Les proteïnes oncofusió mll-af9 i mll-af4 uneixen un repertori de potenciador diferent i orienten el programa runx1 en leucèmia mieloide aguda 11q23 | oncogen

Les proteïnes oncofusió mll-af9 i mll-af4 uneixen un repertori de potenciador diferent i orienten el programa runx1 en leucèmia mieloide aguda 11q23 | oncogen

Anonim

Temes

  • Leucèmia mieloide aguda
  • Genòmica del càncer
  • Epigenètica
  • Modificacions d'història post-traducció
  • Transcripció

Resum

En les leucèmies 11q23, la part N-terminal del gen de leucèmia mixta (MLL) es fusiona amb> 60 gens associats diferents. Per definir un conjunt bàsic de dianes reorganitzades per MLL, es va investigar la unió a tot el genoma de les proteïnes de fusió MLL-AF9 i MLL-AF4 i signatures epigenètiques associades en les línies cel·lulars de leucèmia mieloide aguda (AML) THP-1 i MV4-11 . Es van destapar tant els gens comuns i específics de targetes específiques MLL-AF9 i MLL-AF4, totes marcades per H3K79me2, H3K27ac i H3K4me3. A banda de l’enllaç del promotor, també vam identificar l’enllaç MLL-AF9 i MLL-AF4 en subconjunts específics d’elements reguladors distals actius no superposats. Malgrat aquest enllaç del potenciador diferencial, MLL-AF9 i MLL-AF4 encara dirigeixen un programa gènic comú, que representa part del programa del gen RUNX1 i constitueix gens específics de CD34 + i monòcits. En comparar aquests conjunts de dades es van identificar diversos factors de transcripció del dit de zinc (TFs) com a possibles co-reguladors de MLL-AF9. Junts, aquests resultats suggereixen que les fusions de MLL col·laboren amb subconjunts específics de TF per desregular el programa genètic RUNX1 en 11L23 AMLs.

Introducció

La leucèmia mixta de llinatge (MLL), codificada pel gen de la lisina (K) -específica de metil transferasa 2A ( KMT2A ) a 11q23 , és una proteïna que deposita H3K4me3 activa durant el desenvolupament primerenc. Les leucèmies de reordenació MLL (MLLr) són les responsables de prop del 10% de totes les leucèmies limfoblàstiques agudes i mieloides (ALL / AML). 1 El domini N-terminal CXXC que conté la part que uneix ADN del gen MLL es pot fusionar, mitjançant traducció genòmica, amb> 60 socis de fusió diferents. 2 Els dos socis de fusió més comuns, AF9 (MLLT3) i AF4 (AFF1), es troben en un 30% de MLLr AML i un 66% de casos de MLLr ALL respectivament. 3

Els socis de fusió més prevalents (inclosos AF9 i AF4) estan presents en el complex de super-allargament (SEC), donant lloc a un mecanisme d’acció general MLLr tot i estar compost per proteïnes diferents. 4, 5 La SEC s’uneix normalment a l’ARN polimerasa II i facilita l’allargament transcripcional. En les leucèmies de MLLr, la SEC està lligada al domini d'unió a l'ADN de la MLL a través del soci de fusió, donant lloc a una transcripció aberrant de gens objectiu de MLL. Al costat, AF9 i altres socis de fusió com ara ENL, AF10 i AF17 estan presents al complex DOT1L (DOTCOM). Aquest diposita H3K79me2 en gens transcrits activament, donant lloc a una deposició aberrant de H3K79me2 en aquests subconjunts de leucèmies induïdes per MLLr. 6, 7, 8 Com a tal, la inhibició de DOT1L és una via prometedora per al tractament de la leucèmia induïda per MLLr. 9, 10

A més, s’ha demostrat que les AML en general i la leucèmia MLLr en particular són sensibles a la inhibició de proteïnes de la família BET com BRD4, que regulen l’allargament de la transcripció mitjançant P-TEFb a promotors i potenciadors. També s’han demostrat que les proteïnes de fusió 11, 12, 13, 14 MLL interfereixen amb els RUNX1 15, 16, 17 i modulen PU.1 mitjançant els seus elements reguladors distals. 18 A més, la MLLr i altres AMLs són sensibles a la inhibició de les cinases mediadores, 19 vinculant la modulació d'elements reguladors distals a l'execució del programa leucèmic de MLLr.

Fins ara, els mapes a tot el genoma de la unió de MLL només estan disponibles en models de ratolí AML, 7 ALL ALL 20, 21, 22 i MLL-AF6 de la línia cel·lular AML humana ML-2. 23 Cap informe fins ara ha descrit la unió MLL-AF9 i -AF4 a tot el genoma en AML humana.

