Mir455 està relacionat amb la senyalització d'hipòxia i es desregula en la preeclampsia | mort i malaltia cel·lular

Mir455 està relacionat amb la senyalització d'hipòxia i es desregula en la preeclampsia | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Biomarcadors
  • Senyalització cel·lular
  • miRNAs
  • Preeclàmpsia

Resum

La preeclampsia és un trastorn greu relacionat amb l’embaràs i una de les principals causes de mortalitat materna i fetal a tot el món. Un dels objectius més importants en obstetrícia és, doncs, la identificació precoç dels pacients amb un risc més gran de preeclampsia. Aquí identifiquem dos microRNA humans relacionats com a biomarcadors potencials per detectar embarassos amb risc. Demostrem que el miR455-3P i el miR455-5P estan significativament regulats en placentes de pacients amb preeclampsia, mentre que altres microRNAs específics de placenta continuen sense ser afectats. La predicció i validació d’objectiu de microRNA van revelar un potencial enllaç de miR455-3P a la senyalització d’hipòxia. Juntament amb la nostra observació que els nivells d’expressió de miR455-3P i miR455-5P estan regulats durant la diferenciació de trofoblast, els nostres resultats suggereixen un model en el qual miR455-3P reprimeix una resposta d’hipòxia que d’una altra manera podria impedir que els citotrofoblasts es diferenciïn entre sincitiotrofoblastos. En resum, el nostre treball revela una aberrant senyalització d’hipòxia en preeclampsia que es pot explicar mitjançant l’expressió desregulada de miR455. A mesura que s'ha trobat miR455 en sang circulant, es pot fer el desenvolupament de proves prenatals no invasives que permetin un diagnòstic precoç de la preeclampsia.

Principal

La placenta connecta el fetus en desenvolupament amb la paret uterina i permet l’intercanvi de gasos, l’absorció de nutrients i l’eliminació de productes de rebuig mitjançant el subministrament de sang de la mare. D'altra banda, la placenta té una activitat endocrina, produint diverses hormones i factors de creixement associats a l'embaràs que regulen el creixement fetal i la resposta materna a l'embaràs. La funció aberrante o el desenvolupament de la placenta s’han associat a moltes complicacions de l’embaràs, inclosa la preeclampsia (PE). El PE és un trastorn multisistèmic, associat a l’embaràs, amb una incidència del 2-5% que és una causa principal de morbilitat i mortalitat materna i fetal. 2 Tot i que l’etiologia exacta de la PE segueix evitant, la placenta té un paper central. 3 En el primer i segon trimestre, les interaccions immunològiques feto-maternes aberrants locals a la paret uterina condueixen a una invasió de la paret arterial deteriorada per les cèl·lules del trofoblast. Això es tradueix en una transformació fallida de les artèries espirals uterines i posteriorment va disminuir la perfusió placentària. 3 Hipòxia crònica o períodes alterns d’hipòxia / reoxigenació a l’espai intervílic desencadena l’estrès oxidatiu del teixit i augmenta l’apoptosi placentària i la necrosi. 4 Posteriorment, les deixalles placentàries i l'expressió aberrant de factors proinflamatoris, antiangiogènics i angiogènics condueixen a una disfunció de les cèl·lules endotelials sistèmiques i una resposta inflamatòria exagerada. 5, 6, 7, 8, 9 Curiosament, les partícules que es desprenen a la superfície de la placenta són alliberades a la circulació materna i el seu contingut, el DNA i els microARN (miRNAs) poden servir com a biomarcadors no invasius per a trastorns relacionats amb l’embaràs. 10, 11

Els microRNA són una gran família de reguladors post-transcripcionals d’expressió gènica, d’uns 21 nucleòtids (nt) de longitud, que controlen molts processos de desenvolupament i cel·lulars en organismes eucariotes. Els microARN són processats a partir de molècules precursores (pri-miRNAs), que es transcriuen a partir de gens miRNA independents o representen introns de gens codificants de proteïnes. Els micro-ARNs es repleguen en pells que són processades de forma seqüencial per l'enzim nuclear DNA de RNAse III en pre-miRNAs de 70º. Després d’exportar-lo al citoplasma, Dicer processa més endavant el Dicer a un dúplex de 21-pb miRNA / miRNA *. Una part d’aquest dúplex, que representa un miRNA madur, s’incorpora llavors al complex silenciador induït pel miRNA (miRISC). 12 Per a molts gens de miRNA, un miRNA madur derivat del braç 5 ′ o del 3 ′ de la pina del pèl preRiRNA s’incorpora preferentment al miRISC. No obstant això, al voltant del 10-15% dels gens del miRNA expressen ambdós miRNA madurs. S'anoten amb els sufixos -5p i -3p. 13, 14, 15

