La pèrdua de rictor amb l’envelliment en osteoblasts afavoreix la pèrdua òssia relacionada amb l’edat mort i malaltia cel·lular

La pèrdua de rictor amb l’envelliment en osteoblasts afavoreix la pèrdua òssia relacionada amb l’edat mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Envelliment
  • Senyalització cel·lular
  • Osteoporosi
  • Terapèutica

Resum

La disfunció osteoblast és una de les causes principals de la pèrdua òssia relacionada amb l'edat, però els mecanismes subjacents als canvis de la funció osteoblast amb l'envelliment són poc coneguts. Aquest estudi demostra que els osteoblasts de ratolins envellits presenten una adhesió notòria a la superfície de formació òssia i una mineralització reduïda in vivo i in vitro . Rictor, un component específic de l’objectiu mecanicista del complex 2 de rapamicina (mTORC2) que controla l’organització dels citoesquelets i la supervivència cel·lular, està regulat amb l’envelliment dels osteoblasts. Mecànicament, vam trobar que un augment del nivell d’espècies reactives d’oxigen amb l’envelliment estimula l’expressió de miR-218, que s’adreça directament a Rictor i redueix l’adhesió i supervivència d’osoblast a la superfície òsoblast, produint una disminució del nombre d’osteoblasts funcionals i una pèrdua òssia accelerada en ratolins envellits. . Els nostres resultats revelen una nova via funcional important per a la pèrdua òssia relacionada amb l'edat i el suport de miR-218 i Rictor com a objectius potencials per a la intervenció terapèutica per al tractament amb osteoporosi relacionada amb l'edat.

Principal

La pèrdua òssia relacionada amb l’edat és la causa principal de fractures osteoporòtiques en la gent gran, caracteritzada principalment per una formació òssia reduïda en la resorció òssia persistent. Es creu que la disfunció osteoblast relacionada amb l'edat 1, 2, 3, 4 és una de les principals causes de pèrdua òssia relacionada amb l'edat tant en homes com en dones més enllà de la cinquena dècada. Tanmateix, els mecanismes cel·lulars i moleculars subjacents als canvis en la funció osteoblast amb l'envelliment són poc entesos. 5, 6, 7

L’osteoblast és una cèl·lula formadora d’os única derivada de cèl·lules mare mesenquimals de la medul·la òssia (BMSCs), que són cèl·lules pluripotents que donen lloc a diferents cèl·lules específiques del teixit incloent osteoblasts, condròcits i adipòcits. 8, 9 Com que l’osteopènia relacionada amb l’edat es caracteritza per una reducció de la formació òssia i una major acumulació de greix de medul·la, s’ha suggerit que l’acumulació excessiva d’adipòcits de medul·la després de la pèrdua òssia és causada per una diferenciació desequilibrada de BMSCs en adipòcits de medul·la en excés d’osteoblasts. 4, 5, 6 La majoria d’estudis anteriors es van centrar en els mecanismes moleculars que hi ha darrere del canvi d’osteoblast a la diferenciació d’adipòcits en els BMSC durant l’envelliment. 10, 11, 12, 13 Tanmateix, la formació òssia depèn del nombre i de l’activitat d’osteoblasts individuals reclutats als llocs de formació òssia, i l’activitat funcional dels osteoblasts durant la formació òssia in vivo no depèn només del nombre i de la taxa de generació d’osteoblàstics. cèl·lules però també en la seva vida útil funcional. 14, 15, 16 Actualment es subratlla la contribució a la pèrdua òssia dels canvis relacionats amb l’edat en la migració, l’adhesió, la mineralització i l’apoptosi d’osteoblasts. 7, 17 A més, encara no es coneixen les vies de senyalització que controlen aquests processos.

El blanc mecanicista conservat evolutivament de la rapamicina (mTOR) forma dos complexos funcionalment diferents. El primer, mTOR complex 1 (mTORC1), format per mTOR, Raptor i mLST8 (GβL), és sensible a la rapamicina i es pensa que controla el creixement autònom de les cèl·lules en resposta a la disponibilitat de nutrients i els factors de creixement. 18, 19, 20 El segon complex, mTORC2, que conté els components bàsics mTOR, mSIN1, mLST8 i Rictor, és en gran part insensible a la rapamicina. mTORC2 es va descobrir més recentment i hi ha informació limitada sobre la seva regulació i funció. La fosforilació d'Akt al lloc motiu hidrofòbic (Ser473) és necessària per a l'activitat cap a alguns (però no cap a tots) substrats, i és la lectura més ben caracteritzada de l'activitat del mTORC2. Els estudis fins ara suggereixen que mTORC2 intueix específicament els factors de creixement per regular la proliferació cel·lular, l'organització del citoesquelet d'actina i la supervivència cel·lular. 19, 21, 22, 23

Diversos estudis recents han demostrat que la supressió o la regulació descendent de Rictor / mTORC2 en els BMSCs va donar lloc a una capacitat de diferenciació osteogènica reduïda i un potencial de diferenciació adipogènic més gran. La senyalització 24, 25, 26 mTORC2 regula el creixement esquelètic i la selecció del llinatge en els MSC mitjançant mecanismes desconeguts. 24, 25, 26 El nostre paper en la pèrdua òssia relacionada amb l’edat i en els mecanismes reguladors subjacents i aigües subjacents no s’ha sabut. En aquest informe, demostrem que els ratolins amb supressió Rictor específica de l’osteoblast mostraven una pèrdua òssia accelerada relacionada amb l’edat i vam identificar un nou mecanisme mitjançant el qual l’augment del nivell d’espècies reactives d’oxigen (ROS) amb l’envelliment estimula l’expressió miR-218, que s’adreça directament. Rictoritza i redueix l’adhesió i la supervivència dels osteoblasts, amb la qual cosa es produeixen pèrdues d’os relacionades amb l’edat.

