El magnesi indueix una apoptosi neuronal suprimint l’excitabilitat | mort i malaltia cel·lular

El magnesi indueix una apoptosi neuronal suprimint l’excitabilitat | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Excitabilitat
  • Magnesi
  • Neurodegeneració

Resum

En obstetrícia clínica, l’ús de sulfat de magnesi (MgSO 4 ) està molt estès, però es desconeixen efectes sobre el desenvolupament cerebral. Molts agents que deprimeixen excitabilitat neuronal augmenten la neuroapoptosi del desenvolupament. En aquest estudi, hem utilitzat cultius dissociats d’hipocamp de rosegadors per examinar els efectes de Mg ++ sobre l’excitabilitat i la supervivència. Pèrdua de cèl·lules associada a la caspasa-3 causada per Mg ++ a concentracions clínicament rellevants. Les tècniques de clamp patch-pinça de cèl·lula sencera van mesurar els efectes de Mg ++ sobre el llindar del potencial d’acció, l’amplitud màxima del potencial d’acció, el nombre d’espiga i els canvis en el potencial de membrana en repòs. Llindar potencial de l'acció despolaritzada de Mg ++, probablement a partir dels efectes de cribatge de càrrega superficial en els canals de sodi amb tensió. Mg ++ també va disminuir el nombre de potencials d’acció en resposta a la injecció de corrent fix sense afectar l’amplitud màxima del potencial d’acció. Sorprenentment, Mg ++ també va despolaritzar el potencial neuronal en repòs de forma concentrada amb un desplaçament de +5, 2 mV a 10 mM. Les rampes de tensió van suggerir que Mg ++ bloquejava una conductança de potassi que contribuïa al potencial de repòs. Malgrat aquest efecte despolaritzant de Mg ++, l'efecte inhibidor net de Mg ++ va silenciar gairebé completament l'activitat de xarxa neuronal que es va mesurar amb enregistraments en matèria multielectrodes. Arribem a la conclusió que, tot i que Mg ++ té efectes complexos sobre l’excitabilitat cel·lular, la influència inhibidora general de Mg ++ disminueix la supervivència neuronal. Units amb evidències recents in vivo , els nostres resultats suggereixen que es pot justificar la precaució en l'ús de Mg ++ en obstetrícia clínica i neonatologia.

Principal

El sulfat de magnesi (MgSO 4 ) ha estat utilitzat en obstetrícia clínica durant més de 70 anys per tractar la preeclàmpsia / eclampsia i el treball preterme, condicions que compliquen aproximadament el 3 i el 12, 4% dels embarassos, respectivament, als Estats Units cada any. 1 Actualment, MgSO 4 és l’estàndard d’atenció per prevenir i tractar les convulsions eclamètiques, i tot i que la seva seguretat i efectivitat com a tocolític és controvertida, 2, 3 es calcula que més de 150 000 dones als Estats Units reben teràpia tocolítica a més o menys 34 setmanes de gestació anuals, amb MgSO 4 utilitzat com a primera línia de tractament en la majoria dels casos. 4, 5 Tot i que MgSO 4 ha estat generalment acceptat com a segur sense efectes adversos en els nounats, cap estudi ha estudiat si l'exposició de cervells normals en desenvolupament a altes concentracions de Mg ++ té efectes o conseqüències perjudicials.

En canvi, Mg ++ s’ha estudiat àmpliament com un potencial neuroprotectant per prevenir o millorar els resultats de lesions cerebrals derivades d’hipòxia / isquèmia perinatal com encefalopatia, hemorràgia intraventricular, leucomalàcia periventricular i paràlisi cerebral. 6, 7 Tanmateix, la seguretat i l’eficàcia neuroprotectora de Mg ++ per a nounats prematurs i amb risc segueixen sent controvertides. 8 recents avaluacions sobre l’ús de MgSO 4 per a la neuroprotecció del fetus o l’ús com a tocolític en dones amb risc de naixement prematur van concloure que no s’han establert efectes neuroprotectors; MgSO 4 és ineficient per retardar o prevenir el part prematur i pot augmentar en realitat la morbiditat i la mortalitat neonatal. 2, 9

El magnesi és secundari només en potassi en abundància com a catió intracel·lular en el cos humà, i Mg ++ participa en moltes funcions cel·lulars, incloent la producció d’energia, la neurotransmissió sinàptica i la senyalització intracel·lular. Mg ++ bloqueja els canals iònics del receptor del glutamat de N- metil- D-aspartat (NMDA), prevenint el flux d’ions en els potencials potencials de repòs neuronal. 10 cations diferencials, inclòs Mg ++ a concentracions de mM, disminueixen l’activació de canals tensats per voltatge mitjançant efectes de cribatge de càrrega superficial, 11, 12, 13, 14 i redueixen així l’excitabilitat neuronal. Mg ++ a altes concentracions extracel·lulars també bloqueja l’afluència de Ca ++ i disminueix la transmissió sinàptica. Aparentment, les accions bombològiques resulten de la contractilitat miometrial reduïda mitjançant accions Mg ++ extracel·lulars i intracel·lulars. 16 Tot i això, Mg ++ suprafisiològic també bloqueja les conductances de potassi i els receptors γ -aminobutírics (GABA) A. 17, 18, 19 Les evidències recents suggereixen que l’alleujament de la inhibició induïda per Mg ++ a llarg termini podria produir augments homeostàtics en potenciació i plasticitat a llarg termini. Per tant, a concentracions suprafisiològiques, Mg ++ pot tenir accions complexes sobre excitabilitat neuronal, i no està clar si preval la excitació neta o la inhibició durant la incubació prolongada.