Com a part del miRISC, els miRNAs madurs es combinen amb bases de seqüències al 3'-UTR dels ARNm diana i dirigeixen la seva repressió translacional i / o mortenilació i degradació de l'ARNm. També s'ha suggerit que els microRNAs orientin la seqüència de codificació d'alguns ARNm i els 5'UTR de mRNAs de codificació de proteïnes ribosòmiques, que condueixin a la inhibició o l'activació de les dianes, respectivament. 16, 17 La majoria dels miRNAs dels animals s’apareixen de manera imperfecta amb els ARNm diana. No obstant això, una orientació a l'ARNm eficient requereix el sincronització de bases contínues de la seqüència de "llavors" del miRNA (nt 2-8). 18 Com que la complementarietat més extensa que el maridatge de llavors no és habitual en els animals, preveure computacionalment els ARNm objectiu de miRNA ha estat un repte. No obstant això, s'han desenvolupat diverses eines computacionals per predir possibles objectius de miRNA. 18

El perfil de l’expressió del miRNA ha revelat que alguns miRNA s’expressen universalment, però d’altres teixits específicament. Les proves acumulades mostren que els ARNm sovint es desregulen en malignes humanes i poden actuar com a oncogens o gens supressors del tumor. 20, 21 A la placenta humana, dos grans cúmuls de gens miRNA estan codificats en el cromosoma 14 (C14MC) i el cromosoma 19 (C19MC). 22, 23 Curiosament, l'expressió de certs miRNAs específics de placenta està desregulada en els teixits càncer, tot i que els seus rols funcionals han estat evidents. 23, 24 Pocs miRNAs específics de la placenta s’han associat a trastorns de la placenta com el PE. Per exemple, diversos estudis han posat de manifest la sobreregulació del miRNA miR210 en placenta de pacients amb PE. 26, 27, 28, 29, 30 Tanmateix, la majoria d’aquests estudis estaven limitats per l’escassetat de mostres placentàries necessàries per a l’expressió de miRNA, la seva heterogeneïtat i / o el baix nombre de miRNA estudiats. 26, 30 Per tant, no està clar fins a quin punt els ARNm que no són miR210 s'expressen de manera diferent en pacients amb PE.

Els trofoblasts són cèl·lules especialitzades de la placenta que tenen un paper important en la implantació d’embrions i la interacció amb l’úter matern. Dues vies de diferenciació de trofoblasts condueixen al desenvolupament placentari. 31 En la via extravíl·lula, les cèl·lules es diferencien en trofoblasts extravílics intersticials que envaeixen la decidua i una part del miometri, o bé en trofoblasts extravillosos endovasculars que remodelen els vasos materns. A la via vallosa, les cèl·lules del citotrofoblast (CT) es fusionen amb una capa de sincittiotrofoblast multinucleada (SCT) que cobreix tota la superfície de la placenta. 31 Aquest sinctiu està en contacte directe amb la sang materna i facilita així l’intercanvi de nutrients, residus i gasos entre els sistemes matern i fetal. S’ha proposat implicar en l’etiologia de la PE una diferenciació defectuosa per TC i SCT. 32

Per estudiar l'expressió de miRNA durant la diferenciació de trofoblastos vellosos, es va utilitzar un model in vitro establert que recapitula la diferenciació de les cèl·lules CT a SCT i l'expressió miRNA perfilada mitjançant seqüenciació d'ARN petit de nova generació. Aquesta anàlisi va revelar dos miRNAs relacionats (miR455-5P / -3P) que van ser regulats reproductiblement després de la diferenciació de TC a SCT. Els resultats de les anàlisis de la predicció i la validació de l'objectiu suggereixen que miR455-3P restringeix una resposta d'hipòxia que altrament impediria la diferenciació de TC a SCT. És important destacar que l'expressió de miR455 es va descartar significativament en 15 casos de PE en comparació amb 14 controls sanitaris de donants, mentre que els nivells d'altres miRNAs específics de placenta no van ser afectats. Per tant, miR455 miRNAs són biomarcadors potencials per al diagnòstic precoç d’embarassos de risc.

Resultats

Reconstitució in vitro de citotrofoblast per diferenciació de sincitotrofoblastos

Com que la placenta és un òrgan complex i heterogeni, l'estudi molecular detallat dels mecanismes subjacents a la biologia placentària és molt difícil, si no és impossible. Per tant, l’ús de models cel·lulars adequats és avantatjós. Per estudiar miRNAs durant la diferenciació de cèl·lules de trofoblast vellós, vam explotar la línia cel·lular establerta com a CT (BeWo). S'ha demostrat que les cèl·lules BeWo sincialitzen després del tractament amb forskolina (FSK), un activador d'adenilat ciclasa i un inductor cíclic AMP (Figura 1a). De fet, la tinció de cèl·lules tractades amb control de DAPI juntament amb un anticòs que reconeix el marcador de membrana plasmàtica E-cadherina va confirmar que les cèl·lules BeWo estan mononucleades. Tot i això, el tractament amb 10 μ M FSK va afavorir la formació de cèl·lules multinucleades, demostrant així la formació de SCT (figura 1b).

