L'alliberament intracel·lular de ca2 + a través dels receptors de la rianodina contribueix a la disfunció mitocondrial mediada pel receptor ampa i l'estrès er en els oligodendròcits | mort i malaltia cel·lular

L'alliberament intracel·lular de ca2 + a través dels receptors de la rianodina contribueix a la disfunció mitocondrial mediada pel receptor ampa i l'estrès er en els oligodendròcits | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Malalties metabòliques
  • Oligodendròcit
  • Secreció

Resum

La sobreactivació de receptors ionotròpics del glutamat en oligodendròcits indueix una sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ i una mort excitotòxica, un procés que contribueix a la desmielinació i a l’esclerosi múltiple. Els insults excitotòxics provoquen alteracions mitocondrials ben caracteritzades i una disfunció del reticle endoplasmàtic (ER), cosa que no s’entén del tot. En aquest estudi, es va analitzar la contribució de l’alliberament d’ER-Ca 2+ mitjançant els receptors de rianodina (RyRs) i els receptors d’inositol trifosfat (IP 3 Rs) a l’excitotoxicitat en oligodendròcits in vitro . Primer, vam observar que els oligodendròcits expressen tots els RyRs i IP 3 caracteritzats anteriorment. El bloqueig de l'alliberament de Ca 2+ induït per Ca 2+ per TMB-8 després de la sobrecàrrega de Ca-2 α -amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propionat (AMPA) va atenuar tant la mort oligodendròcita com la sobrecarrega citosòlica de Ca 2+. . Al seu torn, la inhibició de RyR per la rianodina també va reduir la sobrecàrrega de Ca 2+ mentre que la inhibició de la IP 3 R no era efectiva. A més, la despolarització de la membrana mitocondrial provocada per AMPA, l'estrès oxidatiu i l'activació de la caspasa-3, que en tots els casos es va veure disminuïda per la inhibició del RyR. A més, vam observar que l’AMPA va induir una resposta d’estrès ER tal com es va revelar per la subunitat α del factor d’iniciació eucariota 2 α fosforilació, la sobreexpressió de les chaperones GRP i la divisió de la caspasa-12 depenent de RyR. Finalment, atenuació de l'estrès ER amb oligodendròcits protegits amb salubrina per excitotoxicitat AMPA. Junts, aquests resultats demostren que l’alliberament de Ca 2+ mitjançant RyRs contribueix a la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+, disfunció mitocondrial, estrès ER i mort cel·lular després d’excitotoxicitat mediada en el receptor AMPA en oligodendròcits.

Principal

Els oligodendròcits, cèl·lules mielinitzants del SNC, expressen receptors funcionals de glutamat ionotròpic, 1 que poden desencadenar la mort de les cèl·lules tant in vivo com in vitro. 2, 3 Per tant, la rellevància de l’excitotoxicitat del glutamat per a les neurones en lesions agudes al SNC i trastorns neurodegeneratius crònics 4 s’ha ampliat a oligodendròcits i malalties desmielinitzadores com, per exemple, l’esclerosi múltiple (EM). 5

Els mitocondris són crucials per a l’homeòstasi intracel·lular de Ca 2+ i l’acumulació de Ca 2+ induïda per insults excitotòxics condueix a la despolarització de la membrana mitocondrial, augment de la producció de radicals lliures d’oxigen i la mort d’oligodendròcits depenent de la caspasa o independent. 6 Al seu torn, el reticle endoplasmàtic (ER) també és crític per a l’homeòstasi de Ca 2+ i el seu estrès contribueix a desordenar desmielinitzants. 7 ER serveix com a magatzem de Ca 2+ d’ intercanvi ràpid i contribueix a la cascada de citosòlic de Ca 2+ alliberant Ca 2+ principalment a través de receptors de rianodina (RyR) i inositol trifosfat (IP 3 R). 8 La família RyR té tres isoformes, totes expressades al cervell, i té múltiples llocs al·lotèrics de connexió de Ca 2+ responsables de desencadenar l'alliberament de Ca 2+ induït de Ca 2+ (CICR) al citosol. 9 IP 3 R (isoformes I, II i III) també s’expressen al cervell i s’activen per Ins (1, 4, 5) P 3, producte metabòlic de l’activitat de la fosfolipasa C (PLC), i també estan regulades per IP 3 -vies independents. Aquests RyR / IP 3 R tenen un paper central en la supervivència cel·lular i en la mort de les cèl·lules apoptòtiques. 11

CICR d’ER pot activar l’apoptosi depenent dels mitocondris mitjançant una sobrecàrrega de Ca 2+ d’aquest orgànul. De fet, els ER i els mitocondris estan acoblats físicament i funcionalment per microdomanes, que inclouen RyRs i IP 3 Rs. 12, 13 Així, la senyalització de Ca 2+ entre aquests orgànuls pot iniciar l’apoptosi mitjançant esdeveniments de toxicitat específics dels mitocondris. A més, ER pot induir apoptosi per vies intrínseques activades per deteriorament de la funció ER. En particular, l'acumulació de proteïnes desplegades o l'esgotament de Ca 2+ d'ER inicia la resposta de proteïna desplegada (UPR) 15 activant la subunitat PERK / α de la via α del factor d'iniciació eucariota 2 (eIF2). 16 L' UPR condueix a una paralització de la traducció i a una sobreexpressió de chaperones GRP per restablir la capacitat de plegament de proteïnes ER. Tot i això, sota un estrès greu ER en si mateix pot induir apoptosi activant la caspasa-12, que s’activa sota la interrupció de l’homeòstasi de Ca 2+ i l’acumulació d’excés de proteïnes dins de la ER. 17

