Microrna-195 té com a objectiu la proteïna 2 com a factor de ribosilació adp per induir l'apoptosi en cèl·lules mare neurals derivades de cèl·lules mare embrionàries humanes | mort i malaltia cel·lular

Microrna-195 té com a objectiu la proteïna 2 com a factor de ribosilació adp per induir l'apoptosi en cèl·lules mare neurals derivades de cèl·lules mare embrionàries humanes | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • miRNAs
  • Progenitors neuronals

Resum

Les cèl·lules progenitores neuronals (NPCs) derivades de cèl·lules mare embrionàries humanes (HESCs) tenen un gran potencial en teràpia cel·lular, cribratge de fàrmacs i proves de toxicitat de malalties degeneratives neuronals. Tanmateix, la regulació molecular de la seva proliferació i apoptosi, que s’ha de revelar abans de l’aplicació clínica, és en gran mesura desconeguda. El microRNA miR-195 s'expressa al cervell i està involucrat en diversos processos de proapoptosi o antiapoptosi en cèl·lules cancerígenes. Aquí, es va definir el paper proapoptòtic del miR-195 en les NPCs derivades de dues línies hESC independents (cèl·lules mare embrionàries humanes derivades de les cèl·lules progenitores neurals, HESC-NPCs). La sobreexpressió de miR-195 en les HPC-NPCs va induir una mort extensiva de cèl·lules apoptòtiques. De forma consistent, les anàlisis transcripcionals de microarray global van indicar que miR-195 regulava principalment gens associats amb apoptosi en HESC-NPCs. Mecànicament, es va identificar una petita proteïna que uneix GTP a la proteïna 2 de ribosilació com a factor de ribosilació (ARL2) com a objectiu directe de miR-195. El silenciament de ARL2 en NPC- HPC va provocar un fenotip apoptòtic semblant al de la sobreexpressió de miR-195, revelant per primera vegada un paper essencial de ARL2 en la supervivència dels PNC humans. D'altra banda, l'expressió forçada de ALR2 podria abolir la reducció del nombre de cèl·lules causada per la sobreexpressió del miR-195. Curiosament, vam trobar que el paraquat, una neurotoxina, no només va induir apoptosi sinó que va augmentar el miR-195 i va reduir l’expressió de ARL2 en les HPC-NPCs, cosa que indica la possible afectació de miR-195 i ARL2 en l’apoptosi de NPC induïda per neurotoxines. Sobretot, la inhibició de membres de la família de miR-195 podria bloquejar l’apoptosi de NPC induïda per la neurotoxina. Col·lectivament, miR-195 regula l'apoptosi cel·lular de forma dependent del context mitjançant una orientació directa a ARL2 . La constatació del paper crític de l’ARL2 per a la supervivència de les NPC humanes i l’associació de miR-195 i ARL2 amb l’apoptosi induïda per neurotoxines tenen importants implicacions per entendre els mecanismes moleculars que controlen la supervivència de la NPC i facilitaria la nostra manipulació de la patogènesi neurològica.

Principal

La diferenciació amb èxit de cèl·lules mare embrionàries humanes (HESCs) 1 o cèl·lules mare pluripotents induïdes 2 a cèl·lules progenitores neurals (NPCs) obre perspectives fascinants per a la investigació cerebral humana i l'aplicació potencial en malalties degeneratives neuronals. Les teràpies basades en la substitució de cèl·lules clíniques depenen críticament de la comprensió completa de les cèl·lules donants. Tanmateix, se sap molt poc sobre els comportaments cel·lulars dels PNC derivats dels HESCs o dels mecanismes moleculars que coordinen la seva proliferació i supervivència. Tot i que nombrosos estudis realitzats en models de rosegadors han proporcionat una visió molecular important sobre aquests processos cel·lulars, 3 investigacions realitzades directament sobre cèl·lules humanes són de gran importància per desenvolupar estratègies terapèutiques efectives.

Durant l'última dècada, una nova classe de gens reguladors coneguts com a microARN (miRNAs) ha atret una gran quantitat d'atenció com a capa addicional de regulació de l'ARNm en els eucariotes. Els microRNAs són ARNs que no codifiquen endògens, aproximadament 22 nucleòtids de longitud, 4 i es reuneixen en un complex silenciador induït per ARN (RISC), que facilita la seva interacció amb la regió 3 'no traduïda (3'-UTR) de mRNA objectius mitjançant complementaris imperfectes. paralització de bases. Les 2-8 bases de la porció de 5 ′ de la seqüència de miRNA anomenada "regió de llavor" són crítics en el reconeixement de l'objectiu. Normalment, els miRNAs regulen negativament l'expressió gènica objectiu mitjançant la degradació o degradació de la traducció de l'ARNm. Es preveu que el genoma humà contingui més de 1000 miRNAs, aproximadament el 3% del nombre total de gens humans. Se sap que tenen un paper important en diversos processos biològics, inclosa la patogènesi del càncer, 6 desenvolupament neural, la regulació del cicle cel·lular 7, etc. Una característica dels miRNAs és que poden modular l’expressió de molts gens simultàniament, fent-los poderosos reguladors post-transcripcionals. A més, un únic miRNA podria executar diferents funcions biològiques en diferents tipus cel·lulars. Per aquest motiu, els rols precisos dels miRNAs en diversos tipus de cèl·lules haurien de ser investigats en situacions específiques si volem comprendre els miRNAs de manera comprensiva.

miR-195 pertany a la família miR-15/16, que consta d'un grup de miRNAs (miR-195, miR-15a, miR-15b, miR-16-1 i miR-16-2) que comparteixen la mateixa seqüència. . 10 Les seqüències madures de miR-195 es conserven evolutivament entre espècies de mamífers. 11 estudis anteriors han demostrat que miR-195 s’expressa de forma anormal en múltiples tipus de malalties cel·lulars, inclosos carcinoma hepatocel·lular humà, 12 glioblastoma, 13, 14 càncer colorectal 15 i hipertròfia cardíaca. 16 Es va informar que, com altres membres de la família miR-15/16, miR-195 té diversos papers en la regulació de la progressió del cicle cel·lular 17, 18 i l’apoptosi cel·lular 15, 19 en la progressió del càncer i el desenvolupament cardiovascular. Sobretot, en diferents tipus de cèl·lules, miR-195 pot funcionar de manera oposada. Per exemple, a DESCER o DROSHA knockdown HESCs , miR-195 va suprimir el WEE1 per promoure la proliferació cel·lular. No obstant això, a les cèl·lules del glioblastoma humà, miR-195 es va orientar a l' E2F3 conduint directament a la detenció del cicle cel·lular. A més, miR-195 mostra un nivell d’expressió de moderat a baix al cervell embrionari dels mamífers, amb el nivell més alt a l’etapa del desenvolupament del cervell preadult. 11 Malgrat tots aquests avenços en la investigació sobre el MiR-195, les funcions del miR-195 en els PCN humans no s’han examinat.

