La retirada d’atg5 retarda la maduració i redueix la supervivència de les neurones generades per adults a l’hipocamp | mort i malaltia cel·lular

La retirada d’atg5 retarda la maduració i redueix la supervivència de les neurones generades per adults a l’hipocamp | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Neurogènesi adulta
  • Autofagia
  • Hipocamp
  • Progenitors neuronals

Resum

L’autofàgia és una via de degradació lisosòmica conservada evolutivament que té un paper important en el manteniment, l’expansió i la diferenciació de les cèl·lules. L’eliminació de gens essencials per a l’autofàgia de la tija neural embrionària i les cèl·lules precursores redueix la supervivència i inhibeix la diferenciació neuronal de les neurones generades per adults. Cap estudi ha modificat l’autofagia dins de les cèl·lules precursores adultes, deixant desconegut el paper autofàgic autòfag en la neurogènesi adulta. Aquí demostrem que hi ha un flux autòfag a les cèl·lules progenitores que divideixen els adults i la seva descendència al gir dentat. Per investigar el paper de l’autofàgia en la neurogènesi de l’hipocamp adult, hem suprimit genèticament el gen 5 relacionat amb l’autofàgia ( Atg5 ) que reduïa el flux autòfag i la supervivència de la descendència de les cèl·lules progenitores dividides . Aquesta reducció significativa de la supervivència de les neurones generades per adults va acompanyada d’un retard en la maduració neuronal, incloent una reducció transitòria de la densitat de la columna vertebral en absència d’un canvi de diferenciació. El retard en la maduració cel·lular i la pèrdua de progènie de les cèl·lules nulles Atg5 no estava present en ratolins que mancaven de la proteïna pro-apoptòtica essencial Bax (proteïna X associada a Bcl-2), cosa que suggereix que les cèl·lules amb deficiència Atg5 moren per una Bax mecanisme dependent. A més, es va produir una pèrdua de cèl·lules nul·les d'Atg5 després de l'exposició al funcionament, cosa que suggereix que Atg5 és necessari per augmentar la neurogènesi induïda per la correcció. Aquests descobriments posen de manifest el requeriment autònom cel·lular d’Atg5 en la supervivència de les neurones generades per adults.

Principal

Al cervell adult, la neurogènesi permet el desenvolupament continu de les neurones generades per adults com a resposta a estímuls fisiològics i patològics. Les cèl·lules progenitores neurals (NPCs) dins del nínxol neurogènic de la zona subventricular (SVZ) i la zona subgranular (SGZ) donen lloc a neurones generades per adults dins del bulb olfactiu i dentat, respectivament. 1, 2, 3 La capacitat dels NPCs de proliferar, diferenciar-se i integrar-se en circuits per modificar el comportament fa que la comprensió d’aquestes cèl·lules i els factors que regulen aquests processos siguin crítics per desenvolupar noves teràpies. Això és especialment important per a diverses malalties com ara les malalties neurodegeneratives, incloses les malalties de Parkinson i Huntington que s’associen a una neurogènesi reduïda d’adults, així com d’estratègies de medicina regenerativa per a la recuperació després de l’ictus. 4, 5, 6

Dos grups han trobat que la macroautofagia in vivo (en endavant denominada autofagia) pot regular la neurogènesi adulta examinant l'efecte de la supressió dels gens relacionats amb l' autofagia ( Atgs ). Yazdankhah et al. 7 van trobar que els ratolins embrionaris heterozigots amb l'heterozigota ambra1 i Beclin1 presenten menys NPCs en el SVZ i una reducció associada de la neurogènesi en el bulb olfactiu. Wang et al. 8 van trobar que la supressió condicional de la proteïna que interacciona la família FIP200 de FIP200 (adhesió focal kinasa (FAK) de M r 200 K, també coneguda com ULK1, una proteïna que interactua amb un homòleg Atg1) dels NPC embrionaris esgota progressivament el nombre de NPC postnatals, així com redueix neurogènesi i augmenta l’astrogènesi. En contrast amb l'embrió, Lv et al. 9 van demostrar que un knockdown específic del gen 5 relacionat amb l’ autofagia ( Atg5 ) augmenta la proliferació i inhibeix la diferenciació neuronal dels NPC embrionaris durant el desenvolupament cortical. Aquestes dades suggereixen que les NPC embrionàries i adultes s’alteren quan s’eliminen els gens relacionats amb l’autofàgia a l’embrió. Tanmateix, encara es desconeix si l’autofàgia, independentment dels efectes de l’embrió, és necessària directament per als NPCs i la seva descendència en l’adult.

Aquí es va provar el paper funcional de l’autofàgia específicament al cervell adult eliminant Atg5 de les NPC dividides . Vam trobar que el flux autòfag es produeix en NPCs adults i que l’eliminació d’ Atg5 està associada amb una reducció del flux autòfag . A més, trobem que les cèl·lules nulles Atg5 tenen una reducció significativa de la supervivència, així com un retard en la maduració neuronal. La reducció de la neurogènesi es va produir a falta d’alterar la proliferació o el llinatge cel·lular. A més, l'eliminació de Bax (proteïna X associada a Bcl-2) va restablir la neurogènesi en absència d' Atg5 , implicant les funcions de Bax aigües avall d'Atg5 per regular la supervivència de les neurones generades per adults. Finalment, es va demostrar que la senyalització depenent de Atg5 és necessària per a un augment de la supervivència induïda per les NPCs que es produeixen.

