Un vector replicon de Kunjin que codifica el factor estimulant de la colònia macròfags de granulòcits per a la teràpia gènica intra-tumoral | teràpia gènica

Un vector replicon de Kunjin que codifica el factor estimulant de la colònia macròfags de granulòcits per a la teràpia gènica intra-tumoral | teràpia gènica

Anonim

Resum

Recentment hem desenvolupat un sistema vectorial viral no citopàtic basat en rèplica no basat en ARN basat en el flavivirus Kunjin. Aquí, il·lustrem la utilitat del sistema de rèplica de Kunjin per a la teràpia gènica. Les injeccions intra-tumorals de partícules semblants al virus de replicon de Kunjin que codifiquen el factor estimulant de la colònia de granulòcits van poder guarir> 50% del carcinoma de còlon CT26 subcutani i melanomes B16-OVA. La regressió de tumors CT26 es va correlacionar amb la inducció de cèl·lules T CD8 anticancerígenes i el tractament de tumors CT26 subcutanats també va provocar la regressió de metàstasis de pulmó CT26. Només algunes estratègies basades en la immunitat són capaces de curar aquests tumors agressius una vegada que siguin d’una mida raonable, que il·lustren el potencial d’aquest sistema vectorial per a aplicacions de teràpia gènica intra-tumoral.

Introducció

La teràpia gènica intra-tumoral (la transfecció de cèl·lules tumorals in situ ) està sorgint com a estratègia viable per tractar malalties malignes en humans. Diverses teràpies gèniques vectorament víriques han demostrat una activitat clínica significativa en els assaigs humans 1, 2 i una, gendicina, ha estat autoritzada. 3 Un dels principals factors limitadors en el desenvolupament d'aquest tipus de teràpies és la manca de modalitats de part que proporcionen de forma segura una expressió gènica de nivell elevat sostinguda in vivo . 4 Recentment hem desenvolupat un nou sistema de lliurament de gens basat en el replicó de RNA no citopàtic i no citopàtic basat en el flavivirus australià Kunjin (KUN). S'han desenvolupat diversos sistemes basats en replicons, 6 amb rèpliques basades en alfavirus, potser els més ben estudiats. El principi bàsic que fonamenta la majoria dels sistemes de rèplica d’ARN és la substitució dels gens estructurals del genoma viral per un gen heteròleg. L’ARN replicon es pot embalar en partícules de tipus virus (VLPs) proporcionant les proteïnes estructurals en trans en les línies cel·lulars d’embalatge. 8 Els VLP resultants es poden utilitzar llavors per infectar / transfectar cèl·lules on l'ARN replicon s'amplifica massivament i contínuament mitjançant rèpliques d'ARN codificades per replicon. Els alts nivells d’ARN asseguren alts nivells d’expressió gènica heteròloga i els intermedis de replicació de doble cadena d’ARN (dsRNA) indueixen interferó (IFN) -α / β i altres “senyals de perill”. 5 Com que no es codifica gens gens estructurals en el genoma del rèplica, no es produeix cap producció de partícules infeccioses de virus i la infecció es limita a una sola ronda. A més, els vectors rèplica basats en VLP proporcionen només ARN, evitant així les possibles complicacions associades a la integració del cromosoma d’ADN. Les característiques addicionals associades als rèplics de KUN són (i) que van ser derivades del virus Kunjin, que és endèmic al nord d’Austràlia i sol causar infecció asimptomàtica en humans, amb casos molt rars de febre lleu i / o encefalitis lleu; 9 (ii) la majoria de les poblacions mundials no tenen anticossos neutralitzadors dirigits al virus KUN; (iii) els enzims de l'ARN polimerasa dels flavivirus semblen replicar l'ARN amb alta fidelitat, 10 una observació confirmada per nosaltres pel sistema de rèplica KUN (dades no publicades); (iv) La recombinació de l'ARN en els sistemes de flavivirus sembla ser extremadament rara i, per tant, el risc de generar virus recombinants potencialment infecciosos tant en pacients tractats com durant la generació de VLP és molt baix i (v) els rèplics KUN no indueixen cap apoptosi ni efectes citopàtics. 5 La recombinació de l'ARN es produeix freqüentment en sistemes d'alfavirus i això pot conduir a la generació de virus recombinants competents en la replicació. 11 A més, en sistemes convencionals d’alfavirus, la transfecció de rèpliques produeix la inducció d’apoptosi / efectes citopàtics i, per tant, s’acaba la producció de proteïnes en pocs dies. En canvi, la transfecció de rèpliques KUN no produeix efectes citopàtics, amb la qual cosa es produeix una proteïna terapèutica sostinguda. A més, quan les cèl·lules transfectades de replicon KUN es divideixen, les dues cèl·lules filles conserven l'ARN replicon i continuen produint proteïnes recombinants. 12

