Millorar el rendiment de cèl·lules tumorals circulants facilita la caracterització molecular i el reconeixement de l’amplificació discordant d’her2 en el càncer de mama | diari britànic de càncer

Millorar el rendiment de cèl·lules tumorals circulants facilita la caracterització molecular i el reconeixement de l’amplificació discordant d’her2 en el càncer de mama | diari britànic de càncer

Anonim

Temes

  • Càncer
  • Amplificació gènica
  • Biomarcadors tumorals

Aquest article s'ha actualitzat

Resum

Antecedents:

Les cèl·lules tumorals circulants (CTCs) ofereixen un enfocament no invasiu per obtenir i caracteritzar cèl·lules tumorals metastàtiques, però la seva utilitat s’ha vist limitada pels baixos rendiments de CTC dels mètodes d’aïllament convencionals.

Mètodes:

Per millorar els rendiments de CTC i facilitar la seva caracterització molecular, vam comparar el Kit d’epitelials CellSearch (CEK) aprovat per l’administració d’aliments i fàrmacs amb un mètode simplificat de captura de CTC, CellSearch Profile Kit (CPK), amb mostres de sang aparellades de pacients amb pit metastàtic ( n = 75) i càncer de pulmó ( n = 71). Els marcadors moleculars que inclouen el factor de creixement epidèrmic humà Receptor 2 (HER2) es van avaluar en CTC per fluorescència hibridació in situ (FISH) i comparat amb càncer primari i metastàtic dels pacients.

Resultats:

El nombre mitjà de cèl·lules de pacients amb càncer de mama mitjançant CPK va ser de 117 vs 4 per CEK ( P <0, 0001). Les mostres de càncer de pulmó eren similars; CPK: 145 cel·les vs CEK: 4 cel·les ( P <0, 0001). Les CTC recuperades eren relativament pures (60-70%) i eren evaluables per FISH i immunofluorescència. Un total de 10 de 30 (33%) pacients de càncer de mama amb HER2 i teixit metastàtic negatiu HER2 tenien CTCs amplificades per HER2.

Conclusió:

El mètode CPK proporciona un alt rendiment de CTC relativament pur, facilitant la seva caracterització molecular. Les cèl·lules tumorals circulants obtingudes mitjançant la tecnologia CPK demostren que existeix discordança significativa entre l’amplificació HER2 de les CTCs d’un pacient i la del tumor primari i metastàtic.

Principal

La necessitat d’accés a mostres de càncer metastàtic i la dificultat inherent per obtenir-les mitjançant biòpsies convencionals, ha provocat l’interès per fonts alternatives de cèl·lules metastàtiques. Una d'aquestes alternatives és analitzar cèl·lules tumorals circulants (CTCs). Es creu que les cèl·lules tumorals que circulen són bastant rares a la sang de la majoria dels pacients amb malaltia metastàtica: s’ha estimat que estan presents a una freqüència d’1 de cada 10 9 cèl·lules sanguínies (Mostert et al, 2009). Les cèl·lules tumorals que circulen proporcionen la capacitat potencial de controlar la malaltia metastàtica, informació pronòstica i un mitjà per realitzar interrogatoris moleculars no invasius de càncers, ja que aquestes cèl·lules poden proporcionar una instantània molecular, o biòpsia en temps real, de cèl·lules tumorals. Les cèl·lules tumorals que circulen també es poden utilitzar per determinar els mecanismes de resistència adquirida a teràpies dirigides, que només es produeixen o evolucionen durant el tractament del fàrmac. La capacitat d'aïllar un nombre relativament gran de CTC pur és necessària per a aquestes aplicacions aigües avall.

Les cèl·lules tumorals en circulació s’han acceptat cada cop més com a factor pronòstic independent i com a marcador de resposta terapèutica i s’han intentat estandarditzar el seu aïllament i caracterització (Hayes i Smerage, 2008). El sistema automatitzat de CellSearch (Veridex; Warren, NJ, EUA) és el primer mètode que ha estat aprovat clínicament per la Food and Drug Administration dels Estats Units per capturar i detectar CTC. Aquest sistema es basa en un aïllament immunomagnètic seguit per l’anàlisi de microscòpia de fluorescència. Actualment hi ha disponibles dos mètodes de preparació de mostres diferents, però relacionats, el CellSearch Epithelial Cell Kit (CEK) i el CellSearch Profile Kit (CPK). Ambdós mètodes utilitzen una selecció immunomagnètica positiva amb anticossos anti-epitelials de molècules d’adhesió unides a partícules de ferro per enriquir-se per a les CTC. En el sistema CEK, les cèl·lules capturades són permeabilitzades i etiquetades amb anticossos citoceratina i específics de CD45, i la taca nuclear 4’-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), i s’analitzen mitjançant un recompte semiautomatitzat de CTCs marcats adequadament ( Riethdorf et al, 2007). En canvi, el procediment CPK no implica l’etiquetatge ni l’enumeració de les cèl·lules, sinó que només utilitza l’anticòs anticipític d’adhesió de cèl·lules acoblat a partícules de ferro per produir una població enriquida de CTCs, que es pot utilitzar per a anàlisis moleculars. Tot i això, en contrast amb el mètode CEK, el procediment CPK no està aprovat per a l'administració clínica per a l'administració d'aliments i medicaments.