Resultats

Flux autofàgic en NPCs hipocampals i la seva descendència

L’autofàgia és un procés altament dinàmic que inclou la inducció, l’iniciació i l’allargament de la membrana d’aïllament, formant l’autofagoma que es buida després de la fusió amb el lisosoma. La manifestació de la cadena lleugera 3 (LC3) i la LC3 modificada per a la fosfatidil-etanolamina (LC3-II) s'ha mostrat en els NPCs SVZ i la seva descendència al corrent migratori rostral i al bulb olfactiu. 7, 8

Dins del gir dentat, encara no es coneix la distribució cel·lular dels autofagosomes dins dels NPCs i la seva descendència. Així, per provar si l’activitat autofàgica es produeix en els NPCs i la seva descendència a mesura que maduren dins del SGZ, hem utilitzat la proteïna marcada mCherry-EGFP-LC3 monomèrica que s’ha utilitzat recentment per mesurar el flux autofàgic al cervell en neurones madures. 10 Basat en la sensibilitat del senyal fluorescent GFP, però no en el senyal fluorescent mCryry, a les condicions àcides del lumen dels lisosomes, aquest plantejament permet detectar autofagosomes (GFP i mCherry que expressen puncta (GFP + mCherry +)) i autolysosomes (només punxa express mCherry (GFP-mCherry +).

Es va crear un retrovirus mCherry-EGFP-LC3 per infectar i signar el naixement dels NPC dividits i es va examinar l'expressió de la proteïna mCherry-EGFP-LC3 als 3, 7, 14 i 30 dies després de la infecció (DPI). Les cèl·lules infectades es van identificar mitjançant la seva pronunciació expressió de la tinció citoplasmàtica no nuclear de GFP i la puntuació que expressa mCherry, indicativa dels autolisosomes i suggerent de flux autofàgic ràpid (figura 1a). Els autolisosomes eren clarament visibles en el soma i els processos de les cèl·lules infectades. A 3–14 DPI, la quantificació del nombre d’autolisosomes presents a les cèl·lules marcades no va revelar cap diferència significativa en el nombre total d’autolisosoma del soma per cèl·lula infectada (figura 1b). A 30 DPI es va produir una reducció significativa del nombre d’autolisosomes en els processos, però no dins del soma (figures 1b i c). A més, vam confirmar que les cèl·lules infectades eren NPCs i la seva descendència en identificar que el marcador neuronal immatur doblecortina (DCX) s’expressava en el 94 ± 7% i el 93 ± 7% de les cèl·lules infectades a 3 i 7 DPI, respectivament (Figura 1d). Junts, aquestes troballes suggereixen que l’autofàgia és activa en la NPC durant tot el seu desenvolupament i apareix més activa en el procés de desenvolupament a les cèl·lules de menys d’un mes d’antiguitat.

Image

L’etiquetatge retroviral amb mCherry-EGFP-LC3 mostra una activitat autofàgica dins dels NPC presents en el SGZ de la DG. ( a ) Imatges representatives de cèl·lules tàndriques infectades pel retrovirus mCherry-EGFP-LC3 mostrant autolisosomes mCherry + presents durant el procés de maduració de NPC als 3, 7, 14 i 30 dies després de la injecció (DPI). Es van quantificar els autolisosomes dins de ( b ) el soma, així com ( c ) els processos que s’estenen des del cos cel·lular ( n = 2-3 animals per grup, 7-15 cèl·lules / animal, ANOVA unidireccional, ** P < 0, 005 en comparació amb 7DPI). ( d ) La imatge representativa a 7 DPI mostra cèl·lules DCX + que expressen autolisosomes (punta de fletxa apuntant a autolisosomes presents a la dendrita de la neurona que expressa DCX). Barres d’escala = 10 μ m

Imatge a mida completa

Atg5 es requereix per a la supervivència de la descendència de NPCs

Per determinar si l’autofàgia és fonamental per a la supervivència de les NPCs i la seva descendència, es va utilitzar un enfocament de transferència de gens mediat per retrovirus per eliminar Atg5 de les NPC dividides en el cervell adult. Per determinar si la pèrdua d' Atg5 dels NPCs afectaria el flux autòfag, es va comptabilitzar el nombre d' autolysosomes en els ratolins Atg5 + / + i Atg5 flox / flox que van ser injectats amb els retrovirus GFP-Cre i mCherry-EGFP-LC3. Les cèl·lules infectades amb mCherry-EGFP-LC3 solament expressaven GFP en el citoplasma (figura 2a cap de fletxa, major ampliació a la figura 2b), mentre que les cèl·lules infectades amb els dos virus expressaven GFP a tot el nucli i el citoplasma perquè l'expressió GFP a les cèl·lules infectades amb GFP-Cre és nuclear a causa d’un senyal de localització nuclear (figura 2a fletxa, major ampliació a la figura 2c). La quantificació de cèl·lules infectades amb Atg5- null i Atg5 + / + va revelar significativament menys autolysosomes en les cèl·lules Atg5-null tant en el cos cel·lular (figura 2d) com en el procés (figura 2e).