Image

miR455 és induït a la sincitialització in vitro . ( a ) Esquema esquemàtic de la diferenciació de citocitofonia (sincitiotrofoblast (SCT)). ( b ) Fusió de cèl·lules BeWo després del tractament amb FSK. Les cèl·lules es van fixar i es van inmunodistribuir mitjançant anticorp anti-E-cadherina (verd). Els nuclis es van contrarestar amb DAPI (blau). Panell esquerre: Les cèl·lules de BeWo van ser tractades amb vehicle (DMSO) durant 48 hores i es van mantenir com a cèl·lules mononucleades (CT). Panell dret: les cèl·lules van començar a fusionar-se després de 48 hores de tractament amb FSK, produint cèl·lules multinucleades (SCT) (fletxa blanca). Barra d’escala, 100 μ m ( c ) Expressió de marcadors SCT. L’ARN es va extreure en diferents moments després del tractament amb FSK. els nivells de mRNA de tres gens específics SCT es van mesurar per qRT-PCR. Les dades es van normalitzar a l'ARNm RPLP0 i es van comparar als tractaments de control (valor mitjà ± SEM de tres experiments independents). ( d ) inducció de miR455 en SCT vers CT. Després de 48 h de control o tractament amb FSK, es va extreure ARN total i es van obtenir petits ARN sotmesos a seqüenciació de gran rendiment. Els nivells de miRNA normalitzats de cèl·lules tractades amb FSK i controlades es representen com a escala de log 2 en els eixos x i y, respectivament. Cada miRNA està representat per una creu. Els ARNm miR455 degradats estan indicats amb creus vermelles. Es mostra el resultat d’una rèplica biològica representativa. ( e i f ) La inducció plegada de miR455-3P (E) i -5P (F) després de 48 h de tractament amb FSK es va determinar mitjançant seqüenciació d'ARN petita o qRT-PCR (valor mitjà ± SEM de quatre i tres experiments independents, respectivament) . ( g ) Estructura del puny de la fitxa del precursor pre-miR455. ( h ) Anàlisi d'expressió de pri-miR455, miR455 i del gen host COL27A1 . L’ARN es va extreure als punts de temps indicats després del tractament amb FSK i es va analitzar per qRT-PCR mitjançant assaigs TaqMan. Les dades es van normalitzar a l'ARNm d'U6 o a l'ARNm RPLP0 i es van comparar als tractaments de control (valor mitjà ± SEM de tres experiments independents)

Imatge a mida completa

Per confirmar encara més la transició de CT a SCT al tractament amb FSK, vam supervisar l’expressió de gens induïts durant la sincitialització mitjançant RT-PCR quantitativa. L’hormona gonadotropina beta coriònica (CGB) és un marcador de la formació de SCT. El tractament amb FSK va produir un augment gradual dels nivells d’ARNm de CGB fins a un màxim després de 60 h. De la mateixa manera, l'expressió de ERVFRD-1 i MFSD2A va ser fortament induïda en el tractament amb FSK (Figura 1c). ERVFRD-1 és un gen retroviral endogen que codifica per a la proteïna sincytin2 i codifica MFSD2A per al receptor de la sincitina 2. Les dues proteïnes són essencials per a la sincitialització. 33, 35 Aquests resultats confirmen la inducció efectiva de la sincitialització en el tractament amb FSK i validen les cèl·lules BeWo com a model adequat per estudiar la diferenciació de TC a SCT.

miR455 s'expressa diferencialment durant la sincialització

Per investigar si el procés de sincitialització va acompanyat de canvis en l’expressió del miRNA, vam aïllar petits ARNs de quatre experiments de diferenciació in vitro independents i vam generar biblioteques per a la seqüenciació d’il·lumina. Després de processar les dades de seqüenciació i filtratge de miRNAs anotats a miRBase (//www.mirbase.org/), es van comparar els perfils d’expressió de miRNA de les diferents rèpliques biològiques. L’expressió de microRNA estava altament correlacionada entre les quatre rèpliques biològiques, tant per a cèl·lules tractades amb FSK com per a FSK (figura suplementària 1). Confirmant l’origen trofoblàstic de la línia cel·lular BeWo, vam trobar que el 50% de tots els miRNA seqüenciats a partir de cèl·lules controlades o amb FSK eren derivades del clúster cromosoma-19-miRNA (C19MC) (Taula suplementària S1). C19MC codifica per a 59 miRNAs que s’expressen principalment en placenta humana. La comparació de l’expressió de C19MC en cèl·lules tractades amb FSK- versus controlades no mostrà cap diferència significativa en l’expressió d’aquests miRNAs específics de placenta (Taula suplementària S1). A més, els perfils d'expressió de miRNA generals eren notablement similars en mostres de control i tractament de FSK (Figura 1d i Figura Suplementària 1). No obstant això, es van observar nivells elevats dels miRNAs miR455-3P i miR455-5P de forma constant en cèl·lules tractades amb FSK. Per validar aquesta observació, es va valorar l'expressió miR455-3P i miR455-5P mitjançant qRT-PCR mitjançant assajos de TaqMan validats. En consonància amb les petites dades de seqüenciació d’ARN, es van millorar els nivells de miR455-3P i miR455-5P ca. cinc vegades quan es van tractar les cèl·lules amb FSK durant 48 h (Figures 1e i f).