Els compostos que inhibeixen l’activitat neuronal, inclosos antagonistes de NMDA i bloquejadors de canals de calci, desencadenen una neurodegeneració apoptòtica generalitzada al cervell en desenvolupament durant la finestra de vulnerabilitat (ratolins i rates 0-14 dies després de la vida). 21, 22, 23 En els rosegadors, aquest període crític correspon aproximadament al tercer trimestre del desenvolupament humà, quan l’exposició a MgSO 4 té lloc típicament en humans. Si Mg ++ inhibeix suficientment les neurones, l’administració de Mg ++ a animals joves pot augmentar la neuroapoptosi de desenvolupament. De fet, vam demostrar que MgSO 4 in vivo indueix una neuroapoptosi generalitzada del sistema nerviós central els dies 3 i 7 postnatal, però no el dia postnatal 14. 25 Aquest treball no va investigar explícitament si Mg ++ va actuar directament o indirectament sobre les neurones diana susceptibles. als quals les preparacions in vitro són especialment adequades.

Tenint en compte les complexes accions cel·lulars de Mg ++ sobre l’excitabilitat esmentades anteriorment i preguntes sobre si Mg ++ provoca directament la mort neuronal, es va examinar la supervivència in vitro , juntament amb estudis eletrofisiològics per a provar els efectes de Mg ++ sobre l’excitabilitat de les neurones. Per a aquests estudis mecanicistes, vam explotar una preparació de cultiu primari de neurones de l’hipocamp rosegador.

Resultats

Efectes de supervivència / neurones de caspase-3 activades

Vam trobar que tant MgSO 4 com MgCl 2 a concentracions de 5 i 10 mM van induir la mort de les neurones de l’hipocamp respecte a les cultures de control (figures 1a i b). Menys neurones es van observar en cultius tractats versus controls i els perfils cel·lulars de les neurones moribundes eren sovint visibles i caracteritzats per nuclis condensats i fragmentats, com sovint s’associa amb la mort de cèl·lules apoptòtiques. Els dos MgSO 4 i MgCl 2 van tenir efectes negatius forts sobre la supervivència a 5 mM i a 10 mM van afegir Mg ++ (Figura 1b). Això situa la concentració en què Mg ++ mata neurones en el rang en què té efectes importants sobre els canals iònics i és clínicament rellevant. 26 A partir del grau important de mort cel·lular produït a concentracions de 5 i 10 mM de MgSO 4, es va examinar la supervivència en un estudi de concentració-resposta comparant 1, 2, 5 i 5 mM. En aquests estudis (figura 1c), es va produir una tendència de pèrdua neuronal amb concentracions inferiors a 1 mM de MgSO 4 afegit ( P = 0, 07). Aquesta tendència es va fer estadísticament significativa a 2, 5 i 5 mM per sobre de les condicions de control (figura 1c).

Image

Mg ++ disminueix la supervivència neuronal en cultius hipocampals primaris. ( a ) Fotomicrògraf de contrast de fases que mostra neurones sanes (exemples indicats amb fletxes) utilitzats en el recompte de cèl·lules. ( b ) Resum de recomptes procedents de camps seleccionats aleatòriament a partir de plats tractats amb MgSO 4 o MgCl 2 a les concentracions indicades. Es van normalitzar els recomptes a partir de cultius de germanes de control ( n = 5 experiments en planxes independents). El tractament amb Mg ++ va ser des del dia in vitro del dia 5 al dia in vitro 10. ( c ) Resum de les proves de concentracions més baixes de MgSO 4 en un percentatge de supervivència respecte al control. Tot i que aquest conjunt de cultius era lleugerament menys susceptible a efectes de 5 mM Mg ++ en comparació amb els cultius a ( a ), concentracions inferiors a 1 mM per sobre del control van produir una disminució significativa de la supervivència en comparació amb el control. Les barres representen el mitjà ± SEM ( n = 6). * P <0, 05; *** P <0, 001

Imatge a mida completa

MgSO 4 indueix una onada de neurodegeneració apoptòtica al cervell del ratolí neonatal, 25 en part definida per l’activació de la caspasa-3, una caspasa efectora en molts tipus d’apoptosi neuronal. 27 Per determinar si les neurones exposades a Mg ++ in vitro sofreixen canvis apoptòtics i per identificar positivament les neurones que moren, vam immunodeposar els cultius de l’hipocamp per a la caspasa-3 activada. L’immunostaining per a la caspasa-3 activada té avantatges respecte a altres mesures d’activitat de la caspasa perquè identifica el tipus de cèl·lula que conté l’enzim activat (en el nostre cas les neurones de l’hipocamp). La identificació de tipus cel·lular és una característica útil en el nostre cultiu mixt d’astròcits i neurones. Immunitzem cèl·lules en condicions de control i cultius tractats amb 5 i 10 mM MgSO 4 addicionals durant 3 dies a partir dels 6 dies in vitro . L’apoptosi en resposta al bloqueig d’activitat in vitro mostra un augment significatiu de la tinció de caspasa-3 en cèl·lules susceptibles, i Mg ++ va produir un augment depenent de la concentració en el percentatge de neurones immunoreactives en cultius (figura 2), similar a una varietat de tractaments que inhibeixen. activitat neuronal. 28, 29 El nombre mitjà absolut de cèl·lules sanes en els grups de control versus grups tractats eren similars (68, 8 ± 22, 8 cèl·lules per control; 64, 1 ± 20, 5 cèl·lules per 5 mM i 64, 4 ± 26, 7 cèl·lules per 10 mM). Aquesta similitud va resultar de l'avaluació primerenca dels cultius als 3 dies després del tractament amb MgSO 4 (Figura 2) enfront dels 6 dies després de l'avaluació del tractament a la Figura 1 (vegeu també Moulder et al. 28 ). Tant els grups MgSO 4 de 5 i 10 mM van mostrar percentatges significativament més alts de cèl·lules caspasa-3-positives respecte dels controls germans (figures 2c i d). Els baixos percentatges absoluts de neurones immunoreactives caspasa-3 reflecteixen la lenta pèrdua global de neurones, combinada amb la immunoreactivitat de la caspasa-3 transitòria en les neurones individuals. Una instantània d’immunoreactivitat en caspasa-3 en qualsevol moment durant la pèrdua progressiva de neurones produeix només una minoria de cèl·lules positives. 28, 29