Resultats

L’adhesió i la supervivència dels osteoblasts es redueixen notablement i es redueix l’expressió de Rictor amb l’envelliment in vitro i in vivo

Els fenotips de pèrdua òssia relacionats amb l’edat es van caracteritzar en ratolins. Les anàlisis de tomografia micro-computada (micro-CT) del fèmur distal van mostrar una disminució important de la massa òssia en els ratolins envellits (16 mesos) en comparació amb els ratolins joves (3 mesos), com es demostra amb una disminució significativa del volum ossi trabecular. per volum de teixit (BV / TV), nombre trabecular (Tb.N), gruix trabecular (Tb.Th) i densitat de massa òssia (BMD), unit a un augment de la separació trabecular (Tb.Sp) (figura suplementària 1). Les anàlisis histològiques i immunohistoquímiques de les fèmores van revelar un nombre més gran d’adipòcits més grans, caracteritzats per vacúols greixos a la medul·la òssia (figura suplementària 2A), i disminució del nombre d’osteoblasts osteocalcinos positius (figura 1a) i osteoclasts positius TRAP als trabeculars. i superfícies òssies endosteals en ratolins envellits (figura suplementària 2B). L’acumulació de greix de medul·la òssia i la disminució del nombre d’osteoblasts implica que hi hagué un canvi d’osteogènesi a adipogènesi en els BMSCs. Curiosament, les anàlisis del microscopi electrònic d’escaneig (SEM) van revelar una superfície òssia trabecular rugosa amb moltes cèl·lules unides en ratolins joves, però una superfície òssia trabecular llisa i amb poca adhesió de cèl·lules en ratolins envellits (figura 1b). Moltes llacunes o lacunes buides amb cèl·lules replegades (figura 1b), acompanyades d’una reducció de la taxa de formació òssia (BFR) (figura 1c), implicant una disminució de l’adhesió d’osteoblastos durant la pèrdua òssia relacionada amb l’edat.

Image

L’adhesió i la supervivència dels osteoblasts es redueixen notablement i l’expressió de Rictor es regula amb l’envelliment in vitro i in vivo . ( a ) Tinció immunohistoquímica (IHC) representativa per a osteocalcina (OCN) de ratolins de 3 mesos i 16 mesos ( n = 6). Fletxa, osteoblast; BS, superfície òssia; barra d’escala, 50 μ m; * P <0, 01 contra 3M. ( b ) Imatge SEM d'ossos trabeculars de la femora de ratolins d'entre 3 i 16 mesos. El panell superior mostrava un os de trabecula menys i més prim en ratolins de 16 mesos. Fletxa negra, osteoblasts o osteocits, barra d’escala de panell amunt, 500 μ m; barra d’escala del panell inferior, 50 μ m. ( c ) Fotomicrografies de tinció fluorescent de calceïna de ratolins de 3 i 16 mesos i quantificació de la superfície mineralitzant / superfície òssia (MS / BS), taxa d'aposició de minerals (MAR) i MAR / osteoblast. Fletxa: superfície de formació òssia; barra d’escala, 20 μ m ( n = 3 * P <0, 01 contra 3M). ( d ) Anàlisis d’adhesió cel·lular de cultius d’osteoblastos calvaris de ratolins d’entre 3 i 16 mesos amb (panell inferior) o sense matrigel (panell superior) a la placa ( n = 3 * P <0, 01 contra 3M). ( e ) Fotomicrografies representatives de la formació de nòduls ossis en cultius de MSC de ratolins de 3 a 16 mesos. Barra d’escala, 400 μ m. ( f ) Anàlisi del blot occidental de la polimerasa de ribosa-poli-ADP-closa (PARP) en lisats d'os trabeculars dissecats de femelles de ratolins de 3 i 16 mesos. ( g ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió de Rictor i P-Akt (S473) en lisats d'os trabeculars de ratolins de 3 a 16 mesos. ( h ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió mTOR, Rictor, Raptor i P-Akt (S473) en lisats de pulmó, melsa i ronyó de ratolins de 3 a 16 mesos. ( i ) Anàlisi del blot occidental de Rictor, mTOR, Raptor, osteocalcina (OCN) i expressió de P-Akt (S473) en osteoblastos càlvaris primaris de ratolins de 3 a 16 mesos

Imatge a mida completa

Per confirmar encara més aquests fenotips relacionats amb l’edat in vitro , es van cultivar osteoblasts calvaris de ratolins d’entre 3 i 16 mesos. Els osteoblasts de ratolins vells van mostrar una capacitat reduïda significativament d’adhesió cel·lular (figura 1d) i mineralització (figura 1e), però van augmentar l’apoptosi (figura 1f). En conjunt, aquestes troballes suggereixen que a més del canvi de la diferenciació osteogènica a la diferenciació adipogènica de BMSCs, disminució de l’adhesió i mineralització d’osteoblastos i augment de l’apoptosi, poden tenir importants papers en l’osteopènia relacionada amb l’edat.

Rictor / mTORC2 ha demostrat que controla tant l’organització citoesquelètica de l’actina com la supervivència cel·lular. 24, 27, 28 Per explorar el mecanisme responsable de la capacitat reduïda d’adhesió i supervivència cel·lular a mesura que envelleixen els osteoblasts, es van disseccionar mostres d’os trabeculars de la femora de ratolins joves i envellits, i es va extreure proteïna total per examinar l’expressió de Rictor mitjançant la taquilla occidental. Curiosament, l’expressió de Rictor i la fosforilació del substrat mTORC2 Akt (S473) es van reduir notablement a l’os trabecular de ratolins envellits (figura 1g). En canvi, ni el nivell de mTORC1 (mTOR i Raptor) a l’os, ni els nivells de Rictor en altres òrgans incloent la melsa, ronyó i pulmó, no van mostrar cap canvi significatiu amb l’envelliment (figura 1h), implicant una descregulació específica d’os de Rictor. en ratolins envellits. La reducció de Rictor, però no de mTOR ni de Raptor, es va confirmar encara més en osteoblastos calvarials primaris cultius de ratolins envellits (Figura 1i). D’acord, la desfosforilació d’Akt (S473), l’objectiu descendent de Rictor / mTORC2, es va produir en osteoblasts de ratolins envellits (Figures 1g i). Així, hem identificat la descregulació específica de Rictor induïda per l’envelliment en osteoblasts, que pot tenir un paper en la pèrdua òssia relacionada amb l’edat.

La supressió de Rictor en osteoblasts perjudica la formació òssia i estimula la pèrdua òssia relacionada amb l'edat

Per investigar el paper de Rictor / mTORC2 en la formació d’osteobastos i ossos, hem generat ratolins eliminatoris condicionats amb la supressió de Rictor limitada als osteoblasts en creuar els ratolins Rictor flotats amb els ratolins Osx-GFP-Cre (que expressen una proteïna de fusió GFP-Cre sota la direcció del promotor Osx1). Hem emparellat Osx-GFP-Cre TG / + amb ratolins Rictor flox / flox i ratolins femelles seleccionats amb el genotip Osx-GFP-Cre TG / + ; Rictor flox / flox (aquí després anomenat OBRictorKO) per a una anàlisi detallada. Les femelles Osx-GFP-Cre TG / + ; les paperetes Rictor + / + van servir de control. Els ratolins OBRictorKO van néixer a la freqüència esperada de Mendelian, i la recombinació i la supressió dels al·lels Rictor només es van produir en teixits esquelètics (és a dir, potes i crani) com es demostra per PCR específica de l’al·lel (figura suplementària 3) i per blot occidental (figura 2a). La tinció immunohistoquímica de les seccions del fèmur distal va mostrar una disminució dramàtica de P-Akt (S473) en els ratolins OBRictorKO (figura 2b), cosa que indica que el mTORC2 estava inactivat per la disrupció del Rictor.