Els miRNAs madurs miR455-3P i miR455-5P provenen d’un fil de pèl pre-miRNA codificat a l’intron 10 del gen de col·lagen COL27A1 (figura 1g i figura suplementària 2). Així, els nivells elevats dels dos miRNA madurs poden ser el resultat de la transcripció més gran del gen hoste COL27A1 . Consistent amb això, vam observar un fort augment dels nivells d'ARNm de COL27A1 després del tractament amb FSK de cèl·lules BeWo. Els nivells d'ARNm de COL27A1 van ser els més alts les 24 h després del tractament amb FSK i van disminuir gradualment després (Figura 1h). És important destacar que es va observar un perfil d’expressió molt similar per a la transcripció del precursor pri-miR455 al tractament amb FSK, tot i que no tan alt com el nivell màxim del mRNA de COL27A1 (Figura 1h). A més, es va produir un augment en els ARNm miR455-3P madurs i miR455-5P més tard del transcripció del precursor pri-miR455. Es va observar un augment màxim de miR455 ca. madurs. 48 h després del tractament amb FSK, concomitant amb un descens de la prioritat de miR455 (Figura 1h). Aquests resultats demostren que el tractament de cèl·lules BeWo amb FSK estimula l'expressió del gen COL27A1 i per tant condueix a una major producció de pri-miR455. Per tant, tot i que no es pot descartar un augment de processament de precursors o estabilitat de miRNA, l’elevació observada en miR455 madur després del tractament amb FSK de cèl·lules BeWo es pot atribuir a una major expressió del gen COL27A1 .

Desregulació de miR455 en placentes de pacients amb PE

S'ha proposat que la PE comporti una diferenciació irregular de TC a SCT. 32 Per investigar si miR455 s’expressa en placenta i que pot ser regulat erròniament en PE, es van recollir mostres de placenta a partir de 15 casos de PE i 14 controls sanitaris de donants. Les principals característiques clíniques dels pacients es resumeixen a la taula 1. En particular, l’edat materna, l’índex de massa corporal i el percentatge de nullitat no eren significativament diferents entre els dos grups de pacients. No obstant això, els pacients amb PE presentaven una tendència al retard de creixement intrauterí, augment de la pressió arterial (sistòlica i diastòlica) i proteinúria, i van donar a llum, en mitjana, 4 setmanes abans que el grup control. Les placentes van ser dissecades de l'arbre de les vil·les immediatament després del part. Per compensar la variabilitat intra-placentària, vam extreure ARN total de 3-4 mostres independents per placenta (Figura 2a), donant un total d’almenys 45 mostres d’ARN i 42 de RNA de control.

Taula completa

Image

miR455 i miR210 estan desregulades en placentes de preeclampsia (PE). ( a ) Esquema esquemàtic del processament de placenta. Circa 3-4 peces (caixa vermella) es van disseccionar de la part interior de cada placenta (X) per limitar la contaminació materna. Es va extreure ARN total de cada peça de placenta (X.1 a Xn) i nivells d’expressió miRNA mesurats en tres rèpliques tècniques per qRT-PCR mitjançant assaigs TaqMan. ( b ) Expressió snRNA U6 en placentes PE i control (Ctrl). Els nivells de snRNA U6 van ser mesurats per TaqMan qRT-PCR. El valor del llindar de cicle (Ct) obtingut per al snRNA U6 es representa com a representació del percentil del 5 al 95 del percentatge de la caixa del bigot. El valor P es va calcular mitjançant la prova de Mann – Whitney. ( c ) miRNAs expressats en placentes. L’expressió de sis miRNAs seleccionats va ser determinada per TaqMan qRT-PCR en placentes de control. Per a cada miRNA, l'expressió es va normalitzar a snRNA U6 i es va representar a una escala log2 mitjançant una representació del percentil del 5è-95è percentil de la caixa del bigot. ( d ) MicroRNAs que no estan expressats de forma diferent en control respecte a les placentes PE. ( e ) Els nivells de miR-210 són més elevats en PE que les placentes de control. ( f ) els nivells de miR-455 són menors en PE que les placentes de control. ( d – f ): els valors P es van calcular mitjançant la prova de Mann – Whitney

Imatge a mida completa

L’anàlisi qRT-PCR va revelar que els nivells d’expressió d’ARN petit (ARNN) nuclear U6 no eren significativament diferents entre els dos grups de pacients (Figura 2b). A més validant la qualitat de les nostres mostres, vam detectar miR526B, miR518B i miR517A, tres miRNAs representatius codificats en el C19MC específic de placenta, així com miR210, un miRNA mostrat anteriorment que estava regulat en placenta de pacients PE 26, 27, 28 (Figura 2c). És important destacar que també es van detectar miR455-3P i miR455-5P, que eren molt més abundants que el snRNA U6 i el miR210 en les mostres d’ARN control (figura 2c).