En aquest estudi, vam demostrar el paper del miR-195 en la coordinació de la supervivència de l’NPC i l’apoptosi en la primera etapa de la diferenciació neuronal i vam identificar una proteïna que s’enllaça a GTP, la proteïna 2 del factor de ribosil·lació ADP (ARL2), com a autèntica diana funcional de miR-195 en aquests processos biològics. A més, vam trobar que l’expressió de miR-195 augmentava amb el tractament de neurotoxina, paraquat i rotenona, cosa que implicava la seva potencial implicació en la regulació de la resposta de NPC a neurotoxines.

Resultats

Les NPC es generen a partir de les HESC

Per generar NPCs a partir de hESCs, es va utilitzar un protocol de diferenciació adherent modificat a partir d’un enfocament anteriorment informat. Es van tractar 20 HESC indiferenciats de la línia SHhES1, 21 prèviament derivats al nostre laboratori i mantinguts sota una condició lliure d’alimentació (figura 1a, esquema superior), amb un antagonista de proteïna morfogenètica òssia Noggin (100 ng / ml) durant unes 3 setmanes. Quan l'estructura epitelial neural polaritzada es va fer clarament visible, les cèl·lules es van recollir mecànicament en bloc per a la formació de la neurosfera en presència del factor bàsic de creixement del fibroblast (bFGF) (figura 1a, quadre inferior). Després del cultiu de suspensió, les neurosferes es van replantejar en plats de cultiu recoberts de Matrigel. Aquestes cèl·lules, designades com a pas 1 (p1) de SHHES1-NPCs, formaven estructures de roseta progenitors neurals típiques. Posteriorment, els NPC es van dissociar en cèl·lules simples i es van replanar a alta densitat per a una major expansió (Figura 1b). Per caracteritzar les propietats dels NPCs dissociats, es van examinar els nivells d’expressió de múltiples marcadors de llinatge neuronal mitjançant una tinció d’immunofluorescència. Gairebé el 90% dels NPCs van expressar marcadors NPC, SOX2 i Nestin (figura 1c), mentre que el marcador d’astròcit GFAP i el marcador d’oligodendrocits OLIG2 rarament es van detectar en NPCs p2 (Figura 1d). L’elevat percentatge de cèl·lules positives de Ki-67 va indicar que la majoria de NPC encara estaven en progressió del cicle cel·lular (Figura 1e). A més, els NPCs dissociats eren capaços de generar neurosferes (figura 1f). El potencial de diferenciació dels NPCs de ShHES1 es va provar mitjançant un assaig de diferenciació espontània. Cèl·lules neuronals diferenciades estirades des de les neurosferes (figura 1g). La majoria de les cèl·lules eren immunopositives davant l'anticòs del marcador de neurones Tuj1 (Figura 1h), mentre que algunes d'elles eren cèl·lules glials positives per GFAP (Figura 1i). Els NPCs SHHES1 generats amb el nostre protocol eren expandibles a un ritme de divisió relativament elevat i mantenien el potencial multipotent per almenys 10 passatges quan es complementava bFGF (dades no mostrades). Per tant, aquests NPC es van convertir en una eina cel·lular ideal per a l'estudi de mecanismes moleculars que governen les propietats de NPC durant la diferenciació neuronal primerenca.

Image

Els SHHES1-NPCs es generen a partir d’ESCs humans de la línia SHhES1. ( a ) Diagrama de flux esquemàtic (panell superior) i la morfologia representativa que il·lustra els passos seqüencials de la diferenciació neuronal (plafó inferior). ( b ) Les rosetes aïllades es van dissociar en cèl·lules simples (p2) en presència de bFGF (10 ng / ml). ( c ) Tinció de coimmunofluorescència per Nestin i SOX2 en NPCs p2. ( d ) Coimmunosting per a GFAP i OLIG2. ( e ) Tinció d'immunofluorescència per a Ki-67. ( f ) Neurosferes formades a partir de NPCs dissociades (p2) en el cultiu de suspensió amb bFGF (10 ng / ml). ( g ) La morfologia de les neurosferes adherides després de la suspensió durant dues setmanes en absència de bFGF. ( h ) i ( i ) Tinció d’immunofluorescència de Tuj1 ( h ) i GFAP ( i ) a les cèl·lules indicades a ( g ). Barres d’escala en ( a - i ), 100 μ m. A ( c ) - ( e ), ( h ) i ( i ) es va utilitzar DAPI (blau) per ressaltar el nucli

Imatge a mida completa

A més, vam generar NPCs a partir d’una altra línia independent de HESC (línia H9 1 ) mitjançant un mètode d’inducció neural de 3 inhibidors, que era una modificació dels protocols reportats anteriorment. Els tres inhibidors incloïen Noggin, SB431542 (inhibidor farmacològic de la senyalització del receptor activina / nodal de tipus I 23 ) i el compost C (un inhibidor químic dels receptors de la superfamília transformant β (TGF β ) del factor de creixement transformant 24 ) (figura suplementària S1a). Amb aquest protocol, es van generar ràpidament de forma eficient i ràpides les NPCs a partir de les HESCs H9 (H9-NPCs). Els resultats de la tinció d’immunofluorescència van demostrar que els NPC-H9 van expressar marcadors NPC com CD133, DACH1, ZIC1, Nestin i SOX2 en una estructura de roseta similar al tub neural (figura suplementària S1b). L'expressió de SOX2, Nestin i Ki-67 també es va detectar en H9-NPCs dissociats, mentre que les cèl·lules immunoreactives als anticossos de MAP2, GFAP, OLIG2 i LEX1 rarament es van observar (figura suplementària S1c). A més, l'anàlisi de citometria de flux (FCA) va demostrar que més del 96% dels NPC-H9 eren SOX2 + / OCT4 - . Així, les HPC-NPCs van mostrar la morfologia cel·lular i l'expressió del marcador semblant a SHhES1-NPCs i totes dues es van utilitzar en aquest estudi.