Després del descobriment que les vacunes que contenen cèl·lules tumorals autòlegs irradiades que expressen el factor estimulant de la colònia de macròfags granulòcits (GM-CSF) generen cèl·lules efectives anti-càncer CD8 T, GM-CSF ha estat estudiat àmpliament per la seva utilitat contra el càncer, i el plantejament ha estat ara s'utilitzen en diversos assajos clínics. 13 Més recentment amb l’arribada de la immunoteràpia intra-tumoral, 14 s’han desenvolupat diversos enfocaments que tenen com a resultat la secreció GM-CSF a l’entorn del tumor in situ , evitant així l’obligatorietat de manipular cèl·lules tumorals autòleges in vitro . Les modalitats de lliurament intra-tumorals de GM-CSF inclouen vectors d’ADN, 15, 16 vaccínies, 17 microsfores encapsulades, 18 hidrogels bioadhesius 19 i vectors virus de l’herpes simplex (HSC) infeccioses d’un cicle únic (DISC). 20 DISC / HSV-GM-CSF han finalitzat assaigs de melanoma en fase I amb resultats prometedors. 2 L’ atracció i maduració de cèl·lules dendrítiques semblen ser els components crítics del mecanisme d’acció 21-22 de GM-CSF amb destrucció del tumor depenent en gran mesura de cèl·lules T anti-càncer CD8. 20, 23, 24, 25

L’IFN-α / β està aprovat per al tractament de diversos càncers i media una sèrie d’activitats directes contra els càncers, les més conegudes de les quals són alentiment del cicle cel·lular, promoció de la diferenciació, anti-angiogènesi i promoció de l’apoptosi. 26 L’ IFN-α / β també és un enllaç important entre el sistema immunitari innat i el adaptatiu. IFN-α / β afavoreix la generació de cèl·lules T CD8 esbiaixades amb Th1 mitjançant l'estimulació de cèl·lules dendrítiques. 27, 28 cèl·lules dendrítiques tractades amb IFN-α també tenen una capacitat productora d’interleucina (IL) -12 i generen un nombre més gran de cèl·lules T anti-càncer CD8. L’ IFN-α / β també actua directament sobre les cèl·lules T CD8 per afavorir la supervivència, l’expansió clonal, la diferenciació i la memòria. 30, 31, 32, 33 L’ expressió d’IFN-α / β mediada per la transfecció per part de cèl·lules tumorals in vivo també millora l’activitat anticancerigen, 34 incloent cèl·lules T anti-càncer CD8. 35 A més, s'ha demostrat que l'IFN-α / β sinergitza amb GM-CSF per millorar la inducció de les cèl·lules T CD8 per part de les cèl·lules dendrítiques. 36, 37 La teràpia amb una vacuna de cèl·lules tumorals que segrega GM-CSF també es va demostrar que es va millorar substancialment quan es va injectar IFN-α al lloc del tumor, amb la millora de la teràpia associada a l'augment de cèl·lules T CD8 anticancerígenes. 24

Aquí es va voler explotar la sinergia entre IFN-α / β i GM-CSF per a la teràpia gènica intra-tumoral mitjançant la construcció d’un vector de rèplica de Kunjin que codifica GM-CSF. També es va introduir una mutació a la proteïna no estructural del vector NS2A ( 30 Ala a 30 Pro), que esperava augmentar el nivell de producció d’IFN-α / β mitjançant cèl·lules transfectades per replicon. Ja hem demostrat anteriorment que aquesta mutació desactiva la capacitat del virus per limitar la inducció d’IFN-α / β sense afectar l’expressió gènica heteròloga. 38, 39

Resultats

Construcció KUN GM-CSF

La construcció del rèplica KUN GM-CSF es mostra a la figura 1a. Els diversos elements de les construccions de rèplica KUN i els seus papers han estat descrits anteriorment. 5 El gen GM-CSF està flanquejat per un virus de malaltia de la boca i la boca 2A lloc d'autoproteasa (FMDV2A) i un lloc d'entrada de ribosoma intern (IRES) del virus de l'encefalomicarditis. Aquests elements asseguren que la proteïna GM-CSF es separa de la seqüència C20 al seu terminal N i que les proteïnes no estructurals (que codifiquen les rèpliques d'ARN) es tradueixen malgrat el codó stop al final del gen GM-CSF. L’ ARN AR -transcrit es va utilitzar per generar VLPs de KUN GM-CSF per transfecció d’una línia cel·lular d’embalatge, que subministra les proteïnes estructurals KUN en trans . 8 Després de la infecció de cèl·lules, les rèpliques d'ARN codificades per replicas KUN amplifiquen massivament l'ARN replicon, produint un gran nombre de molècules d'ARN codificant GM-CSF. La replicació dsRNA intermedia també indueix 'senyals de perill', que es tradueixen en la secreció de IFN-α / β (figura 1b). 5