L’estrès i l’excitotoxicitat d’ER s’han associat a trastorns desmielinitzants, però mentre que el lligam entre aquests dos fenòmens s’ha descrit a les neurones, 18, 19 continua sent desconegut en els oligodendròcits. En aquest estudi, hem investigat la contribució de l’alliberament d’ER-Ca 2+ a l’excitotoxicitat oligodendroglial in vitro . En aquest estudi, demostrem que l'activació del receptor α -amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propionat (AMPA) indueix l'estrès ER i la posterior activació de la caspasa-12, així com la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ i Disfunció mitocondrial, que tots depenen de l'alliberament ER-Ca 2+ mitjançant RyRs.

Resultats

Els RyR i els IP 3 R s’expressen en oligodendròcits cultivats

Tant els RyRs com els IP 3 R han estat descrits àmpliament al SNC 20, 21 encara que la distribució específica d'aquests receptors al llarg del cervell encara no està clara. Per confirmar l’expressió de les diferents isoformes RyR i IP 3 R del nostre model oligodendroglial in vitro , es va realitzar un etiquetatge d’immunofluorescència per a cada isoforma i la proteïna bàsica de mielina (MBP) com a marcador oligodendroglial específic. Els oligodendròcits van mostrar la coexpressió de les tres isoformes de IP 3 R (I, II i III) i el MBP (Figura 1). La immunofluorescència i la co-expressió també van ser positives per a les tres isoformes de RyR (Figura 1). La doble coloració d’immunofluorescència mitjançant anticossos MBP va revelar que la isoforma IP 3 R / RyR i la coexpressió MBP es van produir principalment al llarg del cos i processos proximals d’oligodendròcits madurs productors de mielina. En conjunt, aquests resultats indiquen que les tres isoformes d’IP 3 R i RyRs estan presents en els nostres oligodendròcits in vitro derivats del nervi òptic de rata.

Image

Els IP 3 i els RyRs s’expressen en oligodendròcits cultivats. Els oligodendròcits (proteïna bàsica de mielina bàsica específica als oligodendròcits (MBP), vermell) estan tenyits amb anticossos d’IP 3 RI, II, III i de RyR-I, II, III (tots dos en verd). La co-expressió dels receptors i la immunofluorescència MBP es mostra en imatges fusionades (groc). Les sis isoformes s’expressen en cèl·lules MBP + . Barra d’escala: 50 μ m

Imatge a mida completa

El bloqueig de l'alliberament de ER Ca 2+ mitjançant RyRs redueix la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ i l'excitotoxicitat en oligodendròcits

L’activació del receptor AMPA indueix un augment dels nivells citosòlics de Ca 2+ que és suficient per desencadenar excitotoxicitat en oligodendròcits cultivats, sense necessitat d’entrada de Ca 2+ a través de canals activats per tensió ni d’intercanviador de Na + -Ca 2+ . 22 Per estudiar la contribució de l’alliberament d’ER-Ca 2+ a l’excitotoxicitat oligodendroglial, les cèl·lules van estar exposades a concentracions creixents d’AMPA en presència o absència de l’inhibidor de CICR TMB-8. El 23 AMPA (25–100 μ M) va induir una mort cel·lular de 34, 1 ± 3, 6 a 52, 3 ± 3, 7% de control (cèl·lules no tractades, n = 4), que es va reduir significativament en presència de TMB-8 (Figura 2a). Tot i això, la rianodina 9 inhibidora de RyR selectiva no era protectora (figura 2b).

Image

La inhibició de l'alliberament de ER Ca 2+ redueix l'excitotoxicitat induïda per AMPA i la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ en oligodendròcits. ( a, b ) La toxicitat induïda per AMPA es redueix significativament per TMB-8, però no per rianodina. Els oligodendròcits (DIV 1) foren pretractats amb TMB-8 (50 μ M, 30 min) o rianodina (50 μ M, 45 min) i exposats a concentracions creixents d’AMPA en presència de CTZ (100 μ M). La viabilitat es va quantificar 24 hores després pel mètode calceina-AM. Les dades representen mitjans SEM de valors de fluorescència AM de calceina-AM normalitzats d'almenys n = 4 cultius. La importància estadística es va valorar amb la prova t- ( * P <0.05) i l’anàlisi bidireccional de l’anàlisi de la variància (ANOVA) ( P = 0.034). ( c ) AMPA (25 μ M) juntament amb CTZ (100 μ M) indueix un ràpid augment de Ca 2+ citosòlic, que es redueix significativament en presència de rianodina (50 μ M) i TMB-8 (50 μ M) però no per 2-APB (10 μ M). Les neurones es van carregar amb Fura-2 AM durant 30 min abans de l’aplicació de fàrmacs. Les traces representen el curs del temps de [Ca 2+ ] i (significa ± SEM) durant l'exposició a agonista de tres experiments independents

Imatge a mida completa

Per analitzar la contribució de CICR, i particularment de RyRs i IP 3 Rs, a l’augment de Ca 2+ citosòlic induït per AMPA, es va mesurar per microfluorimetria la concentració de Ca 2+ intracel·lular ([Ca 2+ ] i ) després de l’aplicació d’AMPA ( 25 μ M) a oligodendròcits en presència de TMB-8 (50 μ M), rianodina (50 μ M) i inhibidor IP 3 R 2APB (10 μ M). 24 En oligodendròcits estimulats per AMPA [Ca 2+ ] vaig augmentar fins a 841 ± 65 nM ( n = 78 cèl·lules), un efecte que es va reduir molt en presència de TMB-8 (492, 3 ± 67, 4, n = 33 cèl·lules) i rianodina (264 ± 23 nM, n = 96 cel·les; figura 2c). Tanmateix, la inhibició de IP 3 Rs per 2APB (10 μ M) no va atenuar [Ca 2+ ] i significativament (figura 2c). Aquests resultats indiquen que l’alliberament de Ca 2+ a través de RyRs, però no a través d’IP 3 Rs, contribueix a la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ induïda per AMPA i l’excitotoxicitat en oligodendròcits.