Image

La supressió de Rictor en osteoblasts perjudica la formació òssia i estimula la pèrdua òssia relacionada amb l'edat. ( a ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió de Rictor i P-Akt (S473) en osteoblasts calvaris primaris de cultiu procedents de OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge. ( b ) Tinció representativa de l’IHC per a p-Akt (S473) de femelles distals d’OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge; barra d’escala, 100 μ m. ( c ) Micro-tomografies representatives de vèrtebres de ratolins de tipus OBRictorKO de 6 mesos i salvatges. ( d - g ) Canvis en vertebres trabeculars BV / TV, BMD, Tb.Sp i Tb.N amb edat a OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge ( n = 6, * P <0, 01). ( h ) La tinció representativa de l'HHC per a l'OCN en femelles distals a partir de OBRictorKO de 6 mesos i ratolins de tipus salvatge ( n = 6). Fletxa, osteoblast; barra d’escala, 50 μ m; * P <0, 01 entre genotips. ( i ) Tinció representativa de TRAP per a osteoclasts de femelles distals de OBRictorKO de 6 mesos i ratolins de tipus salvatge ( n = 6). NS, no hi ha diferència significativa entre genotips; barra d’escala, 100 μ m. ( j ) Anàlisi d'immunosorbent vinculat a l'enzim (ELISA) anàlisi dels nivells de propèptid N-terminal de Procollagen tipus I (PINP) sèrics en OBRictorKO de 6 mesos i ratolins de tipus salvatge ( n = 6). * P <0, 01 contra WT. ( k ) Tinció representativa de calceïna i quantificació de MS / BS, MAR i MAR / osteoblast en femelles distals a partir de ratolins OBRictorKO de 6 mesos i tipus ratolins ( n = 3 * P <0, 01 vers OBRictorKO). ( l ) La tinció representativa de la femella distal de OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge, es van comptar amb adipòcits ( n = 6). NS, no hi ha diferència significativa entre genotips; barra d’escala, 1 mm

Imatge a mida completa

Tot i que no es van observar diferències significatives en el pes corporal i la longitud entre els ratolins amb deficiència de Rictor i els controls de fullaraca a totes les edats. Els ratolins OBRictorKO van desenvolupar osteoporosi a mesura que augmentava l'edat (figures 2c – g i figura suplementària S4). En els ratolins OBRictorKO als 6 mesos d’edat, BV / TV es va reduir notablement en comparació amb les escombraries de tipus salvatge ( P <0, 001; Figura 2d i figura suplementària S4). El gruix d’os cortical (Ct.Ch) també va disminuir significativament en els ratolins d’eliminació de Rictor (figura suplementària S5). L'anàlisi histològica de la metàfisi tibial en ratolins de 6 mesos va demostrar que l'osteoporosi en els ratolins OBRictorKO es va associar amb una disminució marcada del nombre d'osteoblasts (cèl·lules positives OCN) per unitat de superfície òssia (figura 2h), mentre que el nombre d'osteoclàstics va disminuir lleugerament (Figura 2i). D'acord amb aquestes observacions, els nivells sèrics del propèptid N-terminal del procollagen tipus 1 (P1NP), un marcador de formació d'ossos, es van reduir en els ratolins OBRictorKO de 6 mesos en comparació amb els ratolins de tipus salvatge (figura 2j). També es va reduir la freqüència bruta de ratolins OBRictorKO de 6 mesos en comparació amb els controls de fullaraca (Figura 2k). A més, no es va poder observar cap acumulació d’adipòcits detectables en ratolins OBRictorKO de 6 mesos d’edat (figura 2l). Aquestes dades demostren que l’osteoporosi relacionada amb l’edat en els ratolins OBRictorKO s’associa amb una reducció de la formació òssia davant l’activitat normal de l’osteoclast, però no amb una acumulació de greix de medul·la.

Rictor és essencial per a l’adhesió, mineralització i supervivència dels osteoblasts

Per investigar els mecanismes subjacents a la formació òssia reduïda en els ratolins OBRictorKO, primer vam explorar la diferenciació d’osteobastos i adipòcits en cultius MSC preparats a partir de ratolins de tipus OBRictorKO i de tipus salvatge. Tot i que s'ha suposat que la supressió de Rictor en MSCs va induir un canvi de l'osteoblastogènesi a l'adipogènesi, 25, 26 BMSC de ratolins OBRictorKO no van mostrar una eficiència més gran en l'adipogènesi (figura suplementària S6). Això indica que la supressió de Rictor en osteoblasts no va afectar la diferenciació de BMSC, d'acord amb el greix de medul·la no modificat en els ratolins OBRictorKO. Tanmateix, els BMSC dels ratolins OBRictorKO tenien una capacitat reduïda significativament de formar nòduls ossis mineralitzats quan es cultivaven en un medi osteogènic, acompanyat per la interrupció de Rictor en estadis de diferenciació tardana (figures 3a i b). Es van obtenir resultats similars en cultius d’osteoblasts calvaris (figura 3c). Aquests resultats suggereixen que la supressió de Rictor en osteoblasts no redueix la diferenciació osteoblàstica de BMSC, sinó que inhibeix la formació òsoblàstica.

Image

Rictor és essencial per a l’adhesió, mineralització i supervivència dels osteoblasts. ( a ) Fotomicrografies de nòdul de calci en MSCs aïllats de ratolins de tipus salvatge i OBRictorKO després de la inducció osteognènica durant 21 dies. ( b ) Anàlisi del blot occidental de l’expressió de Rictor i OCN en MSC d’OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge que van patir inducció osteogènica durant 14 dies. ( c ) Fotomicrofotografies de formació de nòduls ossis en cultius d'osteoblastos procedents de OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge. ( d ) Anàlisi de l’adhesió cel·lular de cultius d’osteobastos primaris d’OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge amb (panell inferior) o sense matrigel (panell superior) a la placa ( n = 3). * P <0, 01 en comparació amb ratolins de tipus salvatge. ( e ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió PARP clivada en lisats d'os trabeculars de OBRictorKO de 6 mesos i ratolins de tipus salvatge. ( f ) Fotomicrografies representatives de l'actina F (fluorescència vermella) i expressió de p-paxil·lina (fluorescència verda Y118) en osteoblasts primaris de OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge. Fletxa, p-Paxillina (Y118); barra d’espant, 5 μ m. ( g ) anàlisi SEM de l'os trabecular de OBRictorKO de 6 mesos i ratolins de tipus salvatge. El panell superior mostrava un os de trabecula menys i més prim en els ratolins OBRictorKO. Fletxa negra, osteoblast o osteòcit; barra superior del panell, 500 μ m; barra inferior del panell, 50 μ m