Image

( a ) Construcció KUN GM-CSF. Promotor de l'ARN polimerasa SP6. UTR, regions no traduïdes; Stop, Stop codon; IRES, lloc d’entrada de ribosomes interns del virus de l’encefalomicarditis; KUN NSPs, KUN proteïnes no estructurals NS1, 2A, 2B, 3, 4A, 4B i 5; C20, primers 20 codons de proteïna nucli KUN; E22, últims 22 codons de proteïna KUN E; FMDV2A, virus de la malaltia del peu i la boca 2A autoproteasa; HDVr, ribozimme antigenòmic del virus del virus de l’hepatitis delta; senyal pA, SV40 poliA. ( b ) Representació esquemàtica del mecanisme d’acció proposat. La infecció de cèl·lules tumorals per VLPs de KUN GM-CSF dóna com a resultat l'expressió de rèpliques que codifiquen l'ARN replicon i GM-CSF, amb la replicació dsRNA que indueix IFN-α / β.

Imatge a mida completa

Secreció de GM-CSF i IFN-α / β in vitro

Es va utilitzar un bioanàlisi GM-CSF per il·lustrar que les cèl·lules KUN GM-CSF infectades amb VLP, però no infectades, van produir GM-CSF. En aquests assaigs, el 55-90% de les cèl·lules Vero van estar infectades amb VLP determinades per la tinció d'anticossos d'immunofluorescència (IFA) (dades no mostrades). L'interval de GM-CSF bioactiu produït per cèl·lula cada 60 h va ser així de 0, 26–0, 43 pg (figura 2a). Es van obtenir valors similars quan es van utilitzar VLP KUN GM-CSF per infectar cèl·lules BHK i B16 (dades no mostrades). Això es compara amb 0, 15 pg / cèl·lula cada 24 h segregades per cèl·lules B16 transfectades de manera estable amb un plasmidi d’ADN que codifica GM-CSF murí 40 i ∼ 0, 2 pg / cèl·lula cada 24 hores per a cèl·lules CHO que expressen de forma estable GM-CSF humana. 41 Per al sistema GM-CSF DISC-humà, es va reportar que la producció de GM-CSF va ser de 0, 023–0, 3 pg / cèl·lula cada 24 hores per a un rang de línies cel·lulars de càncer humà. 42

Image

( a ) Secreció de GM-CSF bioactiva per part de cèl·lules infectades per KUN GM-CSF. Les cèl·lules Vero es van infectar amb VLP GM-CSF KUN i els sobrenedants es van analitzar per duplicat per GM-CSF mitjançant bioassaig a les 60 h. Les dades mostren la mitjana de dos experiments ± se ND, no detectats. ( b ) Secreció d’IFN-α / β. Les KL replicon VLPs que codificaven el tipus salvatge NS2A (WT NS2A) o NS2A mutat per A30P (NS2A / A30P) es van utilitzar per infectar cèl·lules A549 i sobrenedants analitzats per duplicat per IFN-α / β per bioassaig. Les dades mostren la mitjana ± sd ( c ) Tinció Dual IFA de cèl·lules Vero infectades amb VLPs KUN GM-CSF, que es van recol·lectar a partir de sobrenedants de la línia cel·lular d’embalatge el dia 2 després de la transfecció d’ARN, amb anticossos específics per NS1 i GM-CSF. L’últim plafó mostra una combinació dels dos primers plafons. ( d ) Inserir estabilitat. Es mostra el títol infecciós calculat amb anticossos anti-NS1 o anti-GM-CSF de VLPs recollits de la línia cel·lular d’embalatge els dies indicats. Es va eliminar tot el sobrenedant i es va substituir per un medi fresc a cada collita. Es mostra el percentatge de VLPs que expressen GM-CSF i es va calcular mitjançant el títol GM-CSF / Títol NS1 × 100.