La sobreexpressió de miR-195 en els PNC indueix apoptosi

Per explorar si el miR-195 té un paper en la proliferació i l'apoptosi de les cèl·lules mare embrionàries derivades de les cèl·lules mare embrionàries humanes (hESC-NPC), es va sobreexpressar el miR-195 en SHhES1-NPCs. La transfecció de precursor de miR-195 de doble cadena (pre-miR-195) a SHHES1-NPCs va reduir el número de cèl·lules en un 30% en comparació amb la transfecció de precursor d'escorcoll de control (pre-miR-NC) (figura 2a). Com s'ha informat que miR-195 afectava el cicle cel·lular o l'apoptosi cel·lular en altres tipus cel·lulars, 12, 15 es va examinar si la reducció del nombre de cèl·lules de NPC després de la sobreexpressió de miR-195 es va deure a alteració del cicle cel·lular o a un augment de l'apoptosi cel·lular. La FCA no va detectar diferències discernibles en els perfils de cicle cel·lular i la taxa d’incorporació de 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdU) entre els NPCs sobreexpressats de miR-195 i les cèl·lules de control (Figures suplementàries S2a i b), cosa que indica que el MiR-195 podria no controla la distribució o la proliferació de cicles cel·lulars de NPC-HESC. En lloc d'això, els assajos de tinció de l'Annexina V-PI van detectar més cèl·lules apoptòtiques positives de l'Annexina V en les SHHES1-NPCs miR-195-sobreexpressades que en les cèl·lules transfectades pre-miR-NC (Figura 2b), consistents amb els resultats de la deoxinucleotidil-transferasa terminal. assaig d'etiquetatge de nick-end (TUNEL) dUTP (figura 2c). A més, es va regular el nivell de proteïna de la caspasa-3 escindida després de la transfecció pre-miR-195 en SHhES1-NPCs (Figura 2d). Aquests resultats demostren que miR-195 pot induir poderosament l'apoptosi en els HPC-NPCs.

Image

miR-195 indueix l’apoptosi cel·lular en HPC-NPCs. ( a ) Tauler esquerre: Imatges cel·lulars de SHhES1-NPCs 72 h després de la transfecció amb 50 nM de pre-miR-NC o pre-miR-195. Mock és el control de reactius de transfecció. Barres d’escala, 100 μ m. Panell dret: l’anàlisi estadística del nombre de cel·les d’NPCs mostrat al tauler esquerre; n = 3, * P <0, 05. El valor de pre-miR-NC es va establir en 1. ( b ) Panell esquerre: L'apoptosi es va mostrar com el percentatge de cèl·lules positives de l'Annexina V en les cèl·lules indicades a ( a ) per la FCA; Panell dret: l’anàlisi estadística de les cèl·lules apoptòtiques; n = 3, ** P <0, 01. ( c ) Els assaigs de TUNEL es van realitzar 48 h després de la transfecció de 50 nM de pre-miR-195 o pre-miR-NC per detectar la mort de cèl·lules apoptòtiques. ( d ) Una immunoblot representativa de la caspasa-3 escindida en NPCs amb 50 nM de pre-miR-195 o transfecció pre-miR-NC durant 48 h. Per a ( c ) i ( d ), els experiments es van dur a terme tres vegades amb resultats similars

Imatge a mida completa

Per determinar si l’apoptosi induïda per miR-195 era un fenomen específic per a SHhES1-NPCs o era general per a altres HESC-NPCs, es va examinar el paper del miR-195 en els H9-NPCs. De la mateixa manera, els assajos de TUNEL van detectar més cèl·lules apoptòtiques en NPCs H9-NPCs pre-miR-195-Transfected (Figures complementàries S2c i d), acompanyades d’una reducció moderada però constant del nombre de cèl·lules (figura suplementària S2e). A més, la caspasa-3 es va activar després de la transfecció de pre-miR-195 en H9-NPCs (figura suplementària S2f). En conjunt, miR-195 va actuar com un factor proapoptòtic en els PCI-HESC.

Per provar si altres membres de la família miR-15/16 també podrien promoure l’apoptosi en els HPC-NPCs, vam sobreexpressar miR-15a, que es diferencia de la majoria de miR-195 en aquesta família (figura suplementària S2g), en SHhES1-NPCs. De manera similar a miR-195, la transfecció del precursor de miR-15a (pre-miR-15a) va donar lloc a una reducció del nombre de cèl·lules (figura suplementària S2h). D'altra banda, el nivell de proteïna de la caspasa-3 escindida va ser elevat per miR-15a, però no per un miR-128 no relacionat (figura suplementària S2i). Per tant, miR-15a sembla ser un factor proapoptòtic en les NPC humanes, com ho és el miR-195.

Per caracteritzar més l’apoptosi induïda per miR-195, es va utilitzar l’àcid nucleic bloquejat (LNA) -195 per silenciar miR-195 en els SHHES1-NPCs pre-miR-195-transfectats. Com es demostra en els resultats quantitatius de la transcripció inversa-reacció en cadena de la polimerasa (qRT-PCR), LNA-195 va reduir eficientment el nivell de miR-195 (figura suplementària S3a) quan es van introduir simultàniament pre-miR-195 i LNA-195 a les NPCs simultàniament. En presència de LNA-195, la reducció mediada en miR-195 en el nombre de cèl·lules i l’apoptosi van ser abolides completament (Figures suplementàries S3b-f). Aquestes dades proporcionen una forta evidència del paper del miR-195 en la inducció de la mort de cèl·lules apoptòtiques en els PNC hESC.

Les anàlisis de Microarray identifiquen signatures d’expressió gènica regulades per miR-195 en hESC-NPCs

Ens interessava la base molecular subjacent al paper específic del miR-195. Estudis anteriors van identificar diversos objectius potencials de miR-195, inclosos BCL2 , AKT3 i FGF2 , i van estar implicats en les funcions del miR-195 en diversos tipus cel·lulars. 15, 25 Es va examinar si l'expressió d'aquests gens estava regulada per miR-195 en NPCs humanes. Tot i això, ni els nivells de mRNA de BCL2 , AKT3 i FGF2 ni els nivells de proteïnes de BCL2 i AKT3 no van canviar en NPCs transduïts prèviament a miR-195 (Figures suplementàries S4a i b). Així, sembla poc probable que miR-195 indueixi l’apoptosi en HPC-NPCs mitjançant la modulació de l’expressió d’aquests gens objectiu anteriorment reportats.

Per identificar objectius genuins de miR-195 en NPCs, es van realitzar anàlisis de microarrays d’expressió gènica. Perfils d'expressió gènica global de NPCs transfectats amb dosis iguals de pre-miR-195 + LNA-NC (grup miR-195), pre-miR-195 + LNA-195 (grup LNA-195) i pre-miR-NC + LNA -NC (grup de control) es va mesurar. Es van fer anàlisis de gens expressats diferencialment amb un valor P 2.0, mostrat com la relació dels valors en el grup miR-195 enfront dels del grup control. En aquest cas, es van identificar 192 gens expressats de manera diferent. Els termes de l’ontologia gènica (GO) associats a aquests gens es van enriquir amb milers de termes biològics (Figura 3a). Tal i com va ordenar el rànquing de valor P , els gens reglats per miR-195 es relacionaven amb processos biològics de proliferació i mort biològica. Aquesta troballa estava d’acord amb les funcions de miR-195 informades en aquest i altres estudis.

