Les cèl·lules canceroses de còlon metastàtiques sw620 es preparen per morir quan es desprenen i poden sensibilitzar-se als anoikis per la bh3-mimetic abt-737 | mort i malaltia cel·lular

Les cèl·lules canceroses de còlon metastàtiques sw620 es preparen per morir quan es desprenen i poden sensibilitzar-se als anoikis per la bh3-mimetic abt-737 | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Teràpia contra el càncer
  • Càncer de còlon
  • Metàstasi

Resum

Anoikis, una apoptosi depenent de Bax desencadenada per despreniment de la matriu extracel·lular, sovint s’inhibeix en les cèl·lules cancerígenes metastàtiques. Usant un parell de línies de cèl·lules isogèniques de càncer de còlon humà derivades ja sigui del tumor primari (SW480) o d’una metàstasi de ganglis limfàtics (SW620), vam trobar que només les cèl·lules SW480 eren sensibles als anoikis. La regulació mínima, però no la degradació de Mcl-1, es va determinar com un factor crític de la iniciació d'aniikis en cèl·lules SW480. La fosforilació mediada per ERK objectius Bim per a la ubiqüitinació i la degradació proteasomal. Un inhibidor de MEK (PD0325901) va ser capaç d’augmentar l’expressió Bim a les cèl·lules SW620 i de sensibilitzar aquestes cèl·lules als anoikis. Així, en ambdues línies cel·lulars, els anoikis estan sota el control de proteïnes de la família Bcl-2. El més interessant es va trobar que la mimètica BH3 ABT-737 no només va augmentar el nivell d'apoptosi en cèl·lules SW480 en suspensió, sinó també per sensibilitzar les cèl·lules SW620 a anoikis. D’acord amb això, es va trobar que les dues línies cel·lulars cultivades en suspensió van estar preparades per morir, determinada per la detecció de complexos Bcl-2: Bim i Bcl-xL: Bim. En canvi, les cèl·lules SW480 i SW620 adherides eren resistents a l’ABT-737. Això indica que, sofrint o no anoikis, les cèl·lules canceroses del còlon que s’han desvinculat de la matriu extracel·lular podrien passar per un estat transitori, on són sensibles als mimetics BH3. Això conferiria a compostos com Navitoclax o ABT-199 una finestra terapèutica on podrien tenir un anti-metastàtic.

Principal

Anoikis és una mort apoptòtica particular a causa de la pèrdua d’adhesió cel·lular adequada, 1, 2, 3 i cèl·lules tumorals que adquireixen un potencial metastàtic han desenvolupat mecanismes per resistir als anoikis. 4, 5 Malgrat la seva definició única, els anoikis són essencialment un procés apoptòtic. D'acord amb l'apoptosi clàssica, anoikis implica la via intrínseca, a causa de la pertorbació de l'homeòstasi mitocondrial o la via extrínseca desencadenada pels receptors de la mort de la superfície cel·lular. 3, 6

Les proteïnes de la família de leucèmia / limfoma 2 (Bcl-2) de cèl·lules B són àrbitres clau del compromís amb l’apoptosi al mitocondrió. 2, 7 Aquesta família està formada per membres pro i anti-apoptòtics, que tots comparteixen homologia de seqüències en els seus dominis d’homologia Bcl-2 (BH). Les proteïnes anti-apoptòtiques, incloent Bcl-2, gen relacionat amb Bcl-2, isoforma llarga (Bcl-xL), Bcl-w i leucèmia mèl·lula 1 (Mcl-1) contenen dominis BH 1-4. Generalment es troben a la membrana mitocondrial exterior, on funcionen per inhibir les proteïnes Bcl-2 pro-apoptòtiques. Les proteïnes pro-apoptòtiques es divideixen en les proteïnes x Bcl-2-acssociated effectors multi-domini (Bax), Bak i Bok (que contenen dominis BH 1-3), o proteïnes només BH3, que només contenen el domini BH3. Les proteïnes pro-apoptòtiques multi-domini Bax i Bak promouen la permeabilització de la membrana externa mitocondrial. 8 Les proteïnes només BH3, com ara agonista de mort de domini interactiu Bcl-2 (Bid), Bim i PUMA actuen com a activadors directes de Bax i Bax pro-apoptòtics o com a repressors de proteïnes anti-apoptòtiques. 9, 10 Han estat nomenats activadors. L’altra classe de proteïnes només BH3 com Bad, denominades sensibilitzadores, desencadena l’apoptosi en unir-se a proteïnes anti-apoptòtiques i desplaçar les proteïnes activades només BH3.