Image

Més neurones mostren una immunoreactivitat en caspasa-3 en cultius tractats amb Mg ++ . ( a ) Camp de control que mostra negatives neurones sanes per a la immunoreactivitat del caspase-3 activat. ( b ) Camp d'un cultiu tractat amb Mg ++ amb una neurona positiva per a la caspasa-3 activada (fletxa). ( c ) Els gràfics de barres resumeixen el percentatge de cèl·lules pospàsiques-3-positives en relació amb cèl·lules sanes dels mateixos camps. Ambdues concentracions de MgSO 4 (5 i 10 mM) van augmentar significativament el percentatge de neurones apoptòtiques sobre control ( n = 5 experiments). ( d ) Resum d'experiments addicionals dissenyats per provar la protecció per incubació de KCl. El KCl només va mostrar una tendència de protecció contra la pèrdua neuronal attritional i va reduir el percentatge d’immunoreactivitat als nivells de control conjuntament amb l’exposició a Mg ++ ( n = 5). * P <0, 05; ** P <0, 01

Imatge a mida completa

S'ha demostrat que la incubació crònica de neurones amb concentracions elevades de KCl al medi de cultiu protegeix les neurones de la mort de cèl·lules apoptòtiques derivades de la sobreinhibició i de la privació del factor neurotròfic. Es pensa que la despolarització de KCl 23, 28, 29, 30, 31 prevé l'apoptosi augmentant moderadament la concentració de Ca 2+ intracel·lular. 30 Si Mg ++ actués disminuint l’activitat neuronal, hipotetitzaríem que el tractament amb KCl contrarestaria l’efecte de Mg ++ . En canvi, si Mg ++ actués per altres mecanismes, com l’excitació d’excitació, podríem esperar que la despolarització de KCl agreujés la mort. Per tant, per ajudar a aclarir encara més la naturalesa de la mort neuronal induïda per Mg ++ in vitro , vam provar l'efecte de 30 mM KCl en la mort cel·lular associada a la caspasa induïda per Mg ++ . Vam trobar que KCl protegia significativament tant contra la mort neuronal espontània com contra la mort cel·lular induïda per MgSO 4 (Figura 2d). Com es va demostrar en els experiments anteriors, la comparació del control vers MgSO 4 va mostrar una augment significativa de la presència de caspasa-3 activada. La comparació de les figures 2c i d mostra una variabilitat considerable en la quantitat d’apoptosi relacionada amb l’atritió entre cultius de control de diferents plaques (∼ 8% a la figura 2c enfront de ∼ 2% a la figura 2d). Tot i que no s’entenen del tot els factors que participen en el nivell d’apoptosi de fons, l’augment induït de Mg ++ en la immunoreactivitat del caspasa-3 va ser robust en el context de la baixa pèrdua actritional més baixa.

Electrofisiologia

Per determinar els efectes de Mg ++ en l’excitabilitat de les neurones hipocampals, es van realitzar experiments d’electrofisiologia amb les mateixes concentracions de MgCl 2 que els experiments de supervivència (2, 5, 5 i 10 mM). MgCl 2, més que MgSO 4, es va utilitzar en els experiments d’electrofisiologia perquè les sals de clor s’utilitzen rutinàriament en electrofisiologia de cultiu. Com vam predir una reducció neta de l’excitabilitat per Mg ++ basada en els nostres estudis de supervivència, vam comparar els efectes de la concentració d’escalada de tetrodotoxina (TTX), un antagonista altament selectiu dels canals de sodi amb tensió amb efectes ben definits sobre l’excitabilitat. El silenciament TTX mata les neurones en el cultiu de l’hipocamp mitjançant l’apoptosi durant un període de temps similar al de Mg ++, 28, 29, de manera que va servir de comparador rellevant.

En el mode de pinça actual, es va utilitzar un pols de corrent de 20 ms de +70 a +220 pA per iniciar els potencials d’acció. Les amplituds actuals molt més enllà de la reobasa de la cèl·lula es van utilitzar per ajudar a assegurar que el ciclisme es produïa per una amplitud de corrent fixa, malgrat la menor excitabilitat prevista amb l'aplicació Mg ++ i TTX. Es van registrar i analitzar rastres per al llindar de potencial d’acció, l’amplitud de pic potencial d’acció, el nombre d’espiga i els canvis en el potencial de membrana en repòs ( V m ).

