Microarrays com a sensors de toxina | la revista farmacogenòmica

Microarrays com a sensors de toxina | la revista farmacogenòmica

Anonim

Els microarrays es poden utilitzar per identificar efectes de toxina en l’expressió gènica, delimitar vies de desintoxicació in vivo i, potencialment, com a sensors per controlar l’exposició humana.

"Per què un corb com un escriptori?" va preguntar a la memorable Mad Hatter a Lewis Carroll, Alice in Wonderland, un enigma que ha desconcertat i divertit als lectors durant més d’un segle. Aquest no va ser l'únic exemple de l'estrany comportament de Mad Hatter a la famosa festa del te d'Alícia. The Mad Hatter va criticar els cabells llargs d’Alícia, una crítica inusualment avançadora i desconcertant a una noia victoriana, i va practicar un rellotge de polsera que informava el dia del mes, però no l’hora del dia. Tan estrany va ser l'episodi que una exasperada Alícia la va considerar com la "festa del te més estúpida a la qual he estat mai", 1 potser no sorprèn en vista dels casos ben documentats d'intoxicació per mercuri que van provocar els fabricants de feltre al segle XIX, produint un infinitat de símptomes que inclouen una disfunció neurològica severa. 2 Tot i que el Mad Hatter de Carroll era un personatge de ficció, el síndrome de "locomero boig" era qualsevol cosa, tan important, de fet que es va traduir en la prohibició completa del nitrat de mercuri de la indústria confeccionadora de barrets.

L’exposició a toxines ambientals continua sent un repte als països industrialitzats, amb més de 70 000 compostos químics registrats per al seu ús només als Estats Units, i relativament poca informació detallada disponible sobre la toxicitat d’aquests compostos en humans. Es coneixen o sospiten que els dissolvents orgànics, els pesticides, els herbicides i els metalls pesants contribueixen al càncer, els defectes de naixement, els trastorns immunològics i una malaltia neurològica quan s’exposen als humans a nivells elevats 4 . El tetraclorur de carboni (CCl 4 ) és un líquid net i incolor, tòxic que entra a l’atmosfera d’una manera molt eficient a causa de la seva alta pressió de vapor. La vida atmosfèrica d’aquest compost estable és d’aproximadament 50 anys. 5 CCl 4 s'utilitza comercialment en neteja en sec, desgreixatge i en la producció de refrigerants i altres hidrocarburs clorats, i l'exposició aguda humana per inhalació produeix símptomes greus com nàusees, vòmits, marejos i mal de cap. El fetge, el ronyó i el cervell són tres dels principals òrgans objectiu d'aquesta substància tòxica i l'exposició crònica a rates i ratolins de laboratori produeix letalitat embrionària, hepatomes i carcinoma hepatocel·lular. 5 L’estabilitat i la toxicitat de CCl 4 suggereixen la necessitat de noves eines per estudiar i controlar l’exposició humana a CCl 4 i altres toxines ambientals.

En aquest context, la nostra discussió versa un article recent de Young et al. 6 "Anàlisi de l'expressió gènica en fetges de rata tractades amb tetraclorur de carboni mitjançant una nova tecnologia de bioarray" publicada a The Pharmacogenomics Journal . En un article destinat a ser un clàssic, Young et al 6 combinen microarrays d'alta qualitat, potents eines computacionals i un model de rata ben consolidat de toxicitat hepàtica per identificar gens induïts i reprimits per CCl 4 . La signatura d'expressió identificada en aquest estudi proporciona pistes bioquímiques noves sobre el mecanisme de toxicitat per CCl 4 a les rates, i és probable que aquestes dades siguin informatives en humans. El treball també suggereix un enfocament general per estudiar les toxines ambientals, proporcionant un camí senzill fins a desenvolupar microarrays analítics per avaluar l’exposició del pacient.

El document es basa en les primeres publicacions de microarray, cosa que va demostrar la utilitat dels xips per a la perfilació d’expressió 7 i per al descobriment de gens induït per la toxina, 8 i, en aquest aspecte, el paper Young et al 6 no trenca nou terreny. Tanmateix, pel que fa a tots els detalls tècnics del plantejament i per identificar un subconjunt específic de gens induïts per CCl 4, la publicació de Young és nova i impressionant.

El treball comença amb una descripció de les plataformes de microarray, que descriuen alguns dels pros i els contres dels dos tipus principals de microarrays d’àcid nucleic (ADNc i oligonucleòtid). Young et al 6 assenyalen correctament que per als organismes on hi ha informació de seqüència abundant, els microarrays oligonucleòtids 9 ofereixen alguns avantatges sobre les microarrays d'ADNc 7, incloent el fet que els elements de matriu monocatenaris no s'autohibriden i, per tant, poden produir senyals més forts que elements d'ADNc de doble cadena. Els oligos es poden dissenyar amb precisió puntual contra regions de gens únics, eliminant essencialment la hibridació entre gens homòlegs i proporcionant una precisió de la prova més gran. També hi ha algunes diferències importants entre les matrius d’oligonucleòtids sintetitzades in situ 10 i les microarrays realitzades per deposició mitjançant pins o dolls de tinta. Una gran distinció entre les matrius tradicionals 10 i les microarrays 7 és l’ús de la detecció de fluorescència en lloc dels radioisòtops, cosa que permet un alt grau de miniaturització d’assaig en aquest darrer cas. Una diferència important entre la síntesi in situ i la deposició és la capacitat d'aquest últim per avaluar la qualitat i la puresa dels oligonucleòtids abans de la fabricació de microarray.