Imatge a mida completa

Per explicar més la disminució del nombre d’osteoblastos a la superfície òssia trabecular dels ratolins OBRictorKO, es va examinar la capacitat d’adhesió cel·lular i la supervivència d’osteoblasts cultivats d’OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge. Els osteoblasts de ratolins OBRictorKO tenien una capacitat reduïda significativament d’unió a la matriu de cultiu i augmentaren la PARP fendida (figures 3d i e). A més, es va deteriorar la fosforilació de la paxil·lina, un objectiu a baix de Rictor que regula l'organització citoesquelètica, en osteoblasts eliminats per Rictor (Figura 3f). El més important, les anàlisis SEM van revelar una menor adherència cel·lular a la superfície òssia trabecular (figura 3g), que repliquen els fenotips vistos en els osteoblasts de ratolins envellits. En conjunt, aquestes troballes demostren que Rictor és essencial per a l’adhesió, funció i supervivència d’osteoblasts.

Rictor és un objectiu de miR-218 en osteoblasts

A continuació, es va investigar el mecanisme subjacent a la regulació inferior de l'expressió Rictor en osteoblasts en ratolins envellits. L'anàlisi q-PCR va demostrar que el nivell de mRNA de Rictor en osteoblasts de ratolins envellits va romandre invariable en comparació amb els ratolins joves (figura suplementària S7), cosa que suggereix que la regulació transcripcional no contribueix a la descregulació de Rictor en osteoblasts.

Diversos microRNAs, incloent miR-188, miR-218, han estat informats per apuntar a Rictor en cèl·lules humanes i de ratolins. 29, 30, 31, 32, 33 Així, es va realitzar una anàlisi bioinformàtica dels potencials miRNA dirigits a Rictor en ratolins (Taula suplementària S2). L'anàlisi quantitativa de PCR en temps real del nivell de 13 miRNAs de gran puntuació va revelar que miR-218 estava fortament regulat en osteoblasts de ratolins en edat (l'expressió va augmentar un 1013% en osteoblasts de ratolins en edat en comparació amb els de ratolins joves) (figura 4a). Transfecció de mímics de miR-218 va desglossar de forma destacada Rictor, mentre que els antagomirs miR-218 van regular el nivell de proteïnes Rictor (figura 4b). D’acord amb això, la fosforilació d’Akt (S473) i paxilina, dues dianes avall que medien la supervivència cel·lular regulada per Rictor i l’organització d’actina, respectivament, es van veure millorades per mímiques de miR-218 o reduïdes amb antagòmers de miR-218 (figura 4b). Hi ha dos llocs miR-218 a la UTR de Rictor 3 ′ (figura 4c).

Image

Rictor és un objectiu de miR-218 en osteoblasts. ( a ) Anàlisi PCR en temps real de 13 miRNAs d'expressió a l'os trabecular de ratolins de 3 i 16 mesos ( n = 6). * P <0, 01 contra 3M. ( b ) Anàlisi del blot occidental de Rictor, p-Paxillin (Y118) i P-Akt (S473) expressió en osteoblasts transfectats amb mímics de miR-218 i inhibidors de miR-218. ( c ) El lloc positiu d'unió miR-218 a la UTR de Rictor 3 ′. ( d ) L'activitat de la luciferasa a les cèl·lules MC3T3-E1 co-transfectades amb mímiques miR-218 o control negatiu (NC) i els indicadors de 3 'indicats per UTR ( n = 3). * P <0, 01 contra NC; ** P <0, 05 vers NC

Imatge a mida completa

Per determinar si miR-218 dirigeix ​​a Rictor directament en osteoblasts, vam clonar els 3 ′ UTR de Rictor en una construcció luciferasa. Segons els informes que es feien servir osteoblasts que expressaven miR-218, es va revelar que miR-218 va reprimir les UTRs de Rictor (Figura 4d). Mutacions de dos llocs putatius de miR-218 que es conserven en humans versus ratolins en la resposta a la UTR de Rictor 3 ′ abrogada a miR-218 (Figura 4d). Aquests resultats suggereixen que tots dos llocs previstos contribueixen igualment a la reducció de Rictor mediada per miR-218. En conjunt, aquests resultats suggereixen que miR-218 dirigeix ​​directament a Rictor en osteoblasts.

el miR-218 reprimeix l’adhesió i la supervivència dels osteoblasts dirigint Rictor

Per definir més el paper del miR-218 en els osteoblasts, es van examinar els efectes dels mímics i antagomirs de miR-218 sobre l’adhesió cel·lular, l’apoptosi induïda per l’estrès en osteoblasts primaris i la línia cel·lular d’osteobastos MC3T3-E1. miR-218 imita una reducció de l’adhesió cel·lular i una apoptosi induïda per inanició sèrica, mentre que els antagomirs miR-218 van millorar l’adhesió cel·lular, però va reduir l’apoptosi en osteoblasts (Figures 5a i b).

Image

el miR-218 reprimeix l’adhesió i la supervivència dels osteoblasts dirigint Rictor. ( a ) Anàlisi d'adhesió de cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques de miR-218, inhibidors de miR-218 i NC ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( b ) Anàlisi de l'AnnexinV de l'apoptosi en cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques de miR-218 o inhibidor de miR-218 i morts de fam sèrum durant 48 h ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( c ) Anàlisi Western blot de Rictor, p-Paxillin (Y118), Runx2 i p-Akt (S473) expressió en cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques miR-218. ( d ) Anàlisi Western blot de Rictor, p-Paxillin (Y118), Runx2 i p-Akt (S473) expressió en cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb inhibidor de miR-218 o NC. ( e ) Anàlisi Western blot de Rictor, p-Paxillin (Y118) i p-Akt (S473) expressió en cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques miR-218 i / o vectors que expressen Rictor. ( f ) Anàlisi d'adhesió de cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques miR-218 i / o vector amb expressió de Rictor ( n = 3). * P <0, 01, ** P <0, 05. ( g ) Anàlisi de l'annexinV d'apoptosi en cèl·lules MC3T3-E1 transfectades amb mímiques miR-218 i / o vector amb expressió de Rictor ( n = 3); * P <0, 01, ** P <0, 05

Imatge a mida completa

A continuació, ens vam preguntar si Rictor media la regulació dels osteoblasts via miR-218. Com era d’esperar, miR-218 imita la regulació de la via de senyalització Rictor / mTORC2 i la fosforilació d’Akt (S473) i paxillina, mentre que els antagomirs miR-218 milloraven la via de senyalització Rictor / mTORC2 (figures 5c i d). És important destacar que la sobreexpressió de Rictor va rescatar la reducció de Akt (S473) i la fosforilació de paxilina i l’adhesió cel·lular i la millora de l’apoptosi per mímiques de miR-218 (Figures 5e – g). En conjunt, aquests descobriments demostren que el miR-218 reprimeix l’adhesió i la supervivència dels osteoblasts dirigint-se a Rictor.