Image

El plantejament basat en microarray identifica ARL2 com un autèntic objectiu de miR-195. ( a ) Anàlisi de l'ontologia gènica (GO) de gens expressats de manera diferenciada ( P 2) en miR-195 o grups de control de SHhES1-NPCs. El gràfic enumera els 15 termes principals de GO ordenats pel valor P i inclou almenys 12 recomptes de gens. ( b ) Tauler superior: Il·lustració esquemàtica del 3'-UTR d' ARL2 i els seus llocs potencials de MiR-195 previstes per TargetScan. Immediatament a continuació, es mostren els alineaments de seqüències de llocs d’unió miR-195 putatius en diferents espècies. Els llocs complementaris de llavors es destaquen en vermell i els mutants en verd. ( c ) Dual analitzador de la luciferasa en 293T cèl·lules co-transfectades amb construccions de doble luciferasa que contenen 0, 05 μ g de tipus salvatge (wt-ARL2) o els mutants (mu1-4) al 3'-UTR de ARL2 juntament amb 20 pmol de pre-miR-NC o pre-miR-195; n = 3, * P <0, 05, ** P <0, 01. L'activitat normalitzada de luciferasa de cèl·lules trans-infectades pre-miR-NC es va establir en 1. Mu - All mutant inclou la mutació dels quatre llocs d'unió miR-195 identificats. ( d ) Panell superior: els nivells d'ARNm d' ARL2 es van determinar mitjançant qRT-PCR en NPCs sobreexpressats amb miR-195 amb LNA-195 o LNA de control (LNA-NC); n = 3, * P <0, 05. El valor de control es va establir en 1. Immediatament a continuació, es mostra la taquilla occidental representativa del nivell de proteïna ARL2. Es van realitzar tres experiments independents amb resultats similars

Imatge a mida completa

Per restringir els gens candidats dels objectius miR-195, vam solapar gens expressats de manera diferent en comparacions de miR-195 / control i miR-195 / LNA-195 i vam identificar set gens, que van ser regulats per la sobreexpressió miR-195 però recuperats per LNA. -195 cotransfecció. D’aquests gens, ARL2 va ser previst com a objectiu candidat de miR-195 pels tres programes àmpliament utilitzats, TargetScan, PicTar i miRanda (Taula 1). A més, es van identificar quatre llocs positius d’unió miR-195 al 3’-UTR de ARL2 com a altament conservats entre diferents espècies (figura 3b). La prova de la interacció funcional de miR-195 amb els llocs objectius putatius de ARL2 va ser examinada per assajos de reporters de la luciferasa. L’expressió ectòpica de miR-195 va suprimir significativament l’activitat del reporter que portava els llocs objectius previstos de tipus salvatge d’ ARL2 . A més, aquest efecte inhibidor només es podria abolir quan es mutaven els quatre llocs. La mutació d’un lloc únic no va poder interrompre la interacció (figura 3c). És important destacar que la sobreexpressió de miR-195 en els HPC-NPCs va suprimir l'expressió endògena d' ARL2 tant a nivell de mARN com a proteïna (Figura 3d). Així, les nostres dades proporcionen l’evidència experimental que ARL2 és un autèntic objectiu de miR-195 en hPC-NPCs.

Taula completa

La descrelació de ARL2 és la principal responsable de l’apoptosi mediada per miR-195 en els NPCs hESC

ARL2 és conegut per codificar una petita proteïna que uneix GTP de la superfamília RAS. Tanmateix, la seva funció en els PNC no era coneguda. Ens vam preguntar si ARL2, com a objectiu aigües avall directe de miR-195, tenia una funció relacionada amb la regulació de l’apoptosi en els HPC-NPCs. Per a això, es van utilitzar tres ARNs interferents (siRNAs) interferits ARL2 diferents per silenciar específicament l’expressió d’ ARL2 en SHhES1-NPCs. La repressió amb èxit de l’expressió ARL2 es va verificar mitjançant qRT-PCR i western blotting (figures 4a i b). Morfològicament, les cèl·lules es van tornar rodones i brillants després de la transfecció de siRNAs ARL2 . A més, la derrota de ARL2 va reduir el nombre de NPC, evidentment, de forma similar a la sobreexpressió de miR-195 (figura 4c). Els resultats de Western Blotting van revelar nivells elevats de proteïnes de la caspasa-3 escindida en tots els NPCs transfectats amb siRNA de ARL2 , tot i que a diferents extensions (figura 4d). Les anàlisis V-PI de l' Annexina van revelar un augment del percentatge de cèl·lules apoptòtiques quan ARL2 es va descartar ( Figs 4e i f). Aquests resultats van demostrar que el silenciament de ARL2 produïa un fenotip similar al de la sobreexpressió de miR-195 i que ARL2 era necessari per a la supervivència dels NPC-HESC. Tot i això, no queda clar si miR-195 va induir apoptosi mitjançant la supressió de l’expressió ARL2 . Vam abordar aquesta pregunta sobreexpressant ARL2 abans d’introduir el pre-miR-195 a les NPCs i vam trobar que la sobreexpressió d’ ARL2 impedia la reducció del nombre de cèl·lules induïdes per miR-195 (figures 4g – i). La constatació dóna suport a la noció de que la regulació descendent de ARL2 pot suposar una apoptosi mediada per miR-195 en NPC humanes.

Image

ARL2 és un objectiu funcional a baix del miR-195 durant el procés proapoptòtic. ( a ) Anàlisi QRT-PCR de l'expressió ARL2 en SHhES1-NPCs 72 h post-transfecció de 25 nM de siRNAs ARL2 . El valor de siRNAs de control (ctrl) es va establir en 1; n = 3, * P <0, 05, ** P <0, 01. ( b ) Anàlisis Western blot de l'expressió ARL2 en cèl·lules transfectades amb ARL2 siRNA. ( c ) Imatges de contrast de fase dels NPCs SHhES1-transfectats amb siRNA ARL2 o oligonucleòtids de control. La barra d’escala és de 100 μ m. ( d ) Una delegació occidental representativa de la caspasa-3 escindida en NPCs transfectada amb siRNAs indicats a ( c ). ( e ) Parcel·les representatives de l'assaig de doble tinció de l' Annexina V / PI després del RNAi ARL2 a les PNB . El perfil de citometria de flux representa una tinció d’isotiocianat d’annexina-V-fluoresceïna (FITC) a l’eix x i PI a l’eix y. ( f ) Anàlisi estadística del percentatge de cèl·lules apoptòtiques positives de l'Annexina V en NPCs indicat a ( c ); n = 3, * P <0, 05 i ** P <0, 01. ( g ) Tant els nivells de proteïna ALR2 exògena com endògena en cèl·lules co-transfectades amb 50 pmol de pre-miR-195 i 5 μ g de plasmides ARL2 -pPy marcats amb bandera (F- ARL2 ) es van mesurar per Western Blot. Es van realitzar tres assaigs independents i es van obtenir resultats similars. ( h ) La transfecció d' ARL2 va restablir el nombre cel·lular de NPC sobreexpressats de miR-195 en comparació amb el grup control. El valor del grup de control es va establir en 1. n = 3, ** P <0, 01. ( i ) La imatge cel·lular representativa de ( h ). Les barres d’escala són 100 μ m

Imatge a mida completa

L’apoptosi induïda per la neurotoxina està relacionada amb miR-195 i ARL2

Per aprendre processos fisiològics o patològics associats a miR-195, es va examinar el patró d’expressió de miR-195 durant la diferenciació d’ESC humana en progenitors neuronals en els dies d’inducció 0, 5, 10 i 25. Els resultats de l’anàlisi qRT-PCR van mostrar una tendència creixent gradualment. en el nivell de miR-195 (Figura 5a), implicant l’associació potencial de miR-195 amb aquest procés.