Imatge a mida completa

Recentment hem identificat una mutació, 30 Ala a 30 Pro (A30P) en la proteïna no estructural NS2A de KUN, que inhabilita la capacitat del virus per limitar la inducció IFN-α / β. 38, 39 Com era d’esperar, les cèl·lules infectades amb VLPs que contenien aquesta mutació NS2A / A30P produïen substancialment més VLP IFN-α / β que les VLP de tipus salvatge (WT) a les 18 h després de la infecció (figura 2b). Si se suposa una bioactivitat de 2, 18 × 10 8 U mg −1, les cèl·lules infectades amb VLP de KUN A30P van produir al voltant de 6 ng de cèl·lules IFN-α / β / 10 6 cada 18 h, la qual cosa és comparable a les cèl·lules IFN-α / 10 6 de 7, 8 ng. cada 18 hores produïdes per cèl·lules tumorals transfectades amb un plasmidi d'ADN que codifica IFN-α, 43 però a un ordre de magnitud inferior a la produïda per cèl·lules tumorals transfectades amb un vector adenovirus que codifica IFN-α. 35 Tots els experiments aquí descrits van utilitzar VLP KUN GM-CSF que contenien la mutació NS2A / A30P.

Tot i que es pot predir que l’augment de la producció d’IFN-α / β a partir de rèpliques amb la mutació NS2A / A30P hauria d’inhibir la replicació d’ARN replicon (i per tant la producció GM-CSF), aquest no és el cas perquè NS2A, NS2B, NS3, NS4A i NS4B també inhibeixen la senyalització del receptor IFN-α / β. 44 Així, tot i que les cèl·lules transfectades amb replicon segreguen IFN-α / β, són resistents a l’activitat antiviral d’IFN-α / β. És important destacar que aquesta resistència als efectes antivírics de l’IFN-α / β es conserva a les cèl·lules transfectades amb rèpliques que contenen la mutació NS2A / A30P (WJ Liu i AA Khromykh, observació inèdita).

Inserir estabilitat

Nosaltres 45 i altres 46 han notat que les VLP de flavivirus poden deixar anar l’expressió de certs gens inserits mitjançant mecanismes que actualment estan mal entesos. El potencial d'inestabilitat genètica no és únic als rèplics de flavivirus i s'ha descrit per a molts vectors virals recombinants. 47, 48, 49, 50, 51 Hem observat que per a rèpliques de Kunjin inestables, la supressió d’inseriments es produeix durant la generació de VLP a la línia cel·lular d’embalatge, i allargar el temps entre la transfecció d’ARN de la línia cel·lular d’embalatge i la recol·lecció dels VLP augmenta la proporció. de VLPs que no expressen el gen inserit. 45 Per examinar l’estabilitat d’inserció dels VLPs KUN GM-CSF, les VLP recollides els dies 2, 3 i 4 van ser analitzades per IFA per determinar el títol infecciós de VLPs utilitzant anticossos anti-NS1 i anti-GM-CSF. Un exemple de les imatges de IFA obtingudes es mostra a la figura 2c, que il·lustra que després de la infecció per VLP (a multiplicitat d'infecció (MOI) = 0, 04), gairebé totes les cèl·lules que expressen NS1 també expressen GM-CSF. Això es va repetir per a les VLP recollides els dies 3 i 4, i les dades derivades de cèl·lules tenyides anti-NS1 i anti-GM-CSF es van convertir en títols infecciosos (figura 2d). L'estabilitat de les plaquetes va ser molt alta, amb només una disminució insignificant de les VLP recollides el dia 4. Així, per a aquesta construcció, l'estabilitat genètica semblava ser molt elevada.

Tractament VLP KUN GM-CSF de tumors CT26

Per provar l’activitat anticancerigen de la teràpia VLP intra-tumoral de KUN GM-CSF, es van injectar cèl·lules de carcinoma de còlon CT26 per via subcutània (sc) a la part posterior de ratolins Balb / c. Al cap de 3 dies, quan els tumors havien aconseguit una mida mitjana de ∼ 9 mm 2 (rang: 6–12), es van tractar diàriament durant 10 dies amb injeccions intra-tumorals de VLPs KUN GM-CSF, VLPs de control KUN, mitjà, o no va rebre cap tractament. Es va controlar la mida del tumor i es van eutanitzar els animals quan els tumors van arribar als 100 mm 2 . Els animals tractats amb VLP KUN GM-CSF van sobreviure significativament més temps que els que van rebre VLPs de control KUN (test de classificació del registre: P = 0.017). Els animals tractats amb VLP amb control KUN també van sobreviure més temps que els animals tractats amb medi o els animals que no van rebre cap tractament (test de classificació P = 0, 019 per a tots dos) (Figura 3a). Els tumors del 50% dels animals tractats amb VLP KUN GM-CSF van créixer fins als 20–50 mm 2, però després van començar a retrocedir al voltant dels dies 7–12 i van arribar a ser indetectables el dia 18 i van romandre indetectables fins al final de l’experiment el. dia 64 (Figura 3b, quadrats negres, amb l'etiqueta "curat"). Els tumors en els animals restants del grup de tractament KL GM-CSF VLP van créixer marginalment més lent que els tumors en els altres grups, però finalment van assolir els 100 mm 2 (figura 3b, quadrats negres, amb l'etiqueta "no curada"). En sis experiments repetits separats, el tractament amb VLP KUN GM-CSF va ser capaç de curar, de mitjana, el 50% dels tumors CT26 establerts (taula 1), amb corbes de supervivència i creixement similars a les mostrades a la figura 3 (dades no mostrades). A la dosi 2 × 10 6 UI, el KUN va controlar el tractament amb VLP ni va regressar ni curar cap dels tumors (taula 1).