Aquí ens vam proposar investigar els mecanismes moleculars i els objectius de l'AML induïda per MLLr. Per això, es va caracteritzar el programa de signatura epigenètica i d’expressió gènica a tot el genoma de tipus salvatge (WT) MLL, MLL-AF9 i MLL-AF4 en cèl·lules AML humanes. Mostrem que les proteïnes de fusió MLL s’uneixen en un mode ‘ampli’ que s’allarga sobre el cos del gen així com en un mode ‘agut’ parat al lloc d’inici de la transcripció (TSS), a més d’elements no genics, com els potenciadors distals. Mostrem que MLL-AF9 i MLL-AF4 només comparteixen un subconjunt de gens objectiu, tot i així mostren enriquiment per a les mateixes vies tant en els conjunts de gens específics com en MLL-AF9 i MLL-AF4. Aquests gens objectiu estan marcats per l’enriquiment de H3K79me2, H3K4me3 i H3K27ac, així com per l’ocupació de RUNX1 i constitueixen una barreja de conjunts genètics expressats per CD34 + i monòcits. Tots dos resultats suggereixen que, a MLLr AML, el progenitor mediat per RUNX1 al programa de diferenciació de monòcits està desregulat.

Resultats

Les fusions MLL i WT MLL mostren un mode d’enquadernació ampli i pronunciat

Per investigar els llocs d’unió de MLL-AF9, es va utilitzar un substrat de cèl·lules THP-1 que expressen tant MLT WT com MLL-AF9 però no WT AF9 (figures 1a i b, figura suplementària S1A). L'ús d'anticossos contra el N-terminus de MLL-1 (ab1542 / ab1547) i el terminal C de AF9 (ab1327 / ab1474) (Figura 1a) en la immunoprecipitació de cromatina (ChIP) -qPCR (PCR quantitativa) va mostrar un enriquiment per a la HOXA canònica. Regió objectiu de fusió MLL a les cèl·lules THP-1 (Figura 1c), mentre que HOXA7 i MEIS1, en contraposició a les expectatives, 24, 25, 26 no es van enriquir. L'anàlisi occidental contra MLL i AF9 amb els nostres anticossos no va donar resultats (no es mostren dades), cosa que va suggerir que els nostres anticossos eren de 'grau ChIP-seq', però no de 'Western grade'. Posteriorment, es van realitzar experiments amb ChIP-seq utilitzant anticossos MLL i AF9 en cèl·lules MLLr de THP-1 que van confirmar l’enriquiment al locus HOXA tant per als anticossos (figura 1d, superior). Curiosament, vam observar que tant la MLL com l’AF9 mostren no només les regions enriquides de mode ampli que s’allarguen sobre els cossos gènics (figura 1d, mitjana), sinó també les regions enriquides de “mode fort” en els promotors i potenciadors de la destinació (figura 1d, part inferior) .

Image

Patrons d’unió a tot el genoma de MLL i AF9 en cèl·lules THP-1. ( a ) Representació esquemàtica de MLL, AF9 i MLL-AF9. Les ubicacions d’unió als anticossos s’indiquen amb línies puntejades, les regions d’imprimació que s’utilitzen al quadre ( b ) amb una línia plena. ( b ) Experiments de transcriptasa inversa-qPCR ( n = 5) en cèl·lules THP-1 amb primers contra C i N terminals de MLL i AF9 normalitzats a GAPDH. El terminal N de AF9 no està expressat, cosa que indica que no hi ha cap expressió WT de AF9 en aquesta línia cel·lular. *** P <0, 001 (prova de t de Welch). ( c ) Experiments amb ChIP-qPCR utilitzant dos anticossos anti-MLL-1 i dos anti-AF9 a les cèl·lules THP-1 i primers per a HOXA7, 9, 10 i MEIS1. ( d ) Visió general de ChIP-seq de la unió de MLL i AF9 en els locis HOXA, ZEB2 i CDKN2C en cèl·lules THP-1. ( e ) Classificació dels esdeveniments vinculants de MLL i AF9 en modes "àmplies" i "agudes". A l'esquerra: boxplot que mostra la dispersió de les longituds punta. Dreta: barra de barres que mostra distribucions genòmiques. ( f ) Classificació d'esdeveniments vinculants MLL-AF9 i MLL WT. Perfils mitjans que mostren intensitats del senyal ChIP-seq per a esdeveniments d’unió MLL-AF9 i MLL WT en cèl·lules THP-1. ( g ) A l'esquerra: Distribució d'esdeveniments vinculants de MLL-AF9 i MLL WT en els modes "amples" i "punxants". Dreta: Distribució genòmica d'esdeveniments vinculants de MLL-AF9 i MLL WT en els modes "amples" i "punxants". ( h ) Diagrama de Venn que il·lustra la superposició entre els objectius AML humans (THP-1) MLL-AF9, objectius MLL-AF9 en un model LSC de ratolí (Bernt et al. 7 ) i ALL target MLL-AF4 ALL (Guenther et al. 20 ).