ROS estimula el miR-218 per descartar Rictor en osteoblasts de ratolins envellits

La deficiència d’estrògens s’ha considerat el mecanisme principal de l’osteoporosi tant en dones com en homes, però les evidències epidemiològiques en humans i estudis mecànics recents en rosegadors indiquen que l’envelliment i l’augment associat de ROS són els culpables del màxim. 34, 35 Per explicar l’augment relacionat amb l’edat de miR-218 i la reducció de Rictor en osteoblasts, es va explorar encara més el paper potencial del ROS en aquest procés. Com era d’esperar, els nivells de ROS van ser elevats significativament a l’os trabecular i l’osteoblast de ratolins envellits (Figura 6a). Curiosament, el tractament amb peròxid d’hidrogen (H 2 O 2 ) va augmentar el nivell de miR-218 en 18 vegades en osteoblasts (figura 6b; figura suplementària S8). Per tant, es va reduir l’expressió de Rictor, P-Akt (S473) i l’adhesió cel·lular, mentre que l’apoptosi va ser estimulada per H 2 O 2 (Figures 6c – e). L'expressió de components mTORC1, mTOR i Raptor no es va veure afectada (Figura 6c), cosa que indica una regulació específica de Rictor / mTORC2 per ROS en osteoblasts. D'altra banda, estudis anteriors han demostrat que miR-218 es troba situat a 4p15.31 i 5q35.1 dins de l'intron de Slit2 i Slit3. Es va comprovar que el silenciament de Slit2 i Slit3 va disminuir l'expressió de miR-218, cosa que va suggerir la regulació de miR-218 pels seus gens hostes en osteoblasts (figura suplementària S9).

Image

ROS estimula el miR-218 per descartar Rictor en els osteoblasts de ratolins envellits. ( a ) nivells de ROS en ossos trabeculars de ratolins de 3 i 16 mesos ( n = 6); * P <0, 01 en comparació amb ratolins de 3 mesos. ( b ) Efecte de H 2 O 2 (1 μ M) sobre l'expressió miR-218 en cèl·lules MC3T3-E1 ( n = 3). * P <0, 01 contra controls. ( c ) Anàlisi del blot occidental de Rictor, mTOR i expressió de Raptor en cèl·lules MC3T3-E1 tractades amb H 2 O 2 (5, 10 μ M) durant 48 h. ( d ) Efecte de H 2 O 2 (1 μ M durant 24 h) sobre l’adhesió cel·lular MC3T3-E1 ( n = 3). * P <0, 01 contra controls. ( e ) Efecte de H 2 O 2 (10 μ M durant 36 h) i sobre l'apoptosi de cèl·lules MC3T3-E1 ( n = 3). * P <0, 01 contra controls

Imatge a mida completa

El cargador ROS redueix l'expressió de miR-218 i Rictor i la pèrdua òssia relacionada amb l'edat en els ratolins

Per confirmar la correlació de ROS amb miR-218 i l’expressió de Rictor i la pèrdua òssia relacionada amb l’edat in vivo , es van administrar ratolins envellits amb NAC del cargador ROS. Com que la pèrdua òssia marcada va començar des dels 9 mesos en els ratolins i també es va observar una pèrdua important de Rictor en els ratolins als 9 mesos (Figura 7a), vam tractar els ratolins als 7 mesos amb NAC per evitar la pèrdua òssia relacionada amb l’edat. Vam trobar que en els ratolins tractats amb NAC (16 mesos) es va reduir el nivell de ROS d’os trabeculars (figura 7b), mentre que BV / TV, el nombre trabecular i el gruix trabecular es van augmentar en comparació amb els ratolins control (Figures 7c – g; Figura suplementària) S10). Les anàlisis histològiques i d’IHC de les fèmores van revelar un augment significatiu del nombre d’osteoblasts amb osteocalcina positiva i una lleugera disminució del nombre d’osteoclasts en ratolins tractats amb NAC (figures 7h i i). És important destacar que, a més de la pèrdua òssia deteriorada, el nivell de miR-218 (figura 7j) i la disminució de la PARP es va disminuir, mentre que l’expressió de Rictor i P-Akt (S473) es van millorar en els ratolins tractats amb NAC (figura 7l). Aquests descobriments suggereixen que ROS estimula la baixada regulació de Rictor mediada per miR-218 en osteoblasts de ratolins envellits.

Image

El cargador ROS redueix l'expressió de miR-218 i Rictor i la pèrdua òssia relacionada amb l'edat en els ratolins. ( a ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió Rictor, Raptor i P-Akt (S473) en l'os trabecular de ratolins de 3, 9 i 16 mesos. ( b ) nivells de ROS òssies trabeculars en ratolins de 9 mesos tractats amb N-acetil-l-cisteïna (NAC; 2 mg / ml) o vehicle durant 7 mesos ( n = 10). * P <0, 01 contra controls. ( c ) Micro-TC rastrejos representatius de vèrtebres de ratolins descrits a la secció ( b ). ( d - g ) òssos trabeculars BV / TV, BMD, Tb.Sp i Tb.N en ratolins descrits a ( c ) ( n = 10); * P <0, 01 contra controls. ( h, i ) Oestocalcina IHC ( h ) o TRAP ( i ) tinció de femora distal de ratolins descrits a ( b ). Barra d’escala, 50 μ m; * P <0, 01 contra controls. ( j ) Anàlisi de PCR en temps real de l'expressió miR-218 en ossos trabeculars de ratolins descrits a ( b ) ( n = 10). * P <0, 01 contra controls. ( k ) Anàlisi de cargols Westem de l'expressió de c-PARP en ossos trabeculars de ratolins descrits a la secció (b). ( l ) Anàlisi del blot occidental de l’expressió de Rictor, Raptor i P-Akt (S473) en ossos trabeculars de ratolins descrits a ( b ). ( m ) Un model esquemàtic que representa que la regulació de miR-218 i la pèrdua de Rictor amb l'envelliment indueixen la patogènesi de la pèrdua òssia relacionada amb l'edat.