Image

L’eliminació d’ Atg5 mediada pel retrovirus de les NPC dividides redueix el nombre d’autolisosomes i disminueix la supervivència cel·lular. ( a ) Imatge representativa del gir dentat que mostra dues cèl·lules infectades amb retroviral. Una cèl·lula infectada pel virus mCherry-EGFP-LC3 s'identifica mitjançant l'expressió citoplasmàtica de GFP, també identificable a ( b ) amb major ampliació. En canvi, una cèl·lula infectada amb mCherry-EGFP-LC3 i GFP-Cre s'identifica mitjançant EGFP citoplasmàtica i expressió nuclear de GFP, respectivament, també identificables en ( c ) amb major ampliació. Barra d’escala = 20 μ m ( a ) i 5 μ m ( b i c ). El nombre d'autolysosomes en el ( d ) cos cel·lular i ( e ) processos de cèl·lules Atg5-null en ratolins flox / flox d' Atg5 es va reduir significativament en comparació amb les cèl·lules WT en ratolins Atg5 + / + a 7 DPI ( n = 3 Atg5 + / + ratolins, n = 2 ratolins Atx5 flox / flox ; n = 7-13 cel·les / animal; cel·la t (50) = 5, 7, **** P <0, 0001; per processos t (50) = 5, 0, **** P <0, 0001). ( f ) Imatges confocals representatives de cel·les GFP-Cre + (verd), RFP + (vermell) i de doble etiquetada (groc; PF + RFP +) a 3, 7, 30 i 60 DPI de retrovirus ( CAG-GFP-Cre i CAG- RFP ) al gir dentat de ratolins WT ( Atg5 + / + ) i ratolins flotats Atg5 ( Atg5 flox / flox ). Barra d’escala = 20 μ m. ( g ) La proporció de supervivència expressada com GFP + RFP + (groc) sobre totes les cèl·lules RFP + (vermelles + grogues) a 3-60 DPI mostrant menys supervivència de cèl·lules nulles Atg5 a 30 i 60 DPI ( n = 2-5 animals per grup, ANOVA bidireccional, Bonferroni post hoc . ** P <0, 01, *** P ≤0, 005)

Imatge a mida completa

Per tal de mapar el destí i avaluar la supervivència dels NPCs Atg5-null, es va utilitzar una barreja de GFP-Cre retroviral ( CAG-GFP-Cre ) i control RFP ( CAG-RFP ) 11 per infectar els NPC dividits en la SGZ de els ratolins Atg5 flox / flox i papes de tipus salvatge ( Atg5 + / + ). Aquest enfocament es va utilitzar ja que permet la comparació de la relació de les cèl·lules GFP-Cre- i que expressen RFP (GFP + RFP +) amb etiquetes dobles infectades amb Atg5 a totes les cèl·lules que expressen RFP (RFP +), de manera similar publicada pel nostre grup i altres. 11, 12, 13, 14, 15 Tal com s'esperava en els ratolins Atg5 + / +, no hi ha una diferència significativa en la relació de supervivència entre 3 i 60 DPI. En canvi, en els ratolins flox / flox Atg5 es va produir una reducció de la supervivència al llarg del temps, i l'anàlisi post-hoc va revelar una reducció significativa de la supervivència entre 3 i 7 DPI. La reducció significativa de la supervivència de cèl·lules Atg5-nul de 3 a 7 DPI es va associar amb una reducció significativa del percentatge de supervivència entre els ratolins Flox / flox d’ Atg5 i els ratolins Atg5 + / + + de control entre 30 i 60 DPI (figures 2f i g) . El resultat de la proporció de supervivència reduïda també es va recolzar en el recompte de cèl·lules per al nombre mitjà de cèl·lules infectades amb Cre-GFP i RFP, que van revelar una reducció significativa del nombre de cèl·lules infectades amb Cre-GFP a 7 DPI en els ratolins Flox / Flox Atg5 en comparació. amb el control de ratolins Atg5 + / + . La reducció del nombre de cèl·lules Atg5-null (GFP +) es va produir a falta de diferències en el nombre de cèl·lules infectades amb RFP de control en qualsevol moment (figura suplementària 1). Així, en general, els resultats suggereixen que Atg5 és necessari per a la supervivència de la descendència dels PNC durant la finestra crítica de 3 a 7 dies. Aquests resultats suggereixen que la reducció significativa de la supervivència dels NPCs Atg5-null està mediada per l’autofàgia.

La descendència de NPCs Atg5-null presenta un retard en la maduració neuronal a falta de canviar el destí

