La inhibició de l’autofàgia sensibilitza les cèl·lules del mesotelioma pleural malignes a dos inhibidors de pi3k / mtor | mort i malaltia cel·lular

La inhibició de l’autofàgia sensibilitza les cèl·lules del mesotelioma pleural malignes a dos inhibidors de pi3k / mtor | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Autofagia
  • Resistència terapèutica contra el càncer
  • Senyalització cel·lular
  • Mesotelioma

Resum

El mesotelioma pleural maligne (MPM) té l'origen en la majoria dels casos per inflamacions cròniques del mesoteli per exposició a fibres d'amiant. Atès l'efecte limitat de la quimioteràpia, s'està fent un gran esforç per trobar noves opcions de tractament. Es va informar que la ruta de PI3K / mTOR estava regulada en MPM. Hem provat les propietats d’inhibició del creixement cel·lular de dos inhibidors de PI3K / mTOR dual NVP-BEZ235 i GDC-0980 en línies cel·lulars de 19 MPM. Podríem identificar línies sensibles i resistents; tanmateix, no hi va haver cap correlació a la baixada de marcadors d'activitat de PI3K / mTOR. Com a resultat de la inhibició del mTOR, tots dos fàrmacs van induir autofagia a llarg termini, però no la mort cel·lular. El bloqueig autofàgic per cloroquina en combinació amb els inhibidors del doble PI3K / mTOR va induir significativament la mort de cèl·lules independent de la caspasa que implicava RIP1 en la línia cel·lular sensible SPC212. La mort cel·lular a la línia cel·lular resistent Mero-82 va ser menys acusada i no es va induir mitjançant el mecanisme depenent del RIP1, cosa que suggereix la implicació dels efectors RIP1 aigües avall. La inducció de mort cel·lular es va confirmar en sistemes 3D. A partir d’aquests resultats, identifiquem l’autofàgia com un dels principals mecanismes de resistència a la mort cel·lular davant d’inhibidors de PI3K / mTOR dobles en MPM. Com que els inhibidors de PI3K / mTOR s’estan investigant en assaigs clínics, aquests resultats poden ajudar a interpretar el seu resultat i suggerir formes d’intervenció.

Principal

El mesotelioma pleural maligne (MPM) és sensible a la diana de fosfatidilinositol 3-cinasa / mamífer d'inhibidors de senyalització de rapamicina (PI3K / mTOR) a causa de l'activació de la senyalització PI3K / mTOR. 1, 2 L'activació pot resultar de la inactivació de la fosfatasa INP4A, que està regulada en un 44% de la MPM (presentada a IMIG2014), o alteracions dels components de senyalització PI3K, mutats en un 9% de la MPM, 3 mentre que les mutacions del receptor de tirosina quinasa / no s'han identificat amplificacions en dos estudis recents de gran rendiment. 4, 5

Un dels gens supressors tumorals freqüentment mutats en MPM és NF2 i es va demostrar que les cèl·lules nul·les NF2 eren sensibles als efectes inhibidors del creixement de la rapamicina 6 mitjançant mecanismes que impliquen l'activació mTORC1 independent de la senyalització PI3K. Tot i això, l’inhibidor mTOR, everolimus, no va mostrar cap benefici terapèutic en pacients amb MPM no seleccionats. 7 Com que els inhibidors de mTORC1 sovint condueixen a una retroalimentació de l’activació de PI3K en càncers, 8 i 9 vam postular que els inhibidors de PI3K-mTOR dobles poden produir un benefici terapèutic més gran. A més, també es va demostrar que NF2 inhibeix l'activitat de PI3K en unir-se a potenciador PI-L (PIKE-L), que interromp la vinculació de PIKE-L a PI3K 10 i la pèrdua de NF2 en el schwannoma es va sensibilitzar als inhibidors de PI3K. 11

En una pantalla de l’inhibidor de doble PI3K / mTOR NVP-BEZ235, dins del quadre de cribratge de la genòmica de la sensibilitat de drogues de Sanger Institute / MGH, es va demostrar que la supressió de 12 CDKN2A va estar associada amb una augmentada sensibilitat. Com que NF2 i CDKN2A són de fet els gens més sovint mutats en MPM, el bloqueig de la senyalització PI3K / mTOR pot ser un enfocament vàlid per evitar la dificultat d’aplicar una teràpia dirigida en absència d’un oncogen identificat. La raó d’orientar el camí PI3K / mTOR també es recolza en l’associació d’un augment d’activitat amb un pitjor resultat clínic. 13, 14

NVP-BEZ235 (ref15) i GDC-0980 (ref16) són inhibidors de molècules petites de classe I PI3K i mTOR (mTORC1 i mTORC2). GDC-0980 s’ha provat en estudis de fase I on la cohort d’extensió de fase I va mostrar dues respostes objectives entre 26 pacients amb mesotelioma. 17 Malgrat aquests resultats encoratjadors, aquest medicament no s’explorarà més a causa dels efectes secundaris observats en un altre assaig clínic. 18 Això, però, no ens hauria de dissuadir per intentar trobar mitjans per millorar l’efecte antitumoral d’aquesta classe d’agents. Abans hem demostrat que la inhibició de la senyalització PI3K / mTOR sensibilitza les cèl·lules del mesotelioma a fàrmacs que surten a la sortida del transportador ABCG2 mitjançant la inhibició de la funció de ABCG2. En aquest estudi, hem volgut identificar els mecanismes subjacents responsables de la sensibilitat versus resistència a la inhibició de PI3K / mTOR en un gran panell de línies cel·lulars del mesotelioma. Vam observar que la inhibició de PI3K / mTOR augmenta la taxa autofàgica, cosa que constitueix un mecanisme eficient de resistència induint la detenció i la supervivència del creixement. Tanmateix, el bloqueig de l’autofagia, que per se afecta al creixement cel·lular, és sintèticament letal quan es combina amb inhibidors de PI3K / mTOR mitjançant un mecanisme que implica la mort de cèl·lules que depèn de la proteïna cinasa 1 (RIP1) que interactua amb el receptor.

