Mirna-210 modula un canvi de metabolisme de l’energia cel·lular induïda pel níquel mitjançant la repressió de les proteïnes del conjunt de ferro i sofre clúster iscu1 / 2 en cèl·lules neuro-2a | mort i malaltia cel·lular

Mirna-210 modula un canvi de metabolisme de l’energia cel·lular induïda pel níquel mitjançant la repressió de les proteïnes del conjunt de ferro i sofre clúster iscu1 / 2 en cèl·lules neuro-2a | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Metabolisme energètic
  • miRNAs
  • Síndromes de neurotoxicitat

Resum

El canvi de metabolisme de l’energia cel·lular, caracteritzat per la inhibició de la fosforilació oxidativa (OXPHOS) i la millora de la glicòlisi, està implicat en la neurotoxicitat induïda pel níquel. El microRNA-210 (miR-210) està regulat pel factor de transcripció induïble de la hipòxia-1 α (HIF-1 α ) en condicions hipòxiques i controla el metabolisme de l’energia mitocondrial reprimint la proteïna del conjunt de ferro i sofre (ISCU1 / 2). ISCU1 / 2 facilita el muntatge de cúmuls de ferro-sofre (ISCs), els grups protètics crítics per a les reaccions de reducció de l’oxidació mitocondrial. Aquest estudi tenia com a objectiu investigar si miR-210 modula alteracions en el metabolisme energètic després de l'exposició al níquel mitjançant la supressió d'ISCU1 / 2 i la inactivació d'enzims metabòlics que contenen ISCs. Es va determinar que l'exposició al NiCl 2 condueix a una acumulació significativa de HIF-1 α , més que a HIF-1 β , a les cèl·lules Neuro-2a. La sobreexpressió del miR-210 i la baixada de la ISCU1 / 2 es van observar de forma dependent de la dosi i del temps. Els assaigs de guany de funció i pèrdua de disfunció van revelar que miR-210 va mediar la supressió ISCU1 / 2, alteracions del metabolisme energètic i la inactivació enzimàtica metabòlica que conté ISC després de l'exposició al níquel. A més, l'impacte de miR-210 sobre els enzims metabòlics que contenien ISC era independent de la regulació cel·lular del ferro. En general, aquestes dades suggereixen que la repressió del miR-210 sobre ISCU1 / 2 pot contribuir a alteracions en el metabolisme de l’energia després de l’exposició al níquel. Una millor comprensió de l’impacte del níquel sobre el metabolisme de l’energia cel·lular pot facilitar l’elucidació dels mecanismes pels quals el níquel afecta la salut humana.

Principal

Els compostos de níquel (Ni) són contaminants ambientals de gran distribució i són perillosos per a la salut pública. 1 Tot i que es desconeix el mecanisme exacte de toxicitat induïda per Ni, les proves creixents indiquen que les respostes mímiques de l'hipòxia, que estan mediades principalment per l'estabilització del factor-1 α (HIF-1 α ) hipoxia, poden contribuir als efectes adversos de Ni al cos humà. 2, 3 L’activació de gens objectiu HIF-1 α , inclòs l’inhibidor d’activadors del plasminogen (PAI-1), el factor de creixement endotelial vascular (VEGF) i la quimiocina CXC, estan implicats en trastorns pulmònics induïts per pols Ni. La reducció de 4, 5 de HIF-1 α de IL-6 en cèl·lules endotelials primàries humanes es produeix en reaccions al·lèrgiques de contacte de Ni. 6 A més, l’angiogènesi regulada amb HIF-1 i el silenciament gènic poden contribuir a la carcinogènesi induïda pel Ni. 2 Les investigacions addicionals de respostes de mímica d'hipòxia induïda pel Ni poden dilucidar els mecanismes de toxicitat de Ni en humans.

Les alteracions del metabolisme energètic, caracteritzades per la repressió del cicle d’àcid tricarboxílic (TCA), el transport d’electrons mitocondrials i la fosforilació oxidativa (OXPHOS), però la millora de la glicòlisi, són respostes adaptatives típiques sota estrès induït per l’hipòxia. Curiosament, aquestes alteracions depenen del HIF-1 α i sorgeixen en condicions normògiques si el HIF-1 α cel·lular està estabilitzat per agents químics. 8, 9 Tot i que el canvi metabòlic afavoreix la resistència i la supervivència de les cèl·lules en condicions hipòxiques, aquest canvi contribueix als efectes nocius del Ni. Chen i Costa 11 van informar que el Ni disminueix l’activitat dels enzims que contenen ferro cel·lular, inhibeix l’OXPHOS i augmenta l’activitat glicolítica cel·lular. L’adaptabilitat inductible de les cèl·lules en condicions hipòxiques facilita la seva transformació maligna després de l’exposició crònica a Ni. 2 A més, la reducció del subministrament d’energia comporta la disfunció de teixits amb alta demanda d’energia, inclòs el sistema nerviós. En el nostre estudi anterior, la ingestió de compostos Ni solubles en ratolins va donar lloc a la pertorbació del metabolisme aeròbic acompanyada de canvis neurobutorials. Per tant, la investigació de la relació entre l'estabilització HIF-1 α i l'alteració del metabolisme energètic és una estratègia ideal per a dilucidar el mecanisme de toxicitat de Ni.