La figura 3 mostra que es va produir un augment dependent dels llindars potencials d’acció amb tractament Mg ++ (figures 3a i b), que va donar lloc a una disminució de l’excitabilitat, mesurada com el nombre d’espigons obtinguts per la injecció de corrent fix (figura 3c ). L’efecte en l’inici de la punta es va fer tan greu a 10 mM Mg ++ que a dues cèl·lules no vam poder evocar potencials d’acció a aquesta concentració. El llindar TTX (30 nM) també va despolaritzar significativament (Figura 4a). Quantitativament, l'efecte de 30 nM TTX sobre el llindar potencial d'acció va ser similar a l'efecte de 2, 5 i 5 mM Mg ++, amb efectes més forts de 60 nM i 90 nM TTX ( P <0, 001) en comparació amb 30 nM.

Image

Mg ++ augmenta el llindar de tensió per a l’inici del potencial d’acció i disminueix el nombre d’espigons en resposta a la injecció de corrent prolongada. ( a ) Exemples representatius de potencials d'acció derivats d'una injecció de corrent d'amplitud fixa (+120 pA) en enregistraments de cèl·lules completes. Es donen llindars potencials d’acció per a cada rastre, que representen d’esquerra a dreta: 1 (línia base), 2, 5, 5 i 10 mM MgCl 2 addicionals. Vegeu la figura 4 per obtenir dades de resum. ( b ) Primeres traces derivades dels exemples mostrats a ( a ). Mg ++ va reduir el pendent màxim dels potencials d’acció (amplitud màxima del primer derivat), coherent amb una reducció de la disponibilitat de canals Na + . ( c ) Efectes de Mg ++ en el nombre de potencials d’acció produïts en resposta a una injecció de corrent fix. Els exemples són dels mateixos enregistraments que als panells ( a ) i ( b ). Vegeu la figura 4 per obtenir dades de resum

Imatge a mida completa

Image

Resum de dades acumulades d’enregistraments de clamp-clamp de cèl·lules senceres. ( a ) Tauler esquerre: la supressió del llindar potencial d'acció depenia de la concentració de Mg ++ . Tauler dret: Els efectes TTX sobre el llindar potencial d’acció eren comparables als de Mg ++ . ( b ) Mg ++ va disminuir el nombre d'espigues per injecció actual. Una tendència depenent de la concentració assolí una importància estadística amb la concentració més alta de Mg ++ . TTX va aproximar de nou l’efecte de Mg ++ . ( c ) L'amplitud màxima del pic potencial no va ser afectada per Mg ++, però es va reduir significativament per TTX. ( n = 13 per a cèl·lules tractades amb Mg ++ i 11 per a cèl·lules tractades amb TTX). ** P <0, 01; *** P <0, 001

Imatge a mida completa

Mg ++ no va afectar significativament l'amplitud màxima dels potencials d'acció excepte a la concentració més alta (10 mM). Tanmateix, el canvi en la màxima pendent i amplitud màxima del primer derivat del potencial d’acció (figures 3b i 4) és coherent amb una disminució de la disponibilitat i l’activació dels canals Na + i el posterior desplaçament del llindar. En canvi, TTX a concentracions de 30 nM ( P <0, 01) i superior ( P <0, 001) va disminuir significativament l’amplitud dels potencials d’acció (figura 4c). Això s'esperava a causa del bloqueig directe dels canals de sodi per TTX. Mg ++ també va induir una disminució de la concentració en el nombre de potencials d’acció evocats per la injecció de corrent d’amplitud fixa (figura 4b). Igual que Mg ++, TTX a 30, 60 i 90 nM va disminuir el nombre d’espigues respecte a la línia de base (figura 4).

Malgrat aquests efectes inhibidors de Mg ++, també vam observar un efecte excitatori no anticipat de Mg ++ . V neuronal en repòs despolaritzat de Mg ++ de forma dependent de la concentració (Figures 5a i b). Aquest efecte es va associar amb una major resistència a l’entrada cel·lular (figura 5c). Per definir el potencial de reversió aproximat del corrent implicat, es van fixar cèl·lules amb tensió i es van realitzar protocols de rampa de tensió (figura 5c). El canvi de pendent de la resposta actual a la rampa de tensió posa de manifest la disminució de la conductança de la membrana en resposta a l'aplicació Mg ++ . La resta digital de la resposta de base de la resposta en presència de Mg ++ va suggerir un potencial de reversió fortament negatiu del corrent sensible Mg ++ (−84, 8 ± 14, 3 mV, n = 6 cèl·lules). En una cel·la, vam comprovar que la reversió no es va afectar augmentant la concentració de clorur de pipeta a 140 mM (potencial de reversió del clorur (E Cl− ) = 0 mV). En la majoria de cèl·lules, el corrent sensible Mg ++ va mostrar una rectificació aparent interior (vegeu exemple a la figura 5c). Això podria suggerir que Mg ++ bloqueja un corrent de rectificació interior, però no podem excloure un bloc dependent de la tensió d'una conductància ohmica. Com era d'esperar, TTX no va produir cap canvi consistent en la reposició de V m (−63, 4 ± 2, 4 mV versus 30 nM TTX: −63, 7 ± 3, 7 mV). En resum, aquests experiments suggereixen que Mg ++ influeix en el potencial de descans principalment bloquejant una conductança de potassi oberta en repòs, possiblement una conductança de rectificació interior.