Per examinar si la pèrdua d' Atg5 va alterar la maduració o el destí de les NPCs, vam quantificar l'expressió de diferents marcadors de llinatge cel·lulars a les cèl·lules Atg5-null en els ratolins Atg5 flox / flox davant de les cèl·lules que expressen Atg5 en el control Atg5 + / + ratolins. A 3 DPI, no hi va haver diferència en la proporció de cèl·lules que expressaven Atg5-null i Atg5 que es dividien, mesurada per cèl·lules GFP + que expressaven el marcador del cicle cel·lular, Ki67 (figura suplementària 2). L'examen i quantificació de les cèl·lules que expressen Atg5-null i Atg5 que expressaven el marcador neuronal immadur DCX variaven significativament entre 3 i 30 DPI (figures 3a i b). A 3 DPI, hi va haver una proporció similar de cèl·lules que expressaven Atg5-null i Atg5 que expressaven DCX. A 7 DPI, es va produir una reducció significativa de la proporció de cèl·lules nul·les Atg5 supervivents que expressaven DCX. En canvi, a 30 DPI es va produir un augment significatiu de la proporció de cèl·lules nul·les Atg5 que van sobreviure que van expressar DCX. Aquesta troballa va plantejar la hipòtesi que les cèl·lules generades per Atg5-nul adult poden tenir un retard en la seva maduració neuronal. En suport d'aquesta hipòtesi es va observar una reducció significativa de la proporció de cèl·lules nulles Atg5 a 7 DPI que van expressar el marcador neuronal madur NeuN (figures 3c i d). Aquest efecte va ser transitori i gairebé tots els NPC van expressar NeuN a 30 i 60 DPI. En suport addicional de les cèl·lules Atg5-null amb retard transitori en la maduració, la proporció de 30 cèl·lules de DPI Atg5-null que expressaven tant DCX com NeuN es va incrementar significativament (figures 3e i f). Combinant la nostra anàlisi del nombre de cèl·lules que expressen Atg5-null i Atg5 que expressen entre 3 i 60 DPI (Figura 2) i percentatge mitjà que es converteixen en neurones a 60 DPI (NeuN +) (Figura 3c), podem estimar més que l'eliminació de Atg5 va reduir el nombre de neurones noves en aproximadament dobles (taxa de supervivència neuronal entre 3 i 60 dies: 53% de tipus salvatge (WT) i 27% Atg5 fl / fl ). Per tant, aquests resultats avalen que Atg5 té un paper pro-supervivència i es requereix per al desenvolupament temporal de la neurona jove immadura a mesura que es desenvolupa en una neurona generada per adults.

Image

La descendència dels NPCs Atg5-nuls supervivents té un retard en la maduració neuronal en absència d’un canvi en el destí. ( a ) Imatge representativa de les cèl·lules GFP-Cre + a 7 DPI marcades amb DCX (fletxes GFP + DCX + cèl·lules amb etiquetes). ( b ) Quantificació de GFP-Cre + que expressa DCX mostrant proporcionalment menys cèl·lules Atg5-nul·les expresses DCX a 7 i més a 30 DPI ( n = 3-5–5 animals per grup, n = 17–23 cel·les / animal, ANOVA bidireccional, Bonferroni post hoc , ** P <0, 01, **** P <0, 0001). ( c ) Imatge representativa que mostra dues cèl·lules GFP-Cre + que expressen NeuN a 30 DPI. ( d ) Quantificació de GFP-Cre + que expressa NeuN mostrant menys cèl·lules Atg5-nul que expressen cèl·lules NeuN + a 7 DPI ( n = 3–5 animals per grup, n = 17–23 cel·les / animal, ANOVA bidireccional, Bonferroni post hoc , * P <0, 05). ( e ) Imatge representativa de les cel·les GFP-Cre + (verdes) que expressen DCX (vermell) i / o NeuN (blau) (punta de fletxa = GFP-Cre + NeuN + DCX− i fletxa = GFP-Cre + NeuN + DCX +). ( f ) Quantificació que mostra més cèl·lules Atg5-null coexpressen DCX i NeuN a 30 DPI ( n = 4 Atg5 + / + , n = 5 ratolins flox / flox Atg5 , n = 17–23 cel·les / animal, a t (7) = 7, 0, P = 0, 0002). Barres d’escala = 20 μ m

Imatge a mida completa

La descendència de NPCs Atg5-null té una reducció transitòria de la densitat de la columna vertebral

La reducció de la significació de la supervivència de les cèl·lules Atg5-nul es va associar amb un retard en la maduració neuronal. Tenint en compte que l’autofàgia s’ha demostrat recentment que regula la poda embrionària de la columna vertebral 16 i la nostra observació d’autolysosomes presents a les dendrites de cèl·lules hipocampals generades per adults (Figura 1), es va examinar si l’eliminació de la desintegració dendrítica alterada d’ Atg5 i la densitat de la columna vertebral a les cèl·lules generades per adults ( Figura 4). L'anàlisi i examen de la longitud dendrítica total no van revelar diferències en les cèl·lules nulles Atg5 en comparació amb les cèl·lules que expressen Atg5 (figures 4a-c). En canvi, es va produir una reducció significativa de la densitat de la columna vertebral a les cèl·lules que expressaven Atg5-nul versus Atg5 a 30 DPI (figures 4d i e). La reducció de la densitat de la columna vertebral va ser transitòria i no va ser significativament diferent en 60 DPI (figura 4e). Aquests resultats es correlacionen amb el retard en la maduració neuronal observada per l'anàlisi del llinatge (figura 3) i un suport addicional que cal Atg5 durant el desenvolupament de les neurones immadures.

Image

Les cèl·lules nul·les Atg5 que sobreviuen mostren un desenvolupament dendrític normal, però retard en el desenvolupament d’espines. ( a ) Imatges confocals representatives que mostren neurones WT i Atg5-null (GFP + RFP +) a 30 DPI. Barra d’escala = 20 μ m. ( b ) L'anàlisi de sholl dels arbors dendrítics de les neurones WT i Atg5-nul·les no mostra cap diferència en la complexitat de les dendrites ( n = 2 animal per grup, 13-20 dendrites / animal). ( c ) La distribució de la freqüència acumulada de cèl·lules nules WT i Atg5 no mostra diferència en la longitud dendrítica total ( n = 2 animals per genotip, 6-13 cèl·lules / animal). ( d ) Imatge representativa d'espines al llarg d'un segment dendrític de neurones WT i Atg5-null a 30 DPI. Barra d’escala = 2 μ m. ( e ) La quantificació del nombre d'espines per 10 μ m revela una reducció de la densitat de la columna vertebral en les neurones Atg5-nul a 30 DPI ( n = 2 Atg5 + / + , n = 4 ratolins Atg5 flox / flox ; n = 3-7 dendrites / animal). ** P <0, 01