La limitació principal del sistema CEK és el baix rendiment de CTCs. En diversos assajos clínics de pacients amb càncer de mama metastàtic, el nombre mitjà de CTCs aïllats va ser de cinc per 7, 5 ml de sang (Budd et al, 2006; Hayes i altres, 2006; Hayes i Smerage, 2008). Tot i que el nombre baix de CTCs són suficients per proporcionar informació de pronòstic clínic, en la qual s’utilitza un tall de 5 CTC per 7, 5 ml de sang per delimitar una població amb pronòstic deficient, la capacitat de realitzar anàlisis moleculars dels CTCs és limitada. A més, s'ha informat que el grau de contaminació per leucòcits mitjançant el sistema CEK és bastant elevat, cosa que complica encara més les anàlisis moleculars de les CTC. Aquestes limitacions han provocat el desenvolupament de mètodes d’aïllament alternatius de CTC, incloent tecnologies basades en la filtració de mida, gradients de densitat i tècniques microfluídiques, que han demostrat un augment dels rendiments de CTC (Vona et al, 2000; Nagrath et al, 2007; Adams et al., 2008; Williams et al, 2009). Per exemple, s’ha desenvolupat una tecnologia CTC basada en xips microfluídics, que aïlla un nombre relativament elevat de CTCs i es pot utilitzar per detectar mutacions no receptives i sensibles a fàrmacs i receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) de pulmons de cèl·lules no petites. pacients amb càncer (NSCLC) (Nagrath et al, 2007; Maheswaran et al, 2008). Aquest mètode utilitza anticossos específics per a molècules d’adhesió de cèl·lules epitelials que es conjuguen a posts dins del xip CTC. Actualment, aquest sistema està limitat per la manca de disponibilitat generalitzada del sistema, la incapacitat per alliberar les CTC dels llocs microfluídics, el temps de processament prolongat (les mostres s’executen en 1-2 ml h –1 ) i el requisit que les mostres siguin processades. a les poques hores de recollida (Nagrath et al, 2007).

Per abordar algunes de les limitacions dels sistemes CTC actuals, vam valorar el sistema CPK com a mètode per aïllar i estudiar CTCs. Inesperadament, aquest mètode va donar lloc a un aïllament de> 20 vegades més CTC que el mètode CEK. Hem caracteritzat més la puresa dels CTC aïllats i els hem avaluat mitjançant immunofluorescència (IF) i fluorescència hibridació in situ (FISH). Els nostres resultats suggereixen que una modificació en l'ús del sistema CellSearch actual pot donar lloc a un augment significatiu de la capacitat d'aïllar i caracteritzar CTC de pacients amb càncer de mama i NSCLC.

Materials i mètodes

Pacients

Entre desembre del 2007 i març del 2009 es van identificar pacients amb NSCLC metastàtic ( n = 71) o càncer de mama metastàtic ( n = 75) a les clíniques d’Oncologia Toràcica i Càncer de Dona del Dana Farber Cancer Institute. Les característiques dels pacients es descriuen a la taula complementària S1. La sang es va recollir de cada donant als tubs de recollida de sang CellSave (Veridex) o a tubs d’àcid etilenediaminetetraacètic (EDTA), on s’especifica. Les mostres de sang es van mantenir a temperatura ambient i es van processar en un màxim de 72 h després de la recol·lecció. Totes les mostres de pacients amb càncer de mama es van obtenir en el moment en què iniciaven una nova teràpia per al tractament de la seva malaltia. Totes les mostres de pacients amb NSCLC es van obtenir mentre el pacient actualment estava sota teràpia. Les mostres de sang de control es van extreure de voluntaris sans amb antecedents de malalties malignes. Tots els pacients van proporcionar el seu consentiment per escrit i els estudis van ser aprovats per la Junta de Revisió Institucional del Dana Farber Cancer Institute (IRB).

Processament i recompte de mostres

Les mostres es van processar mitjançant el mètode CEK, incloent el recompte semiautomatitzat, segons les instruccions de la fabricació (Johnson & Johnson, 2008). Les mostres processades mitjançant el mètode CPK (segons les instruccions de fabricació, (Johnson i Johnson, 2008)) es van recollir en un tampó de dilució (solució salada tamponada amb fosfat, albumina sèrica del 0, 5% bovina i 0, 1% azida de sodi) i es van transferir immediatament a les diapositives de vidre com a preparacions de citosfina. utilitzant una ThermoFisher Cytospin 3. La centrifugació es va realitzar a 500 g durant 5 min amb un embut de citologia, un filtre prim (Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) i una diapositiva SuperFrost Plus (Thermo Fischer Scientific). Les cèl·lules de la diapositiva de citospina resultant es van fixar amb metanol per IF o immunohistoquímica o es van fixar amb metanol: àcid acètic (3: 1) per a PEIX. Les cèl·lules es van tacar amb antico citocerina ficoerythrin / DAPI / CD45-allophycocyanin (Dako, Carpinteria, CA, EUA) i després es van contar manualment mitjançant un microscopi fluorescència estàndard (Olympus, Center Valley, PA, EUA). La tinció de citokeratina es va considerar positiva quan les cèl·lules mostraven una tinció citoplasmàtica citoplasmàtica inequívoca en un patró similar a l'anell (que confirma un citoplasma intacte) que envolta un nucli intacte.