Resultats

Cribratge de sensibilitat a les drogues de les línies cel·lulars del mesotelioma

En aquest estudi, hem volgut identificar els mecanismes que comptabilitzen la sensibilitat davant la resistència cap als inhibidors duals PI3K / mTOR en un gran panell de línies cel·lulars del mesotelioma. Per resoldre aquesta qüestió, es va realitzar una pantalla de citotoxicitat en 19 línies de cèl·lules de mesotelioma disponibles comercialment. Les cèl·lules es van tractar amb dosis creixents de NVP-BEZ235 o GDC-0980, i es va analitzar la viabilitat i la inhibició del creixement mitjançant la mesura de l'activitat mitocondrial a 72 hores mitjançant un assaig MTT. La distribució IC50 determinada per NVP-BEZ235 va mostrar una diferència aproximada de 26 vegades entre les línies cel·lulars més sensibles i les més resistents, mentre que la distribució ICD GDC-0980 era més homogènia i mostrava una diferència màxima de 8 vegades (figura 1).

Image

Identificació de les línies cel·lulars del mesotelioma sensibles versus resistents a la inhibició de PI3K / mTOR. Línies cel·lulars IC50 de 19 MPM: ACC-Meso-1, SPC212, MSTO-211H, ZL34, ZL55, NCI-H2452, ZL5, NCI-H226, SPC111, NCI-H2052, Mero-25, Mero-95, SDM103T2, ACC -Meso-4, Mero-82, ONE58, Mero-14, Mero-84 i Mero-83 i QQ Plot normalitat test a 250 nM després de 72 h tractades amb ( a ) NVP-BEZ235 i ( b ) GDC-0980

Imatge a mida completa

Per determinar si els resultats obtinguts eren adequats per seleccionar línies cel·lulars resistents i sensibles, vam provar si els percentatges de creixement i de viabilitat per a una concentració determinada de GDC-0980 o NVP-BEZ235 normalment es van distribuir mitjançant la trama quantil-quàntil ( QQ Plot) test de normalitat (figura 1, figura suplementària S1). Ambdós i la viabilitat de la inhibició del creixement cel·lular NVP-BEZ235 i GDC-0980 es van distribuir normalment. Els resultats de la viabilitat de NVP-BEZ235 i GDC-0980 es van centrar en el 45, 7 i el 43, 65%, respectivament, del control no tractat que proporciona una sensibilitat màxima per detectar línies tant resistents com sensibles. Els llindars de línies cel·lulars sensibles i resistents es van establir mitjançant ± 1 SD de la mitjana. La distribució de les línies cel·lulars basades en la IC50 va ser consistent a l’observada a la traça QQ.

La IC50 publicada de NVP-BEZ235 observada en línies cel·lulars oscil·la entre 10 i 100 nM 20, 21 i per a GDC-0980 varia entre 200 i 500 nM. 22 La IC50 del 26% de les línies cel·lulars MPM tractades amb NVP-BEZ235 era <100 nM i la IC50 del 68% de les cèl·lules de línies cel·lulars MPM tractades amb GDC-0980 era <500 nM. A partir d'aquesta observació, la concentració del fàrmac utilitzat per a assaigs funcionals per a NVP-BEZ235 es va establir en 200 nM, que inclou la IC50 del 58% de les línies cel·lulars. Per a GDC-0980, es va triar 500 nM.

No hi ha diferències entre línies cel·lulars sensibles i resistents en la senyalització PI3K / mTORC1 / 2

Per realitzar assaigs funcionals, es van triar sis línies cel·lulars representatives que es solapen en la sensibilitat i la resistència als dos fàrmacs, incloent els SPC212, ZL34 i Mero-25 sensibles i les línies cel·lulars resistents Mero-83, Mero-82 i ONE58. També es va examinar si la fosforilació dels marcadors d'activitat de PI3K / mTORC1 / 2 es va inhibir de manera diferent en les línies cel·lulars sensibles versus resistents i no vam trobar diferències substancials a nivell de senyalització mTORC1 (figura 2a). Els dos inhibidors van reduir de manera similar la fosforilació dels marcadors d'activitat de mTORC1 4E-BP1 i S6 ja després de 4 h de tractament, i es va mantenir després de 72 h de forma dependent de la dosi. La fosforilació S6 no es va correlacionar amb la fosforilació 4E-BP1, i això pot ser representatiu en l'addicció de les cèl·lules cancerígenes a la traducció aberrant eIF4F mediada per heterotrimer, 23 el muntatge de la qual és inhibit per 4E-BP1 desfosforilat.

Image

La disminució de la senyalització de PI3K / mTOR va acompanyada de la detenció de la G1, que és més acusada en les línies cel·lulars sensibles. ( a ) Els lisats de proteïnes de les línies cel·lulars sensibles SPC212, ZL34 i Mero-25 i de les línies cel·lulars resistents Mero-83, Mero-82 i ONE58 es van analitzar mitjançant Western blot contra marcadors d'activitat PI3K / mTOR: fosfo-AKT (Thr308), fosfo- AKT (Ser473), AKT, fosfo-S6, S6, fosfo-4E-BP1, 4E-BP1, i Actina. Cada línia cel·lular es va morir de fam sèrica durant 16 h i es va tractar com s’indica durant 4 h amb 1000 μ g / ml IGF-1, 0, 5 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980 o es va tractar durant 72 h amb concentracions creixents de NVP. -BEZ235 o GDC-0980 segons s’indica. ( b ) Perfil de cicle cel·lular de la línia cel·lular sensible SPC212 i de la línia resistent Mero-82 tractada amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235 o 0, 5 μ M GDC-0980 durant 72 h. Les dades es presenten com a mitjans ± SD mitjançant ≥3 experiments independents. La significació es va determinar per la prova t de l'alumne (*** P <0.005, ** P <0.01 i * P <0.05; NS, no significativa)

Imatge a mida completa

La inhibició de la fosforilació GDC-0980 del substrat mTORC2 AKT (Ser473) va ser molt eficient a les 4 h i es va mantenir després de 72 h en la majoria de les línies analitzades, mentre que l’efecte inhibidor NVP-BEZ235 va disminuir després de 72 h. De la mateixa manera, la inhibició del marcador d’activitat PI3K p100 fosforilació AKT (Thr308) va ser eficient amb tots dos fàrmacs a 4 h, però només es va mantenir l’efecte inhibidor GDC-0980 després de 72 h durant la majoria de les línies analitzades. Serra et al. Van observar resultats similars amb NVP-BEZ235 . 21 en la inhibició de PI3K / mTORC2 en cèl·lules de càncer de mama on només concentracions altes de 500 nM van aconseguir una inhibició eficient de PI3K p100. Combinats, tot i que no hi va haver cap correlació entre els marcadors de l'activitat de PI3K / mTORC1 / 2 i el creixement cel·lular en línies cel·lulars sensibles i resistents per als dos inhibidors duals PI3K / mTORC1 / 2, GDC-0980 va ser més eficient en bloquejar PI3K / mTORC2 en comparació amb NVP-BEZ235.