La inhibició de RyRs atenua el dany mitocondrial induït per AMPA i l'activació de la caspasa-3 en oligodendròcits

La presa de Ca 2+ mitocondrial durant insults excitotòxics provoca una despolarització de membrana així com la generació d’espècies reactives d’oxigen (ROS) en oligodendròcits de rata cultivats. 6 Com que els mitocondris i els ER poden interactuar mitjançant RyRs, 25 es va analitzar si la inhibició de RyRs pot atenuar la disfunció mitocondrial com a conseqüència de l'excitotoxicitat induïda per AMPA.

Primer, es va utilitzar DCFDA per mesurar la generació de ROS en oligodendròcits estimulats per AMPA (25 μ M, 5 min) després de 30 min de l’insult. En aquestes condicions experimentals, l'exposició a AMPA va augmentar els nivells de ROS fins al 46, 9 ± 11, 2%, n = 7 en comparació amb el control (cèl·lules no tractades, 100%). Aquests nivells es van atenuar significativament per rianodina (10 μ M) a 11, 8 ± 6, 9%, n = 7 (Figura 3a).

Image

El bloqueig de RyR atenua l’estrès oxidatiu, la despolarització mitocondrial i l’apoptosi causada per l’AMPA. ( a ) La Ryanodina redueix la generació de ROS induïda per AMPA en oligodendròcits cultivats. Les cèl·lules es van estimular amb AMPA (25 μ M, 5 min) més CTZ (100 μ M) en presència de rianodina (10 μ M). Els nivells de ROS es van quantificar als 30 min després de la insulta mitjançant la sonda CM-H2DCFDA (30 μ M). Les dades representen un valor ± SEM del% de CM-DCFDA / calceïna-AM de n = 7 cultius. ( b ) La inhibició de l'alliberament de ER Ca2 + mitjançant RyRs atenua la despolarització de la membrana mitocondrial induïda per AMPA. Es van estimular les cèl·lules amb AMPA (25 μ M, 5 min) i CTZ (100 μ M) en presència de rianodina (10 μ M) i es va mesurar el potencial de membrana mitocondrial mitjançant un colorant fluorescent JC-1 1 h després de l'aplicació AMPA. Les dades representen mitjans normalitzats ± SEM de la relació de fluorescència vermell / verd de JC-1 de n = 6 cultius. ( c ) La divisió de la caspasa-3 disminueix en presència de rianodina en oligodendròcits estimulats per l'AMPA. Les cèl·lules van ser exposades a AMPA (25 μ M, 5 min) més CTZ (100 μ M) després de la preincubació amb rianodina (10 μ M) i es van collir 4 hores després per a la detecció de procaspasa-3 per western blot. Les dades representen la densitat òptica dels nivells de procaspase-3 normalitzats a valors de β -actina de n = 4 cultius. ( d ) L'activitat de caspasa-3 induïda per AMPA es redueix en presència de rianodina. Les cèl·lules van estar exposades a AMPA (25 μ M, 5 min) i CTZ (100 μ M) i el reactiu Caspase-Glo 3/7 es va afegir 1 h més tard. Després de 2 h, es va mesurar el senyal luminescent i les dades representen la mitjana de ± SEM dels valors de luminiscència normalitzats als valors de viabilitat cel·lular (calceïna-AM, 1 μ M) per a cada condició de n = 5 cultius. # P <0, 05, ## P <0, 01 en comparació amb el control (cèl·lules no tractades); * P <0, 05 en comparació amb el control (AMPA només), la prova t de l'alumne aparellada

Imatge a mida completa

A continuació, vam examinar si la despolarització mitocondrial estava afectada per la rianodina després d'un insult excitotòxic. Els oligodendròcits es van estimular amb AMPA (25 μ M, 5 min) i es va mesurar el potencial de membrana mitocondrial 1 h més tard mitjançant el colorant fluorescent JC-1. L’AMPA va induir en oligodendròcits una pèrdua de despolarització de la membrana mitocondrial fins a un 79, 01 ± 4% del control (cèl·lules no tractades, n = 6), que es va reduir significativament amb el rianodina (91, 6 ± 3, 8% del control, n = 6) (figura 3b).