Línies i reactius cel·lulars

La línia cel·lular de càncer de mama SK-BR-3 es va obtenir a la American Type Culture Collection. La línia cel·lular mutant EGFR (del E746_A750) NSCLC, HCC827, ha estat descrita anteriorment (Mukohara et al, 2005). Les dues línies cel·lulars es van cultivar a l'Àguila Modificada de Dulbecco o al Roswell Park Memorial Institute 1640 (CellGrowth, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) respectivament, complementades amb un sèrum boví fetal del 10%. Gefitinib i lapatinib es van obtenir a partir de fonts comercials. Les solucions existents de tots dos fàrmacs es van preparar en sulfuròxid de dimetil i es van conservar a -20 ºC. Per a experiments de recuperació in vitro es van cultivar cèl·lules SKBR3 en DMEM amb 10% sèrum boví fetal, 10 μ g ml –1 EGF i 1, 5 m ML-glutamina. Les cèl·lules HCC287 es van cultivar en ACL4 (Invitrogen, Life Technologies) amb un sèrum boví fetal al 10%. Per a mètodes detallats, vegeu Mètodes suplementaris.

Hibridació fluorescència in situ (FISH)

Les sondes EGCR / CEP 7 i el factor de creixement epidèrmic humà Receptor 2 (HER2) / Centromere Probe 17 (CEP17) han estat obtingudes a partir de Vysis Molecular (Abbot Park, IL, EUA). El factor de transició mesenquimal-epitelial (MET) (RP11-95I20) es va obtenir de CHORI (Children Oakland Research Hospital, Oakland, CA, EUA). L’etiquetatge es va fer amb el Nick Translation Kit (Vysis, Abbott Molecular, Des Plaines, IL, EUA). Vegeu dades suplementàries per a mètodes detallats d’anàlisi de FISH de CTC, i per a mètodes de tinció de IF i immunohistoquímica.

Resultats

El mètode CPK aïlla un nombre més gran de cèl·lules que el mètode CEK

Hem estimat que es poden perdre CTCs en els passos addicionals de permeabilització, etiquetatge i rentat específics per al mètode CEK, especialment si els CTC són més 'fràgils' que altres tipus cel·lulars. Per comparar directament el rendiment de cèl·lules aïllades mitjançant procediments CEK i CPK, vam recollir dues mostres de sang perifèrica de pacients amb càncer de mama metastàtic ( n = 75) i NSCLC ( n = 71), i les vam processar en paral·lel. Les cèl·lules obtingudes mitjançant el mètode CPK es comptaven manualment i es comparaven amb els comptes CEK estàndard obtinguts mitjançant el sistema CellSearch. El nombre mitjà de cèl·lules de pacients amb càncer de mama mitjançant el mètode CPK va ser de 116, 5 per 7, 5 ml de sang (rang 4-2432) en comparació amb 4 (rang 0–57) mitjançant el mètode CEK ( P <0, 0001, figura 1A). El nombre de cèl·lules mitjanes de pacients amb NSCLC processats mitjançant el mètode CPK va ser de 145 per 7, 5 ml de sang (rang 5-1801) en comparació amb 4 (rang 0–53) mitjançant el procediment CEK ( P <0, 0001; Figura 1B). També vam comparar aquestes troballes per pacient (figures suplementàries S1A i B) i vam demostrar que per a tots els pacients, el recompte de cèl·lules pel mètode CPK supera el nombre de cèl·lules pel mètode CEK (càncer de mama: R 2 = 0.004919; càncer de pulmó : R 2 = 0, 006952). Per determinar si les diferències de rendiment observades entre els mètodes CEK i CPK es deuen a diferències en el mètode de comptatge cel·lular (manual davant semiautomàtic), vam comparar els recomptes de CTC obtinguts mitjançant el mètode CEK automatitzat amb el d’un recompte de cel·les manual del. mateixa mostra. El recompte manual de CEK es va realitzar traient les mostres enumerades dels cartutxos 'MagNest', processant-les com a preparacions de citosfina i comptant-les manualment. En pacients ( n = 75 pacients; 100 mostres) amb càncer de mama (figura suplementària S1E), el nombre de cèl·lules mitjanes mitjançant el mètode CEK semiautomatitzat va ser de 4 per 7, 5 ml de sang (rang 0–57) en comparació amb 5 per 7, 5 ml. de sang (rang 0–61) quan es van comptabilitzar manualment els exemplars processats amb CEK ( P = NS). De la mateixa manera, en pacients amb NSCLC ( n = 71 pacients; 100 mostres), el recompte de cèl·lules mitjanes mitjançant el mètode CEK semiautomatitzat va ser de quatre per 7, 5 ml de sang (rang 0–53) en comparació amb cinc per 7, 5 ml de sang (rang 5 –67) quan es van comptabilitzar manualment els exemplars processats CEK ( P = poc significatiu; figura suplementària S1F). A més, vam comparar aquestes troballes per pacient (figures suplementàries S1C i S1D) i vam observar una forta correlació entre els recomptes de cèl·lules obtingudes mitjançant el mètode CEK semiautomatitzat amb el mètode CEK manual (exemplars de càncer de mama: R 2 = 0.9930; pulmó) exemplars de càncer: R 2 = 0, 7200). En conjunt, els nostres resultats suggereixen que el mètode CPK aïlla un nombre més gran de cèl·lules que el mètode CEK i que aquestes troballes no es deuen a diferències en el mètode de recompte de cèl·lules.