Image

Tractament VLP KUN GM-CSF de tumors CT26. Els ratolins BALB / c van ser inoculats sc el dia -3 amb cèl·lules CT26, i quan els tumors havien assolit una mida mitjana de ∼ 9 mm 2 el dia 0, se'ls va tractar amb injeccions de VLPs de rèplica KUN que codificaven GM-CSF (KUN GM -CSF VLP) ( n = 8), KUN replican VLPs que codifiquen la β-galactosidasa (control KUN VLP) ( n = 8), DMEM (el medi mitjà d'Eagle modificat per Dulbecco) ( n = 8) o es van deixar sense tractar (no hi ha tractament) ( n = 5) Els animals es van eutanasiar quan els tumors van arribar als 100 mm 2 . ( a ) Corbes de supervivència de Kaplan-Meier per als quatre grups. ( b ) Corbes de creixement del tumor del mateix experiment. Quan el tumor d'un animal va arribar als 100 mm 2 i es va eutanasiar, es va incloure un valor de 100 per a aquest animal en el càlcul de la mida mitjana del tumor en moments posteriors. Els animals del grup de tractament VLP de KUN GM-CSF (quadrats negres) es representen en dos grups separats ( n = 4 per grup), un on el tractament va guarir els tumors (curar) i l’altre quan el tractament no va curar el tumor (no curat).

Imatge a mida completa

Taula completa

Inducció de cèl·lules T CD8 mitjançant tractament KL GM-CSF VLP de tumors CT26

L’epítop dominant de cèl·lules T CD8 presentat pels tumors CT26 és SPSYVYHQF, i la regressió dels tumors CT26 mitjançant tractament intra-tumoral DISC / HSV-GM-CSF es va correlacionar amb la inducció de respostes de cèl·lules T CD8 específiques de SPSYVYHQF. 25 Per determinar si la regressió dels tumors CT26 també es va correlacionar amb aquestes respostes, es van tractar els ratolins com a la figura 3, tret que el dia 10 els ratolins es van eutanasiar i es van analitzar els esplenòcits per a cèl·lules T específiques de SPSYVYHQF mitjançant ELISPOT IFN- vivo . Els ratolins amb tumors progressius després del tractament amb VLPs de control KUN o VLP KUN GM-CSF KUN presentaven respostes similars a les cèl·lules T CD8 (Figura 4a). Els tumors d’aquests ratolins mostraven corbes de creixement molt similars a les mostrades a la figura 3b (dades no mostrades). Els ratolins amb tumors de regressió després del tractament amb VLP KUN GM-CSF van mostrar respostes significativament més altes específiques per a SPSYVYHQF (test Mann-Whitney, P = 0.024). Els tumors d’aquests ratolins presentaven corbes de creixement molt similars a les mostrades a la figura 3b, guarides (dades no mostrades). Així doncs, la regressió dels tumors CT26 després del tractament amb VLPs KUN GM-CSF també es va correlacionar amb la inducció de cèl·lules T CD8 específiques del tumor.