Estudis anteriors han demostrat que l’activació submaximal dels receptors AMPA condueix a l’apoptosi en oligodendròcits. 6 Com que aquest procés és precedit principalment per la disfunció mitocondrial i l’activació de les caspases, es va analitzar a continuació si l’alliberament d’ER-Ca 2+ mitjançant RyRs contribueix a aquesta cascada apoptòtica. En oligodendròcits estimulats per AMPA (25 μ M, 5 min), els nivells de proteïna pro-caspasa-3 (inactius), 4 hores després de l'estímul, es van reduir a un 57, 3% en comparació amb cèl·lules no tractades (control, 100%), una característica que es va inhibir en presència de rianodina (107, 1% del control) (figura 3c). Per confirmar l’activació de la caspasa-3, es va quantificar l’activitat escindida-caspasa-3 mitjançant mètodes luminescents. En oligodendòcits tractats amb AMPA (25 μ M, 5 min) l'activitat de caspasa-3 escindida va augmentar fins al 120, 7 ± 2, 6% en comparació amb el control (cèl·lules no tractades, 100%), mentre que el tractament amb rianodina va reduir l'activitat significativament a 104, 3 ± 9, 8%, n = 5 (Figura 3d) En conjunt, aquests resultats indiquen que l'alliberament de ER Ca 2+ mitjançant RyRs contribueix a la disfunció mitocondrial i a la conseqüència de l'apoptosi.

L’excitotoxicitat mediada per AMPA indueix una resposta a l’estrès ER en oligodendròcits

Les neurones es sotmeten a estrès ER durant la dishomeòstasi Ca 2+ induïda per l'excitotoxicitat, 18, 19, efecte que pot ser mediat per RyRs. 26 Per estudiar si AMPA indueix estrès ER en oligodendròcits cultivats, es va analitzar la fosforilació de eI2F α , un objectiu a baix del sensor de tensió ER PERK, així com la subregulació de chaperones com, proteïna regulada per glucosa 78 (GRP78) i GRP94 . L’estímul AMPA (25 μ M, 5 min) va produir una forta fosforilació d’eIF2 α , com ho feia la tampsigargina (5 μ M, 30 min), que indueix l’esgotament del magatzem bloquejant la captació de ER Ca 2+ i serveix de control positiu (figura 4a) . AMPA va desencadenar un augment de peIF2 α fins a 474, 2 ± 107.6%, n = 4, en comparació amb cèl·lules no tractades (control, 100%) (figura 4b). A continuació, vam analitzar els nivells de proteïna GRP78 i GRP94 durant el mateix insult excitotòxic i vam trobar que ambdós estaven regulats, fins a 169, 3 ± 38, 9 i 144, 5 ± 21, 8% de control (cèl·lules no tractades, 100%), respectivament (Figura 4c). Aquests resultats indiquen que els insults excitotòxics mediats pel receptor AMPA indueixen estrès ER i una posterior UPR en oligodendròcits cultivats.

Image

L’AMPA indueix una resposta a l’estrès ER en oligodendròcits in vitro . ( a ) Els insults excitotòxics indueixen un augment dels nivells de peIF2 α en els oligodendròcits. Les cèl·lules es van estimular amb AMPA (25 μ M, 5 min) juntament amb CTZ (100 μ M) i tapsigargina (5 μ M, 30 min), es van fixar 30 min després i es van marcar amb un anticòs contra peIF2 α . Barra d’escala: 50 μ m. ( b ) Les mostres de proteïnes totals es van extreure després de la incubació amb AMPA (25 μ M, 5 min, A25) i els nivells d'eIF2 α i peIF2 α es van quantificar per western blot. Les dades representen el mitjà ± SEM de densitat òptica dels nivells de peIF2 α normalitzats a valors de β -actina de n = 4 cultius. ( c ) L'excitotoxicitat indueix una regulació superior de les chaperones GRP en oligodendròcits. Les mostres de proteïnes totals es van extreure 30 minuts després de l'AMPA (25 μ M, 5 min, A25) més l'estímul CTZ (100 μ M) i es van identificar GRP78 i GRP94 per Western blot mitjançant un anticorp de la seqüència anti-KDEL. Les dades representen el mitjà ± SEM dels valors de densitat òptica normalitzats al senyal β -actina corresponent de n = 8 cultius. * P <0, 01 en comparació amb cèl·lules no tractades; emparellat el test de l'alumne

Imatge a mida completa

AMPA produeix una apoptosi induïda per l'estrès ER de RyR en oligodendròcits

L’estrès greu o perllongat de ER compromet la viabilitat de la mort cel·lular, un mecanisme que pot estar implicat en la fisiopatologia de malalties cerebrals. 27 Per analitzar si l’apoptosi induïda per ER contribueix a l’excitotoxicitat en els oligodendròcits, es va analitzar l’activació de la caspasa-12, que resideix a la part exterior de la membrana ER i es desmunta i s’activa durant l’estrès ER. 17 Cèl·lules estimulades amb AMPA (25 i 100 μ M, 5 min) van passar per un clivatge de caspasa-12, tal com indica els nivells pro-caspasa-12, que es van reduir a 80, 7 ± 4%, n = 8 i 65, 4 ± 15, 9%, n = 5, en comparació amb cèl·lules no tractades (100%), respectivament (Figura 5a). En presència de rianodina, la divisió de caspasa-12 induïda per AMPA es va reduir significativament fins al 101 ± 8, 3% de control, n = 7 (figura 5b).

