinació. Actualment s’estan avaluant nous inhibidors de molècules petites del MDR que mostren una major especificitat alhora que minimitzen el potencial d’interaccions medicament-fàrmac. 37 Altres enfocaments per neutralitzar el MDR impliquen la intervenció al nivell d’expressió de gens transportadors d’ABC inclosos inhibidors de receptors d’hormones nuclears que impulsen l’expressió de transportadors de xenobiòtics, oligonucleòtids antisens, siRNA o teràpies basades en ribozims. Tot i això, aquestes estratègies són col·lectivament experimentals. Les nostres dades confirmen, in vitro , el principi d’utilitzar molècules petites (figures 3c, 4a i 6c i d) o siRNA (figures 3d i 4b) per obviar la funció transportadora ABC com a mitjà per resensibilitzar les cèl·lules resistents als fàrmacs a AZD1152 HQPA . En darrer terme, el disseny racional dels inhibidors de l'Aurora kinasa que l'activitat no està influenciada pel MDR hauria de provocar les molèsties per a les dificultats associades a la coadministració d'un agent de reversió del MDR.

Accessions

GenBank / EMBL / DDBJ

  • E-MEXP-1008
  • GSE7068

Dualitat d’interès

Els autors declaren no tenir interessos financers competitius.