Imatge a mida completa

La inactivació de Bax restableix els dèficits induïts per Atg5 en la neurogènesi

La reducció significativa del nombre de cèl·lules Atg5-null ens va portar a la hipòtesi que les cèl·lules nulles Atg5 moriran probablement per apoptosi. De fet, és ben conegut que el nombre de neurones generades per adults només és una fracció del nombre de NPC dividits a causa de la mort de cèl·lules apoptòtiques que es produeix durant la neurogènesi. 11, 17, 18, 19 Per tant, vam provar si el bloqueig de l’apoptosi evitaria la pèrdua de cèl·lules nul·les Atg5. Concretament, vam determinar si les cèl·lules nul·les Atg5 infectades víricament haurien millorat la supervivència en els ratolins que mancaven de la proteïna apoptòtica essencial, Bax. 20 En consonància amb un procés que depèn de l’apoptosi que depèn de l’apoptosi en els NPCs adults en desenvolupament, hem informat anteriorment que els ratolins embrionaris de Bax ( Bax - / - ) tenen un augment significatiu en el nombre mitjà de cèl·lules marcades viralment en comparació amb els ratolins de control del WT, i poden NPCs de rescat madurats per manca de Bcl-2. 15 Per tant, hem criat ratolins embrionaris Bax ( Bax - / - ) amb ratolins Atg5 flox / flox per crear Atg5 + / + Bax - / - i Atg5 flox / flox Bax - / - ratolins littermats i les cel·les marcades es van examinar 30 DPI amb l’estratègia d’etiquetatge retroviral dual. A falta de Bax, no hi va haver cap diferència en la supervivència de les cèl·lules transduïdes retrovirals amb expressió d'Atg5-nul o Atg5 (figures 5a i b). De la mateixa manera, no hi va haver cap diferència en el percentatge d'expressió Atg5-null o Atg5 que expressava DCX a 30 DPI (Figura 5c). Això contrasta fortament amb el retard en la maduració i l’augment significatiu de la proporció de cèl·lules nul·les Atg5 que sobreviuen, que van expressar DCX a 30 DPI en presència de Bax (Figura 3a). En conjunt, aquests descobriments confirmen que l’eliminació de Bax pot rescatar tant la pèrdua de les cèl·lules nul·les Atg5 com el seu retard en la maduració, donant suport a que Atg5 funciona en els NPC madurants a l’aigua de la via apoptòtica de Bax.

Image

La reducció de la supervivència i la maduració dels NPCs Atg5-null depèn de Bax. ( a ) Imatges representatives i ( b ) quantificació de cèl·lules infectades amb retrovirus de 30 dies d'antiguitat a Atg5 + / + ; eBaxKO i Atg5 flox / flox ; Els ratolins eBaxKO no presenten diferències en els índexs de supervivència a 30DPI ( n = 3 animals / grup). ( c ) Quantificació de cèl·lules GFP-Cre + que no mostren diferències en la proporció del DCX express a 30 DPI a Atg5 + / + ; eBaxKO i Atg5 flox / flox ; ratolins eBaxKO ( n = 2 animals / grup, 20–21 cel·les / animal). Barra d’escala = 20 μ m

Imatge a mida completa

Atg5 es requereix per a l’augment de la supervivència de NPCs induït per l’exercici

S'ha demostrat que la carrera augmenta l'autofagia al cervell, 21 i, per tant, hem provat si es necessitava Atg5 per augmentar la neurogènesi induïda per l'exercici. Com era d’esperar, els ratolins Flox / flox i WT ( Atg5 + / + ) que tenien accés lliure a una roda corrent tenien un augment en el nombre de cèl·lules controlades no creades (RFP + ) controlades en comparació amb els ratolins als quals hi havia accés. una roda bloquejada (figura 6a). L'examen dels ratolins WT va revelar que hi havia un augment significatiu de cèl·lules infectades amb Cre (PF +) en els ratolins donat accés a la roda corrent (figura 6b). L'anàlisi de la proporció de supervivència també va mostrar en els ratolins WT un augment significatiu de la proporció de supervivència (figura 6c). En canvi, els ratolins Atx5 flox / flox que estaven exposats a una roda bloquejada o corrent tenien significativament menys cèl·lules Atg5-null (GFP +) en comparació amb els ratolins WT (figura 6b). A més, els ratolins Atg5 flox / flox en comparació amb els ratolins WT van tenir una reducció significativa del percentatge de supervivència en les rodes bloquejades o en cursa lliure (figura 6c). Aquests canvis es van produir en el context de distàncies similars entre els ratolins WT i Atg5 flox / flox (WT 210 836 ± 32 164 m vers Atg 5 fl / fl 159 909 ± 27 434 m). Per tant, en general, aquests resultats suggereixen que l'execució no pot rescatar el fenotip de supervivència nul Atg5, amb Atg5 necessari per als augments induïts en les NPC.