L’ABT-737 és una molècula petita dissenyada racionalment que s’uneix amb alta afinitat a Bcl-2 i Bcl-xL però no a Mcl-1, i antagonitza la seva funció anti-apoptòtica. 11, 12 ABT-737 s'ha demostrat que reverteix la resistència adquirida al paclitaxel en les línies cel·lulars de càncer de mama. 13 Combinat amb la rapamicina, l'ABT-737 millora la sensibilitat radiofònica dels tumors no pulmonars de cèl·lules petites. La combinació d’ABT-737 i un inhibidor de MEK condueix a la regressió del tumor en diferents models de tumor de ratolí de cèl·lules mutants de KRAS. 15 En les línies cel·lulars de leucèmia mieloide humana i models de xenograft, ABT-737 sinergitza amb els inhibidors de la via PI3K / AKT / mTOR. 16 Navitoclax (ABT-263), una variant disponible oralment d’ABT-737, actualment s’està avaluant en assajos clínics de fase 2. Malgrat les dades prèvies prometedores, la trombocitopènia limita la capacitat d’elevar les concentracions de medicaments. Des d’aleshores, s’ha demostrat que l’ABT-199, un inhibidor selectiu de Bcl-2 sense activitat sobre Bcl-xL, va aconseguir l’activitat antitumoral com a agent únic en la leucèmia limfocítica crònica mentre escatella plaquetes. El ABT-737 mimètic BH3 i compostos relacionats actuen com a agents únics per induir l’apoptosi només en cèl·lules canceroses que depenen de Bcl-2 o Bcl-xL per a la supervivència. 18, 19 Aquesta dependència sembla que es correlaciona amb el segrest de les proteïnes activades només per BH3 per part de les proteïnes anti-apoptòtiques i que aquestes cèl·lules han estat definides com a “preparades per a la mort”. Els mimetics BH3, desplaçant les proteïnes activades només per BH3 de Bcl-2 o Bcl-xL, permeten la seva interacció i l’activació de Bax o Bak. En cèl·lules en què Bcl-2 i Bcl-xL no estan inicials, sovint s'ha demostrat que l'exposició a agents quimioterapèutics indueix l'expressió de proteïnes activadores només BH3 que condueixen a una sinergia entre aquests agents i els mimetics BH3.

S’ha informat que, quan es cultiva en suspensió, algunes cèl·lules sensibles als anoikis indueixen l’expressió de les proteïnes BH3 només el limfoma de cèl·lules B de la mort cel·lular (Bim) 20 o Bmf. 21 Per tant, hem raonat que es podria traçar un paral·lelisme amb els efectes de la quimioteràpia i es va investigar si, quan es desprenen, es modifica la sensibilitat cel·lular a les mítiques BH3. Per a això, es van utilitzar un parell de línies cel·lulars de carcinoma de còlon isogènic: SW480 derivat d’un carcinoma de còlon B de Duke primari i SW620 derivat d’una metàstasi ganglionària mesentèrica del mateix pacient. 22 cèl·lules SW480 són sensibles als anoikis, mentre que les cèl·lules SW620 són resistents. Es va trobar que Bim estava regulat en suspensió en cèl·lules SW480 i que mediava, almenys en part, la seva sensibilitat als anoikis. El més interessant, ambdues línies cel·lulars van morir en presència de ABT-737 quan es cultivaven en suspensió, mentre que eren resistents a aquest compost en condicions adherides. Per tant, les cèl·lules canceroses de còlon separades es preparen per morir, siguin o no sensibles a les anoikis, i compostos com ABT-263 o ABT-199 poden tenir, per tant, propietats anti-metàstiques.

Resultats

Les cèl·lules SW480 són sensibles a les anoikis a diferència de les cèl·lules SW620

Es va comparar el nivell del curs en un any en les cèl·lules SW480 i SW620 després del cultiu en suspensió. Com es mostra a la figura 1a, el percentatge de cèl·lules apoptòtiques SW480 va augmentar amb el temps. En canvi, l’apoptosi a les cèl·lules SW620 gairebé no es podia detectar. Per comprovar si la mort de cèl·lules SW480 es va deure a l’apoptosi clàssica, es van cultivar cèl·lules en presència o absència de l’inhibidor de la pan-caspasa Q-VD-OPH. Els resultats mostrats a la figura 1b indiquen que aquest inhibidor va protegir completament les cèl·lules SW480 contra la mort de cèl·lules induïda per despreniment. També es va controlar l’activació de la caspasa-3 en cèl·lules SW480 en suspensió mitjançant la detecció dels fragments p20 (intermedis) i p17 (madurs) de la caspasa activa mitjançant l’anàlisi de Western blot. El fragment p20 i algun fragment de p17 es van detectar a les 24 h (figura 1c) i a les 48 h la caspasa-3 estava totalment madura. La presència d'activació Q-VD-OPH totalment abrogada de la caspasa-3 (figura 1c).

Image

Sensibilitat a les anoikis a cèl·lules SW480 i SW620. ( a ) Període de mort de cèl·lules apoptòtiques en poblacions de cèl·lules en suspensió SW480 i SW620. ( b ) Període d'apoptosi en cèl·lules en suspensió SW480 cultivades sense (ctrl) o amb l'inhibidor de la pan-caspasa Q-VD-OPH (10 μ M). ( c ) Cinètica de l’activació de la caspasa-3 en cèl·lules adherides (A) o en suspensió SW480 cultivades sense (ctrl) o amb Q-VD-OPH (10 μ M) detectades mitjançant Western blot amb una anti-fendida-caspasa-3 anticorp (fragments p20 i p17). L’asterisc denota una banda inespecífica. Per a tots els gràfics de totes les figures, les barres d’error indiquen SD d’almenys tres experiments independents

Imatge a mida completa

Els anoikis s’han atribuït a la via intrínseca 23 o a la via apoptòtica extrínseca 24, 25 . Per tant, es va estudiar en cinètica la divisió i, per tant, l’activació de la caspasa-8 i la caspasa-9. Com es pot veure a la figura 2a, es va detectar una feble banda de clivatge per a les dues caspases amb prou feines 5 h de cultiu en suspensió. Per provar més quina caspasa iniciadora es trobava a l’àpex de la senyalització apoptòtica, hem utilitzat dos clons de cèl·lules SW480 transfectades de manera estable amb una expressió plasmídica que codifica Bcl-2. Els dos clons eren resistents als anoikis (figura 2b) i, el que és més important, l’activació de totes les caspases es va abrogar en aquests clons (figura 2c), indicant que l’activació de la caspasa-8 mostrada a la figura 2a es produeix aigües avall dels esdeveniments mitocondrials. Per documentar més que la via extrínseca no estava implicada, les cèl·lules SW480 van ser transfectades de manera estable amb un plasmidi d'expressió que codificava una forma dominant-negativa del domini mort associat a Fas (FADD) (FADD-dn) i es van obtenir tres clons (figura 2d). Tots els clons mostraven resistència a l’apoptosi induïda per TRAIL, tal i com s’il·lustra a la figura 2e per al clon 4. Tot i això, tots els clons eren sensibles als anoikis, tal com es mostra a la figura 2f del clon 4, que descartava la via extrínseca.