A més, es va investigar la línia sensible SPC212 i la línia cel·lular resistent Mero-82 basada en la capacitat de cultiu en cultius 3D. Es va confirmar la inhibició del creixement cel·lular analitzant el perfil del cicle cel·lular per a cada línia cel·lular després de 72 h de tractament. L’acumulació de G1 amb 200 nM NVP-BEZ235 i 500 nM GDC-0980 va ser significativament més acusada en les línies sensibles que les línies cel·lulars resistents; tanmateix, no es va observar cap mort cel·lular (figura 2b, figura suplementària S2).

PTEN, un regulador negatiu de la via PI3K, es va expressar de manera diferent en totes les línies cel·lulars MPM provades (figura suplementària S3). Les línies cel·lulars sensibles Mero-25 i ACC-Meso-1 no van mostrar cap expressió de PTEN, cosa que indica que la sobreactivació de la via PI3K predisposa a la sensibilitat als inhibidors.

Es va demostrar que la pèrdua de NF2 sensibilitza tant als inhibidors de PI3K com dels mTOR. 6, 11 Només quatre línies MPM van expressar proteïna NF2 (NCI-H2452, ACC-Meso-4, MSTO-211H i Mero-25), d'acord amb estudis anteriors. 6, 24, 25 De les quatre línies, tres (NCI-H2452, ACC-Meso-4, MSTO-211H) han documentat el tipus NF2 salvatge segons la base de dades CCLE i dades publicades. 24, 26 Com que només poques línies expressen NF2 de tipus salvatge provat, és difícil extreure cap conclusió sobre qualsevol correlació entre l’estat de NF2 i la sensibilitat i la resistència als inhibidors duals PI3K / mTOR en les nostres configuracions experimentals.

Les línies cel·lulars MPM presenten nivells elevats d’autofagia basal

L’autofàgia és un mecanisme de supervivència mitjançant el qual el material citosòlic és segrestat en una membrana de doble capa, autofagosoma, lliurada al lisosoma per a la seva degradació i reciclada per alimentar el creixement cel·lular en períodes de fam o angoixa. 27 El càncer pot aprofitar aquest mecanisme per mantenir la viabilitat de les cèl·lules, donant lloc a la dormició del tumor, progressió i resistència terapèutica. 28 De forma coherent amb les observacions que altres indiquen que NVP-BEZ235 indueix autofagia en cèl·lules de glioma 29, 30, 31 i GDC-0980 en càncer de pàncrees, 32 també vam observar inducció sostinguda d’autofagia en cèl·lules SPC212 i Mero-82 després de 72 h de tractament, evidenciat pel processament de LC3-I a la forma localitzada LC3-II autofagosoma i degradació de P62 (Figura 3a). Per tant, es va plantejar la hipòtesi que l’autofàgia podria actuar com a mecanisme de resistència en el nostre model de mesotelioma. Vam trobar que gairebé totes les cèl·lules del mesotelioma analitzades tenien nivells elevats d’autofagia basal, tal com indica la forma LC3-II (Figura 3b) en comparació amb la línia cel·lular mesotelial no transformada SDM104. La fam sèrica durant la nit no va augmentar considerablement el nivell d’autofàgia basal en la majoria de les línies cel·lulars analitzades, a diferència d’altres ajustaments del metabolisme observats després de la privació del factor de creixement extern. 33 No es van observar correlacions entre els nivells de LC3-II i els canvis de reguladors de senyalització PI3K / mTOR com PTEN, NF2 així com l'activitat mTORC1 (documentada per fosforilació S6) entre línies resistents i sensibles en condicions de privació sèrica (figura suplementària S3) .

Image

Les cèl·lules del mesotelioma presenten un alt nivell d’autofagia, que s’incrementa amb la inhibició de la senyalització de PI3K / mTOR. ( a ) Anti-P62 i -LC3BI / II i -Actina Western blots de lisats de proteïnes de la línia cel·lular sensible SPC212 i de la línia cel·lular resistent Mero-82 tractades durant 72 h amb concentracions creixents de NVP-BEZ235 o GDC-0980, tal com s'ha indicat. ( b ) Línies cel·lulars anti-LC3BI / II i -Actina occidentals de les línies de cèl·lules mesotelials SDM104 i MPM SPC111, SPC212, NCI-H226, NCI-H2052, NCI-H2452, Mero-14, Mero-25, Mero-82, Mero-83, Mero-84, Mero-95, ACC-Meso-1, ACC-Meso-4, MSTO-211H i ONE58 es van quedar amb sèrum o sèrum morts de fam durant 16 hores. Al quadre inferior, la quantificació de nivell de proteïna de LC3BII normalitzada contra Actin es representa per a les línies cel·lulars descrites anteriorment amb condicions de cultiu estàndard

Imatge a mida completa

Les cèl·lules SPC212 i Mero-82 tenen un gran flux autòfag i el bloqueig autofàgic les sensibilitza als inhibidors de PI3K / mTOR que indueixen la mort de les cèl·lules de manera RIP1 depenent

S’ha demostrat que GDC-0980 i NVP-BEZ235 sols o en combinació amb altres quimioteràpics o radioteràpia indueixen una apoptosi intrínseca en una varietat de tumors sòlids i líquids. 20, 22, 29, 34, 35, 36 A més, en càncers, com el carcinoma de cèl·lules renals o el càncer de pàncrees, la combinació d’inhibidor d’autofagia cloroquina (CQ) amb mTOR simple o inhibidors duals PI3K / mTOR sensibilitza les cèl·lules i indueix la caspasa. mort cel·lular dependent i independent. 32, 37, 38, 39 CQ és un fàrmac lisosomotròpic que eleva el pH 40 intralysomomal i deteriora la degradació autofàgica de les proteïnes.