Imatge a mida completa

Discussió

Els nostres estudis demostren que la reducció de Rictor amb l’envelliment en osteoblast té un paper important en la patologia de la pèrdua òssia relacionada amb l’edat. Rictor és essencial per a la formació òssia mitjançant el control de l’organització citoesquelètica osteoblast, promovent l’adhesió d’osteoblastos a la superfície i la supervivència dels ossos i, finalment, manté un nombre suficient de cèl·lules osteoblastes funcionals. Proposem una nova via funcional important per a la pèrdua òssia relacionada amb l’edat independent de l’acumulació d’adipòcits a la medul·la òssia: l’acumulació de ROS amb l’envelliment estimula la transcripció de miR-218, que al seu torn dirigeix ​​a Rictor, deteriorant l’adhesió osteoblast a la superfície òssia i afavorint l’apoptosi osteoblast. En conseqüència, la formació òssia es redueix, contribuint a la pèrdua òssia relacionada amb l’edat (figura 7m). Mentrestant, altres miRNAs (miR-152, miR-142, etc.) també podrien apuntar-se a Rictor, i un augment de miR-218 pot tenir altres objectius importants per a osteoblast com Runx2 en aquest procés (figura 6c), tot el que podria contribuir a la pèrdua òssia relacionada amb l’edat.

L’augment de la resorció òssia i / o la disminució de la formació òssia poden causar pèrdua òssia, i es considera que l’adaptació a la formació òssia és el principal mecanisme patogen que media la pèrdua òssia relacionada amb l’edat. 2, 4, 5 La formació dels ossos deteriorada pot resultar d'una disminució del nombre i osteoblast en funció de l'edat, com a conseqüència de multitud de mecanismes intrínsecs relacionats amb la senescència. 7 Com que es va observar una acumulació progressiva de greix a l’espai de la medul·la òssia amb l’augment de l’edat en l’osteopènia relacionada amb l’edat, i es creu que els adipòcits i els osteoblasts de la medul·la provenien de BMSC comuns, es creu que la reducció de la formació òse ostàstica prové del canvi de osteoblast a diferenciació d’adipòcits en els SMC durant l’envelliment. 4, 5, 6 Moltes molècules incloses Rictor, 24, 25, 26 Id4 (12), Maf, 13 receptors cannabinoides tipus 1 (ref. 11) i miR-188 (ref. 31) han demostrat que actuen com aquest interruptor molecular. en la diferenciació de BMSC Tanmateix, la formació òssia in vivo no depèn només del nombre i la taxa de generació d’osteoblasts, sinó també de l’activitat funcional dels osteoblasts i de la vida de cèl·lules osteoblàstiques madures. Els estudis histomorfometrics indiquen que la disminució de la massa òssia relacionada amb l’edat en els ratolins està associada a l’augment d’apoptosi osteoblàstica i osteocítica. Aquest estudi confirma que a les cèl·lules d’individus envellits, més cèl·lules eren apoptòtiques. Curiosament, la capacitat dels osteoblasts de ratolins envellits per adherir-se a la superfície òssia es va reduir notablement en comparació amb la de ratolins joves tant in vitro com in vivo , que és crucial per al procés de formació de l'os. Aquesta troballa posa l'accent en la importància de la desregulació de l'organització citoesquelètica osteoblàstica en la patogènesi de la pèrdua òssia relacionada amb l'edat. Col·lectivament, la disminució de l’adhesió a l’osteoblast a la superfície òssia i l’augment de l’apoptosi d’osteoblast redueixen el nombre d’osteoblasts funcionals durant la pèrdua òssia relacionada amb l’edat.

Estudis recents han establert el paper essencial de Rictor / mTORC2 en la diferenciació de BMSC, però els resultats d’estudis in vitro i in vivo són controvertits. Els dos BMSC primaris de ratolí deficients en Rictor generats pel sistema Cre / loxP o BMSCs amb Rictor derrota per siRNA mostraven una capacitat de diferenciació osteogènica reduïda i un potencial de diferenciació adipogènica millorat. 24, 26 BMSC de ratolins amb interrupció de Rictor en el mesenquima esqueletogènic de les extremitats (inclòs el BMSC) que utilitzaven Prx1-cre també presentaven una diferenciació osteoblàstica in vitro. 25 Aquests resultats demostren que mTORC2 regula la selecció del llinatge cel·lular en favor dels osteoblasts per sobre dels adipòcits in vitro . Tot i això, sorprenentment no es va reduir el nombre d’osteoblasts, però es van observar menys adipòcits de medul·la òssia en els ratolins amb deficiència de Rictor, cosa que indica que Rictor / mTORC2 és necessari per a una adipogènesi de medul·la òssia adequada in vivo. Per tant, la funció de Rictor en la selecció del llinatge BMSC ha de ser més aclarida. En particular, els nostres estudis in vitro i in vivo demostren que Rictor és necessari per a l’organització, l’adhesió, la mineralització i la supervivència dels citosquelètics d’osteoblasts diferenciats. Les nostres evidències suggereixen que Rictor té diferents papers en els BMSC i en els osteoblasts. Per tant, la pèrdua de Rictor en el mesenquima de les extremitats condueix a elements esquelètics més curts i estrets tant en els embrions com en els ratolins postnatals. Aquests ratolins també presentaven un deteriorament de la formació òssia, que es tradueix en ossos corticals més prims. No obstant això, la supressió de Rictor en osteoblasts en aquest estudi no va afectar el creixement ossi durant el desenvolupament, sinó que va accelerar la pèrdua òssia amb l’augment de l’edat per una deficiència en mineralització, adhesió i supervivència d’osteoblasts, cosa que indica el paper essencial de Rictor en el manteniment d’un nombre suficient de osteoblasts funcionals i formació d’ossos. És important destacar que el nostre estudi revela la relació causal entre la pèrdua de Rictor i la pèrdua òssia relacionada amb l'edat, cosa que suggereix que la baixada regulació de Rictor amb l'envelliment té un paper significatiu en la patogènesi de l'osteoporosi relacionada amb l'edat.

Molts estudis han demostrat que els miRNAs tenen un paper crític en totes les etapes de la formació òssia, cosa que suggereix la possibilitat que els miRNAs puguin ser objectius terapèutics nous per a malalties esquelètiques. 37 En els BMSCs, recentment s'ha demostrat que miRNA-188 regula el canvi relacionat amb l'edat entre osteoblast i diferenciació d'adipòcits i la regulació del miRNA-188 contribueix a la pèrdua òssia relacionada amb l'edat. En particular, el miRNA-188 té com a objectiu Rictor i condueix a la seva regulació inferior a l’envelliment dels BMSC. 31 En osteoblasts, no es va observar un augment significatiu del nivell de miR-188 en ratolins envellits. En lloc d'això, l'expressió millorada del miR-218 va dirigir a Rictor i va semblar ser responsable de la pèrdua de Rictor amb l'envelliment en osteoblasts. miR-218 redueix l’adhesió a l’osteoblast i millora l’apoptosi d’osteoblast, confirmant a més el paper negatiu del miR-218 en la formació òssia. La regulació de Rictor en fase per diferents miRNAs durant la diferenciació del llinatge osteoblast posa de manifest la complexitat de la regulació de la diferenciació cel·lular per miRNAs. Tant miR-188 com miR-218 són objectius terapèutics potencials per a l’osteopènia relacionada amb l’edat.