Image

El mètode CPK millora els rendiments cel·lulars amb el mètode CEK. Les mostres de sang de pacients amb ( A ) càncer de mama ( n = 75) o ( B ) NSCLC ( n = 71) processades en paral·lel pel mètode CEK amb quantificació semiautomatitzada (columnes obertes) o el mètode CPK amb quantificació manual ( columnes tancades).

Imatge a mida completa

El mètode CPK aïlla una població molt enriquida de CTC

Una explicació del rendiment millorat observat amb el mètode CPK és que les cèl·lules aïllades no són tots els CTC, sinó una barreja de CTCs i leucòcits contaminants. Aquesta determinació és fonamental si s’han d’utilitzar les cèl·lules aïllades per a qualsevol anàlisi posterior. Per determinar la composició de les cèl·lules aïllades mitjançant el mètode CPK, es va realitzar IF mitjançant anticossos anti-CD45 i anti-citoceratina (AE1 / AE3) en 30 pacients amb càncer de mama i 30 pacients amb càncer de mama. Es van observar tres poblacions de cèl·lules diferents: (1) CD45 positiva, citoceratina negativa, (2) CD45 negativa, citoceratina positiva i (3) cèl·lules negatives tant per a CD45 com per a citoceratina però tenyides amb la taca nuclear DAPI (Figura 2C). Aproximadament el 60% de les cèl·lules aïllades per CPK (rang: 21-95%) es van identificar com a cèl·lules tumorals mitjançant una tinció de citoceratina, mentre que un 6% (rang: 1-22%) es van identificar com a glòbuls blancs (WBCs) per tinció de CD45 (Figura 2A i dades no mostrades). Aquests percentatges corresponen a un nombre absolut mitjà de cèl·lules positives de citoceratina de 280 per mostra (rang 20-20 000) i una mitjana de 34 (entre 20 i 476) cèl·lules positives CD45 per mostra. El restant 32% (rang: 5-68%) de cèl·lules tenyides només amb DAPI i no es podrien classificar com a cèl·lules tumorals ni leucòcits. Com a enfocament complementari, es va utilitzar la classificació de cèl·lules activades per fluorescència en 11 pacients (vuit NSCLC i tres de càncer de mama) per comparar les poblacions de CTCs amb els WBCs (Figura 2B). Els resultats eren similars per a la citoceratina (mitjana positiva: 61%; rang 35-77%), excepte que la freqüència dels globus blancs es va estimar que era encara menor (mitjana positiva: 1%; rang 0–7%) que per IF (comparar la figura 2A i B).

Image

El mètode CPK aïlla una població molt enriquida de CTC. Percentatge de cèl·lules totals capturades pel mètode CPK de pacients amb NSCLC, tinció per a citoceratina (AE1 / AE3), CD45, o tinció nuclear DAPI sola per immunofluorescència o ( B ) FACS. Es van observar resultats similars amb mostres de pacients amb càncer de mama. ( C ) Imatge representativa d’immunofluorescència de cèl·lules capturades amb CPK del pacient amb NSCLC, etiquetada amb citoceratina (verda), DAPI (blau) i CD45 (vermell).

Imatge a mida completa

Com a mètode addicional per avaluar la naturalesa de les cèl·lules aïllades mitjançant el mètode CPK, vam realitzar FISH mitjançant sondes per a HER2 , EGFR i MET . Tenint en compte que la mitjana del 32% de les cèl·lules tenien membranes denudades (cèl·lules només DAPI; figura 2A) i, per tant, no es podia tacar definitivament per a la citoceratina, la identificació de aneuploïdia i / o amplificació gènica en una fracció alta de les cèl·lules suggeriria fortament que algunes o totes aquestes cèl·lules eren CTCs i no WBCs (Figures 3A i B). Entre els CTC de pacients amb càncer de mama clínicament definits com a HER2 positius a partir d’anàlisis dels seus tumors primaris (FISH + i / o IHC 3+ per proves locals, n = 24), el 72% de totes les cèl·lules capturades tenien un número de còpia HER2 gene4. . Aquest llindar s’ha utilitzat com a indicador d’amplificació HER2 en estudis anteriors (Meng et al, 2004). Només el 3% de les cèl·lules tenien dues còpies d’ HER2 . En sis pacients addicionals amb càncer de mama negatiu HER2 clínicament definit, només el 5% de les cèl·lules capturades tenien 4 còpies de HER2 (figura 3D). En canvi, la majoria (95%) de cèl·lules en aquells pacients tenien un número de còpia genètica HER2 de 2 (Figura 3D). De la mateixa manera, entre les mostres de pacients amb NSCLC ( n = 30), el 53% tenia 4 còpies de EGFR i el 13% tenien 4 còpies CEP 7 (Figura 3C). Només una minoria de cèl·lules (5%) tenia dues còpies de EGFR i CEP 7.