Image

L'apoptosi induïda per l'estrès de RyR que contribueix a l'excitotoxicitat. ( a ) AMPA (25 i 100 μ M) més CTZ (100 μ M) indueixen una divisió de la dosi de caspasa depenent de la dosi. Es van estimular les cèl·lules durant 5 min, es van preparar extractes de proteïnes totals 1 h després i es va detectar pro-caspasa-12 mitjançant western blot mitjançant un anticorp específic. Les dades representen el mitjà ± SEM dels valors de densitat òptica de la caspasa-12 normalitzats als valors β -actina de n = 8 i n = 5 cultius respectivament. ( b ) La reducció de la pro-caspasa-12 es va reduir en presència de rianodina (10 μ M, 45 min) en oligodendròcits estimulats per AMPA. Les dades representen el mitjà ± SEM dels valors de densitat òptica de la caspasa-12 normalitzats als valors β -actina de n = 8 cultius. ( c ) La mort oligodendroglial induïda per AMPA es redueix amb el salubrinal (Sal), un inhibidor de l'apoptosi d'estrès ER. Les cèl·lules cultivades van estar exposades a AMPA (25 μ M, 5 min) i CTZ (100 μ M) després del tractament amb Sal 10 i 50 μ M durant 30 min. Per determinar la mort cel·lular, es va utilitzar un colorant vital calceïna-AM 24 hores després ( n = 4 cultius). Les dades representen mitjans normalitzats ± SEM # P <0, 05; ## P <0, 01 en comparació amb cèl·lules no tractades. * P <0, 05 en comparació amb AMPA només; emparellat el test de l'alumne

Imatge a mida completa

Finalment, es va analitzar si l’apoptosi depenent de l’estrès ER està implicada en l’excototoxicitat AMPA. Per a això, es va provar el potencial protector de la salubrinal, un inhibidor de la desfosforilació p-eIF2, que s'ha demostrat que facilita l'apoptosi d'estrès ER. La mort cel·lular induïda per AMPA es va atenuar des d’un 13% de control (cèl·lules no tractades, 0%) a 6, 4 ± 1, 3 i 7, 5 ± 2, 6% per tractaments amb salubrina 10 i 50 μ M, respectivament (Figura 5c). Junts, aquests resultats suggereixen que l’AMPA indueix una resposta a l’estrès ER en oligodendròcits, que contribueix a l’excitotoxicitat mitjançant l’activació de la caspasa-12 i que depèn dels RyRs.

Discussió

La deshomeostàsia ER Ca 2+, l'estrès ER i la neurodegeneració estan estretament associades perquè l'esgotament de les botigues ER provoca la regulació dels marcadors d'estrès ER i la mort neuronal. 15 En aquest estudi, demostrem que l'alliberament de ER-Ca 2+ contribueix a la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ induïda per AMPA i a la disfunció mitocondrial que condueix a l'apoptosi en oligodendròcits. A més, demostrem que els insults excitotòxics als oligodendròcits indueixen estrès ER i l’activació de la caspasa-12, que es veu atenuada bloquejant RyRs. Aquestes dades proporcionen una evidència nova sobre l'associació entre excitotoxicitat i estrès ER en oligodendròcits.

Expressió RyR i IP 3 R en oligodendròcits

Els IP 3 i els RyR es coexpressen en neurones i glia i la mobilització de Ca 2+ mitjançant aquests receptors tenen un paper crucial en la senyalització de Ca 2+ en aquestes cèl·lules. Tanmateix, la majoria dels estudis anteriors sobre l’expressió d’aquests receptors al cervell no distingeixen entre diferents isoformes o tipus cel·lulars. Per valorar l’expressió de RyRs i IP 3 Rs en oligodendròcits in vitro , vam realitzar experiments d’immunofluorescència per examinar la presència en aquestes cèl·lules de totes les isoformes descrites anteriorment d’aquests receptors. La immunolabelling per als RyRs va ser positiva per a les tres isoformes dels oligodendròcits cultivats, una troballa que confirma i amplia els informats en un estudi anterior sobre l’expressió de RyR en aquestes cèl·lules que no distingien entre isoformes diferents. A més, es va trobar que les tres isoformes IP 3 R també estan presents en els oligodendròcits, la qual cosa és en gran mesura coherent amb els estudis immunohistoquímics en el cervell de la rata. 20

Alliberació i excitotoxicitat d’ER-Ca 2+

Hem demostrat anteriorment 18 que l’alliberament d’ER-Ca 2+ contribueix a l’excitotoxicitat neuronal, però encara no hi ha evidències clares sobre l’associació entre l’alliberament d’ER-Ca 2+ i l’excitotoxicitat en oligodendròcits. Després d’avaluar la presència de RyRs i IP 3 Rs en oligodendròcits in vitro , es va analitzar la contribució de l’alliberament d’ER-Ca 2+ a la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ i la mort cel·lular induïda per un insult excitotòxic. Primer, vam observar que l’antagonista prototípic intracel·lular de Ca 2+ TMB-8, que s’ha demostrat que inhibeix la CICR mediada per RyR, 23 morts cel·lulars excitotòxiques atenuades en oligodendròcits. Aquest resultat està d’acord amb estudis anteriors realitzats en cèl·lules de granul cerebelós cultivades, protegides contra la neurotoxicitat del glutamat per TMB-8, 30 i van suggerir que ER podria contribuir a l’excitotoxicitat provocant CICR en oligodendrocits exposats a AMPA. En neurones, el CICR està mediatitzat principalment per RyRs i, tot i que la rianodina atenua l'excitotoxicitat en aquestes cèl·lules, 18 no vam observar un efecte protector consistent d'aquest antagonista en oligodendròcits en el paradigma experimental utilitzat. Tot i això, la inhibició de RyRs va reduir significativament la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+ induïda per AMPA en oligodendrocits, coherent amb experiments anteriors realitzats en neurones i en oligodendròcits en els quals el dantrolè antagonista RyR va protegir aquestes cèl·lules contra l’àcid kainic, l’amiloide β - i el glutamat- Toxicitat induïda. 31, 32, 33 En canvi, s'ha demostrat que els IP 3 R també poden estar regulats per Ca 2 + 10 citosòlics i, per tant, participar en un CICR. Tanmateix, el tractament de cèl·lules amb 2APB, un inhibidor 24 d' ús general d'IP 3 R 24 no va influir en la sobrecàrrega de Ca 2+ induïda per AMPA en oligodendròcits. Així, aquestes dades, juntament amb el fet que TMB-8 reduïa la sobrecàrrega [Ca 2+ ] i mediada per AMPA, suggereixen que l’activació del receptor AMPA provoca un CICR de manera selectiva RyR en cèl·lules oligodendroglials.