Les molècules de microRNA endògenes (miRNAs) són mediadors importants de nombrosos processos cel·lulars, inclosa la resposta a l'hipòxia. 13 MicroRNA-210 (miR-210), que és induït per HIF-1 α durant la hipòxia, és un dels miRNAs més sensibles a l’hipòxia i és un factor ideal que modula la resposta a l’hipòxia. 14 estudis recents han investigat la repressió del miR-210 sobre les proteïnes de muntatge de clúster de ferro-sofre (ISC), ISCU1 i ISCU2, la regió de la qual no es tradueix (UTR) conté un lloc d’unió molt conservat per a miR-210. 15, 16 A les cèl·lules de mamífers, l’ISCU1 es troba al citosol, mentre que l’ISCU2 es troba al mitocondri. ISCU1 / 2 és una chaperona clau per al muntatge d’ISC cel·lulars i el transport a enzims responsables de la respiració mitocondrial i la producció d’energia. Aquests enzims inclouen l'aconitasa, que és integral del cicle TCA, i els complexos respiratoris mitocondrials (complexos I, II i III), que medien el transport d’electrons mitocondrials. Per tant, la supressió d’ISCU1 / 2 condueix a la inactivació d’enzims que contenen ISC per trastorn metabòlic ISC i, en definitiva, inhibeix la respiració mitocondrial. L'eix de regulació que inclou HIF-1 α , miR-210 i ISCU1 / 2 media els processos de metabolisme de l'energia mitocondrial que responen a l'hipòxia en diferents tipus de cèl·lules. 18, 19, 20, 21 En comparació amb l’hipòxia, l’exposició al Ni pot alterar l’homeòstasi de ferro cel·lular que és essencial per al metabolisme dels ISC. 22 És d'interès l'avaluació de si la modificació dels estats cel·lulars del ferro està implicada en esdeveniments metabòlics mediats pel Ni.

Per tant, el present estudi tenia com a objectiu investigar si la repressió del miRNA-210 sobre ISCU1 / 2 subratlla un canvi de metabolisme energètic induït pel Ni. La regulació superior del miR-210 mediada per Ni va reprimir l’expressió d’ISCU1 / 2, va inhibir els enzims ISC típics i va canviar el metabolisme mitocondrial avall. Els nostres resultats indiquen que miR-210 és essencial i suficient per modular les alteracions del metabolisme de l’energia cel·lular induïdes per Ni.

Resultats

Ni indueix estabilització HIF-1 α i expressió miR-210

Es van investigar les expressions de HIF i miR-210 induïdes per tractaments amb NiCl 2 en cèl·lules de Neuro-2a. Les cèl·lules van estar exposades a diferents concentracions de NiCl 2 (0, 0, 25, 0, 5 i 1 mM) durant 4 h o 1 mM de NiCl 2 durant diferents períodes de temps (0, 2, 4 i 8 h). L’anàlisi de Western blot va revelar que el tractament amb Ni va donar lloc a una estabilització evident de HIF-1 α, però no va canviar l’expressió de HIF-1 β (figures 1a i b). La sobreexpressió induïda pel Ni-miR-210, identificada per anàlisi qRT-PCR, es va observar en maneres dependents de la dosi i del temps (figures 1c i d). A més, els agents establerts que van estabilitzar HIF-1 α , deferoxamina (DFX) i CoCl 2, van augmentar l'expressió miR-210 després de 4 hores de tractament en cèl·lules Neuro-2a, tal com es presenta a la Figura 1e.

Image

El níquel indueix l'estabilització HIF-1 α i l'expressió miR-210. ( a i b ) Els nivells de proteïna HIF-1 α i HIF-1 β van ser detectats per western blot després de diferents tractaments amb NiCl 2 . Les estabilitzacions HIF-1 α induïdes pel níquel s'indiquen mitjançant la quantificació de la intensitat de la banda de blot occidental i les imatges típiques. ( c i d ) L’expressió miR-210 després de diferents tractaments amb NiCl 2 es va analitzar per qRT-PCR. La milloració induïda pel níquel de miR-210 depèn tant de la dosi com del temps. ( e ) Els agents ben establerts que van estabilitzar la HIF-1 α , DFX i CoCl 2 cel·lulars, també van augmentar l'expressió miR-210 després de 4 hores de tractament. La barra d'errors reflecteix el SEM d'almenys tres experiments independents. * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