Image

Els anoikis en cèl·lules SW480 s’inicien a les mitocondries. ( a ) Cinètica de l'activació de la caspasa iniciadora en línies cel·lulars SW480 i SW620 cultivades en suspensió. Es detecta caspase-8 de longitud completa (55/54 kD) o clivellada (43/41 kD) i caspase-9 de longitud completa (47 kD) o feta (35 kD) ( b ) Percentatge d'aniikis en clons vectoris buits o amb clones SW480 transfectats amb Bcl-2. ( c ) Falta de detecció de l'activació de la caspasa en clons transfectats amb Bcl-2 durant el cultiu en suspensió. La banda inespecífica està representada per *. ( d ) Els extractes de cèl·lules de clons SW480 transfectats amb FADD.dn (clons 1, 4 i 12) o amb un vector buit (pcDNA3) es van borrar tal com es descriu a Materials i Mètodes amb un anticòs anti-FADD ( e, f ) cèl·lules SW480 transfectades. amb vector buit (SW480 pcDNA3) o que expressa FADD.dn (clon 4) es van cultivar en presència de TRAIL recombinant (25 ng / ml) ( e ) o es van cultivar en suspensió ( f ), i es va quantificar l’apoptosi en diversos moments

Imatge a mida completa

La resistència de les cèl·lules SW620 als anoikis no es deu a la transició epitelial-mezenquimal

La transició epitelial-mesenquimal (EMT) no només és un esdeveniment clau per a que les cèl·lules epitelials adquireixin un fenotip motil, sinó que també permet que les cèl·lules canceroses tinguin evitar anoïcis. 27 Durant el procés EMT, es perd l'expressió de E-cadherina, mentre que l'expressió N-cadherina es regula, procés anomenat "commutador de cadherina". 28 Tant la pèrdua d’E-cadherina 29 com l’adquisició d’expressió de N-cadherina 30 semblen importants per a la generació de senyals de supervivència. Les cèl·lules SW480 mostren una morfologia epitelial, mentre que les cèl·lules SW620 tenen una morfologia arrodonida o similar a un fibroblast que recorda a les cèl·lules que han estat EMT. Per tant, es va estudiar l'expressió de diversos marcadors epitelials i mesenquimàtics en ambdues línies cel·lulars. Com es mostra a la figura 3, l’expressió de E-cadherina es va reduir lleugerament a les cèl·lules SW620 en comparació amb les cèl·lules SW480, però la citoceratina 18, un altre marcador epitelial es va incrementar molt en les cèl·lules SW620. Quant als marcadors mesenquimàtics, la vimentina estava present en les dues línies cel·lulars, però no es va expressar ni N-cadherina ni fibronectina, mentre que ambdues es van trobar en els mieloblasts murins. Així, les cèl·lules SW620 no semblen tenir una naturalitat mesenquimàtica.

Image

Expressió de diversos marcadors epitelials o mesenquimals en cèl·lules SW480 i SW620. Els extractes de cèl·lules es van escorcollar amb diversos anticossos que reconeixen els marcadors epitelials (E-cadherina, citoceratina 18) o mesenquimals (vimentina, N-cadherina, fibronectina). Els mieloblasts murins es van utilitzar com a control positiu per a cèl·lules mesenquimals

Imatge a mida completa

La proteïna BH3 només té un paper en la mort de cèl·lules SW480 a causa dels anoikis

Atès que l’apoptosi mitocondrial està governada per membres de la família Bcl-2, es va estudiar la cinètica d’expressió de diverses d’aquestes proteïnes tant en línies cel·lulars SW480 com SW620 després del seu cultiu en suspensió. Com es mostra a la figura 4a, els anti-apoptòtics Bcl-2 i Bcl-xL es van expressar a nivells comparables en ambdues línies cel·lulars i la seva expressió no va variar durant el cultiu en suspensió. L’expressió Mcl-1 no va canviar durant el cultiu en cèl·lules SW480 en contrast amb un informe recent que va trobar una reducció substancial de l’expressió Mcl-1 a ​​les cèl·lules NIH3T3 durant els anoikis. En general, en el nostre estudi, les cèl·lules SW620 resistents als anoikis expressaven menys Mcl-1 que les cèl·lules SW480 i, per raons desconegudes, el seu nivell d’expressió sembla que de vegades fluctua durant el cultiu. Aquest resultat pot ser degut a la vida mitjana molt curta de Mcl-1 (40 min). Entre les proteïnes pro-apoptòtiques, els nivells d’expressió de Bax i Bid van ser estables a les cèl·lules suspeses. En canvi, l’expressió de la proteïna BH3 només augmentada molt durant el cultiu en suspensió de cèl·lules SW480 i en cinc hores després del despreniment cel·lular. Cal destacar el fet que es va detectar majoritàriament la variant 34 de Bim-EL a aquestes cèl·lules i es coneix com a Bim durant tot l’estudi. L’expressió bim es va incrementar en SW620 però en un grau menor.