ER-mitocondria crosstalk en excitotoxicitat

S'ha demostrat que els ER i els mitocondris estan acoblats físicament i funcionalment en termes de senyalització de Ca 2+ . En particular, les dades anteriors suggereixen que les interaccions entre subdominis que involucren RyRs a l'ER i a la mitocondria permeten la transmissió del senyal de Ca 2+ entre aquests dos orgànuls. 25, 34 A més, l’acoblament de Ca 2+ entre RyRs i mitocondris està implicat en l’activació de vies d’apoptosi mitocondrial. 11 Igual que en les neurones, l’afluència massiva de Ca 2+ generada per la sobreactivació dels receptors d’AMPA en oligodendròcits condueix a una despolarització mitocondrial, estrès oxidatiu i escissió de la caspasa-3. 6 Aquests esdeveniments característics de danys mitocondrials es van atenuar mitjançant la inhibició de l'alliberament de RyR-Ca 2+ en oligodendròcits estimulats per AMPA, d'acord amb resultats anteriors, que van demostrar que l'alliberament de Ca 2+ mediada per RyR i IP 3 R activa la via apoptòtica mitocondrial en neurones exposades a β-amiloide 35 o a NMDA. 18 Aquests resultats indiquen que tot i que no s’ha observat directament l’efecte protector de la rianodina, interfereix en els mecanismes moleculars que condueixen a la mort d’oligodendrocits i, per tant, suggereixen que el CICR mediat per RyR contribueix al dany mitocondrial i a l’apoptosi durant l’excitotoxicitat oligodendroglial.

Excitotoxicitat i estrès ER en oligodendròcits

L’estrès i la neurodegeneració greus d’ER estan estretament relacionats, perquè l’activació de la UPR i la interrupció de l’homeòstasi ER Ca 2+ poden provocar una apoptosi neuronal. En particular, els insults excitotòxics indueixen estrès ER i una posterior UPR en les neurones. 18, 19 A més, l'alliberament ER Ca 2+ mitjançant RyRs regula aquesta resposta a l'estrès en les neurones. 18

Els oligodendròcits sintetitzen una gran quantitat de proteïnes durant la mielinització i, com a conseqüència, són molt sensibles a la interrupció de la via secretora i l’homeòstasi ER. Recentment, s’han trobat vies d’estrès ER activades en alguns trastorns de mielina heretats i MS 7, però es coneix poc sobre el desencadenament de l’estrès ER en aquestes cèl·lules en condicions patològiques. Els nostres resultats mostren que els insults excitotòxics mediats pel receptor AMPA indueixen una activació de la UPR en oligodendròcits, probablement a causa d’una interrupció de l’homeòstasi de Ca 2+ . Tal com s’ha descrit anteriorment en les neurones exposades al kainat 19 i a la NMDA, 18 vam observar una ràpida activació de la via eIF2 α , que també s’ha demostrat que protegeix contra la mort i la desmielinització d’oligodendrocits induïda per encefalomielitis autoimmune (EAE). Es va observar també una prepregnació de GRP78 i GRP94, un esdeveniment característic de la UPR relacionada amb lesions neuronals, 27 també es va trobar en lesions desmielinitzades per EM 37 i consistents amb els resultats obtinguts de neurones exposades a insults excitotòxics. 18, 19

A més de la UPR, els resultats aquí mostrats suggereixen que l'estimulació dels receptors AMPA en oligodendròcits cultivats indueix una mort de cèl·lules apoptòtiques induïda per l'estrès ER. La mort cel·lular excitotòxica produïda per AMPA va disminuir en presència de salubrinal, un inhibidor de la desfosforilació p-eIF2 i de l’apoptosi induïda per l’estrès ER. 28 El tractament amb salubrinal es va demostrar prèviament que millora la pèrdua d’oligodendròcits i la hipomielinació induïdes per IFN. 36 En consonància amb l’apoptosi induïda per l’estrès ER, l’AMPA va causar escissió de la caspasa-12 en oligodendròcits, un esdeveniment que s’ha observat en models de neurodegeneració induïts per estrès ER , 17, 38 i específicament en neurones durant l’excitotoxicitat. A més, es va inhibir l’activació de la caspasa-12 durant l’excitotoxicitat quan els RyRs van ser bloquejats per la rianodina, cosa que indica que l’alliberament ER-Ca 2+ induït per AMPA podria desencadenar apoptosi per vies independents de les mitocondries.

En resum, els resultats aquí indicats indiquen que l’alliberament d’ER-Ca 2+ mitjançant RyRs contribueix a l’excitotoxicitat oligodendroglial in vitro . En els oligodendròcits estimulats per l'AMPA, la inhibició de l'alliberament de ER-Ca 2+ dóna lloc a una atenuació de la sobrecàrrega citosòlica de Ca 2+, danys mitocondrials i apoptosi. A més, les nostres dades proporcionen proves que els insults excitotòxics mediats pel receptor AMPA indueixen una resposta a l'estrès ER en aquestes cèl·lules, que contribueixen a l'excitotoxicitat mitjançant l'activació de la caspasa-12 i, per tant, de les vies d'apoptosi específica per ER.