L'expressió miR-210 induïda pel Ni reprimeix els nivells de proteïna ISCU1 / 2

Es va investigar els nivells de proteïna i transcripció de ISCU1 / 2 en cèl·lules amb diferents tractaments amb NiCl 2 . Els nivells de proteïnes de ISCU1 / 2 van disminuir en maneres de la dosi i del temps en cèl·lules que van estar exposades al NiCl 2 (Figures 2a i b). Es va identificar l’activació induïda pel Ni del fus HIF-1 α / miR210 / ISCU, que es va identificar com a estabilització de HIF-1 α , una sobreexpressió de miR210 i una repressió d’ISCU en diferents cèl·lules (Suplement Figures 1, 2 i 3). Els nivells de transcripció de ISCU1 / 2 no van ser significativament diferents entre les cèl·lules amb diferents tractaments amb NiCl 2 (Figures 2c i d). Per determinar si ISCU1 / 2 estava regulat per miR-210, el tipus salvatge i mutant (71-77 ACGCACA mutat a AGCGAGA) formes del lloc objectiu previst en el 3'-UTR d'ISCU1 / 2 (//www.targetscan .org / mmu_61 /) es van clonar en vectors del gen reporter de la luciferasa. La transfecció de la mímica miR-210 va reprimir l'activitat de la luciferasa que va interactuar amb el lloc objectiu previst de tipus salvatge miR-210. No obstant això, la transfecció del mímic miR-210 no va alterar l'activitat de la luciferasa que interaccionava amb el lloc objectiu mutant (figura 2e). Aquests resultats van verificar que miR-210 regula l'expressió d'ISCU1 / 2 en unir-se al lloc de destí previst al 3'-UTR d'ISCU1 / 2. L'anàlisi del nivell de proteïna en cèl·lules transfectades amb el mímic o inhibidor de miR-210 es va realitzar per establir encara més que ISCU1 / 2 era l'objectiu descendent de miR-210. En condicions d’exposició no Ni, la transfecció del mímic miR-210 (denotat com M) va suprimir el nivell de proteïna ISCU1 / 2 en comparació amb el del control del mímic (MC). A més, en condicions d’exposició al Ni (1 mM durant 4 h), la transfecció de l’inhibidor del miR-210 (I) va atenuar la regulació de baixada de l’ISCU1 / 2 induïda pel Ni en comparació amb la del control dels inhibidors (IC, figura 2f).

Image

L'expressió miR-210 induïda pel níquel reprimeix el nivell de proteïna ISCU1 / 2. ( a i b ) Els nivells de proteïna ISCU1 / 2 van disminuir després de diferents tractaments amb NiCl 2 . ( c i d ) Els nivells de transcripció de ISCU1 / 2 no canvien en cap condició d'exposició al níquel. ( e ) L'efecte de la miR-210 sobre ISCU1 / 2 es va avaluar utilitzant el test reporter de la luciferasa. La disminució de l'activitat de luciferasa en cèl·lules que es van co-transfectar amb construccions de tipus salvatge ISCU1 / 2 3'-UTR que contenen construccions i el mític miR-210 va indicar que ISCU1 / 2 era un gen objectiu de miR-210. ( f ) Western blotting va revelar els efectes del mímic miR-210 o transfecció d'inhibidors sobre els nivells de proteïna ISCU1 / 2. ISCU1 / 2 és reprimit pel mímic miR-210 en comparació amb el control del mímic (els dos carrils esquerre). Durant l’exposició al níquel, la inhibició del miR-210 conserva millor el nivell d’ISCU1 / 2 en comparació amb el control dels inhibidors (els dos carrils mitjans). L'efecte del níquel sobre el nivell ISCU1 / 2 també es va avaluar en cèl·lules no transformades (les dues vies dretes). Les sigles M, MC, I i IC indiquen la transfecció de mímica miR-210, control mímic, inhibidor de miR-210 i control inhibidor, respectivament. El signe "+" indica el tractament d'1 mM NiCl 2 durant 4 h, i el signe "-" indica el tractament de tristesa corresponent. La barra d'errors reflecteix el SEM d'almenys tres experiments independents. * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

L'expressió miR-210 induïda en Ni modula el canvi del metabolisme energètic

El canvi de metabolisme energètic induït pel Ni, caracteritzat per la inhibició de l’OXPHOS i l’augment de la glicòlisi, té un paper important en la neurotoxicitat i carcinogènesi mediada pel Ni. En el nostre estudi, la viabilitat de les cèl·lules Neuro-2a que van ser tractades amb 1 mM de NiCl 2, 10 mM 2-desoxi-D-glucosa (2-DG) o 25 μ M d’àcid bromopirúvic (BrPA) era equivalent als nivells de control. No obstant això, l'exposició al Ni combinada amb 2-DG o BrPA, ambdós inhibidors de la glicòlisi, van donar lloc a una citotoxicitat significativa en les cèl·lules Neuro-2a (Figura 3a). Les cèl·lules exposades a 1 mM de NiCl 2 durant 4 hores també van manifestar una baixa taxa de consum d’oxigen (OCR) (figura 3b). Per confirmar que el canvi de metabolisme energètic induït pel Ni va ser modulat per l’expressió miR-210, es van investigar els estats de metabolisme energètic de les cèl·lules que van ser transfectades amb mímic o inhibidor de miR-210 i tractades amb NiCl 2 . Les quantificacions d’OCR van revelar que el consum d’oxigen estava inhibit en cèl·lules que van ser transfectades amb mímica miR-210 o tractades amb NiCl 2 . La transfecció de l’inhibidor de miR-210 va alleujar la supressió de Ni per consum d’oxigen (figura 3c). La transfecció del mímic miR-210 va reduir la concentració d’adenosina-5'-trifosfat cel·lular (ATP) en condicions que no fossin Ni, mentre que la inhibició de miR-210 va atenuar l’esgotament de l’ATP causat per Ni (Figura 3d). L’hexokinasa (HK) és l’enzim clau de la glicòlisi i un augment de l’activitat HK indica la millora de la glicòlisi. La transfecció de miR-210 mímica va millorar l'activitat de HK en condicions que no eren de NiCl 2, mentre que la inhibició de miR-210 va mitigar l'augment d'activitat de HK causat per Ni (Figura 3e). La transfecció de mímic miR-210 va augmentar el contingut d’àcid làctic cel·lular, el producte final de la glicòlisi, mentre que la inhibició de miR-210 va atenuar l’acumulació d’àcid làctic causada per Ni (figura 3f).