En conclusió, aquest estudi demostra que la regulació baixa de Rictor amb l’envelliment en osteoblasts és important per a la patogènesi de la pèrdua òssia relacionada amb l’edat. Aquesta via és un nou mecanisme independent del canvi de BMSCs dels osteoblasts a adipòcits i acumulació de greix ossi. Orientar aquesta via, que media la disfunció osteoblàstica relacionada amb l’edat, pot ser útil per promoure la formació òssia i reduir la pèrdua òssia associada a l’envelliment.

Materials i mètodes

Materials

Tots els reactius es van obtenir de Sigma (Poole Dorset, Regne Unit), tret que s’indiqui el contrari. Podeu trobar informació detallada sobre els anticossos per a l'anàlisi de blot occidental i la immunohistoquímica a la informació complementària.

Ratolins

Tots els experiments es van realitzar de conformitat i aprovats pel Comitè d’Ètica i Benestar Animal dels Experiments de la Universitat Mèdica del Sud. Els ratolins en què l'exon 11 de Rictor es trobava flanquejat amb un lloc de sol (Rictor flox / flox ) van ser proporcionats amablement pel professor Mark A. Magnuson de la Universitat Vanderbilt. 38 ratolins Osx-GFP-Cre (gat # 006361) es van comprar al laboratori Jackson (Bar Harbor, ME, EUA). Hem realitzat genotips mitjançant ADN genòmic aïllat de les biòpsies de cua, i els primers que s'utilitzen es mostren a la taula complementària S1. Els ratolins C57BL / 6 van ser adquirits al Centre d’animals del laboratori de la Universitat Mèdica del Sud. Nou ratolins de nou mesos van ser tractats amb NAC (oral. 2 mg / ml, dilució amb aigua) durant 7 mesos, n = 10. Els ratolins van ser sacrificats per luxació cervical per millorar el sofriment. La llista de comprovació de les directrius d'arribada complets s'inclou a la taula complementària S2. 39

Cultura de cèl·lules

La línia cel·lular preosteoblast MC3T3-E1 es va mantenir en alfa-MEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) complementada amb 10% sèrum fetal fetal (Gibco), 100 U / ml de penicilina i 100 mg / ml estreptomicina sulfat. Es van preparar BMSC primaris i cèl·lules osteoblàstiques a partir de la medul·la òssia o calvaria de ratolins a diferents edats. Per a la inducció osteogènica, es van afegir 100 μ g / ml àcid ascòrbic (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Alemanya) i 10 mM β -glicerol fosfat (Sigma-Aldrich) a les cèl·lules confluents. La tinció de color vermell Alizarina es va realitzar segons tècniques estàndard. El medi adipogènic incloïa IBMX 0, 5 mM, 5 μ g / ml insulina i 1 μ M dexametasona. Les cèl·lules es van transfectar amb un vector d’expressió Rictor (pRK5-myc-Rictor, addgene, cat # 1860), o amb un mímic miR-218 de 100 nM, un inhibidor de MiR-218 o un oligo control de revolta mitjançant l’agent de transfecció lipo2000 (Invitrogen, Carlsbad, Canadà ) segons les instruccions del fabricant.

Anàlisi confocal

Les cèl·lules osteoblastes d’OBRictorKO i ratolins de tipus salvatge conreats en cobertes de vidre en plaques de sis pous es van fixar amb 4% paraformaldehid fred en gel amb solució salina tamponada amb fosfat (PBS) durant 20 min a 4 ° C i permeabilitzades amb 0, 2% de Tritó X- 100 en PBS durant 5 min, després bloquejat amb sèrum de cabra durant 30 min i incubat en P-Paxillina (Y118) (dilució 1: 100 amb 1% de BSA) durant 1 h. A continuació, es van rentar en PBS durant 3 × 5 min. Les cèl·lules es van tacar amb fal·loidina conjugada amb FICT (dilució a 1: 500 amb 1% de BSA) i anticossos secundaris conjugats de 488 (a dilució 1: 250 amb 1% de BSA) i es van incubar durant 1 h a temperatura ambient. Després, es van tornar a rentar en PBS durant 3 × 5 min. Es van obtenir fotomicrografies mitjançant microscòpia confocal FLOUVIEW (Olympus, Tòquio, Japó).

Assaig d’adhesió cel·lular

Les cèl·lules d'osteoblastos primaris i MC3T3-E1 es van trypsinitzar i es van tornar a suspendre a una concentració de 5 × 10 4 cèl·lules. Les cel·les es van permetre adherir-se a pel·lícules primes de PLAGA a 37 ° C durant 1 h. Les cèl·lules no adherents es van eliminar rentant-se amb PBS tres vegades i es van fixar en 70% etanol durant 15 min. La solució de taca violeta de cristall es va incubar amb les cèl·lules adherides durant 15 min a temperatura ambient. Les cèl·lules tacades es comptaven a continuació en un hemacòmetre sota un microscopi lleuger.

Assajos ELISA i ROS

El PINP sèric es va mesurar amb un kit d’immunoassaig enzimàtic competitiu del ratolí (Elabscience, Shanghai, Xina) i es va mesurar la concentració de ROS a l’os segons les instruccions del fabricant.

Preparació de seccions descalcificades, histoquímica i immunohistoquímica (IHC) i anàlisis histomorfometriques

Els teixits femurs dissecats dels ratolins es van fixar amb un 4% de paraformaldehid en PBS a 4 ° C durant 24 hores i després es van descalcificar en 15% EDTA (pH 7, 4) a 4 ° C durant 14 dies. Els teixits van ser incrustats en parafina per obtenir un compost de temperatura òptima de tall (Sakura Finetek, Tòquio, Japó), i es van preparar seccions orientades al sagittal de 2-5 μ m per a anàlisis histològiques. Es va realitzar una tinció en H&E de rutina. La tinció amb fosfatasa àcida resistent al tartrat (TRAP) es va realitzar mitjançant un protocol estàndard (Sigma-Aldrich). Per IHC, vam incubar anticossos primaris que van reconèixer osteocalcina de ratolí durant la nit a 4 ° C. All sections were observed and photographed on Olympus BX51 microscope (Tokyo, Japan). Immunohistochemical staining was evaluated by cell number counting. Osteoblasts on bone surface were discerned by morphology and calculated by two independent observers blinded to the groups. At least three mice per group were examined.