L’excitotoxicitat del glutamat és rellevant per als trastorns desmielinitzants del SNC inclosa la EM. Aquesta idea es recolza en dades que mostren que els antagonistes del receptor AMPA i del kainat milloren els símptomes neurològics en diverses formes de la EAE 39 usades per modelar diverses etapes de la EM. Tanmateix, la contribució de l'alliberament d'ER-Ca 2+ a l'excitotoxicitat oligodendroglial encara no s'havia valorat. Així, les troballes indiquen que l'alliberament ER-Ca 2+ mitjançant RyRs i la posterior estrès ER després d'insults de glutamat contribueixen a l'excitotoxicitat d'oligodendrocits. A més, els intermediaris moleculars de l'estrès ER presentats en aquest estudi poden representar objectius candidats a malalties neurodegeneratives i desmielinitzants que pateixen una mort excitotòxica oligodendroglial.

Materials i mètodes

Animals

Tots els experiments es van realitzar sota la supervisió i amb el vistiplau del nostre comitè d’ètica animal (Universitat del País Basc, UPV / EHU). Els animals eren manipulats d’acord amb la Directiva del Consell de les Comunitats Europees. Es van fer tots els esforços possibles per minimitzar el patiment dels animals i el nombre d'animals utilitzats.

Reactius

L’AMPA, ciclotiazida (CTZ) i rianodina es van obtenir a partir d’Ascent Scientific (Bristol, Regne Unit). La calceïna-AM (calceina acetoximetil èster), CM-H 2 DCFDA i JC-1 es van comprar a Invitrogen (Barcelona, ​​Espanya). HBSS, poli-D -lysine i TMB-8 es van obtenir de Sigma (St Louis, MO, EUA), i salubrinal i 2-APB de Calbiochem (Merck Chemicals, Nottingham, Regne Unit).

Cultius de nervis òptics

Es van obtenir cultius primaris d’oligodendròcits derivats dels nervis òptics de les rates Sprague – Dawley de 12 dies (normalment entre 8 i 10 animals per cultiu) tal com es va descriure anteriorment, 40 amb modificacions. 22 Cèl·lules es van placar a la densitat indicada a continuació per a cada procediment experimental, en plaques de 24 pous amb polietil-D-lisina (10 μ g / ml) revestides de folis de coberta de 12 o 14 mm de diàmetre i mantingudes a 37 ° C i 5%. CO 2 en un medi definit químicament. 40

Anàlisis de toxicitat

Es van realitzar assajos de toxicitat cel·lular com es va descriure anteriorment 41 amb modificacions. Les cèl·lules (1 × 10 4 per pou a 1 dia in vitro (DIV1) van estar exposades a AMPA més CTZ (100 μ M) en el medi 40 anteriorment descrit durant 5 min a 37 ° C. Els antagonistes estaven presents abans i durant l’insult excitotòxic. i la viabilitat cel·lular es va avaluar 24 hores després mitjançant assaig fluorimètric de calceïna-AM Tots els experiments es van realitzar per triplicat / quadruplicat i els valors proporcionats són la mitjana normalitzada ± SEM d'almenys tres experiments independents.

Mesures de potencial intracel·lular de ROS i membrana mitocondrial

Els oligodendròcits (DIV 1; 1 × 10 4 per pou es van estimular amb AMPA 25 μ M més CTZ 100 μ M durant 5 min en absència o presència de rianodina (10 μ M, 45 min) i es van carregar amb 5- (i-6) ) èster acetil (clorometil-2'7'-diclorodihidrofluoresceïna) diacetat (CM-H 2 DCFDA) durant 30 min per a la mesura de la ROS generada. La calceïna-AM (1 μ M) es va utilitzar per quantificar el nombre de cèl·lules del camp de lectura i es va mesurar la fluorescència tal com es va descriure anteriorment.42 Per a la quantificació del potencial de membrana mitocondrial, les cèl·lules es van carregar 30 min després de l'estímul excitotòxic amb colorant JC-1 durant 15 min i es va mesurar la relació de fluorescència vermell / verd. Tots els experiments es van realitzar en quadruplicat i els valors proporcionats són la mitjana normalitzada ± SEM d'almenys tres experiments independents.

Quantificació de l’activitat Caspase-3

Els oligodendròcits (1 × 10 4 per pou) es van xapar en plaques de 96 pous amb revestiment de poli-D-lisina i, després d’un dia in vitro, es van exposar cèl·lules a AMPA 25 μ M més CTZ 100 μ M durant 5 min en presència. o absència de rianodina. Després d'1 h, es va afegir el substrat Caspase-Glo -3/7 (Promega, Madison, WI, EUA) i després de 2 h l'activitat de caspasa-3 es va mesurar segons les instruccions del fabricant. Tots els experiments es van realitzar per triplicat i les dades proporcionades són la mitjana ± SEM dels valors de luminiscència normalitzats als valors de viabilitat cel·lular (calceïna-AM, 1 μ M) per a cada condició.