Image

L'expressió miR-210 induïda pel níquel modula el canvi del metabolisme energètic. ( a ) La viabilitat de les cèl·lules va ser determinada pel test CCK8 després del tractament amb níquel. Els inhibidors de la glicòlisi, 2-DG (10 mM) o BrPA (25 μ M) exacerben la citotoxicitat del níquel. ( b ) Una corba representativa del consum d’oxigen que es basa en la pressió parcial d’oxigen (mmHg) detectada en temps real que envolta les cèl·lules indica la supressió del níquel pel consum d’oxigen cel·lular. ( c ) La transfecció de mímica de miR-210 redueix la taxa de consum d’oxigen (OCR) de cèl·lules en condicions que no siguin NiCl 2 i la inhibició de miR-210 facilita la repressió de la taxa de consum d’oxigen causada per l’exposició al níquel. ( d ) La transfecció del mímic miR-210 redueix la concentració d'ATP cel·lular en condicions que no siguin NiCl 2 i la inhibició de miR-210 atenua l'esgotament de l'ATP causat per l'exposició al níquel. ( e ) L’activitat de l’hexokinasa (HK) es va mesurar a partir de les reaccions de HK i 6-fosfoglucosa deshidrogenasa i reflectida pel canvi de densitat òptica a 340 nm ((mOD 340 / min / mg) mesurant la generació de NADPH. La transfecció de mímica miR-210 millora l'activitat de HK en condicions que no siguin NiCl 2 i la inhibició de miR-210 mitiga l'augment d'activitat de HK causat per l'exposició al níquel. ( f ) La transfecció de mímica miR-210 augmenta el contingut d'àcid làctic cel·lular en condicions que no siguin NiCl 2 i la inhibició de miR-210 atenua l'acumulació d'àcid làctic causada per l'exposició al níquel. Les sigles M, MC, I i IC indiquen la transfecció de mímica miR-210, control mímic, inhibidor de miR-210 i control inhibidor, respectivament. El signe "+" indica el tractament d'1 mM NiCl 2 durant 4 h, i el signe "-" indica el tractament de tristesa corresponent. La barra d'errors reflecteix el SEM d'almenys tres experiments independents. * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

L’expressió miR-210 induïda en Ni inhibeix els enzims metabòlics que contenen ISC

Es va mesurar l'activitat de dos enzims metabòlics típics de la ISC, l'aconitasa i el complex I, en cèl·lules transfectades amb mímic i inhibidor de miR-210. La transfecció de la mímica miR-210 va suprimir l'activitat d'aquests dos enzims en condicions que no eren Ni, mentre que la inhibició del miR-210 va atenuar la supressió dels enzims causats per Ni. A més, la transfecció o tractament no va canviar el nivell proteic del component representatiu de l'aconitasa (ACO2) o del complex I (NDUFA9), tal com es descriu a les figures 4c i d.

Image

L’expressió miR-210 induïda pel níquel inhibeix els enzims metabòlics que contenen ISC. ( a i b ) L’activitat de la conitasa i del complex I de cèl·lules transfectades amb mímic o inhibidor de miR-210 es va mesurar mitjançant un mètode espectrofotomètric i es va expressar com ΔmOD 340 / min / mg de proteïna. ( c i d ) Es presenten les bandes representatives mitjançant anàlisi de blot occidental per demostrar els nivells de proteïnes d’aconitasa (ACO-2) o complex I (NDUFA9) després de tractaments adequats. Les sigles M, MC, I i IC indiquen la transfecció de mímica miR-210, control mímic, inhibidor de miR-210 i control inhibidor, respectivament. El signe "+" indica un tractament amb 1 mM NiCl 2 durant 4 h, i el signe "-" indica el tractament de tristesa corresponent. La barra d'errors reflecteix el SEM d'almenys tres experiments independents. * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

El tractament amb NiCl 2 mM durant 4 h no altera l’homeòstasi cel·lular de ferro

Per determinar si la supressió enzimàtica que conté ISC mediada per Ni es relaciona amb la pertorbació de la homeòstasi del ferro causada pel Ni, es van examinar els estats del metabolisme del ferro de les cèl·lules exposades a 1 mM NiCl 2 durant diferents temps. Una disminució important dels ions de ferro cel·lular només es troba en els grups d’exposició de 8 h (figura 5a). Els nivells de proteïna de ferritina total, la forma principal de ferro emmagatzemat a les cèl·lules, van ser analitzats per western blot després del tractament amb Ni. L’exposició al NiCl 2 durant 2 o 4 h no va reduir els nivells de ferritina cel·lular. Tot i això, es va reduir el nivell de ferritina a les cèl·lules que van estar exposades a Ni durant 8 h (figura 5b). La sobreexpressió del receptor de transferrina (TfR), una important resposta cel·lular en condicions deficients de ferro, només es va observar en cèl·lules exposades a NiCl 2 durant 8 h (figura 5c).