La comparació de l’abundància de miRNA en mostres dels dos grups de pacients no va mostrar diferències significatives en miR526B, miR518B o miR517A, demostrant que l’expressió del C19MC no es va veure afectada notablement en pacients amb PE (figura 2d). Tot i això, miR210 es va registrar de manera significativa en placenta dels pacients amb PE (figura 2e), d'acord amb els informes anteriors. En canvi, els nivells de miR455-3P i miR455-5P van ser significativament més baixos en PE que en mostres de control (figura 2f).

En resum, els miRNA madurs miR455-3P i miR455-5P s’expressen en placenta humana. Si bé l'expressió de miRNAs de la C19MC específica de placenta no es va veure afectada, els nivells de miRNA de miR455 eren significativament més baixos en placenta per part dels PE que els pacients control. Per contra, miR210 era més abundant en mostres de PE.

Els miR455 miRNA formen part de miRISC funcional

Com a part del miRISC, els miRNAs madurs es combinen de bases per apuntar els ARNm i dirigir la seva repressió. Com que miR455-3P i miR455-5P són relativament abundants tant en cèl·lules BeWo com en mostres de placenta, és possible que tinguin un paper important en la regulació de vies rellevants per a la fisiologia de placenta. Per provar si miR455-3P i miR455-5P formen part de miRISC funcional i per verificar els objectius previstos de miR455, vam adoptar un assaig de reporter d'activitat de miRNA basat en luciferasa. 38 Aquest assaig inclou un vector d’expressió de mamífers que codifica els gens reporters de la renilla luciferasa (RL) i la firefly luciferase (FL). El gen del reporter RL es fusiona amb una seqüència objectiu miRNA putatiu i per tant supervisa l’activitat del miRNA. El gen del reporter FL s’utilitza com a control de normalització (figura 3a).

Image

miR455 és part del miRISC funcional a les cèl·lules BeWo. ( a ) Esquema del test de doble luciferasa utilitzat en aquest estudi. Les seqüències complementàries exactes de miR455-3 P i -5P, o els 3′UTR de vuit gens diana potencials de miR455, es van clonar 3 'a la renilla luciferasa (RL) ORF (carrils superiors). S’indica la posició dels llocs d’unió potencials de miR455-3P (vermell) o miR455-5P (blau). Les cèl·lules BeWo van ser transfectades i tractades durant 48 hores amb FSK (nivells alts de miR455) o DMSO (nivells baixos de miR455). ( b ) La FSK no té cap efecte sobre l'expressió de renilla luciferasa. El vector sense seqüències objectiu clonades 3 'de renilla va ser transfectat en cèl·lules BeWo. Després de 48 h de tractament, les cèl·lules van ser lisades i es van mesurar les activitats de RL i FL. Les relacions RL / FL es van calcular per a cèl·lules tractades amb DMSO i FSK. Els valors P es van calcular mitjançant la prova T no paramètrica. ( c i d ) Els vectors amb seqüències diana miR455-3P o -5P clonats 3 'de renilla van ser transfectats en cèl·lules BeWo. Les relacions RL / FL es van calcular per a cèl·lules tractades amb DMSO i FSK. Els valors P es van calcular mitjançant la prova T no paramètrica. ( e i f ) Els 3'UTRs de vuit dianes potencials miR455 es van clonar al plasmidi de doble luciferasa. Un dia després de la transfecció, es van tractar les cèl·lules durant 48 hores amb FSK o DMSO. Les relacions RL / FL es van calcular per a cèl·lules tractades amb DMSO i FSK. Es va calcular la repressió percentual dels respectius periodistes miRNA normalitzant les relacions RL / FL després del tractament amb FSK a les racions RL / FL després del tractament control. Els valors P es van calcular mitjançant la prova T no paramètrica

Imatge a mida completa

Primer vam transfectar cèl·lules BeWo amb un plasmidi reporter que no tenia seqüències diana miRNA. Després de la transfecció, es van tractar les cèl·lules amb DMSO o FSK per induir la sincitialització. Es van observar relacions d’activitat RL / FL que no eren significativament diferents en cèl·lules tractades amb control i FSK, demostrant que l’activitat de la luciferasa no està afectada pel procés de sincitialització ni pel tractament FSK per si mateix , a falta d’una seqüència objectiu miR455 (figura 3b ). No obstant això, l'activitat de RL es va reduir significativament amb el tractament amb FSK quan el reporter RL es va fusionar a una seqüència objectiu miR455-3P completament complementària (Figura 3c). De la mateixa manera, la RL fosa amb una seqüència objectiu miR455-5P complementària es va reprimir després del tractament amb FSK (Figura 3d). Aquests resultats demostren que ambdós miR455 miRNA formen part del miRISC funcional a les cèl·lules BeWo i que el test de l'activitat del miRNA reporta de forma fiable l'activitat del MiR455-RISC.