Image

miR-195 i ARL2 poden estar relacionats amb l’apoptosi induïda per neurotoxines. ( a ) Els nivells d'expressió de miR-195 es van mesurar per qRT-PCR durant la diferenciació neural de l'H9 ESC a diferents dies, inclosos D0, 5, 10 i 25; n = 3. El valor de la mostra de D0 es va establir en 1. ( b ) Anàlisi QRT-PCR dels nivells d'expressió de miR-195 en NPCs tractats amb 500 μ M de paraquat o 500 nM de rotenona. El valor del tractament amb dimetilsulfoxid (DMSO) es va establir en 1; n = 3, * P <0, 05. ( c ) El nombre cel·lular de NPCs va disminuir sota el tractament de paraquat (500 μ M) o rotenona (500 nM). Les barres d’escala són 100 μ m. ( d ) L'anàlisi estadística del nombre de cèl·lules en cèl·lules indicades a ( c ); n = 4, ** P <0, 01. ( e ) i ( f ) L'anàlisi estadística i les trames representatives de la tinció de PI de NPCs tractades com s'indica; n = 3, * P <0, 05, ** P <0, 01. ( g ) La representació occidental representativa per la protecció de ARL2 i la caspasa-3 fendida a les cèl·lules indicades a ( e ). Es van realitzar dos experiments independents. ( h ) Les anàlisis occidentals representatives de la GFP i la caspasa-3 escindida en NPC infectades amb partícules de lentivirus RLL o Sponge-195 amb o sense paraquat (PQ). Es van realitzar tres experiments independents. ( i ) Les parcel·les representatives de l'anàlisi de tinció de PI de NPCs, tal com s'indica a h ). Tres experiments independents van tenir resultats similars

Imatge a mida completa

Recentment, Zhang i Pan 27 van informar que un factor estressor i potencial cancerigen utilitzat habitualment, hexahidro-1, 3, 5-trinitro-1, 3, 5-triazina (RDX), va induir la subregulació de miR-195 al cervell i al fetge del ratolí., suggerint una possible implicació de miR-195 en el procés d'apoptosi induïda per la neurotoxina. Per tant, vam explorar aquesta possibilitat examinant els patrons d’apoptosi i expressió tant de miR-195 com d’ARL2 després de tractar HESC-NPCs amb neurotoxines, paraquat i rotenona. Es va informar que Paraquat, un herbicida i sospitós factor etiològic en el desenvolupament de la malaltia de Parkinson, va induir apoptosi en el neuroblastoma humà. 28 El complex mitocondrial I inhibeix la rotenona es pot utilitzar per activar vies apoptòtiques a les cèl·lules neurals. 29 Aquí, vam trobar que tant el paraquat com la rotenona augmentaven el nivell d’expressió miR-195 en SHhES1-NPCs (Figura 5b). Simultàniament, van provocar una evident reducció del nombre de NPC (figures 5c i d). A més, FCA va revelar que el percentatge de cèl·lules apoptòtiques va augmentar quan es van tractar cèl·lules amb paraquat o rotenona (figures 5e i f). Curiosament, el paraquat, però no la rotenona, va activar la caspasa-3 i va reduir el nivell de proteïna ARL2 (figura 5g). És possible que el paraquat i la rotenona activessin diferents vies apoptòtiques. La rotenona pot induir apoptosi per via independent de la caspasa-3, que està d’acord amb l’estudi de les cèl·lules mare neurals humanes. 23 En conjunt, miR-195 i ARL2 poden tenir papers en l'apoptosi induïda per neurotoxines com el paraquat.

Finalment, es va determinar si era necessària miR-195 per a l’apoptosi induïda per paraquat. Per a això, es va utilitzar LNA-195 per bloquejar l'efecte del miR-195 en les cèl·lules tractades amb paraquat. Tanmateix, la LNA-195 no va poder evitar la mort cel·lular induïda per paraquat (dades no mostrades). Tenint en compte que altres membres de la família miR-195, com el miR-15a, també podrien funcionar com a factors de proapoptosi per emmascarar l'efecte del LNA-195, vam dissenyar un vector lentiviral (anomenat RLL) a un plasmidi 30 d' esponja miRNA (anomenat Sponge -195) amb set tàndems d'una seqüència, complementaris a la seqüència de llavors de la família miR-195, al 3'-UTR d'un gen reporter de proteïna de fluorescència verda ( GFP ) per suprimir la funció de tota la família miR-195 ( Figura suplementària S5a). L’eficàcia de Sponge-195 es va validar en els dos assajos següents. Primer, es va transfectar Sponge-195 en cèl·lules 293T juntament amb el pre-miR-195 o el pre-miR-15a. FCA va demostrar que ambdós miRNA van ser capaços de reduir l'expressió de GFP, indicant que els membres de la família miR-195 podrien unir els set tàndems de l'Esponja-195 per reduir l'expressió GFP (figura suplementària S5b). En segon lloc, es va examinar si la presència de Sponge-195 podria afectar l’activitat luciferasa controlada per la seqüència 3′-UTR del gen ARL2 . La inhibició de l'activitat de la luciferasa per miR-195 i miR-15a va ser completament abrogada quan es va co-transfectar pre-miR-195 o pre-miR-15a amb Sponge-195, cosa que indica que Sponge-195 podria segrestar eficientment els membres del miR. Família -195 i mantenir el nivell d’expressió gènica objectiu (figura suplementària S5c). Posteriorment, es va utilitzar Sponge-195 per silenciar l'efecte dels membres de la família miR-195 en els SHHES1-NPCs. RLL, el vector parental dels set tàndems, es va utilitzar com a control. Western blot va demostrar que el Sponge-195 va eliminar el nivell actiu de caspasa-3 causat pel tractament paraquat en NPCs transfectades amb RLL (Figura 5h). A més, l’anàlisi de tinció de la PI va revelar que l’apoptosi de NPC induïda per paraquat de l’Esponja-195 (Figura 5i). Aquestes observacions mostren clarament que la família miR-195 té un paper important en l'apoptosi de NPC humana promoguda per paraquat per neurotoxines.