Image

El tractament amb níquel que conté 1 mM de NiCl 2 exposat a cèl·lules durant 4 h no altera l’homeòstasi cel·lular de ferro. ( a ) Els ions de ferro cel·lular (ferrosos i fèrrics) es van mesurar amb el Iron Assay Kit després d’exposar-se a 1 mM NiCl 2 durant diferents períodes de temps (0, 2, 4 i 8 h). Una disminució important dels ions de ferro cel·lular només es va trobar en els grups d’exposició de 8 h. ( b ) Els nivells de proteïnes de ferritina total en cèl·lules que van ser tractades amb 1 mM de NiCl 2 durant 0, 2, 4 i 8 h es van analitzar per western blot. L’exposició a 1 mM de NiCl 2 durant 0, 2 o 4 h no altera el nivell de ferritina cel·lular. ( c ) Els nivells de transcripció del receptor de transferrina (TfR), TfR1 i TfR2, van ser investigats per qRT-PCR després d'exposició al NiCl 2 d' 1 mM a les cèl·lules durant 0, 2, 4 i 8 h. La sobreexpressió d’aquests dos gens només es va trobar en els grups d’exposició de 8 h. Les barres d'error reflecteixen el SEM d'almenys tres experiments independents. * P <0, 05 en comparació amb el control

Imatge a mida completa

Discussió

En aquest estudi, es va tractar amb 1 mM de NiCl 2 durant 4 h d’estabilització HIF-1 α induïda, sobreexpressió miR-210, reducció de proteïnes ISCU1 / 2, alteracions del metabolisme energètic i supressió enzimàtica metabòlica que conté ISC en cèl·lules Neuro-2a. Tot i que els nivells de Ni del nostre estudi és poc probable que s’assoleixin in vivo , aquests nivells d’exposició al Ni s’apliquen habitualment en estudi in vitro per investigar el mecanisme de toxicitat de Ni. 23, 24, 25, 26 El nostre estudi anterior va revelar que una exposició a 1 mM de NiCl 2 durant més de 12 h va produir citotoxicitat evident i disfunció mitocondrial a les cèl·lules Neuro-2a. 27 Com que el metabolisme energètic té un paper important en els processos fisiològics del cervell, investigar les alteracions del metabolisme energètic abans que es produeixi la mort cel·lular pot contribuir a l’elucidació dels mecanismes de neurotoxicitat induïda pel Ni.

De manera similar a la hipòxia, el Ni també suprimeix l’activitat de la prolil hidroxilasa i pertorba la degradació de HIF-1 α . Diversos estudis van revelar que les exposicions breus (2-6 h) a Ni van provocar l'acumulació de HIF-1 α en diversos tipus de cèl·lules i van desencadenar respostes de mímica hipoxia modifiant HIF-1 α . 5, 28, 29 Per tant, s’aplica l’evidència de respostes cel·lulars a l’hipòxia per explicar els efectes sobre la salut de Ni. L’elucidació de miR-210, un microRNA controlat per HIF-1 α , aclareix substancialment la naturalesa de les respostes cel·lulars variades a l’hipòxia. 9, 30 MiR-210 dirigeix ​​el receptor de la tirosina quinasa lligant EphrinA3 (EFNA3), millorant la diferenciació de les cèl·lules endotelials de la vena umbilical humana i promovent l'angiogènesi en la hipòxia. 31, 32 A més, el miR-210 induït per l'hipòxia participa en la regulació del cicle cel·lular modulant els seus gens objectiu, MNT, un conegut antagonista de MYC, i E2F3, una proteïna clau en la regulació del cicle cel·lular. 33, 34 En condicions de privació d’oxigen / glucosa, la sobreexpressada miR-210 reprimeix l’expressió de Bcl-2 i amplifica l’apoptosi de les cèl·lules Neuro-2a. En el nostre estudi, es va observar l'estabilització HIF-1 α i la sobreexpressió miR-210 induïda per NiCl 2 de manera que depèn de la dosi i del temps. A més, CoCl 2 i DFX, els compostos imitats de l'hipòxia ben establerts, van augmentar l'expressió de miR-210. Per tant, miR-210 pot contribuir a les respostes d'hipòxia química, a més del contingut baix d'oxigen.