L’ARNm MUC1 és un objectiu fisiològic de miR455-3P

Per identificar ARNm objectius de miR455 objectius, vam utilitzar el programari miRNA de predicció de target miRNA. Compilant llistes d’objectius potencials per a miR455-3P i -5P, es van observar almenys vuit gens que s’han relacionat amb la senyalització d’hipòxia (figura 3a). Això va despertar el nostre interès perquè l’expressió de miR210 és estimulada per factors inductibles de l’hipòxia (HIF), 40, 41, 42, cosa que suggereix una relació relacionada amb l’hipòxia potencial entre els tres miRNA que vam trobar expressats de manera diferent en mostres de PE.

Per validar els ARNm miR455-3P i -5P prevists, primer es van realitzar assajos de reporter de miRNA dual de luciferasa a les cèl·lules de BeWo. Vam fusionar els 3'UTR complets dels ARNm previstos al reporter RL i vam provar la repressió mediada per miR455 en FSK versus condicions de control (Figura 3a). A diferència del reporter RL fusionat a un lloc d’enllaç miR455 completament complementari (Figures 3c i d), el tractament amb FSK no va suposar una repressió significativa de RL quan es va fusionar als 3 ′ UTR de CUL3, EID1, SIRT1 o STEAP3 (Figures 3e i f). Tot i això, els 3'UTRs de EGLN2, MUC1, FIH1 o ARNT van produir una repressió significativa de RL al tractament amb FSK (Figures 3e i f). Aquests resultats validen els llocs previstes d’enllaç de miR455-5P als 3’UTR d’ARNT i els llocs d’enllaç de miR455-3P als 3′UTR de EGLN2, MUC1 i FIH1.

Per provar si els ARNm EGLN2, MUC1, FIH1 i ARNT endògens estan sota control negatiu pels miRNAs miR455, es va avaluar els nivells de mRNA i proteïnes mitjançant qRT-PCR i Western blotting, respectivament. Per EGLN2 i ARNT, ni els ARNm ni els nivells de proteïna van canviar significativament després del tractament amb FSK de cèl·lules BeWo (Figura 4a i Figura Suplementària 3). FIH1 només es va reprimir de manera constant (figura 4a i figura suplementària 3). En canvi, la MUC1 va ser fortament reprimida tant a nivell d’ARNm com a proteïna (Figures 4a i b i Figura Suplementària 3). Per confirmar la repressió de l'ARNm MUC1 mediada per miR455-3P independentment del tractament amb FSK, vam transfectar cèl·lules BeWo amb miRNAs sintètics de miR455. Com era d’esperar, els nivells d’ARNm de MUC1 i proteïnes es van reduir per transfecció de miR455-3P sintètic, però no de miR455-5P (figures 3c i d). Així, arribem a la conclusió que l'ARNm MUC1 és un objectiu miR455-3P de bona fe que està fortament reprimit durant la sincitialització induïda per FSK de cèl·lules BeWo.

Image

El MUC1 és un objectiu de bona fe de miR455-3P a les cèl·lules BeWo. ( a ) Expressió de mRNAs miR455 potencials en cèl·lules BeWo tractades amb FSK. QRT-PCR es va analitzar l'expressió dels ARNm diana miR455 potencials indicats. Els valors es van normalitzar a RPLP0 i es van mostrar en relació amb les cèl·lules tractades amb DMSO. ( b ) Els nivells de proteïnes MUC1 es redueixen mitjançant tractament amb FSK. Els nivells de proteïna MUC1 i TBP es van analitzar mitjançant western blotting 48 h després del tractament. ( c i d ) MUC1 és reprimit per miR455-3P, però no per miR455-5P. Les cèl·lules BeWo van ser transfectades amb miRNAs sintètics a dues concentracions (5 i 20 nM). Es van recollir mostres d’ARN i proteïnes durant 48 h després de la transfecció. Els nivells de mRNA de MUC1 i proteïnes es van determinar mitjançant qRT-PCR ( c ) i western blot ( d ), respectivament. Es presenta a d . Un representant western blot d'una transfecció amb miRNA sintètic de 20 nM. TBP va servir de control de càrrega