Image

Estudi de l’expressió de la família de proteïnes Bcl-2 en cèl·lules SW480 i SW620 cultivades en suspensió. ( a ) Anàlisi del curs en temps de l'expressió de diversos membres de la família de proteïnes Bcl-2 analitzada mitjançant Western blot en cèl·lules adherides (A) o en suspensió SW480 i SW620. ( b ) eficiència eliminatòria de Bim en cèl·lules adherides (A) o en suspensió tractades SW480 (siRNA Bim) o no (ctrl) amb un siRNA de Bim específic controlat mitjançant Western blot mitjançant un anticòs anti-Bim específic. ( c ) Percentatge d'apoptosi en poblacions de cèl·lules SW480 cultivades en suspensió, ja sigui no transformada (ctrl) o després de la transfecció amb un siRNA específic de Bim (siRNA Bim) o siRNA a un objectiu irrellevant (siRNA irr). ( d ) Anàlisi de l'expressió Bim en lisats de cèl·lules senceres i en les fraccions enriquides en citosòtiques (cito) o en membrana / organellar (mito) en cèl·lules adherides (A) o després de 24 h de suspensió (S). ( e ) Anàlisi del curs en temps de l'expressió de Bim en SW480 que sobreexpressa Bcl-2 (SW480 Bcl-2 4, SW480 Bcl-2 14) o bé adherent (A) o cultivat en suspensió. ( f ) Expressió bim en línies de cèl·lules HT-29 i HT-116 colorectals malignes cultivades en suspensió

Imatge a mida completa

Abrogem l’expressió Bim en cèl·lules SW480 amb un ARN d’interferència petita específica. Com es mostra a la figura 4b, l'expressió Bim va ser completament inhibida per aquest tractament a tota la cultura en suspensió. Es va trobar falta de Bim que protegia molt però no protegia totalment les cèl·lules SW480 dels anoikis (figura 4c). Per tant, podem concloure que Bim està implicat en la sensibilitat de les cèl·lules SW480 als anoikis. El Bmf ha estat implicat en la mort a causa dels anoikis de diversos tipus cel·lulars. 21, 35, 36 Tanmateix, no hem pogut detectar Bmf mitjançant l’anàlisi de taquilla occidental en cap de les dues línies cel·lulars (no mostrades).

A les cèl·lules sanes, Bim-EL es pot segrestar al complex motor de diineïna associat al microtúbul mitjançant la seva unió a LC8. 37 Determinats estímuls apoptòtics interrompen la interacció entre LC8 i el complex motor de la díene, alliberant Bim i permetent així la seva translocació al mitocondri. Per tant, hem intentat determinar si, a més del nivell de Bim en cèl·lules suspeses, també hi podria haver diferències en la seva localització en cèl·lules SW480 en comparació amb cèl·lules SW620. Els microtúbuls es despolimeritzen en uns minuts a temperatura ambient i a 4 ° C i, per tant, no es poden aïllar per centrifugació. Es va utilitzar un altre enfocament amb la utilització del "kit de fraccionament cel·lular" tal com es descriu a Material i Mètodes. Els extractes de cèl·lules que obteníem eren nets, ja que la tubulina monomèrica es trobava exclusivament en la fracció enriquida en proteïnes citosòliques, mentre que AIF, una proteïna mitocondrial, es va detectar exclusivament en la membrana i en la fracció enriquida en proteïna organel·lar (figura 4d). Curiosament, es va trobar Bim en les cèl·lules SW480 adherides principalment a la fracció enriquida en proteïna de la membrana i organellar, i es va detectar Bim regulada en cèl·lules en suspensió en aquesta mateixa fracció. Per tant, l'augment de la quantitat de Bim que trobem a les cèl·lules SW480 separades es localitza en gran part al mitocondri. En canvi, es va trobar que Bim es distribuïa aproximadament per igual en les fraccions citosòliques i enriquides en proteïnes de membrana en cèl·lules adherides i en suspensió SW620. Aquests resultats suggereixen que podria haver-hi una transferència menys eficient de Bim al mitocondri a les cèl·lules SW620.

A continuació, vam provar els dos clons de Bcl-2 que expressen SW480 que vam trobar resistents als anoikis. Tots dos clons van regular Bim quan es cultivaven en suspensió (figura 4e) en el mateix ordre de magnitud en comparació amb les cèl·lules parentals (figura 3a). Per tant, la sensibilitat de les cèl·lules SW480 als anoikis no està només dictada pel nivell d’expressió de Bim, sinó per la relació de Bim a Bcl-2.

Finalment, es van utilitzar dues altres línies de cèl·lules colorectals malignes per comprovar si la regulació general de Bim en cèl·lules suspeses era una característica general. Tal com es mostra a la figura 4f, l’expressió Bim es va incrementar tant en les cèl·lules HT-29 com HCT-116 durant el cultiu en suspensió, i això va anar acompanyat d’una mort cel·lular significativa a causa dels anoikis.

La inhibició d’ERK en cèl·lules SW620 restableix l’expressió de Bim en cèl·lules separades i la seva sensibilitat a les anoikis

L’expressió de Bim està controlada tant per mecanismes transcripcionals com posttranscripcionals. 38 El factor de transcripció similar al cap de forquilla FOXO3a (caixa de forquilla O3a) és un regulador transcripcional clau de Bim i la seva activitat se suprimeix a través de la fosforilació per Akt. Com es mostra a la figura 5a, el bloqueig de la via PI3K / Akt no sensibilitzava les cèl·lules SW620 a les anoikis. D'altra banda, l'anàlisi de blot occidental mitjançant un anticòs anti-fosfo-Akt, va revelar molt poca quantitat d'actius activats en cèl·lules SW620 (no mostrades).