Per provar si NVP-BEZ235 i GDC-0980 promouen la supervivència mitjançant autofagia, es van tractar línies sensibles i resistents amb els inhibidors sols o en combinació amb CQ. CQ sol i en combinació amb GDC-0980 va bloquejar de forma eficient l’autofàgia després de 24 hores de tractament, i aquest efecte es va mantenir després de 72 h. El GDC-0980 només va augmentar el flux autòfag a les cèl·lules SPC212 i Mero-82 a 72 h (Figura 4a). Es va induir una forta vacuolització del citoplasma amb tractament amb CQ sol o en combinació amb els inhibidors de les dues línies cel·lulars, donant suport als resultats de la immunoblot (figura 4b). Tot i que en moments anteriors es va observar un fort impacte morfològic de CQ combinat amb inhibidors de PI3K / mTOR dobles, la mort cel·lular es va detectar només després de 96 h en les línies cel·lulars provades (figura 4c, figura suplementària S4). Es va observar una caiguda important d’ATP en les dues línies cel·lulars tractades amb CQ sola, i aquesta va ser menys destacada a la línia resistent Mero-82 després de 96 h de tractament. La combinació va mostrar un efecte additiu significatiu en la reducció dels nivells d’ATP en les cèl·lules SPC212 i un efecte menor en Mero-82 (figura 4c), que es va confirmar mitjançant un assaig de formació de colònies en cèl·lules Mero-82 (figura suplementària S5).

Image

La inhibició de l’autofàgia amb CQ sensibilitza les línies cel·lulars del mesotelioma davant els inhibidors de PI3K / mTOR. ( a ) Anti-P62, L-C3BI / II i Actin taques occidentals de lisats de proteïnes de la línia cel·lular sensible SPC212 i de la línia cel·lular resistent Mero-82 tractades amb 20 μ M CQ, 0, 5 μ M GDC-0980 o en combinació per a 24, 48 i 72 h. ( b ) Micrografies lleugeres de SPC212 i Mero-82 tractades amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980 soles o en combinació amb 20 μ M CQ durant 96 h. La barra d’escala representa 25 μ m. ( c ) Quantificació del percentatge de contingut d'ATP de cèl·lules SPC212 i cèl·lula Mero-82 tractades amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980 sol o en combinació amb 20 μ M CQ durant 96 h. Les dades es presenten com a mitjans ± SD mitjançant ≥3 experiments independents. La significació es va determinar mitjançant l'anàlisi de la prova de variància (*** P <0.005, ** P <0.01 i * P <0.05; NS, no significatiu)

Imatge a mida completa

Per tal de confirmar el paper de l’autofàgia en la sensibilització a la inhibició de PI3K / mTOR, vam fer callar el gen Atg5 (figura 5a), que és important per a l’allargament de l’autofagosoma. La silenciació d’Atg5 va suposar l’abolició de l’acumulació de P62 després del tractament amb CQ (figura 5b), demostrant així un bloqueig eficient de l’autofàgia. Es van observar resultats similars amb un segon sistema de pinça curta (dades no mostrades). Sorprenentment, silenciar el gen Atg5 es va associar amb un creixement de cèl·lules significativament deteriorat a la línia sensible SPC212 i a la línia resistent a Mero-82 (Figura 5c), cosa que indica la dependència de la MPM de l’autofàgia. A causa d’aquest fenotip, no hem pogut provar l’efecte de la inhibició de PI3K / mTOR.

Image

L’autofagia és necessària per al creixement de cèl·lules del mesotelioma. Les línies cel·lulars SPC212 i Mero-82 van ser transduïdes estables amb partícules de virus que portaven Mir30-Sh-Atg5 o Mir30-Sh-Ctrl. ( a ) El silenciament del gen Atg5 es va confirmar mitjançant la taquilla anti-ATG5 occidental. ( b ) Anti-P62, -LC3BI / II i -Actina de SPC212 i Mero-82 Sh-Atg5 i Sh-Ctrl no tractats o tractats amb 20 μ M CQ durant 4 h. ( c ) Plec de cèl·lules de SPC212 i Mero-82 Sh-Atg5 i Sh-Ctrl durant 3 dies. Les dades es presenten com a mitjans ± SD de tres experiments independents. El significat va ser determinat per la prova de Mann – Whitney U (* P <0.05)

Imatge a mida completa

Per determinar el tipus de mort de cèl·lules induït per la combinació de CQ i els inhibidors duals PI3K / mTOR, es van examinar les cèl·lules per apoptosi mitjançant la valoració del test de viabilitat de l'Annexina V / PI (Figura 6, figura suplementària S6), processament i escissió de la caspasa 3 del substrat caspasa 3 PARP. Es va observar la inducció de la mort cel·lular tant en cèl·lules SPC212 com en Mero-82 amb ambdós inhibidors en l’assaig Annexin V / PI; tanmateix, la inducció significativa de mort cel·lular més gran només es va aconseguir quan s'afegia CQ. Aquest efecte additiu va ser més gran a la línia sensible SPC212 que a la línia resistent Mero-82. L'addició de l'inhibidor de pan-caspasa d'ampli espectre Z-VAD-FMK no va aconseguir rescatar la mort cel·lular (figura 6a). No es va detectar cap alliberació activa de caspasa-3, PARP o citocrom c després del tractament combinat (figura 6b, figura suplementària S7), i tampoc no vam observar un augment de la proteïna BH3 només de proteïna BH (dades no mostrades). En conjunt, aquestes observacions confirmen que no hi va haver una apoptosi intrínseca. A continuació, vam comprovar si es pot produir la mort observada mitjançant un mecanisme depenent del RIP1. 41 cèl·lules SPC212 i Mero-82 van ser tractades amb CQ i NVP-BEZ235 o GDC-0980 en absència i presència de l’inhibidor específic de RIP1 Necrostatin-1 (Nec-1). El Nec-1 només va ser capaç de bloquejar significativament la mort cel·lular induïda per CQ i els inhibidors de doble PI3K / mTOR en SPC212. A les cèl·lules Mero-82, el Nec-1 no va bloquejar la mort cel·lular. A més, els inhibidors del doble PI3K / mTOR van induir la degradació de RIP1 (Figura 6c), que després va ser rescatada per l'addició de CQ a les dues línies cel·lulars. Aquest efecte va ser més evident després de 96 h, quan les cèl·lules van començar a morir. Curiosament, l’inhibidor relacionat amb la proteïna X de l’apoptosi (XIAP) relacionat amb la proteïna prosurvival es va descartar de manera eficient com a resultat de la inhibició de l’AKT només a la línia sensible SPC212 però no a la línia resistent Mero-82.