Imatge a mida completa

miR455-3P limita la senyalització d'hipòxia mediada per HIF2A

S'ha atribuït a MUC1 activació, així com activitats repressives en la senyalització d'hipòxia. 43, 44 En consonància amb els informes que descriuen MUC1 com a activador de la HIF, vam trobar que la derrota mediada per siRNA del mRNA MUC1 va donar lloc a nivells de proteïnes HIF2A (EPAS1) reduïts, però no a l’inrevés , situant l’activitat MUC1 aigües amunt de HIF2A (Figura 5a i Suplementari). Figures 4A i B). HIF2A és un factor de transcripció que indueix l'expressió del gen objectiu en resposta a una baixa concentració d'oxigen. 40, 45 Així, MUC1 afecta positivament les respostes a l’hipòxia produïda per HIF2A a les cèl·lules de BeWo. Intrigadament, miR210 és un objectiu molt conegut dels HIF2A 40, 42 i, per tant, s'espera que respongui a la regulació MUC1. De fet, es va observar una disminució dels nivells de miR210 no només després del cop de HIF2A, sinó també del cop de MUC1 (figura 5b). Com que MUC1 és reprimit per miR455-3P, els nivells de miR210 es mantenen controlats indirectament per miR455-3P (figura 5c).

Image

MUC1 i HIF2A estan desregulats en placentes PE. ( a ) HIF2A està regulat positivament per MUC1. Les cèl·lules BeWo es van transfectar amb siRNAs contra l'ARNm HIF2A o MUC1 a dues concentracions (5 i 20 nM) i amb un siRNA de control negatiu All Star. A les 48 h posttransfecció, es van recol·lectar cèl·lules i es van analitzar mostres de proteïnes mitjançant taquilla occidental. ( b ) el miR210 està regulat per HIF2A i MUC1. Es van recollir cèl·lules 48 h posttransfecció i expressió miR210 analitzades per assaigs de TaqMan. Els valors es van normalitzar a l'expressió snRNA U6 (valor mitjà ± SEM de tres experiments independents). ( c ) Representació esquemàtica de la via de senyalització miR455-3 P / miR210. ( d ) Els nivells de proteïnes MUC1 i HIF2A estan regulats a les placentes PE. Les proteïnes es van extreure de dues placentes de control i dues de PE i es van analitzar. Les taques occidentals es van sondar seqüencialment amb anticossos reconeixent les proteïnes indicades. Es van utilitzar dos anticossos diferents per MUC1. Els anticossos i els pesos moleculars de cada isoforma proteica MUC1 estan indicats a esquerra i dreta, respectivament

Imatge a mida completa

Els resultats anteriors són coherents amb els nivells de miR210 i miR455 que hem trobat correlacionats negativament en mostres de placenta de pacients de PE i control (Figures 2e i f) i suggereixen que els nivells de MUC1 i HIF2A són més elevats en PE que en mostres de control. Com es va informar anteriorment, vam trobar que HIF2A s’expressa en placenta però a nivells marcadament més alts en PE que en mostres de control (figura 5d). És important destacar que també hem detectat nivells més elevats de proteïnes MUC1 a la placenta de pacients amb PE. Consistent amb la repressió mediada per miRNA del mRNA MUC1 , diferents isoformes de proteïnes MUC1 van augmentar en la mateixa mesura (Figura 5d). En conclusió, els pacients amb PE presenten una senyalització d'hipòxia mediada per HIF2A activada en placenta, la qual cosa pot ser causada per l'expressió desregulada de miR455-3P.

Discussió

La PE és un trastorn greu relacionat amb l’embaràs en el 2-5% dels embarassos a l’Occident, però complica fins a un 10% dels embarassos als països en desenvolupament, on sovint l’atenció d’emergència és insuficient o falta. En conseqüència, la PE és la principal causa de mortalitat i mortalitat materna i fetal / neonatal a tot el món. Un dels objectius més importants en obstetrícia és, doncs, la identificació precoç de pacients amb un risc més gran de patir infecció. Aquest estudi demostra que l’ús de models cel·lulars pot contribuir molt a assolir aquest objectiu. A partir del nostre treball previ en una línia cel·lular de cultiu de teixits trofoblastos, vam descobrir una expressió alterada de tres miRNA humans i dues proteïnes en placenta de pacients amb PE. Estudis mecànics d’aquests factors indiquen la senyalització d’hipòxia potencialment errònia que podria contribuir a la patogènesi de la PE. A continuació, tractem la importància dels nostres resultats per a la fisiologia placentària i per al desenvolupament de proves per diagnosticar embarassos amb risc.