Discussió

En aquest estudi, s'informa del paper funcional del miR-195 en la regulació de l'apoptosi de NPCs derivades de dues línies independents de HESCs. La sobreexpressió de miR-195 o el seu membre de la família miR-15a van induir una mort cel·lular apoptòtica important. En consonància amb aquesta funció, l'expressió gènica a tot el genoma va descobrir que la mort cel·lular era el principal procés biològic regulat per miR-195. Mecànicament, ARL2 era un autèntic objectiu funcional avall del miR-195. Proporcionem la primera evidència que ARL2 és essencial per a la supervivència dels NPC-HESC. Patològicament, hem trobat que miR-195 i ARL2 podrien estar implicats en el procés d'apoptosi induïda per la neurotoxina. L’enllaç directe entre miR-195 i ARL2 i el paper funcional d’ARL2 establert aquí proporcionen noves visions sobre la regulació molecular de la supervivència cel·lular i l’apoptosi en els NPC humans i poden ajudar a trobar noves estratègies per millorar la supervivència dels PNC quan s’utilitzen en la malaltia. tractament.

Diversos grups han informat independentment que els membres de la família del miR-15/16 tenen un paper important en la regulació d'una gran varietat de processos biològics i patològics. 31 En aquest estudi, es va demostrar que la sobreexpressió de miR-195 evocava apoptosi cel·lular en NPC-HESC. El silenciament de miR-195 només en SHHES1-NPCs no va produir fenotips discernibles en condicions de cultiu normals i no va poder evitar l’apoptosi de NPC induïda per paraquat (dades no mostrades). No obstant això, silenciar tots els membres de la família miR-195 va reduir considerablement l’apoptosi de NPC induïda per la neurotoxina. La troballa suggereix l'existència de rols redundants entre els membres de la família miR-195 i revela el paper crític d'aquesta família en l'apoptosi mediada per neurotoxines o en la degeneració de les cèl·lules neuronals en els NPC humans.

S'ha informat que diferents línies hESC poden mostrar diferents potencials de diferenciació en llinatges cel·lulars particulars. 27 Per tant, les NPC derivades de diferents línies hESC poden respondre de manera diferent als estímuls proapoptòtics. Hem observat que la resposta apoptòtica de la SHhES1-NPCs a la sobreexpressió miR-195 era més forta que els H9-NPCs, tot i que l’apoptosi es va produir en ambdues línies de NPCs. Com que les dues línies NPC es van generar inicialment per dos protocols d’inducció diferents, calia distingir si la resposta diferencial es devia als mètodes de diferenciació utilitzats o a la seva derivació de dues línies hESC diferents. Per solucionar aquest problema, hem generat NPC-H9 mitjançant el mateix mètode d’inducció Noggin utilitzat per generar SHhES1-NPCs. Curiosament, la resposta apoptòtica de NPC-H9 generada pel mateix protocol amb els SHPC-SHHES1 va mostrar una resposta més feble a la sobreexpressió de miR-195, com ho van fer les HPC-NPCs generades per tres inhibidors (dades no mostrades). Per tant, miR-195 va provocar apoptosi en menor mesura en HPC-NPCs que en SHhES1-NPCs, independentment de l'estratègia de diferenciació.

Es desconeixen en gran mesura els mecanismes moleculars mitjançant els quals miR-195 executa les seves funcions biològiques, tot i que es van informar de diversos objectius possibles. En aquest estudi, es va informar per primer cop de la signatura d’expressió gènica a tot el genoma regulada per miR-195 en NPCs humans. La informació ens ajudarà a entendre millor el funcionament del miR-195. Notablement, en les HPC-NPCs, miR-195 no va afectar l'expressió de diverses dianes conegudes que eren identificades anteriorment en altres tipus cel·lulars. En el seu lloc, miR-195 va dirigir específicament la ARL2 i la regulació inferior de la ARL2 van fenocopiar l'efecte proapoptòtic de la sobreexpressió de miR-195 en els PNCs hESC. És important destacar que la sobreexpressió ARL2 va abolir el fenotip de la sobreexpressió miR-195. D'acord amb la nostra conclusió, dos grups van informar recentment que miR-195 regulava directament l'expressió ARL2. 32, 33 Nishi et al. va trobar que miR-195 va modular els nivells d'ATP i va degenerar els mitocondris via ARL2 en miocits cardíacs. No obstant això, si el seu estudi no es va esmentar si ARL2 es va associar amb apoptosi en miòcits cardíacs. De manera diferent, van trobar que la mutació de qualsevol dels quatre llocs d’unió de miR-195 podia bloquejar l’efecte del miR-195, mentre que en el nostre estudi miR-195 va perdre la seva activitat inhibidora davant ARL2 només quan tots els quatre llocs d’unió putatius van ser mutats. Per tant, la funció d’un miRNA i la forma d’actuar són dependents del context cel·lular.

Fins al moment, hi ha hagut pocs estudis sobre ARL2 i les seves funcions biològiques. Es considera que està implicat en el plegament de la tubulina i la dinàmica de microtúbuls en cèl·lules de mamífers. 34, 35 ARL2 poden formar un complex amb el cofactor D 36 que s’uneix a la tubulina i la proteïna supresora del tumor fosfatasa 2A 37 per regular la fosforilació de p53, que s’uneix al microtúbul per afectar la sensibilitat 38 a la quimioteràpia i l’agressivitat del tumor 39 en el càncer de mama. En aquests estudis, la supressió de l’expressió d’ ARL2 en càncer de mama va inhibir l’apoptosi i la regressió del tumor. 38, 39 El seu resultat és contrari a la nostra constatació que silenciar ARL2 condueix a l’apoptosi en NPCs. A més, es va disminuir la disminució de l'expressió ARL2 disminuint la propagació cel·lular. 34 Es van observar fenòmens similars en NPCs transfectades amb ARL2 siRNAs. Aquí, proporcionem proves directes que silenciar l'expressió ARL2 condueix a l'apoptosi en NPCs humans. Per tant, ARL2 és un factor nou necessari per a la supervivència del PNC. Es requereix més investigació per tractar com ARL2 participa en el control de la supervivència cel·lular.