Image

L’anàlisi FISH confirma que les mostres processades pel mètode CPK tenen un percentatge baix de contaminants de cèl·lules normals. Imatges FISH representatives de cèl·lules processades pel mètode CPK, limfòcit ( A ) amb dues còpies de CEP7 (verd), EGFR (vermell) i MET (blau), ( B ) CTC amb EGFR i MET amplificats. ( C ) Percentatge de cèl·lules totals capturades pel mètode CPK de pacients amb NSCLC amb 4 còpies de EGFR, CEP7 i MET per nucli. ( D ) Percentatge de cèl·lules totals capturades pel mètode CPK de pacients amb càncer de mama HER2-positiu (número 1–24) o HER2-negatiu (número 25-30 de pacient) amb les còpies indicades de HER2 per nucli.

Imatge a mida completa

Com a control addicional, es van analitzar 40 mostres de voluntaris sans amb antecedents de malalties malignes. No s’han trobat cèl·lules tumorals ni amb l’enumeració semiautomàtica CEK ni amb el recompte manual CPK (figura suplementària S2A). En les mostres processades mitjançant el mètode CPK, el nombre mitjà de cèl·lules va ser de cinc per 7, 5 ml de sang (rang: 0–50). Aquestes cèl·lules van ser positives per a CD45 i negatives per a citoceratina mitjançant IF, amb només dues còpies gèniques de CEP7 / EGFR o HER2 detectades per l'anàlisi FISH, coherent amb el WBC normal. Col·lectivament, aquestes dades indiquen que la majoria de cèl·lules capturades pel sistema CPK són, de fet, CTCs amb només una minoria de cèl·lules que són WBC.

Totes les mostres descrites es van preparar mitjançant el mètode de citosfina de baixa velocitat mitjançant un embut de citologia únic amb filtre prim (vegeu la secció Materials i mètodes). També es van avaluar altres tècniques per a la preparació de diapositives, inclosa la citospina d’alta velocitat, diferents tipus d’embut, una preparació prima o bloc cel·lular i aplicar les mostres a diapositives directament com a frotis. En una anàlisi comparativa, el mètode de citosfina de baixa velocitat va produir el màxim rendiment, amb la menor contaminació, el menor dany cel·lular i la menor variació diapositiva a diapositiva en comparació amb altres diversos mètodes (dades no mostrades).

El mètode CPK presenta una baixa variabilitat empresarial i les mostres són estables durant almenys 72 h

A continuació, vam examinar si el nombre de cèl·lules aïllades de pacients amb càncer mitjançant el mètode CPK va ser reproduïble i estable al llarg del temps. Primer hem obtingut tres mostres de cadascun dels set pacients amb NSCLC al mateix moment i les hem processat en paral·lel. El nombre de cèl·lules aïllades va ser similar (figura suplementària S3C) amb un coeficient de variabilitat baix (CV: 9, 7%). També es va avaluar l'impacte del temps en la capacitat d'aïllar CTCs mitjançant el mètode CPK. Com que molts assajos clínics impliquen múltiples centres, és important determinar l'estabilitat de mostres no processades per determinar si el rendiment de CTCs disminueix amb el pas del temps. Per a aquests estudis, vam recollir tres tubs CellSave (LLC, una empresa Johnson & Johnson, Raritan, NJ, EUA) o EDTA de set pacients amb NSCLC i vam incubar les mostres a temperatura ambient durant 24–72 h abans de processar-les mitjançant el mètode CPK. Es va avaluar específicament la recollida de sang tant en els tubs CellSave com EDTA per determinar l’impacte del fixatiu (present als tubs CellSave; absent als tubs EDTA) sobre l’impacte de la recuperació cel·lular al llarg del temps. Vam aïllar números similars de cèl·lules utilitzant tant els tubs CellSave (figura suplementària S3A) com EDTA (figura suplementària S3B). No es va produir un descens significatiu (coeficient de variació (CV) 9, 1% i CV 6, 5%) en el nombre de cèl·lules aïllades amb qualsevol dels dos mètodes durant el període de 72 hores i no es va reduir el nombre de cèl·lules aïllades dels tubs CellSave incubats a temperatura ambient. fins a 144 h (figura suplementària S3A i dades no mostrades). Tot i això, es va produir un descens significatiu del nombre de cèl·lules aïllades dels tubs EDTA incubats a temperatura ambient durant 96 hores abans del processament mitjançant el mètode CPK.

El tractament afecta el rendiment de recuperació cel·lular

Estudis anteriors han trobat que quan les línies de cèl·lules tumorals són espigolades a la sang i aïllades mitjançant el mètode CEK, la taxa de recuperació cel·lular és alta (85-95%; Riethdorf et al, 2007). Tot i això, els rendiments reals de CTC de pacients amb càncer mitjançant el mètode CEK són limitats (Sleijfer et al, 2007). Es va plantejar la hipòtesi que una explicació dels baixos rendiments observats en la pràctica clínica és que les CTC són més 'fràgils' que les línies cel·lulars de càncer, ja sigui per apoptosi o perjudicis adquirits durant el trànsit a través del torrent sanguini i, per tant, no es capten de manera eficaç amb l'anti- anticossos i / o es perden molècules d'adhesió de cèl·lules epitelials en els passos de rentat i etiquetatge post-captura. Per investigar aquesta possibilitat, es van examinar les cèl·lules de càncer de mama (SKBR3; HER2 amplificat) i de càncer de pulmó (HCC827; EGFR del E746_750), ja sigui sense processar o punxades a sang normal, i després es van processar amb els mètodes CPK o CEK. Les cèl·lules foren pretractades amb lapatinib inhibidor de EGFR / HER2 (SKBR3) o gefitinib inhibidor de EGFR (HCC827) per induir apoptosi o no es tractaven. Les cèl·lules es van tacar després amb Ki67 o Apoptosis Detection mitjançant Terminal Transferase i Biotin-16-dUTP (TUNEL) per avaluar les cèl·lules proliferadores i apoptòtiques, respectivament. Com era d’esperar, les cèl·lules no processades van demostrar taxes d’augment d’apoptosi i disminució de la proliferació quan es tractaven amb un inhibidor (figura 4C). Curiosament, no es van observar cèl·lules apoptòtiques a les mostres processades amb el mètode CEK ni en mostres no tractades ni tractades, tot i que les cèl·lules tractades capturades per aquest mètode tenien nivells reduïts de tinció de Ki67, coherent amb l’efecte de l’inhibidor (figura 4A ). En mostres processades amb el mètode CPK, es va recuperar un petit percentatge de cèl·lules positives TUNEL en les mostres no tractades, que van augmentar amb el tractament amb inhibidors, tot i que no fins al nivell de mostres no processades (figura 4B).