El canvi del metabolisme energètic és una important resposta cel·lular a l’hipòxia. Quan l’oxigen és abundant, l’ATP cel·lular es genera principalment a través d’OXPHOS que genera 32 mols d’ATP a partir d’un mol de glucosa. En condicions hipòxiques, se suprimeix OXPHOS i la producció d’energia cel·lular passa a la via glicolítica que només genera 2 mols d’ATP a partir d’un mol de glucosa. Tot i que la glicòlisi no és econòmica per a la generació d’ATP, proporciona el suplement energètic mínim per a la supervivència cel·lular en condicions hipòxiques. Recentment, s'ha revelat que el canvi metabòlic energètic regulat per la via HIF-1 α -miR-210-ISCU1 / 2 participa en processos fisiològics i patològics relacionats amb la hipoxia múltiple. 18, 21 En el nostre estudi, l'exposició al Ni va donar lloc a la baixada dels nivells de proteïna ISCU1 / 2, que va estar relacionada amb els canvis en HIF-1 α i miR-210. Els resultats del gen del reporter del lloc d’enllaç miR-210 previst a ISCU1 / 2 i l’anàlisi de Western blot dels nivells de proteïna ISCU1 / 2 després de la transfecció de miR-210 van confirmar que ISCU1 / 2 estava regulat per miR-210 en exposició al Ni. condicions. La manca de canvi en els nivells d'ARNm d'ISCU1 / 2 després de l'exposició al Ni va revelar els efectes reguladors post-transcripcionals de miR-210 en ISCU1 / 2. 15 D'altra banda, l'activació de la via de regulació HIF-1 α / miR-210 / ISCU1 / 2 va ser universal en diferents cèl·lules tractades amb Ni. Els efectes descendents d'aquesta via de regulació poden estar sota la resposta mímica de l'hipòxia-mímica mediada pel Ni.

Es considera que el canvi de metabolisme energètic, caracteritzat per la millora de la glicòlisi en condicions normòxiques, està implicat en la toxicitat de Ni. Al sistema nerviós central, la inhibició OXPHOS mediada per Ni va donar lloc a estrès del suplement energètic. La inhibició de la glicòlisi amb 2-DG o BrPA va augmentar la citotoxicitat de NiCl 2 en les cèl·lules Neuro-2a del present estudi. A més, el fenotip cel·lular de generació d’energia glicolítica preferent, conegut com a efecte Warburg, està implicat en la carcinogènesi de Ni. 2 L'elucidació dels impactes del Ni en el metabolisme de l'energia cel·lular pot ser important per a l'estudi de la toxicitat de Ni. Vam trobar que el miR-210 era un modulador essencial del canvi del metabolisme energètic induït pel Ni, que va provocar una disminució del consum d’oxigen, dèficit d’ATP, alteració de l’activitat de HK i acumulació d’àcid làctic. Els enzims clau d’OXPHOS, l’aconitasa del cicle de Krebs i el complex I per a la transferència d’electrons mitocondrials, van ser suprimits per miR-210 sense canviar el nivell de proteïna dels seus components. Vol dir que la inactivació d’aquests enzims suposa el dèficit d’ISC, més que la inhibició de l’expressió de proteïnes. Per tant, la repressió de miR-210 sobre els enzims metabòlics dependents de ISCU1 / 2 i ISC proporciona una explicació lògica per a l'estabilització HIF-1 α i el canvi del metabolisme energètic, tots dos observats en diferents condicions d'exposició al Ni. 11, 29 A més, les deficiències en enzims metabòlics que contenen ISC poden atribuir-se a la generació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) i a una disfunció de mitocondris, a través de la qual el Ni va induir citotoxicitat significativa en les cèl·lules nervioses, com es va informar anteriorment. 27, 37 A més del Ni, altres metalls pesants, inclosos el cobalt, el manganès i el vanadí, indueixen una estabilització HIF-1 α . 28 Per tant, l'estudi funcional del miR-210 pot ser valuós per a l'elucidació de la toxicitat de metalls pesants.

En contrast amb les condicions baixes d’oxigen, la resposta d’hipòxia-mímica induïda per Ni pot anar acompanyada d’alteracions dels nivells de ferro cel·lular. Com es va informar anteriorment, Ni pot competir amb el ferro per transportar-1 de metalls divalents (DMT1) i alterar l’homeòstasi de ferro cel·lular. 22, 38 Com que els nivells de ferro cel·lular estan directament vinculats a l’assemblea d’ISC i l’activitat dels enzims dependents de l’ISC, no s’ha d’excloure la influència del Ni en els nivells de ferro cel·lular. Tot i això, basant-nos en els nostres resultats que l'exposició cel·lular a 1 mM de NiCl 2 durant 4 h no va alterar la homeòstasi de ferro cel·lular, vam arribar a la conclusió que la supressió mediada per miR-210 d'enzims metabòlics que contenien ISC era independent de la regulació cel·lular del ferro en el termini de els nostres tractaments amb Ni. Costa i companys de 38 anys han informat els efectes del NiCl 2 en la regulació cel·lular del ferro. En el seu estudi, van sorgir una sèrie d’alteracions significatives que reflecteixen l’activació de la regulació cel·lular del ferro a les 6–8 h posteriors a l’exposició Ni, la qual cosa va ser coherent amb els resultats del nostre estudi. Només el canvi en el contingut cel·lular de ferro després de 4 h d’exposició al Ni va ser diferent entre els dos estudis que es poden atribuir a l’ús de diferents línies cel·lulars o mètodes de determinació del contingut de ferro. Sembla que miR-210 va modular el canvi del metabolisme energètic davant el desequilibri de l’homeòstasi en ferro cel·lular. Calen estudis posteriors per identificar les contribucions específiques d’aquests mecanismes a la toxicitat de Ni.