Image

Atg5 es requereix per a l’augment induït de l’exercici en el desenvolupament de NPCs. ( a ) Els ratolins amb accés lliure a la roda corrent en comparació amb una roda bloquejada van mostrar un augment en el nombre de cèl·lules no infectades amb Cre (RFP + ) tant en els ratolins Atg 5 flox / flox com en WT. ( b ) El nombre de cel·les GFP-Cre + va augmentar-se en els ratolins de bloqueig Atg5 + / + vers Atg5 + / + i comparable en Atg5 flox / flox run vers Atg5 flox / flox lock. ( c ) La proporció de supervivència és més elevada en els ratolins Atg5 + / + run vers Atg5 + / + + i comparable en Atg5 flox / flox run vers Atg5 flox / flox lock (per a - c, n = 4 Atg5 + / + lock, n = 3 bloqueig flox / flox Atg5 , n = 4 Atg5 + / + run, n = 6 run Atg5 flox / flox ). Bonferroni post hoc , *** P≤ 0, 0002, **** P <0, 0001, una diferència significativa en comparació amb el grup de bloqueig del mateix genotip

Imatge a mida completa

Discussió

Aquí demostrem que l’autofàgia és activa en la descendència dels NPCs i que Atg5 és necessari per a la supervivència de la descendència dels NPCs adults. El flux autofàgic està present en la descendència dels NPCs hipocampals, detectant autolysosomes dins del soma i les dendrites. Funcionalment, la infecció retroviral de Cre en ratolins flox / flox de Atg 5 redueix els autolisosomes a les cèl·lules nul·les Atg5 i està associada a una pèrdua significativa de la supervivència de la descendència dels NPC durant els primers 7 dies de la seva maduració. La reducció de la supervivència va acompanyada d’un retard en la maduració de la neurona generada per adults que inclou una reducció transitòria de la densitat de la columna vertebral en absència d’alterar la proliferació o el destí neuronal. Els experiments de complementació in vivo amb ratolins eliminadors de Bax indiquen que la reducció de neurones immadures nul·les Atg5 es produeix aigües amunt d’una mort mediada per Bax. A més, el funcionament, que és un conegut inductor d’autofagia, va ser insuficient per revertir el fenotip de supervivència significatiu dels NPCs Atg5- null.

Aquests resultats suggereixen que Atg5 és un dels agents de control que controlen els NPCs del cervell adult que sobreviuen durant el seu desenvolupament cap a noves neurones funcionals.

Aquests resultats s’afegeixen al treball recent d’altres que han examinat l’autofagia i la neurogènesi adulta en vida 7, 8, 9 i mostren per primera vegada que l’autofàgia té un paper pro-supervivència durant el desenvolupament de neurones de l’hipocamp generades per adults. Les nostres conclusions indiquen, a més, que les cèl·lules de 3 a 7 dies passen per un període crític de supervivència que requereixi Atg5. També es mostra l'efecte de supervivència d'Atg5 en els NPCs que es pot produir independentment dels efectes en els cervells embrionaris o en els primers cervells postnatals, independentment de la alteració de la proliferació cel·lular, així com independent dels efectes en la població de cèl·lules mare adultes, ja que aquest retrovirus té l'objectiu de dividir els NPCs. . Per definir si es requereix Atg5 a les cèl·lules mare, els futurs estudis requereixen un sistema inductible per orientar-se a les cèl·lules mare que es divideixen lentament.

L’eliminació d’Atg5 en els NPCs també va suposar un retard significatiu en la seva maduració. El temps de la demora en la maduració es va observar entre una setmana i un mes després de la infecció vírica. Durant aquest temps se sap que hi ha un requisit d’activitat neuronal per afavorir la supervivència cel·lular mitjançant mecanismes dependents de l’activitat, inclosos els NPCs amb un llindar inferior per a potenciació a llarg termini. 3, 22, 23, 24 Per tant, el retard en la maduració pot contribuir a la reducció de la supervivència de les cèl·lules nulles Atg5. Es tracta d'una possibilitat emocionant, ja que diversos estudis han identificat que l'activitat neuronal pot regular l'autofagia mitjançant diversos mecanismes, com ara el transport retrògrad dependent de l'activitat dels autofagosomes i la degradació presinàptica del receptor AMPA. 25, 26, 27, 28 En conjunt, aquestes troballes condueixen a la hipòtesi que l’autofàgia i l’activitat neuronal poden coregular la supervivència dels PNC madurs.

La reducció de la supervivència i el retard en la maduració de les cèl·lules nul·les Atg5 es produeix independentment d’afectar la diferenciació de les NPC dividides en neurones dentades madures. Gairebé tots els NPCs Atg5-nuls que sobreviuen es converteixen en neurones que expressen NeuN en els dos mesos següents. Això és sorprenent, ja que els estudis in vivo que examinen l’autofagia i la neurogènesi recolzen que almenys Ambra1, Beclin1 i FIP200 es requereixen per a la diferenciació neuronal en la descendència d’NPCs adults. 7, 8 Hi ha moltes explicacions possibles que podrien tenir en compte aquesta diferència. Una hipòtesi és que les NPC dividides en transvirus retrovirus podrien ser passades per l’etapa del compromís del llinatge neuronal. No obstant això, aquesta explicació sembla poc probable, ja que recentment es va publicar una disminució del llinatge neuronal en NPCs amb transducció retroviral. Una hipòtesi més probable pot ser que el requisit d’autofagia per a la diferenciació pot ser diferent dins l’embrió enfront dels NPCs adults i la seva descendència. Això podria originar-se per diferències intrínseques en les poblacions de cèl·lules embrionàries o adultes i en la compensació que es produeix en els nínxols neurogènics embrionaris versus adults. Això es recolza en la variabilitat en els resultats fenotípics reportats en els models de ratolins en ablació d' Atg5 in vivo . L'eliminació condicional d' Atg5 a E10.5 dins de la tija que expressa el nidi i els NPCs van induir la neurodegeneració i l'acumulació de proteïnes intracel·lulars, a falta de diferències grosses en la diferenciació. 30 Més recentment, la derrota inductible d’Atg5 o la sobreexpressió d’Atg5 en els NPC corticals a E13 van suggerir que Atg5 era fonamental per promoure el compromís del llinatge neuronal. 9 Amb la mateixa metodologia a E16, aquest grup també va informar recentment que Atg5 promou la diferenciació d’astròcits dins del còrtex. En canvi, es troba que l'eliminació d'Atg5 no altera el destí de la descendència NPC dividida.