Image

Els CTC apoptòtics són menys efectivament capturats mitjançant mètodes CEK o CPK. Cèl·lules SKBR3 (HER2 + càncer de mama) o HCC827 (EGFR mutant NSCLC) tractades amb vehicle o inhibidor de tirosina quinasa (SKBR3: 1 μ M lapatinib i HCC827; 1 μ M gefitinib) durant 24 h i processades amb ( A ) mètode CEK. ( B ) mètode CPK o ( C ) fregat directament sobre diapositiva sense processar. Les parcel·les representen el percentatge de tinció de cèl·lules (± 1 sd) per immunohistoquímica a Ki67 (barres obertes, marcador de proliferació) o TUNEL (barres tancades, marcador d'apoptosi). ( D ) Percentatge de CTC processats per CPK de pacients amb coloració positiva de NSCLC per KI67 i TUNEL. ( E ) Comparació de l'expressió KI67 en CTCs recuperada mitjançant mètodes CEK o CPK.

Imatge a mida completa

També es va avaluar la freqüència de les cèl·lules tenyidores de Ki67 i TUNEL aïllades de set pacients amb NSCLC mitjançant el mètode CPK. La freqüència de les cèl·lules tenyidores de TUNEL era baixa (mitjana 1, 9%; rang 0–6, 4%) similar a la observada a les línies cel·lulars SKBR3 i NSCLC (Figura 4D). La freqüència de les cèl·lules que tenien Ki67 també va ser menor (mitjana del 0, 7%; rang 0, 3-1, 2%) en les CTC de pacients amb càncer en comparació amb els nivells vistos amb línies cel·lulars (figura 4D). Quan es van processar mostres paral·leles mitjançant el mètode CEK, no es van detectar cèl·lules positives TUNEL, però la fracció de cèl·lules positives de Ki67 va ser numèricament superior a la de les mostres processades amb CPK (Figura 4E). Aquesta observació és coherent amb la hipòtesi que les cèl·lules apoptòtiques i no proliferadores més “fràgils” es perden de manera desproporcionada pel mètode CEK més intens. Tot i això, a causa del reduït nombre de cèl·lules recuperades, no es va poder fer una comparació definitiva. Juntament amb les dades obtingudes a partir de les línies cel·lulars, aquestes troballes suggereixen que els CTC sotmesos a apoptosi en el flux sanguini, ja sigui de manera espontània o com a resultat de l'efecte del tractament, poden ser massa fràgils per sobreviure al pas de captura i / o ser eliminats durant el processament posterior d'exemplars . Aquest efecte sembla ser més intens amb el mètode CEK que el mètode CPK i pot ajudar a explicar l’augment de rendiments de CTC vist amb aquesta última tècnica. Aquestes observacions també poden ajudar a explicar per què les tècniques alternatives de captura de CTC, com els xips microfluídics o els sistemes de microfiltració que minimitzen el nombre d’etapes d’etiquetatge i rentat s’associen a un augment del rendiment de CTC sobre el mètode CEK.

Caracterització de l'amplificació HER2 de CTCs mitjançant anàlisi FISH

Diversos petits estudis han reportat diferents graus de discordança entre l’estat HER2 de CTC de càncer de mama d’un pacient i el del seu tumor primari (Meng et al, 2004; Wulfing et al, 2006; Pestrin et al, 2009). No hi ha dades que examineu la relació entre l'estat HER2 de les CTCs i el del teixit metastàtic. Es va plantejar la hipòtesi que la capacitat de la tecnologia CPK de proporcionar un nombre relativament elevat de CTCs i permetre una anàlisi FISH robusta facilitaria la determinació de la relació entre l’estat HER2 d’un càncer de mama primari dels pacients, lesions metastàtiques i CTC. Per provar aquesta hipòtesi, es va valorar la presència d’amplificació HER2 per FISH, normalitzada per CEP 17, en CTCs de 75 dones amb càncer de mama per a les quals estava disponible l’estat HER2 del càncer primari i una mostra de biòpsia metastàtica (característiques del pacient disponibles en suplementari). Taula S1).