Image

Regulació de l’expressió de proteïna Bim. ( a ) Percentatge d'apoptosi en cèl·lules SW480 i SW620 en suspensió cultivades en presència (Ly294002) o absència (ctrl) de l'inhibidor de PI3K Ly294002 (10 μ M). ( b ) Percentatge d'apoptosi en cèl·lules SW480 i SW620 en suspensió cultivades en presència (PD0325901) o absència (ctrl) de l'inhibidor de MEK PD0325901 (10 μ M). ( c ) Anàlisi Western blot de l'expressió de p-ERK, Bim i ERK total en cèl·lules adherides (A) o en suspensió SW480 (panell superior) i SW620 (panell inferior) cultivades en presència (PD0325901) o absència (ctrl) de PD0325901 (10 μ M). Es va utilitzar anti-Hsc-70 com a control de càrrega. ( d ) Anàlisi del blot occidental de l'expressió Bim en cèl·lules SW620 tractades amb PD0325901 incubades amb o sense BNA siRNA. ( e ) Període de nivell d'anikis en cèl·lules SW620 tractades amb PD0325901 incubades o no amb siRNA Bim

Imatge a mida completa

D'altra banda, la fosforilació mediada per l'ER objectiu Bim per a la ubiqüitat i la degradació proteasomal. Un inhibidor de MEK (PD0325901) va ser molt eficient per sensibilitzar les cèl·lules SW620 a les anoikis, alhora que va augmentar el nivell de mort cel·lular en cèl·lules SW480 cultivades en suspensió (figura 5b). A les cèl·lules SW620 (figura 5c), l’activitat basal d’ERK, tal com es va avaluar mitjançant l’anàlisi Western blot d’ERK fosforilada (p-ERK), va ser baixa i augmentada al final del cultiu, una troballa que vam observar repetidament. L’inhibidor de MEK va ser molt eficient en abrogar l’activitat d’ERK i es va acompanyar d’una regulació superior de l’expressió Bim a partir de les 24 hores que es correlaciona amb els anoikis observats en aquests moments.

Vam silenciar l’expressió de Bim per interferència d’ARN en cèl·lules en suspensió SW620 cultivades en presència de PD0325901 (figura 5d). Com es mostra a la figura 5e, l’extinció de l’expressió Bim va disminuir el percentatge d’apoptosi al voltant de la meitat a 72 h del tractament amb PD0325901 que indica que Bim està implicat en la sensibilització per anoikis per aquest compost. Aquestes dades també indiquen que els mecanismes addicionals són responsables de la mort cel·lular restant. Sorprenentment, l’activitat ERK va ser alta i mantinguda en les cèl·lules SW480 de control a tota la cultura en suspensió (figura 5c), però no va impedir la regulació de l’expressió Bim en les cèl·lules SW480 control a partir de les 5 h. La inhibició del MEK va induir un augment més intens de l’expressió Bim (figura 5c). En aquestes condicions, la mobilitat electroforètica de Bim es va incrementar a causa del fet que Bim es desfosforila. Bim no es va detectar en moments tardans, una observació que creiem que va relacionada amb la mortalitat molt elevada, que afecta la qualitat dels extractes cel·lulars. Així mateix, Erk i Hsc-70, el control de càrrega, es van veure disminuïts en aquests moments tardius.

L’ABT-737 sensibilitza les cèl·lules SW480 i SW620 a les anoikis

La regulació de Bim en cèl·lules SW480 cultivades en suspensió ens va portar a provar si, com s’ha demostrat per a nombrosos fàrmacs quimioterapèutics utilitzats juntament amb Navitoclax, 39 es podria trobar una sinergia entre l’estat en suspensió i l’ABT-737. Com es mostra a la figura 6a, les cèl·lules SW480 adherides eren totalment resistents a ABT-737 (1 μ M). No obstant això, a les cèl·lules en suspensió, es va trobar que la presència de ABT-737 augmentava considerablement el nivell d'uniikis. El mateix tipus d’experiments es van realitzar en cèl·lules SW620 (figura 6b). De nou, les cèl·lules adherides eren resistents a l’ABT-737. Sorprenentment, les cèl·lules SW620 cultivades en suspensió, malgrat la seva resistència als anoikis, van morir en nombres significatius en presència de ABT-737. Per tant, vam comprovar si la presència d’ABT-737 podria haver modificat l’expressió d’alguns membres de la família de Bcl-2 en aquestes cèl·lules. Tal com es mostra a la figura 6c, no va ser així. Aquestes observacions són particularment importants pel que fa a Noxa, ja que s'ha informat que aquest inhibidor de Mcl-1 ha estat induït per tractament ABT-737 en una línia cel·lular de glioma. 40

Image

Anàlisi de la sensibilitat de cèl·lules SW480 i SW620 a la mimètica BH3 ABT-737. ( a, b ) Percentatge d'apoptosi en cèl·lules adherides o en suspensió SW480 ( a ) o SW620 ( b ) cultivades en presència (ABT-737) o absència (ctrl) de ABT-737 (1 μ M). ( c ) Anàlisi de l'expressió del membre de la família Bcl-2 en cèl·lules SW620 durant el cultiu en suspensió en presència o absència d'ABT-737. ( d ) Les cèl·lules SW480 (panells superiors) i SW620 (panells inferiors) eren adherides (Adh) o suspeses durant 24 hores en presència (Susp + ABT) o absència (Susp) de ABT-737 (1 μ M). Buffer de CAPS. Els lisats esborrats es van analitzar directament (lisat cel·lular) o després de la immunoprecipitació amb anticossos anti-Bim (IP Bim) i immunoblotats (WB) per a Bcl-2 i Bim, tal com es descriu a Materials i Mètodes. ( e ) Les cèl·lules es van tractar com a d i es van analitzar per a la coimmunoprecipitació de Bcl-xL. ( f ) Les cèl·lules adherides SW480 cultivades en presència o absència de ABT-737 durant 24 h es van lisar com a d i es van analitzar per a la coimmunoprecipitació de Mcl-1.