Image

La inhibició de l’autofàgia amb CQ combinada amb la inhibició de la senyalització PI3K / mTOR indueix la mort cel·lular independent de la caspasa. ( a ) Les línies de cèl·lules SPC212 i Mero-82 es van tractar segons les indicades amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980, 20 μ M CQ, 20 μ M ZVAD-FMK o 50 μ M Nec-1 durant 96 h . La mort cel·lular es va avaluar mitjançant la tinció de GFP-Annexin V / PI i la citometria de flux. Les dades es presenten com a mitjans ± SD de tres experiments independents. La significació es va determinar mitjançant l’anàlisi de la prova de variància (*** P <0, 005, ** P <0, 01 i * P <0, 05; NS, no significatiu). ( b ) Anti-PARP, -Caspase 3 i -Actin western blots de SPC212 i Mero-82 tractats com s'indica amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980 i 20 μ M CQ. Els MEF immortalitzats amb SV40 tractats durant 15 h amb 3 μ g / ml Etoposide es van utilitzar com a control de l’apoptosi. ( c ) Anti-XIAP (asterisc (*) representa una banda no específica), -RIP1 i -Actina taques occidentals de lisats de proteïnes de SPC212 i Mero-82 tractats tal com s'indica amb 0, 2 μ M NVP-BEZ235, 0, 5 μ M GDC-0980 i 20 μ M CQ durant 72 i 96 h

Imatge a mida completa

Diversos bucles de cruïlla, retroalimentació i avançaments enllacen les rutes de senyalització PI3K / AKT / mTOR i Ras / MEK / ERK, que proporcionen informació sobre les respostes compensatòries observades amb l’orientació de qualsevol via. 43 Vam observar que GDC-0980 va induir l’activació d’ERK en cèl·lules Mero-82 resistents, però no en cèl·lules sensibles SPC212 (figura suplementària S8a). L’activació d’ERK també va ser fortament induïda per CQ en cèl·lules Mero-82 resistents. Per provar si la inhibició de la via MEK / ERK milloraria l'efecte de GDC-0980 i CQ, vam provar U0126, un inhibidor de MEK1 / 2. U0126 va inhibir eficientment la inducció d’ERK per CQ i GDC-0980 (figura suplementària S8b). Tot i això, la combinació de U0126, GDC-0980 i CQ no va induir la mort cel·lular (figura suplementària S8c).

Els inhibidors de doble PI3K / mTOR en combinació amb CQ indueixen la mort cel·lular en MPM 3D

S'han observat esferoides en el líquid pleural de la MPM humana i relacionades amb un augment de la malignitat. S'han utilitzat 44 esferoides MPM per investigar noves opcions terapèutiques 45 i han demostrat que aquest model representa millor la complexitat biològica existent en el tumor dels pacients. 46, 47 Per tant, hem volgut comprovar en aquest model l’eficiència del bloqueig de PI3K / mTOR combinada amb la inhibició de l’autofagia.

En aquest estudi hem utilitzat esferoides densament envasades de 300 μm de diàmetre formades en 4 dies segons un protocol normalitzat. 48 En aquestes condicions, aproximadament un terç de les cèl·lules es troben en estat silenciós, 44 per la qual cosa corresponen millor a l'estat de proliferació de cèl·lules tumorals 49 en comparació amb el cultiu cel·lular 2D.

Les esferoides Mero-82 i SPC212 es van tractar amb només CQ o en combinació amb NVP-BEZ235 o GDC-0980. Tot i que el tractament amb CQ per si sol no va tenir un impacte en el creixement dels esferoides, es va observar una caiguda significativa del contingut d’ATP al voltant del 20% tant per a les línies cel·lulars (Figures 7a-c). A més, els esferoides eren refractius i apareixien foscos a la microscòpia clara. El tractament dels esferoides amb els inhibidors de PI3K / mTOR només va induir una inhibició important del creixement cel·lular i la caiguda d’ATP a les dues línies de cèl·lules (figures 7b i c). La combinació de CQ amb inhibidors de PI3K / mTOR no va tenir un impacte addicional en el creixement cel·lular per si ; tanmateix, es va observar una forta vacuolització i inflor de les cèl·lules úniques del citoplasma (Figura 7a). D'altra banda, hi va haver un efecte additiu significatiu en la reducció d'ATP per a les dues línies cel·lulars. Curiosament, en els esferoides SPC212 el contingut d’ATP estava gairebé esgotat i apareixien desintegrats i les cèl·lules individuals eren reconeixibles, mentre que a la Mero-82 la forma de l’esferoide encara estava intacta en el moment de l’anàlisi.

Image

La inhibició de l’autofàgia amb CQ combinada amb la inhibició de la senyalització de PI3K / mTOR indueix la mort de les cèl·lules esferoides. ( a ) Micrografies lleugeres representatives de les esferoides SPC212 i Mero-82 tractades tal com s’indica amb 1 μ M NVP-BEZ235, 1 μ M GDC-0980 i 20 μ M CQ durant 6 dies. ( b ) Augment del volum (creixement) d'esferoides plegats mostrat al quadre ( a ). ( c ) La viabilitat es presenta com el percentatge de contingut d'ATP en els esferoides SPC212 i Mero-82 tractats tal com es descriu al quadre ( a ). Les dades es presenten com a mitjans ± SD mitjançant ≥3 experiments independents. La significació es va determinar mitjançant l'anàlisi de la prova de variància (*** P <0.005 i * P <0.05; NS, no significatiu)

Imatge a mida completa

La inhibició de l’autofàgia no va sensibilitzar les cèl·lules SDM104 normals a la inhibició de PI3K / mTOR (figures suplementàries S9a – c).