Per als pacients amb amplificació gènica HER2 del seu càncer de mama primari, el grau de concordança amb l'estat de HER2 dels seus CTC va ser elevat, amb només 1 dels 45 (2%) pacients que van demostrar pèrdua d'amplificació HER2 en els CTC corresponents (taula 1). En un pacient amb discordança, la biòpsia metastàtica es va amplificar HER2, reflectint el càncer primari. En canvi, per a aquells pacients en què el càncer de mama primari va ser HER2 negatiu, es va observar una discordança significativa entre la biòpsia primària, metastàtica i CTC. Un total de 10 (33%) d’aquests 30 pacients amb càncer primari negatiu per HER2 tenien CTC positius amb HER2 mitjançant l’anàlisi FISH. La proporció mitjana HER2 / CEP17 dels CTC en aquests pacients va ser de 7, 1. Curiosament, en 9 dels deu pacients amb discordança, la mostra de biòpsia metastàtica era HER2 negativa.

Taula completa

Avaluació de les propietats biològiques dels CTC aïllats mitjançant el mètode CPK

Expressió del receptor tirosina quinases

El mètode CPK és capaç d’aïllar una població molt enriquida de CTCs i un nombre més gran de CTC que el mètode CEK. Aquests resultats proporcionen l’oportunitat d’iniciar la caracterització molecular de CTCs. A més de FISH (figura 3), es va avaluar l'expressió de membrana de HER2 i EGFR fosforilats totals i EGFR mitjançant IF a les línies cel·lulars de càncer de mama i de pulmó espigolades a sang i recuperades amb la CPK (figura suplementària S4A). L’anàlisi IF va ser superior a la tinció immunohistoquímica cromogènica, ja que el substrat immunohistoquímic va tendir a unir-se no específicament a les ferropartícules i va donar lloc a una tinció de fons elevada (dades no mostrades). Es va avaluar l'expressió de EGFR i pEGFR a partir de CTCs en set pacients amb NSCLC (figura suplementària S4C). Es va poder detectar la tinció a totes les mostres, tot i que el percentatge de tinció de cèl·lules per EGFR o pEGFR va ser inferior al de les cèl·lules HCC827 que havien estat picades a la sang i processades mitjançant el mètode CPK. També es va utilitzar IF per avaluar la tinció de membrana de EGFR, pEGFR, HER2 i PHER en CTCs de 20 pacients amb càncer de mama clínicament positiu per HER2 (Figura suplementària S5B). De forma similar als CTC aïllats de pacients amb NSCLC, vam poder detectar EGFR, pEGFR, HER2 i PHER mitjançant IF en els CTC i la freqüència de tinció era menor que en la línia cel·lular tumoral SKBR3 (figura suplementària S5B).

Propagació in vitro

Els tubs estàndard de CellSave contenen un fixador que impedeix l'aïllament de cèl·lules tumorals viables. Després d’haver observat que les CTC poden aïllar-se de manera eficient de la sang extreta en tubs EDTA que no contenen un fixador (figura suplementària S3B), vam explorar si podríem aïllar cèl·lules SKBR3 i HCC827 mitjançant tubs EDTA i fer-les créixer in vitro . Hem espingut un rang (5.000) de cèl·lules SKBR3 o HCC827 a la sang normal recollida als tubs EDTA i les hem processat mitjançant el mètode CPK. Vam poder aïllar cèl·lules viables SKBR3 i HCC827 (figura suplementària S5) i propagar-les in vitro . Tot i això, calia processar una entrada mínima de 50 cel·les (figura suplementària S5). El creixement òptim es va produir davant del medi enriquit i la matriu d’adhesió cel·lular (dades no mostrades).

Discussió

Una de les qüestions més importants que limiten l’ús de CTC com a alternativa a les biòpsies invasives ha estat el rendiment relativament baix. Mitjançant el CellSearch System (Veridex), la tecnologia més àmpliament disponible, es calcula que el rendiment mitjà es trobava en el rang d’1 cèl·lula per ml de sang filtrada (Cristofanilli et al, 2004). Els nostres resultats amb pacients amb càncer de mama i pulmó mitjançant la plataforma CellSearch CEK són consistents amb aquesta constatació. Tot i així, dues observacions aparentment paradoxals ens van impulsar a explorar més endavant aquesta tecnologia. El primer és que diversos estudis utilitzats la plataforma CellSearch han demostrat que l'instrument era altament eficient per capturar línies de càncer de mama immortalitzades espigolades a la sang humana, amb un rendiment del yield85% de les cèl·lules d'entrada (Allard et al, 2004). Hem replicat aquells estudis amb resultats similars; una taxa de captura del 92% (dades no mostrades). La segona observació va ser la constatació que la nova tecnologia microfluídica CTC-xip va informar que els recomptes de CTC significa que els pacients amb càncer de mama de 79 cèl·lules per ml de sang (Nagrath et al, 2007). Si la tecnologia CellSearch ja és altament eficient per a la captura de CTCs en sistemes de model que utilitzen línies cel·lulars de càncer, com pot una altra tecnologia reportar 10–100 vegades més grans rendiments de CTC de mostres de pacients? Postulem que les CTC humanes, en particular les que han estat objecte de tractament anticancerígens, poden ser significativament més 'fràgils' que les línies de cèl·lules cancerígenes utilitzades en l'avaluació inicial de la plataforma CellSearch. A causa d’aquesta fragilitat, els diversos passos de processament implicats en el sistema CEK, inclosos rentats addicionals i passos d’etiquetatge, podrien causar degradació i pèrdua de CTCs capturats.