Image

Mg ++ depolaritza el potencial de repòs neuronal. ( a ) Exemple representatiu del canvi de descans en V m just abans de la injecció actual (fletxa) amb concentracions creixents de Mg ++ . Cada augment de concentració de Mg ++ va induir una despolarització aproximada de 2 mV en V m en repòs. ( b ) El gràfic de barres representa el canvi acumulat en V m de tots els enregistraments cel·lulars ( n = 13). Hi ha aproximadament un desplaçament de +5, 2 mV a la mitjana V m en control versus el grup Mg ++ alt (11 mM total) * P <0, 05; *** P <0, 001. ( c ) Exemple de rampa de tensió realitzada en condicions basals i en presència de 10 mM afegit Mg ++ (11 mM en total). La rampa va ser de –140 a –40 mV a més de 20 m. En restar una resposta en presència de Mg ++ a un escombrat control es va produir un corrent sensible de Mg ++ amb un potencial de reversió de -84, 8 mV en aquesta cel·la

Imatge a mida completa

En el context de les nostres cèl·lules arrodonides banyades en antagonistes del receptor postsinàptic, els efectes inhibidors de Mg ++ semblen dominar l'efecte excitatori sobre el potencial de repòs. No obstant això, els efectes mixtes de Mg ++ plantegen la qüestió de quins efectes predominarien en una xarxa activa espontàniament, com en els nostres estudis de supervivència. Per respondre a aquesta pregunta, vam recórrer a enregistraments de matrius multielectrodes (MEA) de les nostres cultures (Figura 6). Es va utilitzar 30 nM TTX com a comparador perquè va aproximar l’augment del llindar de potencials d’acció i la disminució de l’excitabilitat observada amb la concentració intermèdia de Mg ++ . Quan es van banyar els cultius de MEA en el registre de salines que contenia un Mg ++ de 2, 5 o 5 mM addicionals, es va observar un silenciament gairebé complet de la xarxa neuronal (figura 6). TTX a 30 nM, activitat de xarxa deprimida de manera similar, amb una supressió d'activitat gairebé completa (figura 6). En tots els casos, es van comparar els efectes del tractament amb l’activitat mitjana des de les condicions de control i rentat per tenir en compte la possible pèrdua d’activitat a causa d’un dany neuronal per intercanvis repetits de solucions. Els nivells d’activitat en Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM i TTX 30 nM no eren significativament diferents l’un de l’altre, i tota l’activitat de la xarxa va suprimir força i gairebé completament. Aquests resultats suggereixen clarament que la inhibició és l'efecte predominant de l'elevat Mg ++ extracel·lular a la xarxa intacta.

Image

Mg ++ suprimeix l’activitat de la xarxa. ( a - c ) Trajectes més ràpids de gravacions de MEA de control ( a ), Mg ++ 2, 5 mM ( b ) i rentat ( c ). L'enregistrament de rentat es va realitzar després que el cultiu passés de gravacions realitzades en condicions de tractament Mg ++ 2, 5 mM, Mg ++ 5 mM i TTX 30 nM. Tot i que l’activitat no va ser tan robusta en els enregistraments de rentats, va ser significativament més gran que en cap de les condicions de tractament. La disminució de l'activitat entre el límit inicial i el rentat era probablement deguda a l'eliminació incompleta de TTX, i als efectes de les rentades repetides. Els intercanvis de solució única en el mateix mitjà no van tenir cap efecte en les taxes de detecció de punxes a tota la matriu (ASDR). ( d ) El resum dels nivells d'activitat dels grups de tractament es va mostrar com a una fracció dels ASDRs, expressada en relació amb la mitjana de les taxes de ASDR inicial i de rentat. Es va observar un silenciament gairebé complet de la xarxa neuronal en tots els tractaments experimentals. ( n = 3 experiments independents). ** P <0, 01

Imatge a mida completa

Discussió

Tot i que Mg ++ té efectes complexos sobre l’excitabilitat cel·lular, incloent tant influències excitadores com inhibidores, les nostres dades indiquen que la influència inhibidora general de Mg ++ compta amb una disminució de la supervivència neuronal amb una exposició prolongada. Malgrat una sorprenent despolarització del potencial de repòs, l'efecte net de Mg ++ és inhibidor, com es demostra en els enregistraments de l'activitat de xarxa. La disminució de l’excitabilitat desencadena la mort neuronal i la despolarització amb potassi protegeix contra la mort. Aquests resultats suggereixen que l'apoptosi neuronal induïda per Mg ++ in vivo 25 probablement resulti directament dels efectes de Mg ++ sobre neurones susceptibles en lloc de conseqüències secundàries de l'administració sistèmica de Mg ++ en animals. A l’obstetrícia clínica, l’administració de Mg ++ està tipificada per mantenir nivells sèrics de la mare d’aproximadament 4-8 mg per cada 100 ml (1, 6-3, 3 mM). Aquestes concentracions són properes a les concentracions més baixes que van induir toxicitat neuronal significativa en els nostres experiments.