Els microarrays utilitzats en aquest estudi contenien 1137 dianes úniques que representaven 1040 gens de rata i 97 controls dipositats mitjançant dolls de tinta. Tot i que el subconjunt de gens només representava al voltant del 3% dels gens a la rata, les seves funcions eren àmplies, abastant el metabolisme cel·lular, l’apoptosi, la reparació d’ADN, la regulació del cicle cel·lular, la desintoxicació i altres funcions relacionades amb la toxicitat amb CCl 4 . Els 30-mers dissenyats per ordinador es van fer “fora de línia” mitjançant la síntesi de fosforamidites i es van examinar per a la concentració, la puresa i la identitat de la seqüència abans d’avançar tinta per garantir una alta qualitat. L’adherència al control de qualitat i a la garantia de qualitat contribueixen als resultats excepcionals, i rebutgen la noció guiada que les eines estadístiques poden compatibilitzar xips de mala qualitat (mai!).

La preparació de mostres és sempre un repte en els estudis d’expressió gènica perquè els estímuls no relacionats amb el tractament previst poden alterar els patrons d’expressió i produir artefactes. Young et al 6 tenen la cura adequada en configurar el model animal i en la recol·lecció i preparació de les mostres de rates tractades i de control. La qualitat de les dades fonamenta la validesa dels resultats, i la “qualitat de qualitat a la qualitat” és una lliçó ben agafada i que hem de tamboritzar fortament, ja que les dades de microarray continuen produint-se en quantitats vertiginoses.

La innovació de Microarray està passant a un ritme febril, i és important continuar generant la innovació distingint els principis metodològics dels mètodes, els primers definint "què" i "per què", i els segons generalment exposant "com". Tot i que Young et al 6 utilitzaven els mateixos principis metodològics reportats a la publicació original de microarray, 7 gairebé tots els aspectes tècnics del treball eren diferents del document científic de 95 anys. Schena et al 7 utilitzaven targetes d’ADNc de doble cadena, etiquetatge directe, fluorescència de dos colors, impressió de contactes basada en pinces, química de superfície polisines, exploració confocal i fulls de càlcul per a l’anàlisi de dades. Per contra, Young et al 6 van emprar objectius d’oligonucleòtids monocatenaris, etiquetatge indirecte de sondes, fluorescència d’un sol color, impressió sense contacte, química superficial basada en acrilamida, exploració no confocal i trames de dispersió sofisticades, clustering i mapes autoorganitzadors (SOMs). per a anàlisi de dades. Ambdós treballs van identificar gens per microarray (què) per a comprendre millor un procés biològic (per què), però van utilitzar eines experimentals (com) molt diferents per aconseguir el resultat desitjat.

Els organismes expressen gens quan i on es necessiten i, per tant, els canvis en l'expressió gènica es relacionen estretament amb la seva funció. 11 dels 1040 gens de rata examinats, 19 van ser induïts i 21 van ser reprimits per tractament amb CCl 4 durant 4 dies, i alguns dels 40 gens van ser identificats en estudis anteriors no microarrarals. S'ha demostrat que el factor de transcripció ATF3 s'ha activat en treballs anteriors després de danys hepàtics 12, coherent amb el fet que CCl 4 es desintoxicà en aquest òrgan. Alguns altres gens inclosos els de la família del citocrom P 450 van mostrar canvis d'expressió, no sorprenent a la llum del seu paper en el metabolisme xenobiòtic. L'estudi també va identificar una sèrie de gens nous que inclouen una proteïna tirosina fosfatasa, que es creu que juga un paper en el creixement i la diferenciació cel·lular, 13 i presumptament és induït en resposta a lesions hepàtiques induïdes per CCl 4 . Les dades es correlacionen bé amb enfocaments independents i amplien aquestes observacions aportant informació nova. En aquest sentit, el treball és una ciència de microarrays clàssica, ja que valida l'ús de xips i mostra el valor de la investigació basada en la hipòtesi (basada en el descobriment).

La mineria i el modelat de dades solen ser més difícils que generar resultats bruts, i els autors van triar les seves eines computacionals amb prudència i van aplicar trames de dispersió, agrupació i SOM a les seves dades de microarray. La informació de la parcel·la de dispersió en mostres de control i control versus mateixos demostra la precisió de les dades i ofereix una visió global de l’expressió alterada en funció de la durada del tractament amb CCl 4 . El que crida l’atenció de les dades de la parcel·la de dispersió és que el tractament de 4 dies va produir un efecte més profund que els tractaments de 7- o 14 dies, emfasitzant la importància de “mirar d’hora” en les vies de senyalització. 14 Un aspecte clau del treball és que els dendrograms (clústers) i els SOM van corroborar les dades de la trama de dispersió, cosa que subratlla el valor d’utilitzar diverses eines per a l’anàlisi de dades. Pot ser informatiu mirar més globalment els canvis induïts per CCl 4 mitjançant una microarray de rata 15 més extensa o un microarray de genoma sencer que conté ∼ 30 000 objectius.

Young et al 6 proporcionen un camí clar al desenvolupament de microarrays diagnòstiques que contenen gens responsius CCl 4 per al seguiment de l’exposició humana. L'anàlisi microarray de l'expressió gènica de cèl·lules sanguínies podria ser útil per identificar marcadors basats en sang per a estudis humans. Els “xips de toxina” poden trobar un gran ús mèdic permetent als metges supervisar els símptomes de l’exposició aguda amb assajos quantitatius de microarray que presumptament reflectirien la durada i els nivells d’exposició.

DUALITAT D'INTERÈS

Cap declarat.