Immunocitoquímica

Per a l’anàlisi d’expressió d’expressió IP 3 Rs i RyRs 1, els oligodendròcits DIV es van fixar amb 4% paraformaldehid durant 20 min i es van permeabilitzar en 1% BSA, 1% sèrum normal, 0, 05% Triton X-100 en PBS durant 30 min. A continuació, es van bloquejar les cèl·lules en 10% de BSA, 1% sèrum normal en PBS durant 1 h i es van incubar primer amb l'anticòs anti-MBP (1: 500, Stenberger Monoclonals Inc., Baltimore, MD, EUA) durant 1 h a temperatura ambient a 1% BSA, 1% sèrum normal en PBS. Després del rentat amb PBS, es van marcar les cèl·lules amb IgG conjugada de Alexa Fluor 594 (1: 200, Molecular Sondes, Invitrogen, Barcelona, ​​Espanya) durant 2 hores a RT. Les cèl·lules es van rentar en PBS i es van incubar durant la nit a 4 ° C amb l'anticòs primari: anti-IP 3 RI (1: 1000, Affinity Bioreagents, Rockford, IL, EUA); anti-IP 3 R-II (1: 50, Santa Cruz Biotechnologies, Heidelberg, Alemanya); anti-IP 3 R-III (1: 1000, Chemicon, Millipore Iberica, Madrid, Espanya); anti-RyR-I (1: 1000, Chemicon); anti-RyR-II (1: 1000, Chemicon); anti-RyR-III (1: 50, Santa Cruz Biotecnologia). Després del rentat amb PBS, es va afegir anticorpi secundari conjugat Alexa Fluor 488 (1: 200, Molecular Sondes) durant 1 h seguit de la tinció de Hoechst 33258 (5 μ g / ml, 10 min). Finalment, es van rentar els llençols en PBS, es van muntar amb medi de muntatge glycergel (Dako, Glostrup, Dinamarca) i es van analitzar mitjançant microscòpia confocal amb rastreig làser (Olympus Fluoview FV500, Barcelona, ​​Espanya). Els controls sense anticorp primari no van mostrar cap tinció.

Per a la quantificació de peI2F α , es va utilitzar com a anticorp primari anti-peI2F α (1: 100, Cell Signaling, Denvers, MA, EUA) i la tinció es va fer com anterior.

Western blot

Les cèl·lules (1 × 10 5 ) es van rentar amb solució salada tamponada amb fosfat (PBS, 0, 1 M) i es van obtenir en 20 μ l de tampó de mostres d’electroforesi freda amb gel. Els lisats es van bullir durant 10 minuts i es van separar per electroforesi en gel de poliacrilamida SDS del 10-15%, segons l'experiment. Les mostres van ser transferides durant la nit al dia a la membrana de nitrocel·lulosa (Hybond ECL, Amersham Biosciences, Barcelona, ​​Espanya), bloquejades en 5% de llet descremada, 5% sèrum en TTBS i proteïnes detectades per anticossos primaris específics en 5% BSA en TTBS durant la nit a 4 ° C: anti-caspasa-3 (1: 1000, Santa Cruz Biotecnologies); anti-peIF2 α i anti-eIF2 α (1: 1000, Senyalització cel·lular); anti-KDEL (Grp78, Grp94) (1: 1000, Stressgen Bioreagents, Ann Harbour, MI, EUA); anti-caspasa-12 (1: 1000, Calbiochem); anti- β -actina (1: 2000, Sigma). Després del rentat, es van incubar les membranes amb anticossos secundaris conjugats amb peroxidasa de rave (1: 2000, Sigma) en llet descremada del 5%, 1% sèrum normal en TTBS per a 2 h RT i desenvolupats mitjançant quimioluminiscència millorada segons les indicacions del fabricant (SuperSignal West Dura, Pierce, Rockford, IL, EUA). Els senyals es van quantificar mitjançant el programari Image-J (NIH, Bethesda, MA, EUA) i els valors es van normalitzar al senyal β- actina i es van proporcionar com a mitjana ± SEM d'almenys tres experiments independents.

Mesura de [Ca 2+ ] i

La concentració de Ca 2+ intracel·lular ([Ca 2+ ] i ) es va determinar com es va descriure anteriorment en detall. 6, 43 oligodendròcits (10 4 per pou) van ser pre-incubats amb fura-2 AM (Invitrogen) a 5 μ M en medi de cultiu durant 30–45 min a 37 ° C. Els antagonistes es van perfusar contínuament durant 5 minuts abans i durant l’estímul AMPA més CTZ. El ([Ca 2+ ] i ) es va estimar pel mètode de relació 340/380 i les dades es van analitzar amb el programari Excel (Microsoft; Seattle, WA, EUA) i Prism (Lake Forest, CA, EUA).

Anàlisi de dades

Totes les dades s’expressen com a mitjana ± SEM ( n ), on n es refereix al nombre de cultius analitzats, obtinguts cadascun d’un grup d’animals diferent. En els experiments de mesurament [Ca 2+ ] i, n es refereix al nombre de cèl·lules obtingudes d'almenys tres cultius diferents obtinguts formant grups d'animals diferents. L’anàlisi estadística es va realitzar amb l’anàlisi bidireccional de la variància o la prova de Student de la parella i es va determinar la importància a P <0.05.

Glossari

ER

reticle endoplàsmic

RyR

receptor de rianodina

IP 3 R

receptor de tosfat de inositol

AMPA

Propionat d’ α -amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol

CICR

Alliberament de Ca 2+ induït per Ca 2+

ROS

espècies reactives a l'oxígen

eIF2 α

α subunitat del factor d'iniciació eucariota 2

GRP78

proteïna regulada per glucosa 78

SENYORA

esclerosi múltiple