Les nostres observacions actuals també coincideixen amb els nostres estudis in vitro anteriors que demostren que la depressió de l’activitat espontània de les neurones hipocampals in vitro produeix una pèrdua de cèl·lules apoptòtiques. 28, 29 Tot i que el model de cultiu ha estat útil i generalment es correlaciona bé amb els resultats in vivo , hi ha almenys una diferència amb els estudis neonatals in vivo que mereixen ser mencionats. La pèrdua de cèl·lules dependent de l’activitat in vitro té un curs de temps característicament més lent que l’observat in vivo . La pèrdua in vitro dura> 3 dies, mentre que els marcadors de l’apoptosi in vivo s’observen en poques hores després del tractament. 34, 35 Tot i això, el model in vitro ha estat útil per identificar i estudiar detalls mecànics de l’apoptosi induïda per agents que suprimeixen l’excitabilitat neuronal in vivo . 28, 29

El magnesi endogen manté la funció cel·lular, la integritat i la producció d'energia, i l'extracel·lular Mg ++ modula una gran varietat de diferents canals i receptors iònics, inclosos els receptors NMDA, 10 canals de Ca ++, 36 receptors GABA A i els canals amb tensió. 11, 12, 32 La manipulació de cadascun d’aquests tipus de canals s’ha demostrat que afecta la supervivència cel·lular durant la sinaptogènesi del desenvolupament, quan moltes neurones pateixen la mort cel·lular fisiològica. 31, 34 El tema comú amb agents neuroactius apoptòtics, inclòs Mg ++, és que l'activitat neuronal està fortament suprimida. En susceptible, el desenvolupament de la supressió d'activitats de les neurones activa un "desencadenant" apoptòtic. Aquest desencadenant comú podria reduir-se Ca ++, 30 intracel·lular, però els factors ambientals poden ser influenciats per la configuració. 29

Malgrat la varietat d’objectius sensibles a Mg ++ que podrien ser rellevants per als efectes sobre la supervivència, els nostres resultats suggereixen que és probable que s’iniciï el potencial d’acció alterada i l’apartament de canals de sodi. Aquesta conclusió és la base de les nostres comparacions amb el bloqueig selectiu de canals de sodi TTX. Abans hem demostrat que el silenciament TTX de les neurones és suficient per provocar apoptosi en un període de temps similar al observat aquí amb Mg ++ . Com que Mg ++ eleva el llindar potencial d’acció a valors similars als aconseguits per TTX, i tots dos tenen efectes similars en l’excitabilitat de la xarxa en els enregistraments MEA, és raonable concloure que els efectes sobre el comportament de canals Na + i el llindar potencial d’acció expliquen principalment Mg ++. efectes sobre l’excitabilitat i la supervivència, amb poca necessitat d’invocar explicacions mecanicistes que impliquen altres canals (per exemple, receptors NMDA o canals de Ca 2+ ). Si les cèl·lules rarament aconsegueixen un llindar potencial d'acció a causa de la canalització de canal alterada amb tensió, els canals Ca ++ amb tensió no s'obriran. De la mateixa manera, l'efecte directe de Mg ++ sobre els receptors de NMDA serà en gran mesura irrellevant en absència de potencials d'acció per impulsar l'alliberament de glutamat. Tanmateix, les aportacions d’aquests altres mecanismes inhibidors no poden ser completament excloses.

Els efectes sobre el llindar potencial d'acció i l'excitabilitat de la xarxa resulten gairebé certament dels efectes descrits clàssicament dels cations divalents sobre els canals amb tensió. Els efectes del cribatge de càrrega superficial per Mg ++ i per altres cations divalents s'han descrit en nombrosos escenaris. 11, 12, 13, 14, 32 Aquest efecte resulta probablement de la unió de cations divalents extracel·lulars a càrregues negatives fixes a la membrana cel·lular. 32 Això redueix eficaçment el potencial superficial i produeix una influència local hiperpolaritzant sobre els dominis dels canals sensibles a la tensió. Aquest efecte de cribatge de càrrega es detecta com un canvi despolaritzant en l'activació i inactivació del canal depenent de la tensió. El treball clàssic va descriure la influència de multitud de cations divalents sobre l'excitació en els nodes de Ranvier de les fibres nervioses mielinitzades de la granota; Un augment de deu vegades en la concentració d’ions canvia el llindar de tret fins a +25 mV depenent de l’ió. 12 Concretament, un augment de Mg ++ d’1 a 10 mM canvia l’activació del canal Na + d’aproximadament +15 mV, coincidint amb el desplaçament del potencial d’acció aproximadament de +13 mV observat en els nostres experiments.

També es va identificar un potencial efecte excitatori de Mg ++ sobre V m descansat. Un augment de la concentració de Mg ++ d’1 a 10 mM va despolaritzar la resta 5 m per 5, 2 mV. Segons el nostre coneixement, aquest efecte de Mg ++ no s'ha informat prèviament. Els mecanismes candidats basats en el potencial de reversió del corrent sensible Mg ++ inclouen un bloc de diversos canals de "fuga" com ara canals de rectificació K + interior i canals K + de domini de dos porus, com Kir2.1 i TREK-1 K + canals, respectivament. 18, 19 Tot i que la despolarització induïda per Mg ++ podria, al seu valor nominal, augmentar l'excapacitat cel·lular, els efectes de cribratge de càrrega superficial descrits anteriorment evitarien efectes funcionals significatius de la despolarització en excitabilitat. La despolarització en repòs va ser menor (+5, 2 mV) que el desplaçament esperat en el comportament i la inactivació en estat constant (+13 mV) dels efectes de càrrega superficial (vegeu més amunt). La influència de Mg ++ sobre V m en repòs mereix una exploració més gran i podria proporcionar una comprensió més de la contribució dels canals de "fuita" als V m de repòs cel·lular.