Estudis anteriors destinats a la identificació d’expressió irregular de miRNAs en placenta de pacients amb PE van revelar un augment de nivells de miR210. 26, 27, 28, 29, 30, 36, 37 Els nostres resultats són consistents amb aquestes troballes i, per tant, validen miR210 com a biomarcador robust de PE. A més de miR210, hem identificat miR455 com un miRNA pronòstic més. És important destacar que, a diferència dels nivells elevats de miR210, els nivells de miR455-3P i miR455-5P eren significativament més baixos en placenta PE que en els controls. Una correlació tan negativa pot ser avantatjosa per al desenvolupament d'assajos diagnòstics. Les proves potencials que valoren les ràtios de miR210 / miR455-3P i miR210 / miR455-5P poden predir la PE amb alta especificitat (figura suplementària 5). L’ús de miRNAs com a marcadors de diagnòstic és interessant per dos motius. Primer, es poden desenvolupar assajos basats en RT-PCR altament sensibles. En segon lloc, s’han localitzat àcids nucleics lliures de cèl·lules, inclosos miRNAs, al plasma matern. 46 Notablement, s'ha suggerit la presència de miR455-3P en la circulació de la sang. 47 Així, la mesura de les proporcions de miR210 / miR455 al plasma matern pot oferir una prova no invasiva, altament específica i sensible del risc de PE en l’embaràs precoç.

A diferència de la majoria d’altres miRNAs, el pinç pre-miR455 produeix dos miRNAs madurs, miR455-3P i miR455-5P. Demostrem que ambdós miR455 miRNA formen part de miRISC funcional a les cèl·lules BeWo, que són relativament abundants en placenta i que la seva expressió augmenta durant la sincitialització de trofoblastos in vitro . Així, és probable que els dos miR455 miRNA estiguin implicats en circuits reguladors importants per al desenvolupament i la fisiologia de la placenta.

Se sap ben poc sobre les possibles activitats reguladores de miR455. 48, 49, 50, 51 Mentre que els ARNm diana fisiològics de miR455-5P continuen sent desconeguts, hem identificat l'ARNm MUC1 com a objectiu miR455-3P de bona fe . Corroborant els nostres resultats, s'ha demostrat recentment que MUC1 també està regulat per miR455-3P a les cèl·lules pulmonars. Curiosament, tant les cèl·lules pulmonars com les trofoblastes estan exposades a canvis en entorns d’oxigen i, per tant, hi podrien existir mecanismes de protecció contra les fluctuacions de la tensió d’oxigen. La nostra constatació que miR455-3P provoca una disminució dels nivells de proteïna HIF2A indirectament reprimint l'ARNm de MUC1 (figura 5a) suggereix fortament que miR455-3P pot contribuir a tal buffering.

La sincitialització insuficient de cèl·lules CT de villus produeix perfusió placentària subòptima i, per tant, hipòxia crònica, que és una característica de la PE. En les primeres deu setmanes de gestació, el concepte es troba en una atmosfera relativament hipòxica 54, 55 i restringir l'activació d'una resposta d'hipòxia que pot contrarestar la sincitialització seria de vital importància. Així, és possible que miR455-3P actuï com un reostat que freni una resposta d'hipòxia que d'una altra manera podria impedir la diferenciació de TC a SCT. Importantly, the reduced miR455 expression in PE samples is unlikely to be simply a consequence of low oxygen tension, because cultivation of BeWo cells under hypoxic conditions did not cause a significant change in miR455 expression (data not shown). Therefore, miR455 expression per se may already be irregular, early in the pregnancy of PE patients and thus contribute to pathogenesis. In this respect, it will be very interesting to further investigate regulation of COL27A1 , the collagen protein-coding gene that hosts the miR455 gene.

In conclusion, although the idea that reduced expression of miR455 is causally linked to the development of PE is intriguing, further experimental evidence to support this model is awaited. Nonetheless, we believe that efforts to develop diagnostics using miRNAs as biomarkers to predict PE should be pursued, irrespective of further mechanistic insight into miR455 function.

Informació complementària

Fitxers Excel

  1. 1.

    Taula suplementària 1

  2. 2

    Taula complementària 2

Documents de paraula

  1. 1.

    Dades complementàries

Glossari

miRNA

microARN

PE

preeclampsia

Nou Testament

nucleòtid

pri-miRNA

primary microRNA

pre-miRNA

precursor microRNA

miRISC

microRNA induced silencing complex

UTR

regió no traduïda

C14MC

chromosome 14 microRNA cluster

C19MC

chromosome 19 microRNA cluster

CT

cytotrophoblast

SCT

syncytiotrophoblast

FSK

forskolin

DMSO

dimethylsulfoxid

DAPI

4′, 6′-diamidino-2-phénylindole

CGB

beta chorionic gonadotropin hormone

snRNA

small nuclear RNA

RL

renilla luciferase

FL

mosquetó luciferasa

h

hours

HIF

hypoxia inducible factor

TBP

TATA binding protein

Ctrl

control

Ct

cycle threshold

RT-PCR

reverse transcription-polymerase chain reaction

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)