Per provar si la via ERK està implicada en la resistència Mero-82 en 3D, vam afegir U0126 (figura suplementària S10). La combinació de U0126 i GDC-0980 va tenir un lleuger efecte additiu sobre la viabilitat, i no hi va haver cap efecte significatiu addicional quan es va afegir CQ. No es va observar la desintegració dels esferoides després de 6 dies de tractament. Aquests resultats indiquen que ERK no és la principal via implicada en la resistència a la mort cel·lular.

Discussió

En aquest estudi, demostrem que la fugida d’accés directe a l’autofàgia és una forma de millorar l’eficiència terapèutica de la inhibició de PI3K / mTOR en la MPM.

S'han descrit diversos mecanismes que subratllen la resistència a la inhibició de PI3K / mTOR. Per exemple, les línies cel·lulars de càncer de mama resistents a NVP-BEZ235 han augmentat l’activació de JAK2 / STAT5 resultant de la secreció d’IL-8. Al llarg d’aquestes línies, el tractament combinat amb GDC-0980 juntament amb un inhibidor de c-Met van inhibir el creixement del tumor del mesotelioma de manera eficient. Es van descriure 51 inhibidors de doble PI3K / mTOR per induir l’activació d’ERK mitjançant la inhibició de mTORC2 en càncer de pàncrees. La combinació d’inhibidors de PI3K / mTOR i MEK / ERK va millorar la resposta al fàrmac. Hem observat un efecte similar en la línia cel·lular resistent Mero-82; tanmateix, la combinació d’inhibidors de PI3K / mTOR i MEK / ERK, en presència o absència d’inhibició d’autofagia, no va provocar la mort cel·lular, cosa que indica que podria intervenir un mecanisme addicional. Un altre dels mecanismes de resistència coneguts a la inhibició de PI3K / mTOR inclouen la traducció independent del cap i el mecanisme mediat per FOXO. Es va demostrar que 53 NVP-BEZ235 indueixen una regulació superior i / o l’activació de diverses proteïnes prosurvivalents com RTK, cinases citosòliques, proteïnes antiapoptòtiques i factors de transcripció principalment per traducció independent del cap. Els 54 ARNm traduïts en aquestes condicions tenen una regió no traduïda de 50 estructures molt estructurada, que sovint alberga una seqüència d’entrada del ribosoma intern i diversos AUG aigües amunt. Una de les proteïnes que es tradueixen d'aquesta manera en condicions de síntesi de proteïnes mundials reduïdes és XIAP. 55 XIAP és un regulador intrínsec clau de l’apoptosi, principalment per la seva capacitat d’enllaçar i inhibir les caspases tant iniciadores com efectores. 56 Tot i que els nivells cel·lulars d’XIAP estan regulats per diversos mecanismes independents, la regulació predominant sembla ser el control de la traducció d’ARNm XIAP. Els nivells de XIAP van ser regulats per GDC-0980 en resistència Mero-82, però no en cèl·lules sensibles a SPC212. Curiosament, els nivells de XIAP també van ser regulats per CQ, però això podria estar relacionat amb altres mecanismes, incloent-hi l’augment dels nivells de substrats proteasomes impulsats per la inhibició autofàgica. 57

Els mecanismes que depenen de FOXO poden fonamentar la resposta diferent als dos inhibidors de PI3K / mTOR utilitzats en aquest estudi. De fet, mTORC2 va ser més eficient inhibit per GDC-0980 en comparació amb NVP-BEZ235, donant lloc a la inhibició de l'activació de AKT. Els gens Atg són controlats positivament per FoxO3a, 58 i aquest últim està regulat negativament per AKT actiu. Per tant, GDC-0980 induint un millor bloqueig de l’activació AKT pot donar lloc a un compromís amb autofagia depenent de FOXO3a a llarg termini i, efectivament, vam observar una disminució de la fosforilació de FOXO3a després del tractament amb GDC-0980 (dades no mostrades). Les nostres observacions són consistents amb l’augment d’eficàcia observada per la inhibició de l’autofàgia juntament amb inhibidors de doble PI3K / mTOR en càncer de pàncrees 59 i tumors de la beina del nervi perifèric. 60

La mort cel·lular observada en els nostres contextos experimentals és molt probablement la necroptosi, que és una de les diverses formes de mort cel·lular regulada que implica RIP1, RIP3 i MLKL. 41 El mecanisme d'activació de la necroptosi inclou la disminució dels nivells d'ATP, que en algun moment aboleixen l'activitat de tots els enzims dependents de l'ATP (inclosos diversos transportadors que mantenen l'equilibri iònic a la membrana plasmàtica) i un equilibri redox compromès (que inactiva diversos enzims i provoca oxidacions moleculars. danys en orgànuls i membranes) com a jugadors centrals en l'execució de la mort cel·lular regulada. 41 Es va documentar una disminució dràstica dels nivells d’ATP que recolza la teoria que les cèl·lules van morir a causa d’una necroptosi. La disminució del nivell d’ATP va ser més greu a les cèl·lules sensibles SPC212 en comparació amb les cèl·lules Mero-82 resistents. Curiosament, la mort cel·lular induïda per tractament combinat va ser bloquejada eficientment per l’inhibidor de RIP1 Nec-1 només a la línia cel·lular sensible SPC212. Això indica que la inducció real de mort cel·lular en la línia Mero-82 resistent es produeix en un context independent del RIP1, probablement implicant només RIP3 i MLKL. 41 La probabilitat d’aquest escenari és suggerida per dades recents que demostren que XIAP inhibeix la mort cel·lular 61 depenent del TNF i el RIP3 i per la nostra observació que XIAP no es regulava de manera eficient al tractament combinat amb medicaments en Mero-82 en comparació amb les cèl·lules SPC212

Els resultats observats van ser consistents en els models 2D i 3D. Això és important ja que la fosforilació basal dels membres de la ruta de PI3K / AKT / mTOR s'ha descrit reduïda en esferoides 3D en comparació amb el 2D. 47 Com que 3D / esferoides representen un model més proper a la complexitat biològica del tumor, aquests resultats suggereixen que aquesta opció terapèutica combinada s'ha d'explorar en entorns clínics.