Es va plantejar la hipòtesi que el sistema CPK, que implica significativament menys passos de processament, pot proporcionar un rendiment millorat de CTC de mostres de pacients. De fet, vam observar que el CPK proporcionava constantment un rendiment significativament més gran de CTC que el que es va obtenir amb la plataforma CEK. La diferència mediana era 29 vegades en mostres de càncer de mama i 36 vegades en mostres de càncer de pulmó (Figura 1). A més, pràcticament tots els pacients de mama i pulmó tenien CTC detectables mitjançant el mètode CPK, mentre que els nostres resultats amb el sistema CEK demostren que només el 72% dels pacients tenien CTC detectables, d'acord amb els resultats publicats (Hayes et al, 2006). La millora del rendiment observada amb el CPK no es va deure simplement a les diferències entre el sistema de recompte semiautomatitzat del CEK i els recomptes manuals de CPK (Figures suplementàries S1E i F). Quan els CTC de tots dos mètodes es comptaven manualment, les diferències van persistir. Instead, our observation that when cell lines were pretreated with apoptosis-inducing agents (Figure 4), the yield of CTCs dropped dramatically, suggests that CTC fragility, coupled with the more intensive processing inherent in the CEK method, likely accounts for the observed differences between the CEK and CPK methods.

Importantly, we also found that the purity of the CTCs obtained from the CPK method was quite high, typically in the 60–70% range. This was somewhat unexpected as discussions of the CellSearch system in the literature cite purities in the 0.01–0.1% range, due to contaminating leukocytes. In our studies with the CPK system, the number of contaminating leukocytes, using either patient samples or blood from normal volunteers, and assessed using multiple independent methods, (IF, fluorescence-activated cell sorting), ranged from 20 to 476, and was always less than 25% of total cells. The one study we identified describing the number of contaminating leukocytes observed with the CPK method reported a range of 60–929 CD45-positive cells per sample (Sieuwerts et al, 2009). This study did not report the percentage of CTCs vs leukocytes in their paper, so their results cannot be compared with our data in that regard.

As has previously been demonstrated with the CEK system, we observed that the CPK method has high intrapatient reproducibility and that blood samples remain stable at room temperature for up to 72 h before sample processing (Allard et al, 2004). As many clinical trials involve multiple centres, this sample stability provides the opportunity to collect specimens from multiple sites and analyse them in one central location. This is an advantage over the recently developed microfluidic-based CTC-chip method. That technology has a very low throughput and a requirement for samples to be run within 2 h of being drawn (Nagrath et al, 2007). These limitations make it currently incompatible for use in multicentre clinical trials.

The CPK method clearly does not replace the CEK technique's well-validated usefulness as a prognostic tool for clinical samples. Instead, we feel that the CPK technique's relatively high yield, purity, and sample stability make it well suited for use in obtaining CTCs for molecular characterisation, facilitating clinical phenotyping and investigational studies. As an example of the former, we have used the technique to assess the HER2 gene amplification status of CTCs by FISH and compared it with both the patient's primary breast cancer and tissue from matched distant metastatic sites. In patients with clinically HER2-positive primary and metastatic cancers, virtually all (98%) also had HER2-amplified CTCs. In contrast, in patients with clinically HER2-negative primary cancers, we observed a significant number (33%) of discordant cases in which a patient's CTCs had clear amplification of the HER2 locus, despite an absence of HER2 amplification in the primary cancer. This result is consistent with the data from several other small studies demonstrating discordant HER2 expression in CTCs and together provide the rationale for a clinical trial of a HER2-directed therapy in such patients to definitively test the clinical relevance of this observation (Meng et al, 2004; Wulfing et al, 2006; Pestrin et al, 2009). To the best of our knowledge, our study is the first to also examine the relationship between HER2 amplification in CTCs and that of metastatic biopsy tissue. In six out of seven patients with HER2-negative primary cancers and HER2-amplified CTCs, the metastatic biopsy tissue was HER2 negative, matching the primary cancer rather than the CTCs. This observation suggests that either CTCs represent a separate population of cells distinct from that which makes up the bulk of the metastatic disease, or that the cancer developed HER2 amplification in the interval between the patients' metastatic biopsy and the CTC collection. If the latter explanation were correct, one might expect to see a correlation between the time interval from biopsy to CTC collection and the likelihood that the CTC would gain HER2 amplification. Although we did not observe such a trend (data not shown), our sample size is too small to make any conclusions about the mechanism of this discordance.

In summary, we have demonstrated that using the CellSearch CPK assay, an instrument that is currently available in hundreds of clinical and research laboratories, CTCs can be isolated in sufficient numbers and of sufficient purity to allow for their molecular characterisation. This technology potentially has a large number of applications in investigating the biology of metastatic cancer and in drug development in which it can be used to identify predictive biomarkers, mechanisms of resistance, and facilitate pharmacodynamic studies.

Historial de canvis

Informació complementària

Arxius de Powerpoint

  1. 1.

    Dades complementàries

Documents de paraula

  1. 1.

    Mètodes suplementaris

  2. 2

    Figura Legendes complementàries

    La informació complementària acompanya el document del lloc web de British Journal of Cancer (//www.nature.com/bjc)