Materials i mètodes

Cultiu cel·lular

Les ESC humanes de la línia SHhES1 (cariotip XX, p33-40) es van cultivar en fibroblasts embrionaris de ratolí irradiats (MEFs) amb un canvi diari de medi que consistia en el medi Eagle modificat de Dulbecco, eliminat per Eagle (Gibco / Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) complementat amb un 20% de recanvi sèric (Gibco), 1 mM de glutamina, 0, 1 mM β- mercaptoetanol, 0, 1 mM aminoàcid no essencial, 50 U / ml de penicilina més 50 μ g / ml estreptomicina i 4 ng / ml bFGF (Invitrogen / Vida Technologies, Grand Island, NY, EUA). Es van mantenir 21 ESC humans de la línia H9 (WA-09, cariotip XX, p48-56) tal com es va descriure anteriorment. 40

Generació i cultura de NPCs

Les cèl·lules SHhES1 es van cultivar a Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) en el medi condicionat amb MEF (MEF-CM) suplementat amb 8 ng / ml de bFGF abans de la diferenciació neuronal. Després del cultiu durant un dia amb MEF-CM, les cèl·lules es van induir en llinatges neuronals mitjançant el cultiu amb el medi N2B27 (barreja 1: 1 de DMEM / F12 suplementada amb suplement N2 i medi neurobasal suplementat amb suplement B27; Gibco) més 100 ng / ml rmNoggin (Sistema de R + D, Minneapolis, MN, EUA). Després de l'aparició de cèl·lules polaritzades després de la inducció durant aproximadament 3 setmanes, les cèl·lules es van recollir mecànicament i es van cultivar en suspensió per formar neurosferes al medi N2B27 suplementat amb 10 ng / ml bFGF. Quan es van unir les neurosferes, es van definir les cèl·lules com a p1. A partir de p2, les cèl·lules es van dissociar en cèl·lules simples per un 0, 05% de trypsina (Gibco). Tots els passatges posteriors de NPC es van mantenir en el medi N2B27 amb 10 ng / ml de bFGF.

Les cèl·lules H9 van ser transferides al mitjà mTesR1 (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadà), tal com es descriu. Aleshores, es van processar segons es va informar, 22 tret que vam afegir un altre inhibidor del TGF β , compost C (10 μ M; Sigma, St. Louis, MO, EUA), juntament amb 500 ng / ml rmNoggin i 10 μ M SB431542 ( Tocris Bioscience, Bristol, Regne Unit) per induir la diferenciació neuronal. Similar a la diferenciació neural de les cèl·lules SHHES1, vam agafar cèl·lules en grups i les vam col·locar en plats recoberts de Matrigel quan les cèl·lules polaritzades eren visibles. Més tard, es van dissociar NPCs en cèl·lules simples en el medi N2B27 més 10 ng / ml bFGF i van passar per un 0, 05% de tripsina.

Transfecció transitòria de cèl·lules amb pre-miR o LNA-miR

Les cèl·lules van ser transfectades de forma transitòria amb pre-miRNAs sintètics (Ambion / Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) i / o LNA-miRNAs (Exiqon A / S, Vedbaek, Dinamarca) per Lipofectamine 2000 (Invitrogen) segons les instruccions del fabricant. Les seves concentracions utilitzades en experiments es van proporcionar a les llegendes de la figura. Les cèl·lules es van collir 72 h després de la transfecció o segons s’indica.

Assaig formant neurosfera

Els NPCs van ser digerits per 0, 05% de tripsina i cultivats en suspensió en plats revestits amb poli-HEME (Sigma). Estructures esfèriques formades després del cultiu de 4 a 6 dies en presència de 10 ng / ml de bFGF. Quan es va retirar bFGF, les NPC es van diferenciar espontàniament en cèl·lules neuronals. Es van adjuntar esferes diferenciades a cobertors (Fisherbrand / Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA) recoberts de Matrigel per a la tinció d’immunofluorescència.

Tinció d’immunofluorescència

Les NPCs i les rosetes adjuntes a les cobertures es van tacar com es va descriure anteriorment. 42 Les imatges confocals es van capturar mitjançant un microscopi confocal (TCS SP5; Leica Microsystems, Wetzlar, Alemanya). Els anticossos primaris es van utilitzar amb dilucions següents: Nestina (1: 200; Chemico / MILLIPORE, Temecula CA, EUA), SOX2 (1: 500, anticòs policlonal de conill elevat i purificat per afinitat al nostre laboratori), GFAP (1: 200; Chemicon ), OLIG2 (1: 250; Chemicon), Ki-67 (1: 200; Chemicon), Tuj1 (1: 500; Promega, Madison, WI, EUA), MAP2 (1: 500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), LEX1 (1: 100; Chemicon), CD133 (1: 50; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanya), DACH1 (1: 100; Proteintech, Chicago, IL, EUA) i ZIC1 (1: 100; Novus Biologicals, Littleton, CO, EUA).

Extracció d’ARN i qRT-PCR en temps real

L’ARN total es va aïllar de les NPCs amb reactiu TRIzol (Invitrogen) i es va transcriure inversament a l’ADNc mitjançant oligo (dT) 15 i RevertTra Ace revers transcriptasa (Toyobo, Osaka, Japó). NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA) es va utilitzar per quantificar quantitats de mRNA. QRT-PCR es va realitzar mitjançant el sistema de PCR ABI PRISM 7900 en temps real ràpid (Applied Biosystems) i el Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) segons les instruccions del fabricant. Les seqüències d’imprimació utilitzades per a qRT-PCR es mostren a la taula complementària S1. El miR-195 madur va ser detectat mitjançant anàlisi qRT-PCR en bucle mare mitjançant els kits de test de MicroRNA Humans de Taqman (Applied Biosystems). El RNU48 petit nucleolar va servir com a ARN de referència endògena per normalitzar el contingut cel·lular d’altres miRNAs.

Western blot

L’anàlisi de Western blot es va realitzar en condicions de desnaturalització estàndard mitjançant anticossos següents a dilucions 1: 1000: escorcollada caspasa-3 (Cell Signaling Technology (CST), Denver, MA, EUA), BCL2 (Cell Signaling Technology), α- tubulina (Sigma), GAPDH (Abmart, Arlington, MA, EUA), AKT (Cell Signaling Technology), AKT3 (Cell Signaling Technology) i GFP (Roche, Indianapolis, IN, EUA). Es va utilitzar un anticorp ARL2 (Abgent, San Diego, CA, EUA) a 1: 200 de dilució. Tots els experiments es van realitzar almenys tres vegades.