A més, vam observar que la inhibició de l’autofàgia per si mateixa tenia un efecte sobre el creixement cel·lular del mesotelioma. L’autofàgia afavoreix la supervivència de cèl·lules resistents a l’apoptosi quan es veuen privades de nutrients o factors de creixement extracel·lulars. El tractament de cèl·lules dependents de l’autofàgia per a la seva supervivència amb CQ es tradueix en la mort cel·lular depenent de l’ATP. La inhibició de l’autofagia intrínseca de les cèl·lules canceroses en silenciar Atg5 disminueix el creixement del tumor B16-F10. 63 L’autofàgia té un paper dependent del context en el càncer. 64 Es regula i es requereix per a la supervivència de les cèl·lules tumorals a les regions del tumor hipòxic. 64 El fet de eliminar els gens essencials de l’autofàgia en models de ratolins dissenyats genèticament per al càncer han demostrat un paper pro-tumorigen per l’autofàgia. 65 Els mecanismes de la "addicció autofàgica" observada a les cèl·lules MPM estan fora de l'abast del present estudi, però seran aprofundits.

En conclusió, vam demostrar que els inhibidors de PI3K / mTOR augmenten els nivells d’autofagia en MPM i la combinació juntament amb CQ s’hauria d’explorar més, ja que la inhibició d’autofagia bloqueja aquest mecanisme de resistència.

Materials i mètodes

Reactius

El melc F-12 (Nutrició Mitjana / Nutrició Modified Eagle's Dulbecco) F-12 (DMEM – F12), iodur de propidi i solució d’accions de Penicil·lina / Streptomicina 100 × es van comprar a Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Buchs, Suïssa). La solució de tripsina es va comprar un 0, 25% a GIBCO (Life Technologies Europe, Zug, Suïssa). El sèrum de vedella fetal (FCS, CVFSVF00-01) es va comprar a Eurobio (Ulis (Les), França). La puromicina es va comprar a AppliChem (Darmstadt, Alemanya). Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone (Z-VAD-FMK) was purchased from BACHEM (Bubendorf, CH, Switzerland). Nec-1 was purchased Enzo LifeSciences AG (Lausen, Switzerland). NVP-BEZ235 was obtained from Novartis (Basel, Switzerland) and GDC-0980 was obtained from Genentech (Roche, Basel, Switzerland). U0126 was purchased from Cell Signaling Technology (Allschwil, Switzerland). Nivaquine (chloroquine sulfate) was purchased from Sanofi Aventis (Paris, France). Recombinant His 6 -GFP-Annexin V was kindly provided by T Kaufmann (Bern, CH, Switzerland).

Cultiu cel·lular

The following mesothelioma cell lines have been used: ZL55, ZL5, ZL34, SDM103T2, SPC111 and SPC212 from our laboratory; NCI-H226, NCI-H2052, NCI-H2452, MSTO-211H 66 were obtained from ATCC (Wesel, Germany); ACC-Meso-1 and ACC-Meso-4 24 were obtained from Riken BRC (Ibaraki, Japan); and Mero-25, Mero-82, Mero-83, Mero-84, Mero-95 (ref 67) and ONE58 (ref 68) was obtained from the European Collection of Cell Cultures (Salisbury, UK). The non-transformed mesothelial cell line SDM104 (ref 69) was established in our laboratory. Cells established in our laboratory were maintained as described by Thurneysen et al. 70 The rest of the cell lines were cultured in DMEM–F12 supplemented with 15% FCS and 1% Penicillin/Streptomycin solution. SV40 immortalized wild-type MEF cells and Hek 293T cells were cultured in DMEM high glucose medium supplemented with 10% FCS and 1% Penicillin/Streptomycin. All cells were cultured at 37 °C in a humidified 5% CO 2 atmosphere.

Gel electrophoresis and immunoblotting

Total protein extracts were prepared by lysing the cells with hot H8 buffer containing 10 mM Tris-Cl pH 7.4, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA and 1% SDS and boiled for 5 min. Protein concentration was determined using a DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), and proteins were prepared by adding 6 × reducing Lämmli buffer (600 mM DTT) and boiling the samples for 5 min. A total of 10 μ g protein per extract was separated on denaturing 4–20% gradient SDS-PAGE gels. Proteins were transferred onto PVDF transfer membranes (0.45 μ m, Perkin Elmer, Schwerzenbach, Switzerland). For western blotting, membranes were probed with the following primary antibodies: rabbit anti-AKT (no. 9272), rabbit anti-Phospho-AKT (Thr308) (no. 9275), rabbit anti-Phospho-AKT (Ser473) (193H12, no. 9275), mouse anti-S6 (54D2, no. 2317), rabbit anti-Phospho-S6 (Ser235/236) (D57.2.2E, no. 4858), rabbit anti-4E-BP1 (no. 9452), rabbit-Phospho-4E-BP1 (Thr37/46) (236B4, no. 2855), rabbit anti-p44/42 MAP Kinase (no. 9102), rabbit anti-Phospho-p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr 204) (no. 9101), rabbit anti-PTEN (138G6, no. 9559), rabbit anti-LC3B (no. 2775), rabbit anti-PARP (no. 9542), rabbit anti-caspase-3 (no. 9662) from Cell Signaling Technology; rabbit anti-NF2 (C18, no. sc-332) from Santa Cruz Biotechnologies (Dallas, TX, USA); guinea pig anti-p62 (GP62-C) from Progen (Heidelberg, Germany); mouse anti-RIP (no. 610458) and mouse anti-XIAP (no. 610763) from Transduction Laboratories (Allschwil, Switzerland); mouse anti-ATG5 (7C6) from Nanotools (München, Switzerland); rabbit anti-Phospho-NF2 (Ser518) (PAI-14252) from Pierce (Rockford, IL, USA) and mouse anti-Actin (no. 69100) from MP Biomedicals (Santa Ana, CA, USA). Membranes were then incubated with the secondary antibody goat anti-mouse IgG-HRP (A-5420) from Ancell (Bayport, MN, USA), goat anti-guinea pig IgG-HRP (sc-2438) from Santa Cruz and goat anti-rabbit IgG-HRP (no. 7074) from Cell Signaling. The signals were detected by enhanced chemiluminescence (ECL Western Blotting Reagents, GE Healthcare, Glattbrugg, Switzerland) and detected on photosensitive film (Super RX Fuji x-Ray Film, Fujifilm, Düsseldorf, Germany).