Image

( a ) Anàlisi ELISPOT IFN-γ ex vivo . Els tumors CT26 van ser inoculats i tractats com a la figura 3, excepte que el dia 10, es van matar ratolins i es van analitzar esplenòcits per a les respostes de cèl·lules T CD8 específiques de SPSYVYHQF per IFN-γ ELISPOT. Regressant els tumors tractats amb VLP KUN GM-CSF (comportats com els de la figura 3b, curats) ( n = 3); progressant els tumors tractats per VLP KUN GM-CSF (que es comporten com els de la figura 3b, no curats) ( n = 3) i progressant els tumors de control KUN i VLP i de tractament mitjà (comportant-se com els de la figura 3b) ( n = 2 i 6, respectivament). ( b ) Resistència a recapacitats. Els animals ( n = 7) els quals el tumor CT26 havia estat guarit per tractament VLP de KUN GM-CSF van ser repassats 35-42 setmanes després amb tumors CT26 (KUN GM-CSF VLP). Un grup de ratolins ingents d’edat similar ( n = 4) van rebre el mateix repte CT26 (controls). Els animals es van eutanasiar quan els tumors van arribar als 100 mm 2 i les dades es presenten com a corbes de supervivència de Kaplan-Meier. ( c ) Regressió de metàstasis pulmonars. Els ratolins van ser inoculats amb tumors CT26 intravenosos (No hi havia tumors primaris, n = 10) o tumors CT26 intravenosos més tumors subcutanis (medi, it i KUN GM-CSF VLP, it). Els tumors subcutanis, quan van assolir ∼ 10 mm 2, van ser tractats amb injeccions intratumuorals de medi (it, n , 7) o KUN GM-CSF VLP (KUN GM-CSF VLP, it, n = 17) com anteriorment. El dia 24, es va determinar el nombre de metàstasis pulmonars en els tres grups. Al grup VLP KUN GM-CSF, el tumor primari s’havia retrocedit en 9 i 17 animals.

Imatge a mida completa

Els animals curats pel tractament VLP de KUN GM-CSF van ser resistents al repte CT26

Un grup d'animals curats amb els seus tumors CT26 mitjançant tractament KL GM-CSF VLP (Taula 1) van ser reclosos 35-42 setmanes després amb tumors CT26. En comparació amb els animals de control, els animals curats anteriorment i curats eren significativament més resistents al repte (test de classificació del registre, P = 0.016) (figura 4b). Aquest experiment proporciona una evidència addicional que la cura de tumors CT26 mediada per VLP KUN GM-CSF va provocar la inducció d’una resposta immune adaptativa, que es podria recordar després d’un període significatiu.

El tractament VLP KUN GM-CSF va donar lloc a la regressió de metàstasis llunyanes

La teràpia gènica GM-CSF de tumors primaris s'ha demostrat anteriorment per produir inducció de cèl·lules T anti-càncer CD8 que no només van regressar els tumors tractats, sinó que van retrocedir metàstasis distants (que no estaven sent tractades directament amb la teràpia gènica). 2, 25 Per determinar si el tractament amb VLP KUN GM-CSF de tumors subcutanats també comportaria la regressió de metàstasis pulmonars llunyanes, es van inocular grups de ratolins el mateix dia amb tumors CT26 (i) per via subcutània per establir la primària nominal. tumors i (ii) per via intravenosa per establir metàstasis pulmonars. Quan els tumors primaris van arribar a 10 mm 2, van ser tractats amb VLP GM-CSF o mitjà, com a la figura 3. Els ratolins els tumors primaris dels quals van ser tractats amb VLP GM-CSF KUN (Figura 4c, VLP KUN GM-CSF, tenia) nivells significativament més baixos de metàstasis pulmonars (Test Mann-Whitney, P = 0, 027) que els que els tumors primaris van ser tractats amb medi (figura 4c, mitjà). Un altre grup de control (figura 4c, sense tumors primaris), que va rebre metàstasis pulmonars però no tumors primaris, va desenvolupar més metàstasi pulmonar que els animals que van rebre tant metàstasi pulmonar com tumors primaris (figura 4c, mitjana). Així, com s'ha observat anteriorment en aquest model, un tumor primari sembla ser capaç de suprimir el creixement de metàstasis pulmonars. No obstant això, aquesta supressió es va incrementar clarament de manera significativa ( P = 0.027) quan es van tractar els tumors primaris amb VLP KUN GM-CSF. Es va informar d’un resultat similar pel tractament DISC / HSV-GM-CSF. 25 Aquest experiment confirma de nou la afirmació que la inducció de cèl·lules T CD8 es basa en el mecanisme d’acció del tractament VLP KUN GM-CSF i també il·lustra un avantatge important d’aquest tipus de teràpia, a saber, la regressió de metàstasis llunyanes.

Programació i dosificació

Al sistema CT26 es van provar diversos esquemes de tractament diferents (taula 2). Deu tractaments diaris (amb una dosi de tractament global de 20 × 10 6 UI) de VLPs de KUN GM-CSF semblen ser òptims, amb freqüències d'injecció reduïdes, que redueixen importants reduccions de la cura. L’augment de la dosi cinc vegades (10 × 10 7 ) amb un calendari de 10 injeccions diàries també va proporcionar un augment de les taxes de curació (taula 2). Curiosament, amb aquesta dosi i aquest calendari, les VLP de control de KUN van produir una taxa de curació del 38%, que il·lustra que l’activitat anticancerigen de les VLP de control de KUN que es veuen a les figures 3 i 5 és suficient per curar aquests tumors quan la dosi de VLPs és prou alta.