Imatge a mida completa

Se suposa que les cèl·lules sensibles a ABT-737 estan preparades per morir amb Bcl-2 i / o Bcl-xL complexat amb proteïnes només activadores BH3. Per tant, es van realitzar 41 immunoblots de Bim i Bcl-2 o Bcl-xL en lisats de cèl·lules senceres i en immunoprecipitats anti-Bim a les línies cel·lulars SW480 i SW620. Com es mostra a la figura 6d, es van detectar complexos de Bcl-2: Bim a les dues línies cel·lulars cultivades en suspensió. La formació d’aquests complexos va ser abrogada en presència d’ABT-737, cosa que indica que aquest compost va desplaçar Bim de Bcl-2 (figura 6d). El més important, els complexos Bcl-xL: Bim també es van detectar a les cèl·lules SW480 i SW620 suspeses i desplaçades per ABT-737 (Figura 6e). Bcl-2: Els complexos de Bim també es van trobar en cèl·lules SW480 adherides (Figura 6d) malgrat la seva falta de sensibilitat a ABT-737 en aquestes condicions de cultiu. És possible que, en absència de la regulació superior de Bim, la quantitat d’aquests complexos sigui massa baixa per compensar la funció anti-apoptòtica de Mcl-1 42, molt expressada en cèl·lules SW480 (figura 3a). Es van realitzar immunoprecipitacions de Bim en cèl·lules adherides SW480 tractades o no amb ABT-737, que van revelar la presència de complexos Bim: Mcl-1 en ambdues condicions (Figura 6f). Per tant, creiem que, ja que el nivell de Bim és baix en cèl·lules SW480 adherides, Mcl-1 és capaç de capturar la petita quantitat de proteïnes desplaçada de Bcl-2 / Bcl-xL per ABT-737.

Discussió

Els anoikis són, per essència, un procés anti-metastàtic i la resistència a aquesta forma de mort cel·lular es correlaciona amb l’agressivitat del càncer. 4

En aquest estudi, hem utilitzat les línies de cèl·lules SW480 i SW620 que han estat validades com a model de progressió del càncer de còlon des del tumor primari (SW480) fins a les cèl·lules metastàtiques (SW620) 31, i demostren que durant aquesta progressió les cèl·lules tumorals han adquirit un anoikis. -Fenotip resistent. L'EMT s'ha demostrat com un fenomen important per a l'adquisició de resistència als anoikis 43 ; tanmateix, no hem trobat cap evidència que aquest procés s’hagués produït en cèl·lules SW620 malgrat la seva morfologia suggerent com a fibroblast. És possible que aquestes cèl·lules metastàtiques hagin patit EMT transitòria seguida de transició mesenquimal-epitelial un cop colonitzades el lloc secundari, tal com s’ha suggerit en el càncer de còlon invasor. 44

Entre les proteïnes pro-apoptòtiques provades, Bim va ser l'única que es va altificar en les cèl·lules SW480 en suspensió. És important destacar que el silenciament de l’expressió Bim va confirmar que aquesta proteïna només BH3 va estar implicada en la mort de cèl·lules SW480 per anoikis. Tanmateix, el nivell d'apoptosi va passar del 38% a les cèl·lules control al 15% en les cèl·lules tractades amb l'ARN interferint breu (SiRNA) de Bim que indica que es podria implicar una altra via en la mort cel·lular restant. Vam determinar que la implicació de Bmf era poc probable.

El més interessant, quan es va avaluar l'efecte de ABT-737 sobre cèl·lules en suspensió, es va trobar que aquest compost millora els anoikis no només en les cèl·lules SW480, que regulen Bim en suspensió, sinó també en les cèl·lules SW620, que només fan una mica. S'han realitzat diversos estudis per determinar el mode d'acció ABT-737. Un d’aquests estudis, sobre leucèmia mieloide aguda, indica que ABT-737 actua induint una dissociació de complexos de Bcl-2: Bax i indueix l’apoptosi de manera dependent de Bak però independent de Bim. No obstant això, no hem pogut detectar aquests complexos ni en línia cel·lular ni en adhesió o en suspensió (no es mostra). D'altra banda, en les dues línies cel·lulars cultivades en suspensió, els complexos Bcl-2: Bim i Bcl-xL: Bim van ser immunoprecipitats i aquests complexos van ser alterats per ABT-737. Les nostres dades s’adeqüen, doncs, més als resultats obtinguts en la leucèmia limfocítica crònica, on l’alliberament de Bim de Bcl-2 per ABT-737 condueix a l’activació de Bax. Així, l’ocupació de Bim-Bcl-2 i Bcl-xL en cèl·lules suspeses va provocar morts SW480 i SW620 i ABT-737 va alliberar Bim. Bcl-2: Bim o Bcl-xL: els complexos de Bim amb prou feines es van detectar a les cèl·lules SW620 adherides, probablement explicant per què eren resistents a ABT-737. En canvi, les cèl·lules adherides SW480 mostraven complexos Bcl-2: Bim, mentre que aquestes cèl·lules no eren sensibles a ABT-737. S'ha demostrat que Mcl-1 és un determinant clau de la resistència a les cèl·lules ABT-737 45, 46 i SW480 que expressen nivells alts de Mcl-1. Per tant, fins i tot si els complexos Bcl-2: Bim van ser alterats per ABT-737 en aquestes cèl·lules adherides, el Bim desplaçat podria estar lligat per Mcl-1, mantenint la supervivència. En efecte, podríem detectar complexos Mim-1: Bim en cèl·lules adherides SW480 tractades o no amb ABT-737. L'ajustament de Bim a les cèl·lules en SW480 en suspensió hauria de permetre formar més complexos Bcl-2: Bim. En aquest cas, la quantitat de Bim alliberada per ABT-737 subvertiria la capacitat d’amortització de Mcl-1, fent que les cèl·lules siguin sensibles a la mimètica BH3.