Quantification of cell death by flow cytometry

Floating cells and attached cells were collected and washed with Annexin V staining buffer (150 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 15 mM HEPES pH 7.2, 2% FCS and 10 mM NaN3) and incubated with GFP-Annexin V diluted in staining buffer for at least 30 min on ice in the dark. Cells were then washed in Annexin V staining buffer and resuspended in 500 μ l staining buffer. Propidium iodide was added to a final concentration of 2 μ g/ml, and cells were examined using on an Attune flow cytometer (Applied Biosystems, Zug, Switzerland) and analyzed with the Attune cytometric software v1.2.5 (Applied Biosystems). GFP-Annexin V- and propidium iodide-positive cells were considered as dead cells.

MTT assay and IC50 calculation

Cells were plated in sextuplicates at a density of 3000 cells/well in 96-well plates and allowed to adhere overnight followed by serum starvation for 16 h. The cells were then exposed to 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1 and 5 μ M of GDC-0980 or NVP-BEZ235 for 1 h in serum-free condition, and medium containing serum and the inhibitors were added to the cells and incubated for 72 h. Mitochondrial activity as a readout for cellular viability was assessed by MTT assay. In all, 10 μ l of a 10 mg/ml MTT stock solution (3-amino-9-ethyl-carbazole, Sigma Aldrich, Buchs, Switzerland) was added per well containing cells in 100 μ l DMEM–F12 without Phenol Red. Plates were incubated for 90 min at 37 °C and cells lysed with 100 μ l MTT lysis buffer (10% SDS, 45% dimethyl formamide, adjusted to pH 4.7 by 80% acetic acid/1 M HCl) for 2 h. Absorbance was measured at 570 nm using SpectraMax microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). IC50 was calculated using the GraphPad Prism Software (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA). Cell growth inhibition was assessed using the formula 100 × ( t − t 0)/( c − t 0)=50, where ' t ' is the OD of 72-h exposure time to the test drug, ' t 0' the OD at time 0 and ' c ' the control OD in the absence of drugs.

Anàlisi del cicle cel·lular

For cell cycle analysis, floating cells and attached cells were collected, washed with D-PBS and fixed with ice cold 70% ethanol on ice for 30 min. Then cells were washed twice with D-PBS and incubated with PI/RNAse solution (50 μ g/ml and 100 μ g/ml) at RT for 1 h. Cells were analyzed on an Attune flow cytometer (Applied Biosystems) and data were processed using the ModFit LT cell cycle software (Topsham, ME, USA).

Spheroid formation

To form spheroids, 1000 cells/well for SPC212 and 2000 cells/well for Mero-82 per well were plated on ultra-low attachment 96-well round-bottomed plates (Sigma-Aldrich). Cells were concentrated by gentle centrifugation at 300 × g for 5 min and incubated at 37 °C for 4 days in order to reach 250–300 μ m before starting the treatment. For each treatment, triplicates were performed. After 6 days, volume of the spheroid was calculated by measuring the spheroid diameter on light micrographs. Spheroid growth fold increase was assessed using the formula ( t − t 0)/( c − t 0); ' t '=spheroid volume after 6 days of exposure to test drug, ' t 0'=spheroid volume at time 0 and ' c '=control spheroid volume after 6 days. Viability was performed by determining the ATP content of the spheroids using CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (D160963, Promega, Dübendorf, Switzerland), following the manufacturer's instructions. Luminescence was acquired using GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega).

Lentiviral gene transfer and gene silencing

Two types of short hairpins targeting Atg5 and their respective controls were used: Atg5 shRNA was subcloned in pMSCV-Puro-miR30 (ref 71) and pLKO.1 ATG5 shRNA (Sigma-Aldrich), which were kindly provided by Dr. HU Simon (Bern, CH, Switzerland). HEK 293T cells were co-transfected with PMD2.VSV-G (envelope coding sequence): psPAX2 (packaging elements): shRNA Atg5 or control (total of 5 μ g of DNA) at a ratio of 2:5:3 in 10-cm tissue culture dishes using Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Life Technologies). Lentiviral particles were harvested from the medium 24 and 48 h later, pooled and passed through a 0.2- μ m filter and used fresh for infection or stored in aliquots at −80 °C. Target cell lines were transduced in the presence of 8 μ g/ml polybrene. Successfully transduced cells were selected with 0.3 μ g/ml puromycin for a minimum of 3 weeks.

Anàlisi estadística

IC50 was calculated using the GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Inc.). QQ Plot was used to identify sensitive and resistant cell lines. Drug response viability of the cell lines >1 SD from the mean were considered resistant, and the drug response viability of cell lines <1 SD from the mean were considered sensitive. Statistical analyses were performed using StatView version 5.0.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA). In order to evaluate statistically significant differences between normally distributed variables paired, Student's t -test was used. To assess significance between variables, which were not normally distributed, Mann–Whitney U -test was used. To determine significant additive effects between combination treatments and inhibition of cell death with the inhibitors, ANOVA test was performed. Differences were considered significant when P <0.05.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

  4. 4.

    Figura suplementària 4

  5. 5.

    Figura suplementària 5

  6. 6.

    Figura suplementària 6

  7. 7.

    Figura suplementària 7

  8. 8.

    Figura suplementària 8

  9. 9.

    Figura suplementària 9

  10. 10.

    Figura suplementària 10

Glossari

mTOR

diana de mamífers de la rapamicina

PI3K

fosfatidilinositol 3-cinasa

RIPK1

receptor-interacting protein kinase 1

XIAP

X-linked inhibitor of apoptosis protein

nec-1

necrostatina-1

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)