Taula completa

Image

Tractament KLM GM-CSF VLP de tumors B16-OVA. Els ratolins C57BL / 6 van ser inoculats sc el dia -3 amb cèl·lules B16-OVA, i quan els tumors havien assolit una mida mitjana de ∼ 12 mm 2 el dia 0, van ser tractats amb injeccions intra-tumorals de VLPs replicon KUN que codificaven GM- CSF (KUN GM-CSF VLP) ( n = 6), KUN replican VLPs que codifiquen la β-galactosidasa (control KUN VLP) ( n = 6), DMEM (el medi Eagle modificat de Dulbecco) ( n = 8) o es van deixar sense tractar (Sense tractament) ( n = 10). Els animals es van eutanasiar quan els tumors van arribar als 100 mm 2 . ( a ) Corbes de supervivència de Kaplan-Meier per als quatre grups. ( b ) Corbes de creixement del tumor del mateix experiment. Quan el tumor d'un animal va arribar als 100 mm 2 i es va eutanasiar, es va incloure un valor de 100 mm 2 per a aquest animal en el càlcul de la mida mitjana del tumor per a aquest grup en moments posteriors. Els animals del grup de tractament VLP KUN GM-CSF (quadrats negres) es van dividir en dos grups; un on el tractament va guarir els tumors (curat) ( n = 4) i l’altre en què el tractament no va curar el tumor (no curat) ( n = 2). ( c ) Expressió in vivo de GM-CSF i IFN-α. Els animals van ser tractats com en el quadre a ( n = 4 per grup), excepte que el dia 5, es van excedir els tumors i es van analitzar per duplicat per a expressió de mRNA GM-CSF i IFN-α. Per a l'expressió GM-CSF P <0.05 per al tractament KL GM-CSF VLP en comparació amb VLP i mitjà KUN de control. Per a l’expressió IFN-α, P <0, 05 per a KUN GM-CSF VLP i KUN controlen VLP en comparació amb el medi.

Imatge a mida completa

Tractament KLM GM-CSF VLP de tumors B16-OVA

Per determinar si la teràpia KL GM-CSF VLP podria tenir utilitat en altres tipus de tumor i altres soques de ratolí, es van tractar tumors de melanoma B16-OVA que creixien en ratolins C57BL / 6 tal com es descriu a la figura 3. Es va aconseguir una taxa de curació del 67% (log. test de variació: P <0.001) després de la teràpia KUN GM-CSF VLP (Figura 5a). El tractament amb control KUN amb VLP va tornar a ser capaç de retardar el creixement significativament, però no curar cap dels tumors (test log-rank: P <0.001) (Figura 5a). Les corbes de creixement (representades a la figura 3b) van demostrar que els tumors amb KUN GM-CSF tractats amb VLP van créixer fins a un màxim de 20 a 35 mm 2 els dies 1 a 5 i després van començar a retrocedir (Figura 5b). En quatre dels sis ratolins, els tumors es van detectar entre els dies 17 i 28 i es van mantenir indetectables fins al final de l'experiment el dia 145 (Figura 5b, KUN GM-CSF VLP, curat). En els dos ratolins restants d’aquest grup, els tumors es van tornar a detectar els dies 17 i 23, però van tornar a aparèixer els dies 21 i 33, respectivament (Figura 5b, KUN GM-CSF VLP, no curat). Els tumors B16-OVA no van créixer en els quatre dels ratolins curats quan es van rechaçar amb tumors B16-OVA el dia 145 (dades no mostrades).

Hem provat la teràpia VLP de KUN GM-CSF descrita a la figura 3 en diversos models de tumors (B16, AE17, TUBO, MC38 i 4T1) i, en tots els casos, la teràpia va poder endarrerir el creixement del tumor de manera significativa; tanmateix, la cura del tumor era rara o inconsistent (taula 1).

Expressió de GM-CSF i IFN-α in vivo

Per confirmar que el tractament VLP de KUN GM-CSF realment produeix una producció GM-CSF dins dels tumors in vivo , es va repetir l'experiment descrit a la figura 5a, excepte que el dia 5, es van excisar i analitzar tumors per a l'ARNm de GM-CSF mitjançant temps real. PCR Els tumors tractats amb VLP KUN GM-CSF contenien ∼ 3, 5–4 registres de més mRNA GM-CSF que els tumors tractats amb VLPs de control o KUN o mitjà (Figura 5c, GM-CSF), proporcionant evidències convincents que el tractament KL GM-CSF VLP resulta substancial Expressió GM-CSF derivada de replicon in vivo .