L’ús de Mg ++ en obstetrícia clínica i neonatologia com a anticonvulsiu, tocolític i neuroprotectant és generalitzat, però els estudis que avalen la seva eficàcia clínica són controvertits i cap estudi ha examinat ni establert la seguretat dels seus efectes sobre el cervell normal i en desenvolupament. Combinats amb el nostre recent estudi in vivo , 25 resultats mostren que el desenvolupament de neurones i xarxes neuronals requereix un nivell adequat d’input actiu per a un desenvolupament i supervivència adequats. Les concentracions de Mg ++ clínicament rellevants maten les neurones en aquest moment humitejant l'excitabilitat i augmentant l'apoptosi. Es va observar la mort de cèl·lules apoptòtiques induïdes per Mg ++ en els nostres estudis in vivo anteriors i això es va recolzar en els experiments in vitro presents. Els nostres experiments ajuden a vincular Mg ++ a altres agents neuro-depressius que promouen l’apoptosi en neurones joves. Es requereixen estudis addicionals per avaluar l'efecte a llarg termini de l'exposició prenatal de Mg ++ en un desenvolupament intel·lectual adequat neurocognitiu i intel·lectual.

Referències

  1. 1.

    Martin Jr JN, Thigpen BD, Moore RC, Rose CH, Cushman J, maig W. Accident vascular cerebral i preeclampsia i eclampsia severs: un canvi de paradigma centrat en la pressió arterial sistòlica. Obstet Gynecol 2005; 105 : 246–254.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  2. 2

    Crowther CA, Hiller JE, Doyle LW. Sulfat de magnesi per prevenir el part prematur en part prematurment amenaçada. Base de dades de Cochrane Syst Rev 2002 Art. núm .: CD001060.

      • Google Acadèmic
  3. 3.

    Lyell DJ, Pullen K, Campbell L, Ching S, Druzin ML, Chitkara U et al . Sulfat de magnesi en comparació amb la nifedipina per a una tocolisi aguda de part prematur: un assaig controlat aleatòriament. Obstet Gynecol 2007; 110 : 61–67.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  4. 4.

    Mittendorf R, Pryde PG. Una revisió del paper del sulfat de magnesi en el treball abans de temps. BJOG 2005; 112 (suplement 1): 84–88.

      • Google Acadèmic
  5. 5.

    Grimes DA, Nanda K. Tocolisi de sulfat de magnesi: temps de deixar-se. Obstet Gynecol 2006; 108 : 986–989.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  6. 6.

    Ichiba H, Yokoi T, Tamai H, Ueda T, Kim TJ, Yamano T. Resultat neurodesenvolupant de nadons amb asfíxia nascuda tractats amb sulfat de magnesi. Pediatr Int 2006; 48 : 70–75.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  7. 7.

    Perlman JM. Estratègies d'intervenció per a lesions cerebrals hipoxico-isquèmiques neonatals. Clin Ther 2006; 28 : 1353–1365.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  8. 8.

    Doyle LW, Crowther CA, Middleton P, Marret S. El sulfat de magnesi antenatal i el resultat neurològic en nadons prematurs: una revisió sistemàtica. Obstet Gynecol 2009; 113 : 1327–1333.

      • PubMed
      • Google Acadèmic
  9. 9.

    Pryde PG, Mittendorf R. Ús contemporani de sulfat de magnesi obstètric: indicació, contraindicació i rellevància de la dosi. Obstet Gynecol 2009; 114 : 669–673.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  10. 10.

    Mayer ML, Westbrook GL. Permeació i bloqueig dels canals receptors d’àcid N-metil-D-aspartic mitjançant cations divalents en neurones centrals cultivades de ratolins. J Physiol 1987; 394 : 501–527.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Acadèmic
  11. 11.

    Frankenhaeuser B, Meves H. L’efecte del magnesi i el calci sobre la fibra nerviosa mielinitzada de la granota. J Physiol 1958; 142 : 360–365.

      • Google Acadèmic
  12. 12.

    Hille B, Woodhull AM, Shapiro BI. Càrrega superficial negativa a prop de canals de sodi del nervi: ions divalents, ions monovalents i pH. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1975; 270 : 301–318.

      • Google Acadèmic
  13. 13.

    Hahin R, Campbell DT. Simples canvis en la dependència de la tensió del canal de sodi produït per cations divalents. J Gen Physiol 1983; 82 : 785–805.

      • Google Acadèmic
  14. 14.

    Frankenhaeuser B, Hodgkin AL. L’acció del calci sobre les propietats elèctriques dels axons del calamar. J Physiol 1957; 137 : 218–244.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  15. 15.

    Dodge Jr FA, Rahamimoff R. Acció cooperativa d’ions de calci en alliberament del transmissor a la unió neuromuscular. J Physiol 1967; 193 : 419–432.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Acadèmic
  16. 16.

    Fomin VP, Gibbs SG, Vanam R, Morimiya A, Hurd WW. Efecte del sulfat de magnesi sobre la força contràctil i la concentració intracel·lular de calci en el miometri humà embarassada. Am J Obstet Gynecol 2006; 194 : 1384–1390.

      • Google Acadèmic
  17. 17.

    Moykkynen T, Uusi-Oukari M, Heikkila J, Lovinger DM, Luddens H, Korpi ER . Magnesium potentiation of the function of native and recombinant GABA A receptors. Neuroreport 2001; 12 : 2175–2179.

      • Google Acadèmic
  18. 18.

    Maingret F, Honore E, Lazdunski M, Patel AJ . Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K + channel. Biochem Biophys Res Commun 2002; 292 : 339–346.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  19. 19

    Murata Y, Fujiwara Y, Kubo Y . Identification of a site involved in the block by extracellular Mg 2+ and Ba 2+ as well as permeation of K + in the Kir2.1 K + channel. J Physiol 2002; 544 (Pt 3): 665–677.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  20. 20.