El nostre estudi també demostra que l’eliminació de Bax pot rescatar la pèrdua de les cèl·lules nulles Atg5, donant suport a que Atg5 funciona aigües amunt de la via apoptòtica de Bax a les neurones immadures. Tot i que l’autofàgia i l’apoptosi són processos cel·lulars diferents, les xarxes proteïnes que controlen la seva regulació i execució estan molt interconnectades. Per exemple, Atg5 pot induir apoptosi mitjançant la divisió de la forma no conjugada d’Atg5 mitjançant calpines que després interaccionen directament amb el membre de la família Bcl-2, el limfoma de cèl·lules B, més gran (Bcl-xL). 33 Tot i que tant Atg5 com Atg5 truncat no s’uneixen directament a Bax, no se sap si l’atg5 truncat pot afavorir l’apoptosi mitjançant l’activació de molècules similars a Bax-Bak per la inactivació de Bcl-xL. Com que Atg5 truncada promou l’apoptosi i hem constatat que la supressió d’Atg5 afavoreix la mort de la descendència del NPC, és poc probable que l’Atg5 truncat estigui implicat en la mort de les cèl·lules nulles Atg5. Això també es recolza en la nostra recent troballa que la calpaina-1 i la calpaina-2, les proteases que cliveixen Atg5, no tenen dèficits en la neurogènesi adulta. 34

En conjunt, aquestes dades suggereixen que Atg5 pot estar treballant a través de la via autofàgica canònica per regular la supervivència dels PNC en desenvolupament. Si això és cert, llavors induir l’autofàgia hauria de ser capaç de rescatar el fenotip de supervivència. Això podria passar per una via convencional dependent o Atg5 de la via convencional. Mostrem que l'execució requereix Atg5 als NPCs per augmentar la supervivència dels NPCs i, per tant, no pot rescatar el fenotip de supervivència nul Atg5. Es requerirà més estudis per dilucidar amb més detall el paper de l’autofàgia en la neurogènesi induïda per l’exercici al cervell. Per exemple, aquest estudi va examinar el funcionament voluntari, deixant desconegut si els nostres resultats es generalitzessin a totes les formes d’exercici. A més, per provar directament la hipòtesi que els dèficits de supervivència Atg5-nuls que es produeixen en els ratolins naïfs i en execució són Atg5, és necessari un model de ratolí NPC inductible per a dilucidar si un experiment de guany en funció pot rescatar els dèficits de supervivència de la Cèl·lules nulles Atg5.

En conclusió, els nostres resultats recolzen un requeriment autònom de cèl·lules per Atg5 en neurones immadures adultes. Aquesta troballa proporciona informació nova sobre la regulació de la supervivència de la descendència del PNC que és important per dissenyar estratègies terapèutiques destinades a promoure la reparació endògena i millorar l’èxit dels trasplantaments neuronals. Els nostres resultats també tenen implicacions addicionals a causa del creixement exponencial del desenvolupament de terapèutiques que inhibeixen i indueixen l’autofàgia com a intervenció per a diversos tipus de trastorns humans. 36 Per exemple, els inhibidors autofàgics que s’estan provant com a terapèutiques contra el càncer poden tenir efectes secundaris inesperats de la reducció de la neurogènesi. Tot i això, per contra, els inductors autofàgics que s’estan dissenyant per a malalties neurodegeneratives podrien exercir efectes beneficiosos addicionals mitjançant la promoció de la neurogènesi adulta.

Materials i mètodes

Animals

Els ratolins C57BL / 6 es van comprar a Charles River (Saint-Constant, QC, Canadà, mascle, entre 7 i 12 setmanes). Les línies de ratolí que es van genotipar segons els protocols publicats anteriorment incloïen: els ratolins floxed Atg5 de RIKEN 30 i els ratolins Bax eliminadors dels laboratoris Jackson (Bar Harbor, ME, EUA). En cada grup experimental es van incloure un rang de 2-9 ratolins. Els procediments amb animals es van realitzar sota les directrius del Consell canadenc sobre cura dels animals i van ser aprovats pel Comitè per a la cura dels animals de la Universitat d'Ottawa.

Els ratolins es van allotjar en un cicle de llum / fosca de 12 h amb accés gratuït a l’aigua i el menjar. Per a l’exercici d’exercici (figura 6), els ratolins van ser allotjats de manera senzilla amb accés gratuït a una roda de corrent sense fil de perfil baix o a una roda bloquejada (Med Associates, St. Albans, VT, EUA) durant una setmana abans i dues setmanes després d’una infecció retroviral.