El nivell d’estat estacionari mínim està regulat mitjançant la seva fosforilació ERK1 / 2, que l’apunta a la degradació del proteasoma. Es va trobar que la inhibició de MEK regulava l'expressió de Bim a les dues línies cel·lulars i sensibilitzava les cèl·lules SW620 als anoikis. Així, les cèl·lules SW620 en suspensió són sensibles a l’apoptosi induïda per Bim sempre que aquesta proteïna només BH3 estigui present en quantitats suficients. Tot i així, sembla poc probable que la via ERK sigui l’única responsable de la manca de regulació de Bim en cèl·lules SW620 suspeses, ja que no vam observar una estreta correlació negativa entre el nivell p-ERK i l’expressió Bim. De fet, l'activitat d'ERK és baixa en aquestes cèl·lules i augmentada només en punts posteriors. Tenint en compte els nostres resultats que la ruta PI3K – Akt també no està implicada, és probable que hi hagi una altra via que encara queda identificada també en joc en la regulació de l’expressió Bim.

El nivell Mcl-1, alt i estable durant el cultiu en suspensió de cèl·lules SW480 era inferior i de vegades fluctuant en cèl·lules SW620. És interessant assenyalar que la degradació de Mcl-1 s'ha demostrat necessària per a la inducció d'uniikis en alguns models. Això no és clar en les cel·les SW480. La curta vida mitjana de Mcl-1 ha estat atribuïda a la seva fosforilació per GSK-3 seguida de la seva ubiqüitinació i degradació del proteasoma. El GSK-3 està inhibit per la via PI3K – Akt. Hem trobat molt poca activitat Akt a les cèl·lules SW620 i, per tant, GSK-3 pot ser responsable de la quantitat reduïda de Mcl-1 expressada per les cèl·lules SW620. En qualsevol cas, s'espera que un nivell baix de Mcl-1 sensibilitzi les cèl·lules SW620 a les anoikis, cosa que no és la que hem observat.

En conclusió, tinguin o no anoikis, les cèl·lules de càncer de còlon en suspensió són sensibles a la mimètica BH3 ABT-737. Això indica que les cèl·lules cancerígenes que s’han desvinculat de la matriu extracel·lular podrien passar per una finestra transitòria on poden ser assassinades per compostos com Navitoclax o ABT-199, cosa que donaria propietats anti-metàstiques a aquests agents.

Materials i mètodes

Línies i reactius cel·lulars

Les línies cel·lulars de carcinoma de còlon humà SW480 i SW620 es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC). Es mantenien rutinàriament en el medi mínim essencial de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Saint Aubin, França) suplementat amb un sèrum boví fetal inactivat per calor del 10%, 1% piruvat de sodi, 0, 1 mg / ml estreptomicina, 100 U / ml penicil·lina a 37 ° C en una atmosfera humidificada al 5% de CO 2 . Als cultius en suspensió, es van afegir 2 unitats / ml de despatx (Roche, Meylan, França) al medi de cultiu per obtenir suspensions d’un sol cel. La Dispase és una proteasa neutra bacteriana amb una activitat proteolítica lleu, que s'utilitza principalment per a l'aïllament i el pas rutinari de les cèl·lules primàries. També pot separar les cèl·lules adherides del vas de cultiu 49 digerint la matriu extracel·lular 50 i dissociant els agregats cel·lulars. 51 La dispasa no està inactiva pel sèrum i, donada la seva falta de toxicitat, és un mitjà molt eficient per mantenir les cèl·lules adherides en suspensió unicel·lular.

Es va provar la sensibilitat TRAIL de clons SW480 mitjançant el cultiu de les cèl·lules en presència de l'anticòs recombinant TRAIL recombinant (25 ng / ml) (Alexis Biochemicals, Villeurbanne, França) i anticossos anti-Flag (M2) (Sigma Aldrich, Lió, França) per diverses èpoques.

Les solucions existents de Q-VD-OPH (Biovision, Nanterre, França), Ly294002 (Calbiochem, Darmstadt, Alemanya) i PD0325901 (Sigma Aldrich) es van preparar en DMSO a 10 mM i es van utilitzar a 10 μ M de concentració final. L’ABT-737 (Selleckchem, Souffelweyersheim, França) també es va preparar a DMSO a 10 mM i es va utilitzar a concentració final d’1 μ M.