Anàlisi de citometria de flux

Els NPC es van cultivar en plats recoberts de Matrigel durant almenys 48 h abans dels experiments. Les NPCs es van incubar durant 2 h amb BrdU (10 μ M; BD Biosciences) i després es van fixar amb un 70% d’etanol abans de FCA per un BD FACSAria Cell Sorter (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Els NPCs transfectats es van tacar amb annexina V i iodur de propidi (PI) segons el manual del fabricant. Els cicles cel·lulars es van analitzar mitjançant una tinció de PI mitjançant un classificador de cèl·lules BD FACSAria o un citòmetre de flux BD Accuri C6 (Citometers BD Accuri, Ann Arbor, MI, EUA). Després del tractament del paraquat (Sigma) o rotenona (Sigma), es va utilitzar un protocol simplificat per a l’anàlisi d’apoptosi mitjançant l’anàlisi del contingut d’ADN tal i com es descriu. 43

Prova de TUNEL

Les NPCs transfectades es van fixar en un 4% de paraformaldehid durant 1 h a temperatura ambient i després es van permeabilitzar en una solució Triton X-100 / solució tamponada amb fosfat al 0, 2% durant 15 min. La tinció de TUNEL es va realitzar segons les instruccions del fabricant ( In situ Cell Detection Death Death Kit, POD; Roche). Les cèl·lules tacades es van analitzar mitjançant el Classificador de cèl·lules BD FACSAria.

Assenyala un periodista de la Luciferasa

El 3'-UTR de l' ARL2 humà (NM_001667) es va clonar en un vector que contenia dos marcs de lectura oberts de Luciferasa, Renilla i firefly (psiCHECK2; Promega). Les regions objectiu van ser mutades per PCR amb primers mutants, tal com apareixen a la taula complementària S1. Concretament, quatre llocs complementaris miR-195, TGCTGCTA (G), es van canviar per TGCTGggA (G). Les cèl·lules 293T van ser co-transfectades amb la construcció del reporter i pre-miR-195 mitjançant Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Es van realitzar assajos de periodistes de Luciferasa a 48 h post-transfecció mitjançant el Sistema d’Assaig Dual-Luciferasa (Promega) segons les instruccions del fabricant.

Microarray d'expressió gènica i anàlisi de dades

Es van utilitzar xips Affymetrix HG-U133 plus 2.0 per a cada grup de NPCs amb tres rèpliques biològiques. Es van preparar mostres d’ARN a partir de SHhES1_NPCs 48 h post-transfecció amb les següents condicions: (1) 50 pmol pre-miR-NC (25 nM) més 50 pmol LNA-NC (25 nM); (2) 50 pmol pre-miR-195 (25 nM) més 50 pmol LNA-NC (25 nM); i (3) 50 pmol pre-miR-195 (25 nM) més 50 pmol LNA-195 (25 nM). Els ARN van ser extrets per TRIzol, purificats per un kit QIAGEN RNAeasy (QIAGEN, València, CA, EUA) i sotmesos a fitxes Affymetrix HG-U133 plus 2.0 (Shanghai Biochip Co. Ltd, Shanghai, Xina). Les dades van ser analitzades per l'eina de conversió de la identificació genètica de DAVID (//david.niaid.nih.gov) i el sistema d'anàlisi SBC (//sas.ebioservice.com).

Interferència d’ARN per oligonucleòtids

ARL2 va ser eliminat mitjançant oligonucleòtids duplex (RNAi) en interferència de RNA Stealth (Invitrogen) en SHhES1_NPCs. Les seqüències dels oligos RNAi sigils ARL2 van ser les següents: ARL2 i-1 (5′-TGCGCTGTCCACTACCCAGATGAGG-3 ′), ARL2 i-2 (5′-TCTTCAGGATGGTTGTCTTTCCAGC-3 ′) i ARL2 i-3CTT-TG ′). El control negatiu es va comprar a Invitrogen (Stealth RNAi Negative Control Med GC i High GC).

Construcció de plàsmids i nucleofecció

El plasmidi ARL2 -PET és un regal amable del doctor Nicholas J. Cowan. El fragment d'ADN que conté la seqüència codificant d' ALR2 (NM_001667), digerit a partir d' ARL2 -PET per NdeI i Bam HI, va ser inserit al vector pPyCAGIP-Flag mitjançant els mateixos llocs enzimàtics. Aleshores, 5 μ g d' ARL2 -pPy o pPy-vector es van nuclear en 2 × 10 6 NPCs segons les instruccions del fabricant (Amaxa Nucleofector, Amaxa Biosystems, Colònia, Alemanya). El programa utilitzat és A33. Després de 48 h, 25 nM de pre-miR-NC o 25 nM de pre-miR-195 van ser transfectades per Lipofectamine 2000. Les cèl·lules es van recol·lectar després de 48 h addicionals per a comptatge de números de cèl·lules (comtessa; Invitrogen) i anàlisi de taquilla occidental.

Els set tàndems de la seqüència de llocs d'orientació a la família miR-195 (figura suplementària S5a), sintetitzats per Sangon (Xangai, Xina), van ser inserits en el vector RLL (regal del doctor Holm Zaehres) per llocs enzimàtics Sal I i Kpn I. A continuació, es van transfectar plasmides reporters 0, 05 μ g psiCHECK o ARL2 3′-UTR, 10 pmol pre-miR-NC, pre-miR-195 o pre-miR-15a i 0, 8 μ g RLL o plasmides Sponge-195 en cèl·lules 293T tal com s’indica a la figura complementària S5c mitjançant un reactiu de Lipofectamina 2000 segons les instruccions del fabricant (Invitrogen).

Generació de partícules lentivirals i infecció per virus

Es van obtenir partícules lentivirals RLL i Sponge-195 tal com es va descriure anteriorment. 44 El títol de partícules lentivirals es va detectar a les cèl·lules 293T. La multiplicitat d’infecció de NPC es va establir a 2.

Anàlisi estadística

Tots els valors es mostren com a mitjans ± SD La prova t de l'alumne es va utilitzar per determinar la importància de les diferències en les comparacions entre dos grups. El nivell de confiança 0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària S1

  2. 2

    Figura suplementària S2

  3. 3.

    Figura suplementària S3

  4. 4.

    Figura suplementària S4

  5. 5.

    Figura suplementària S5

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

  2. 2

    Taula suplementària S1

Glossari

NPC

cèl·lula progenitora neuronal

HESC

Cèl·lula mare embrionària humana

hESC-NPC

cèl·lula progenitora neuronal derivada de cèl·lules mare embrionària humana

ARL2

Proteïna 2 com a factor de ribosil·lació ADP

miRNA

microARN

3′-UTR

Regió 3 'no traduïda

bFGF

factor bàsic de creixement del fibroblast

FCA

anàlisi de citometria de flux

TUNEL

Etiquetatge de nick-end dUTP a mediació de desoxinucleotidil-transferasa terminal

qRT-PCR

reacció en cadena de transcripció inversa quantitativa-polimerasa

LNA

àcid nucleic bloquejat

ANAR

ontologia gènica

siRNA

petit ARN interferidor

Pi

iodur de propidi

RDX

hexahidro-1, 3, 5-trinitro-1, 3, 5-triazina

GFP

proteïna de fluorescència verda

MEF

Fibroblast embrionari del ratolí

TGF- β

factor de creixement transformant - β

BrdU

5-brom-2'-desoxiuridina

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)