Retrovirus i injecció estereotòxica

Fred Gage (The Salk Institute, La Jolla, Califòrnia, EUA) va proporcionar generosament els vectors retrovirals CAG-GFP-Cre i CAG-RFP i les corresponents construccions d’embalatge i embolcall. The retroviruses were generated as previously described. 11 The titers of GFP-Cre and RFP viruses were determined by live tittering using 293T cells and ranged between 2 and 4 × 10 8 infectious units (IU) per ml. The GFP-Cre and RFP virus was injected in a 1 : 1 ratio (volume 1.5 μ l), except for mice used for phenotyping that were injected with only GFP- Cre (volume 1 μ l). The mCherry-EGFP-LC3B plasmid (Addgene, Cambridge, MA, USA, 22418) was used to produce retroviruses as described above and 1.5 μ l was injected into the dentate. In order to target the SGZ, all retroviruses were bilaterally injected into the dentate gyrus (−1.7 mm anterior/posterior, ±1.2 mediolateral, −2.4 mm dorsoventral from Bregma) of mice (7–9 weeks old) during stereotaxic surgery. mCherry-EGFP-LC3B retrovirus was also coinjected with the GFP-Cre retrovirus in both Atg5 +/+ and Atg5 flox/flox mice to determine the effect of Atg5KO on autophagic puncta. Infected cells were distinguished based on either nuclear GFP expression (GFP-Cre infected), cytoplasmic GFP expression (mCherry-EGFP-LC3B infected) or both nuclear and cytoplasmic GFP (GFP-Cre and mCherry-EGFP-LC3B dual-infected) cells.

Tissue processing and immunohistochemistry

Mice were anesthetized and transcardially perfused with cold phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) followed by 4% paraformaldehyde in PBS. Brains were removed and postfixed for 1 h in 4% paraformaldehyde and then transferred into 30% sucrose with 0.1% sodium azide in PBS. Brains were sectioned coronally into 30 μ m slices on a freezing microtome and stored in PBS with 0.1% sodium azide. Histology was performed using free-floating methodology with sections being washed in PBS and incubated in 0.1% Tween-20 and 0.1% Triton X-100 in PBS with corresponding primary antibodies at 4 °C overnight. The following primary antibodies were used: chicken anti-GFP (GFP-1020, Aves, Labs, Inc., Tigard, OR, USA, 1 : 5000), rabbit anti-dsRed (632496, Clontech, Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA, 1 : 5000), rabbit anti-Ki67 (275R-14, Cell Marque, Rocklin, CA, USA, 1 : 100), goat anti-DCX (sc-8066, Santa Cruz, Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA, 1 : 500) and mouse anti-NeuN (MAB377, Millipore, Etobicoke, ON, Canada, 1 : 500). On day 2, sections were washed in PBS, incubated with corresponding Cy2-, Cy3- and Cy5-conjugated IgG antibodies (Jackson ImmunoResearch, Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA, 1 : 500) for 1 h at room temperature, stained using 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 10236276001, Roche, Laval, QC, Canada, 1 : 10 000, 3 min) and washed in PBS.

Cells in the SGZ were counted using an Olympus BX51 fluorescent microscope (Olympus Canada Inc., Richmond Hill, ON, Canada) using unbiased histological approaches in every ninth serial section throughout the dentate, as previously described. 38 The quantification of colabeled cells was performed using a Zeiss LSM510-META confocal microscope (Carl Zeiss, North York, ON, Canada), as previously described. 38 For mCherry-EGFP-LC3 puncta counts, the images were acquired at the confocal microscope using 63 × objective and all puncta were counted irrespective of their size within the infected cells. For spine analysis, dual-labeled cells were imaged at × 63 (oil immersion) with a Quorum Spinning-disk confocal microscope (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON, Canada) at emission wavelengths of 406, 490 and 561. MetaMorph automation and image acquisition software (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) was used to create a high-resolution three-dimensional representation of spines throughout the visible dendritic arbor using 0.5 μ m Z -plane optical sectioning in combination with a tile-scan module. Images were subsequently stitched and flattened in MetaMorph and exported to NeuronStudio (CNIC, Ichan School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA) to measure neurite length. Spines were manually quantified from a single neurite that spanned the hippocampal molecular layer (top of the granule cell layer to the hippocampal fissure) per cell in Fiji image processing software (ImageJ, National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA). Spine density (spines/10 μ m) was calculated as the quotient of the number of spines over neurite length multiplied by 10. Although not specifically quantified, spine density was observed to be similar for any individual cell throughout the molecular layer.

Estadístiques

All data are reported as mean±SEM and statistical analysis performed using GraphPad Prism (v6.0) software (GraphPad Sofware, Inc., La Jolla, CA, USA). Experiments with two groups were analyzed by the two-tailed Student's t- test. Analyses of three or more groups were performed using an ANOVA test followed by Bonferroni post hoc . La importància estadística es va definir com P <0, 05.

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

Glossari

Atg5

autophagy related gene 5

Bax

Bcl-2-associated X protein

NPC

neural progenitor cell

SVZ

subventricular zone

SGZ

subgranular zone

LC3

microtubule-associated protein 1 light chain 3

DCX

doublecortin

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)