Real-time PCR

Total RNA was extracted from MC3T3-E1 cells using Trizol reagent (Life Technologies, Waltham, MA, USA). TaqMan probes were used for the detection of miRNA (Applied Biosystems, Life Technologies, Waltham, MA, USA) as described by the manufacturer, by using the small nuclear RNA U6 as an endogenous control. For mRNA-level analysis, cDNA was generated by using reverse transcriptase SuperScript II and poly, dTpremers (Invitrogen). Real-time PCR was performed by SYBR Green Master Mix (Invitrogen) and the ABI7500HT fast real-time PCR System (Applied Biosystems). Primers are described in Supplementary Table S1. U6 was used as an endogenous control. The relative quantification of miRNA expression was performed using the ΔΔCT method.

Vector constructs

The 3′-UTR of Rictor, encompassing the predicted miRNA sequences, was inserted into the multiple cloning site of the reporter vector psiCHECK-2 (Promega, Madison, USA) with Xho I and Not I. The seed-region-mutated reporters contained engineered point mutations of four nucleotides complementary to the 5′-end of the relevant miRNA. The primers used for cloning are listed in Supplementary Table S1. All sequences were confirmed by Sanger sequencing.

Luciferase assays

HEK293 cells were transfected with the indicated psiCHECK-2 luciferase construct. All cells were also transfected with miRNA mimics or negative control. Lysates were collected 36 h after transfection and luciferase activities were measured by using the dual-luciferase reporter assay system (Promega).

miRNA detection

Total RNA, inclusive of the small RNA fraction, was extracted from cultured cells with a Tissue Total RNA Extraction Kit (GenePharma). Reverse transcription reactions were carried out using Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT) (Invitrogen). Real-time PCR was performed on an Applied BiosystemStepOnePlus, using SYBR Green I Real-Time PCR kits (GenePharma, Suzhou, China) for miRNA. The relative expression levels of miRNAs in each sample were calculated and quantified using the 2 −total method after normalization for expression of the positive control.

Scanning electron microscopy (SEM)

The surface of the methylmethacrylate (MMA) embedded femurs were polished and acid-etched with 37% phosphoric acid for 2–10 s. After washing for 5 min with 5% sodium hypochlorite they were coated with gold and palladium before examining with SEM (S-3700 N, Hitachi, Tokyo, Japan).

Calcein staining

Three- and nine-month-old mice were given calcein via intraperitoneal injection, 10 and 3 days before killing. Both femur were fixed in 100% ethanol, embedded in polymethyl methacrylate and sectioned using microtome (Leica SM2500S; knife: Leica VMH400, Nussloch, Germany). A total of 10 μ m thick longitudinal section from each femur was analyzed using Olympus microscope. The flourochrome labels were used to assess the bone MARs. We calculated MAR by measuring the mean distance of fluorescent labels, and dividing the distance by the time point at which the labels were administrated. MAR/OB: average thickness of mineral apposition by an osteoblast per day in 1 mm bone surface.

micro-CT analysis

Quantitative analysis was performed in mice femora at 12- μ m resolution on a micro-CT Scanner (Scanco Medical, Bassersdorf, Switzerland). Briefly, scanning was performed at the lower growth plate in the femora and extended proximally for 300 slices. We started morphometric analysis with the first slice in which the femoral condyles were fully merged and extended for 100 slices proximally. The 3D structure and morphometry were constructed and analyzed for BV/TV (%), BMD (mg HA/mm 3 ), Tb.N. (mm –1 ), Tb.Th. (mm) and Tb.Sp. (mm). We also performed micro-CT imaging in the mid-diaphysis of the femur and performed mid-shaft evaluation of 100 slices to quantify the cortical thickness, bone mineral density and outer/inner perimeter of the mid-shaft.

Trabecular bone ROS assay

Trabecular were isolated from femur and ground with liquid nitrogen. The homogenate in PBS was centrifuged to remove debris and the supernatants were incubated in 10 μ M dichorodihydro fuorescein diacetate (DCFH-DA; Molecular Probes, GenePharma, Suzhou, China) for 10 min at room temperature. DCFH-DA oxidation into 2′, 7′-dichlorofluorescein was measured using a spectrofluorometer (Bio-TEK, Vermont, USA, excitation 485 nm and emission 525 nm). Date were expressed as value of optical density (OD).

Western blot

Cells and tissues were lysated by 2% sodium dodecyl sulfate with 2 M urea, 10% glycerol, 10 mM Tris–HCl (pH 6.8), 10 mM dithiothreitol and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride. The lysates were centrifuged and the supernatants were separated by SDS–PAGE and blotted onto a nitrocellulose (NC) membrane (Bio-Rad Laboratories, Shanghai, China). The membrane was then analyzed using specific antibodies and visualized by enhanced chemiluminescence (ECL Kit, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

Preparation of undecalcified histology sections

To label the mineralization fronts, 6-month-old mice were subcutaneously injected with calcin (Sigma, 15 mg/kg body weight) in 2% sodium bicarbonate solution 10 and 3 days before death. After dissection, the femurs were fixed in 4% paraformaldehyde for 24 h. They were then dehydrated through a graded series of ethanol (70–100%) and xylene before being embedded in MMA without prior decalcification. Ten micrometer-thick sections were prepared for double-labeling fluorescent analysis.

Estadístiques

All results are expressed as mean±SEM T-tests were used to calculate P -values. La importància estadística es va definir com P <0, 05.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Supplementary Informations

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

  4. 4.

    Figura suplementària 4

  5. 5.

    Figura suplementària 5

  6. 6.

    Figura suplementària 6

  7. 7.

    Figura suplementària 7

  8. 8.

    Figura suplementària 8

  9. 9.

    Figura suplementària 9

  10. 10.

    Figura suplementària 10

Glossari

BMD

bone mineral density

BMSCs

bone marrow mesenchymal stem cells

BV/TV

bone volume per tissue volume

MSC

mesenchymal stem cell

mTORC2

mechanistic target of rapamycin complex 2

Tb.N

trabecular number

Tb.Sp

trabecular separation

Tb.Th

trabecular thickness

TRAP

tartrate-resistant acid phosphatase

BS

bone furface

NAC

N-acety- l -cysteine

ROS

espècies reactives a l'oxígen

Supplementary Information accompanies this paper on Cell Death and Disease website (//www.nature.com/cddis)