La replicació dsRNA de Replicon intermedia la producció induïda d’IFN-α / β in vitro (Figura 2a). Per determinar si el tractament amb KUN VLP també va induir una expressió IFN de tipus I in vivo , els tumors descrits anteriorment també es van analitzar per a l’expressió d’ARNN-α mRNA mitjançant PCR en temps real. Tant KUN GM-CSF VLP- com KUN controlen els tumors tractats amb VLP contenien de 3.3 a 4.2 vegades més IFN-α mRNA que tumors tractats amb medi (Figura 5c, IFN-α), que il·lustren que els rèplics van lliurar-lo induïen la producció local del tipus. I IFNs.

Discussió

Aquí il·lustrem la utilitat del sistema vectorial de rèplica KUN en la teràpia gènica intra-tumoral del càncer i mostrem que les VLP KUN que codifiquen GM-CSF van ser capaces de curar una proporció significativa de tumors establerts en almenys dos sistemes models, carcinomes de còlon CT26 cultivats en BALB. / c ratolins i melanomes B16-OVA cultivats en ratolins C57BL / 6. Només algunes estratègies basades en la immunitat són capaces de curar tumors establerts de CT26 o B16-OVA de mida raonable. 25, 52, 53, 54 Moltes estratègies poden evitar la implantació d’aquests tumors en entorns profilàctics totalment poc realistes quan la vacunació precedeix el repte del tumor. Tanmateix, aquests experiments són completament diferents de la teràpia, on el tractament s’inicia després que el tumor s’estableixi i creixi activament. Proposem que l’eficiència d’aquesta modalitat de tractament derivi de la sinergia entre la producció de GM-CSF i la inducció d’IFN-α / β per a la inducció de cèl·lules T anti-càncer CD8. 24, 36, 37

Com passa amb la majoria dels sistemes de transmissió de gens intra-tumorals, és probable que el nivell de transfecció in vivo sigui un factor important. 4 Hem provat l'eficàcia de transfecció de diverses línies de cèl·lules tumorals in vitro i hem trobat que a MOI = 10, l'1, 5% de les cèl·lules CT26 i el 10-20% de les cèl·lules B16-OVA estan transfectades, amb la transfecció de cèl·lules Vero i BHK. solen arribar al 50–90% (dades no mostrades). Això suggereix que pot haver-hi lloc per millorar el vector per maximitzar l’eficiència de transfecció. El pas d’eixams de virus KUN per línies específiques de càncer ha de permetre l’aïllament de virus amb mutacions favorables, que després es poden introduir en vectors KUN per millorar la seva eficiència de transfecció per a aquestes línies. Aquest enfocament ja ha il·lustrat que certes mutacions en gens estructurals o no estructurals poden conduir a grans augments d'eficiència de transfecció en línies cel·lulars específiques. 38, 55

Un dels problemes associats a l'ús repetit de vectors virals és que es generen anticossos específics per al vector que poden comprometre les rondes de tractament posteriors. Hem observat que la resposta de l’anticòs neutralitzant es genera en els ratolins després de 10 injeccions diàries diaris (dades no mostrades) i això pot interferir amb les rondes posteriors del tractament amb VLP. Els rèplics KUN també es poden lliurar com a ADN o ARN, i és probable que aquestes modalitats es vegin afectades per la neutralització dels anticossos. Tot i això, el lliurament basat en ARN intra-tumoral (10 μg d’ARN per dia durant 10 dies) de KUN GM-CSF (fins i tot amb protamina per estabilitzar l’ARN 56 ) no va poder generar una activitat anticancerosa significativa (dades no mostrades). Queda per provar el lliurament intra-tumoral de rèplements KUN que codifica GM-CSF basat en l'ADN; tanmateix, és probable que es necessitin estratègies com el lliurament de pistoles gèniques 57 o l'electroforació in vivo 58 per augmentar l'eficiència de transfecció.

En resum, aquest estudi il·lustra la utilitat del sistema VLP GM-CSF de la rèplica KUN per a teràpia gènica tumoral. El rèplica KUN també pot trobar utilitat per a lliurar altres gens terapèutics que probablement es sinergisquen amb els “senyals de perill” induïts per l'ADNS per generar activitat contra el càncer; entre altres membres de la família dels factors de necrosi tumoral, 53, 59 IL-3, 60 o IL-24. 61

Conflicte d'interessos

Un Khromykh i un Suhrbier són consultors a temps parcial per a Replikun Ltd. Replikun Ltd és l'empresa a qui ha estat llicenciada la tecnologia descrita al document. La resta d’autors declaren cap conflicte d’interès.