    Slutsky I, Abumaria N, Wu LJ, Huang C, Zhang L, Li B et al . Enhancement of learning and memory by elevating brain magnesium. Neuron 2010; 65 : 165–177.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  21. 21.

    Ikonomidou C, Bosch F, Miksa M, Bittigau P, Vockler J, Dikranian K et al . Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Ciència 1999; 283 : 70–74.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  22. 22.

    Jevtovic-Todorovic V, Hartman RE, Izumi Y, Benshoff ND, Dikranian K, Zorumski CF et al . Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits. J Neurosci 2003; 23 : 876–882.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Acadèmic
  23. 23.

    Turner CP, Miller R, Smith C, Brown L, Blackstone K, Dunham SR et al . Widespread neonatal brain damage following calcium channel blockade. Dev Neurosci 2007; 29 : 213–231.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  24. 24.

    Dobbing J, Sands J . Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Hum Dev 1979; 3 : 79–83.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  25. 25.

    Dribben WH, Creeley CE, Wang HH, Smith DJ, Farber NB, Olney JW . High dose magnesium sulfate exposure induces apoptotic cell death in the developing neonatal mouse brain. Neonatology 2009; 96 : 23–32.

      • Google Acadèmic
  26. 26.

    Mittendorf R, Covert R, Elin R, Pryde PG, Khoshnood B, Lee K . Umbilical cord serum ionized magnesium level and total pediatric mortality. Obstet Gynecol 2001; 98 : 75–78.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  27. 27.

    Young C, Tenkova T, Dikranian K, Olney JW . Excitotoxic versus apoptotic mechanisms of neuronal cell death in perinatal hypoxia/ischemia. Curr Mol Med 2004; 4 : 77–85.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  28. 28.

    Moulder KL, Fu T, Melbostad H, Cormier RJ, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Ethanol-induced death of postnatal hippocampal neurons. Neurobiol Dis 2002; 10 : 396–409.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  29. 29.

    Shute AA, Cormier RJ, Moulder KL, Benz A, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Astrocytes exert a pro-apoptotic effect on neurons in postnatal hippocampal cultures. Neuroscience 2005; 131 : 349–358.

      • Google Acadèmic
  30. 30.

    Franklin JL, Johnson Jr EM . Suppression of programmed neuronal death by sustained elevation of cytoplasmic calcium. Trends Neurosci 1992; 15 : 501–508.

      • Google Acadèmic
  31. 31.

    Heck N, Golbs A, Riedemann T, Sun JJ, Lessmann V, Luhmann HJ . Activity-dependent regulation of neuronal apoptosis in neonatal mouse cerebral cortex. Cereb Cortex 2008; 18 : 1335–1349.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  32. 32.

    Hille B . Ion Channels of Excitable Membranes . 3rd edn Sinauer: Sunderland, MA, 2001. xviii, 814 p.pp.

      • Google Acadèmic
  33. 33.

    Meeks JP, Mennerick S . Action potential initiation and propagation in CA3 pyramidal axons. J Neurophysiol 2007; 97 : 3460–3472.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  34. 34.

    Olney JW, Wozniak DF, Jevtovic-Todorovic V, Farber NB, Bittigau P, Ikonomidou C . Drug-induced apoptotic neurodegeneration in the developing brain. Brain Pathol 2002; 12 : 488–498.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  35. 35.

    Xu W, Cormier R, Fu T, Covey DF, Isenberg KE, Zorumski CF et al . Slow death of postnatal hippocampal neurons by GABA A receptor overactivation. J Neurosci 2000; 20 : 3147–3156.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Acadèmic
  36. 36.

    Hagiwara S, Takahashi K . Surface density of calcium ions and calcium spikes in the barnacle muscle fiber membrane. J Gen Physiol 1967; 50 : 583–601.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  37. 37.

    Mennerick S, Que J, Benz A, Zorumski CF . Passive and synaptic properties of hippocampal neurons grown in microcultures and in mass cultures. J Neurophysiol 1995; 73 : 320–332.

      • CAS
      • PubMed
      • Google Acadèmic
  38. 38.

    Zorumski CF, Thio LL, Clark GD, Clifford DB . Blockade of desensitization augments quisqualate excitotoxicity in hippocampal neurons. Neuron 1990; 5 : 61–66.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  39. 39.

    Potter SM, DeMarse TB . A new approach to neural cell culture for long-term studies. J Neurosci Methods 2001; 110 : 17–24.

      • CAS
      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic
  40. 40.

    Wagenaar DA, Pine J, Potter SM . An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neurosci 2006; 7 : 11.

      • PubMed
      • Article
      • Google Acadèmic

Descarregueu referències

Agraïments

We thank A Taylor and A Benz for technical help and laboratory members for advice and discussion. This work was supported by US National Institutes of Health grants 5K08NS048113–04 (WHD), NS44041 (LNE), NS54174 and MH78823 (SM), a grant from the Epilepsy Foundation of America (LNE), and an NIH Neuroscience Blueprint Core Grant P30NS057105 to Washington University.

Glossari

AMPA

α -amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate

GABA

γ -aminobutyric acid

ANOVA

analysis of variance

ASDR

array-wide spike detection rate

V m

membrane potential

MEA

multielectrode array

NMDA

N -methyl- D -aspartate

∣ TTX

tetrodotoxin

Author Contributions: WHD, LNE and SM all participated in the conception and design of the experiments, in collection, analysis and interpretation of data and in writing and revising the paper.