En resum, els nostres resultats suggereixen que el microRNA de control HIF-1 α , miR-210, va modular el canvi del metabolisme de l’energia cel·lular reprimint ISCU1 / 2 després de l’exposició al Ni. Com que el metabolisme energètic és fonamental en el sistema nerviós central, els nostres resultats proporcionen una comprensió de la comprensió de la neurotoxicitat mediada per Ni. A més, es podria utilitzar la capacitat del miR-210 per regular la resposta mímica de l’hipòxia mitjançant la unió a gens objectiu per a dilucidar els efectes sobre la salut d’una varietat de metalls pesants que indueixen l’estabilització HIF-1 α .

Materials i mètodes

Tractament i cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars de neuroblastoma de ratolí (Neuro-2a), obtingudes de l’Institut de Bioquímica i Biologia Cel·lular (Acadèmia Xinesa de les Ciències, Xangai, Xina), es van cultivar en el medi modificat de Eagle (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) complementat amb 10% sèrum boví fetal inactivat per calor (FBS, HyClone, Logan, UT, EUA) i 1% v / v de penicil·lina / estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) en una atmosfera humida amb un 5% de CO 2 . a 37 ° C. Es va preparar una solució en 1 M de clorur de Ni (NiCl 2 · 6H 2 O, Sigma-Aldrich) amb H 2 O estèril i es va diluir a les concentracions adequades per al tractament cel·lular.

Anàlisi de taquilla occidental

A partir d'extractes de cèl·lules senceres, 40 μg de proteïna es van resoldre mitjançant SDS-PAGE i es van transferir a una membrana fluorur de poliviniliden (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Es van sondar membranes de diverses proteïnes amb els anticossos primaris adequats i es van visualitzar amb el sistema d’electroquimiluminiscència (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Les bandes es van analitzar i analitzar mitjançant un sistema ChemiDoc XRS + amb Image Lab Software (Bio-Rad).

Anticossos

El anticorp monoclonal del ratolí contra el HIF-1 α es va comprar a Novus Biologicals (Littleton, CO, EUA). Els anticossos monoclonals de conill contra HIF-1 β i FTH1 es van comprar a Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Es va comprar un anticorp policlonal de conill a ISCU1 / 2 a Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Es va adquirir a Abcam (Cambridge, Regne Unit), un anticorp policlonal de conill contra Aconitase 2 i anticorp monoclonal del ratolí contra NDUFA9.

Transfecció cel·lular

El mímic miRNA (miR10000267) o inhibidor (miR20000267) per a la transfecció cel·lular es van comprar a RiboBio (Guangzhou, Xina) i es van utilitzar segons les instruccions del fabricant. Breument, 24 h després de la sembra cel·lular, el medi sense penicil·lina / estreptomicina es va substituir pel medi de transfecció que conté mimetisme o inhibidor de miRNA de 100 nM i un reactiu de transfecció de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) del 0, 2% v / v. Després de les 4 h, el medi de transfecció es va substituir per un medi fresc absent de penicilina / estreptomicina. Les cèl·lules transfectades de forma transitòria es van recollir després d’una incubació addicional de 24 hores per a experiments posteriors.

anàlisi qRT-PCR

L'extracció de l'ARN total i la quantificació d'ISCU, TfR1, TfR2 i miR-210 es van realitzar seguint el nostre protocol publicat anteriorment. 27 Els conjunts d’imprimació QRT-PCR miRNA-loop loop (un primer imprimant de transcripció inversa i un parell d’imprimació PCR quantitativa per a cada conjunt, MQP-0102 i MQP-0201) van ser dissenyats per RiboBio. La U6 es va utilitzar com a control intern dels miRNAs, i la β -actina es va utilitzar com a control intern del mARN. Els primers emprats en aquest estudi van ser els següents: ISCU-forward, 5′-CTCTGCCTGCCGCCTGTG-3 ′ i inversa, 5′-CTGCTTCTCTGGCTCCTCCTTC-3 ′; TfR1 cap endavant, 5′-GAGACTACTTCCGTGCTACTTC-3 ′ i revers, 5′-TGGAGATACATAGGGCGACAG-3 ′; TfR2 cap endavant, 5′-AGAGTGGTTGGAGGGCTAC-3 ′ i revers, 5′-CAATGAGGCTGACGAGAAGG-3 ′; β -actina endavant, 5′-CCACACCCGCCACCAGTTC-3 ′ i inversa, 5′-CCTTCTGACCCATTCCCACCATC-3 ′.