The following antibodies were used: anti-Bax (N-20, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Heildelberg, Germany), anti-Bid (R&D Systems, Lille, France), anti- cleaved caspase-3 (Cell Signaling, Saint Quentin en Yvelines, France), anti-Hsc70 (B-6, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Mcl-1 (S-19, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-2 (H-100, Santa Cruz Biotechnology, Inc), anti-Bcl-xL (BD Transduction Laboratories, Le Pont de Claix, France), anti-Bim (Cell Signaling), anti-pErk (Cell Signaling), anti-Erk total (Cell Signaling), anti-actin (MBL, Nanterre, France) and anti-FADD (BD Transduction Laboratories).

Anàlisi de citometria de flux de cèl·lules apoptòtiques

Suspended cells maintained in culture from 24–72 h were washed in PBS (phosphate-buffered saline), fixed in 70% cold ethanol and stored at −20 °C for at least 12 h. After two washes in PBS, cells were resuspended and stained in 0.5 ml of PBS containing 50 μ g/ml propidium iodide. The fluorescence intensity of propidium iodide was assessed with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Le Pont de Claix, France) and analyzed using the CellQuest (Becton Dickinson) software. The percentage of cells with apoptotic nuclei, distinguished by their hypodiploid DNA content (sub-G0/G1 peak), 52 was assessed for each histogram.

Western blotting and immunoprecipitation

Cells were lysed with ice-cold NP40 lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% NP40) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM sodium orthovanadate (Na 3 VO 4) and 1/100 protease cocktail inhibitors (Sigma, Lyon, France). All lysates were clarified by centrifugation at 15 000 × g for 15 min at 4 °C. Protein concentrations were assessed using the Bradford assay (BioRad, Hercules, CA, USA). Proteins amounting to 50 μ g were prepared in loading Laemmli's buffer (60 mM Tris-HCL pH 6.8, 0.18 M β -mercaptoethanol, 2% SDS, 10% glycerol and 0.005% bromophénol blue), boiled for 5 min, subjected to sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis and transferred on ice for 1.5 h to polyvinylidenedifluoride membrane (Amersham Hybond-LFP, GE healthcare, Velizy-Villacoublay, France). After blocking for at least 1 h in Tris-buffered saline supplemented with 5% BSA and 0.5% Tween-20 (TBS-T), membranes were probed with the appropriate primary antibodies in TBS-T overnight. Proteins were visualized by using Lycor secondary antibodies and Odyssey detection material.

For immunoprecipitation experiments, cells were lysed with CHAPS lysis buffer (30 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% Glycerol, 10 mM NaPP and 1% CHAPS) containing 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mMsodium orthovanadate (Na 3 VO 4 ) and 1/100 protease cocktail inhibitors). Nuclear pellets and debris were removed by centrifugation, at 15 000 × g for 15 mn at 4 °C. Six milligrams of proteins from cell lysates were incubated for 1 h at 4 °C with the anti-Bim antibodies. Protein-G beads were added to the immune complexes for 45 min and washed five times with ice-cold CHAPS lysis buffer. Purified immunoprecipitates, immobilized on protein-G beads, were mixed with an equal volume of Laemmli's buffer 2x, boiled for 5 min and further analyzed by means of western blot for both Bim and Bcl-2 content.

Small-interfering RNA-mediated silencing of Bim

In 3 ml of culture medium, 3 × 10 5 cells were transfected with Bim siRNA or irrelevant siRNA (Ambion Life Technologies, Saint Aubin, France). Each siRNA was used at 20 nM final concentration. INTERFERin (20 μ l, Polyplus transfection, Ozyme, Saint Quentin en Yvelines, France) was incubated with siRNA duplex in 800 μ l of DMEM without serum for 20 min at room temperature. The mixture was then added to the cells, which were transferred to culture plates and incubated at 37 °C. Seventy-two hours after transfection, cells were detached with culture medium containing 2 units/ml of dispase, cultured in this medium for 24, 48 or 72 h and the percentage of apoptotic cells was quantified as described above. Extinction of Bim expression by the Bim siRNA was monitored by means of western blot throughout the culture in suspension.

Stable transfection of FADD.dn in SW480 cells

The pcDNA3/ FADD.dn vector encodes for a truncated form of FADD protein deleted of its two DED domains and thus unable to recruit caspase-8. SW480 cells were transfected 5 μ g of either pcDNA3/FADD.dn or pcDNA3 empty vector with the use of JetPei (Polyplus transfection). Transfected cells were selected with neomycin (400 μ g/ml) and then cloned.

Fraccionament cel·lular

We used the 'cell fractionation kit' (catalog no. 9038) from Cell Signaling Technology according to manufacturer's instructions. This methodology is detergent-based 53 and is performed on ice. Cell pellet is resuspended in a first, digitonin-based, buffer for 5 mn followed by a centrifugation at 500 × g . The supernatant is the cytosolic protein-enriched fraction. The pellet is resuspended in a second, triton-based buffer for 5 mn and centrifuged at 8000 × g . The supernatant is the membrane and organellar protein-enriched fraction, which contains, among others, mitochondria-associated proteins. The remaining pellet, which we did not use, contains the actin cytoskeleton and the nuclear proteins. Given that microtubules depolymerize within minutes on ice, tubulin and all associated proteins, including dynein motor complex-bound Bim for our purpose, end up in the cytosolic fraction.

Glossari

Bcl-2

B-cell leukemia/lymphoma 2

Bax

Bcl-2-acssociated x protein

Bcl-xL

Bcl-2-related gene, long isoform

Mcl-1

myeloid cell leukemia 1

Oferta

Agonista de mort de domini interactiu Bcl-2

Bim

B-cell lymphoma 2 interacting mediator of cell death

siRNA

ARN interferint curt

EMT

epithelial–mesenchymal transition

FADD

Fas-associated death domain