Test de Luciferasa

Les regions 3′-UTR de la ISCU que contenien els llocs d’enllaç previstos per miR-210, salvatges o mutants (71–77 ACGCACA mutats a AGCGAGA), es clonaven en vectors pmiR-RB-REPORT (GUR100509 i GUR100510; RiboBio). Després de la co-transfecció amb els vectors i la mímica de miR-210, es van mesurar les activitats de la licor i Renilla luciferasa mitjançant la Dual-luciferase Reporter Assay (Promega, Madison, WI, EUA).

Anàlisi CCK

Les cèl·lules van ser plantades en una placa de 96 pous i exposades a 1 mM de NiCl 2 durant 2 h. A continuació, es va afegir 2-DG (10 mM) o BrPA (25 μ M) al medi que contenia Ni i es va incubar durant 2 h addicionals. A continuació, el medi de la placa de 96 pous es va substituir per un medi fresc que conté una solució CCK-8 del 10% v / v (Dojindo, Kumamoto, Japó) i es va incubar durant 2 h. La densitat òptica (OD) de cada pou es va determinar a una longitud d’ona de 450 nm amb el lector de microplaques Infinite M200 (Tecan, Männedorf, Suïssa). La viabilitat de les cèl·lules es reporta com un percentatge del valor de control.

Test ATP

El contingut d’ATP es va determinar mitjançant el kit de determinació d’ATP (Molecular Sondes, Eugene, OR, EUA). La luminiscència de la mostra es va mesurar mitjançant un lector de microplaques Infinite M200 (Tecan). Es van establir corbes estàndard d’ATP i les concentracions d’ATP es van expressar en nmol / mg de proteïna.

Taxa de consum d’oxigen

Les cèl·lules (1 × 10 5 per pou) van ser xapades, transfectades i exposades a NiCl 2 durant 4 hores abans de la mesura. La taxa de canvi d’oxigen als medis que envolten les cèl·lules intactes es va mesurar mitjançant un analitzador de flux de flux extracel·lular XF96 (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, EUA). L’OCR d’un pou es va determinar quantificant els canvis depenents de l’oxigen en la fluorescència d’un complex propietat de fluoresceïna (pmol / min / pou).

Anàlisi d’activitat de HK

L’activitat de HK es va mesurar mitjançant el kit de determinació d’Activitat de l’hexokinasa (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Xina) basat en una reacció acoblada de HK i 6-fosfoglucosa deshidrogenasa. L’activitat de l’hexokinasa es va determinar mitjançant la generació de nucleòtid de trifosforidina (NADPH) i es va mesurar com el canvi d’OD a 340 nm (ODOD340) a 37 ° C durant 3 min. L’activitat de l’hexokinasa es va expressar com a proteïna ΔmOD340 / min / mg (ΔmOD340 = ΔOD340 / 1000).

Test de lactats

El contingut de lactat intracel·lular es va mesurar mitjançant el kit de determinació de lactat (Nanjing Jiancheng) segons les instruccions del fabricant. Es van establir corbes estàndard i les concentracions de lactat es van expressar en μ mol / mg de proteïna.

Assajos d’activitats complexes i complexes I

Després del tractament adequat, les cèl·lules es van recollir en tubs d’Eppendorf, es van tornar a suspendre en un tampó hipotònic (KCl 120 mM, HEPES 20 mM, 2 mM MgCl 2 i 1 mM EGTA, pH 7, 4) i es van interrompre realitzant deu polsos de 1 s amb el Vibra. -Processador d’ultrasons cel·lulars (Sonics & Materials, Danbury, CT, EUA). Les posteriors avaluacions dels dos enzims metabòlics ISC típics es van realitzar segons el protocol anteriorment informat. 12

Contingut de ferro cel·lular

El total de ions de ferro cel·lular (fèrrics i fèrrics) es va mesurar mitjançant el Iron Assay Kit (Abcam) seguint les instruccions del fabricant. Les cèl·lules van ser sembrades en plaques de sis pous i exposades a Ni durant diferents períodes de temps. Es van establir corbes estàndard per als ions de ferro i el contingut de ferro cel·lular es va expressar com a nmol per pou.

Anàlisi estadística

Els valors s'expressen com la mitjana ± SEM i es van analitzar per SPSS (V18.0.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Les comparacions de dades es van completar mitjançant ANOVA unidireccional o una prova de pair combinada per comparar els mitjans dels diferents grups de tractament. P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

Documents de paraula

  1. 1.

    Llegenda suplementària

Glossari

OXPHOS

fosforilació oxidativa

miR-210

microRNA-210

HIF-1 α

factor de transcripció induïble de la hipòxia-1 α

ISCU1 / 2

proteïna de muntatge de clúster ferro-sofre

ISC

cúmul ferro-sofre

Ni

níquel

TCA

àcid tricarboxílic

UTR

regió no traduïda

DFX

deferoxamina

2-DG

2-desoxi- D -glucosa

BrPA

àcid bromopirúvic

HK

hexokinasa

TfR

receptor de transferrina

OD

densitat òptica

ROS

espècies reactives a l'oxígen

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)