Imatge a mida completa

Utilitzant MACS2 per a la definició de picos afilats i HOMER per definir àmplies regions (vegeu Materials i mètodes), vam identificar 16 099 regions sense filtrar ocupades per MLL en cèl·lules THP-1 (Taula suplementària S1). D’aquestes, 8217 eren de ‘mode ampli’ (longitud mitjana ~ 12 kb) i 7882 de ‘mode agut’ (longitud mitjana ~ 4, 6 kb) (figura 1e, esquerra). L'anàlisi de la distribució genòmica va revelar que els pics del 'mode ampli' cobreixen més regions TSS (figura 1e, dreta), mentre que els pics del 'mode fort' semblen haver-se més sovint a les regions intergèniques.

Com que AF9 no s’expressava del seu lloc endogen en aquest substrat de cèl·lules THP-1 (figura 1b, figura suplementària S1A), vam definir els pics d’unió MLL-AF9 com aquells llocs d’unió MLL que mostren un senyal alt AF9, i MLL WT -enllaços d'esdeveniments com els que mostren un senyal AF9 baix (figura 1f). Això va destil·lar la nostra llista de regions ocupades per MLL fins a 1613 llocs d’enllaç de fusió MLL-AF9 d’alta confiança, inclosos objectius coneguts d’AML i MLLr com HOXA9, CDK6, MYB, MYC, JMJD1C, FOXP2, FLI1, RUNX1, PBX3, BCL2 i BRD4, així com 439 llocs d’enllaç WT d’alta confiança en MLL (taula suplementària S1). En total, el 84% d’aquests llocs d’unió a MLL-AF9 són de ‘mode ampli’, enfront del 58% dels llocs d’enllaç amb MLL WT (figura 1g, a l’esquerra), i ocupen més regions TSS en comparació amb WT MLL (figura 1g, dret).

Com que l'ocupació i l'expressió de MEIS1 és gairebé universal per a totes les AML i ALL, 27, 28 induïdes per la fusió de MLL , hem investigat el locus MEIS1 a les cèl·lules THP-1 mitjançant les nostres dades a tot el genoma (figura suplementària S1B). Això va corroborar el nostre ChIP-qPCR constatar que MEIS1 no està lligat per MLL-AF9 i no expressat en cel·les THP-1, ja que només està marcat per H3K4me3 al seu promotor, però no per MLL, AF9, H3K27ac o H3K79me2. L'expressió de MEIS1 en l'AML induïda per fusió de MLL s'ha demostrat especialment important per a la transformació inicial de les cèl·lules leucèmiques en models de ratolí. 29, 30, 31, 32 Per tant, es pot concebre que, en algun moment des de l'establiment original de la línia cel·lular THP-1 el 1980, 33 el lloc fos silenciat i el seu paper en el manteniment leucèmic fos assumit per una altra proteïna de la classe TALE com, per exemple., per exemple, PBX3, que està expressat i regulat per MLL-AF9 a les cèl·lules THP-1.

Per validar encara més les troballes, vam realitzar experiments addicionals de ChIP-seq contra MLL (ab1542) i AF9 (ab1474) en un pacient AML positiu amb MLL-AF9 i vam repetir el CHIP-seq de MLL en cèl·lules THP-1 amb un anticorp dirigit. un epítop diferent (ab1547). La intensitat del senyal ChIP-seq a les nostres regions designades d’unió MLL-AF9 mostra un bon enriquiment en els tres casos (figura suplementària S1C). Això indica que els nostres objectius seleccionats MLL-AF9 no només estan units per la proteïna de fusió en el sistema de línia cel·lular, sinó també per a més cèl·lules primàries de plàstic.

Com la leucèmia induïda per la fusió de MLL s'ha estudiat anteriorment en diversos altres models humans i de ratolins, per exemple, Bernt et al. 7 i Guenther et al. , 20 vam proposar comparar els nostres gens objectiu MLL-AF9 amb els gens objectiu identificats en aquests estudis. Hem trobat un encavalcament relativament menor entre el 12 i el 23% entre el nostre conjunt i els altres altres conjunts (figura 1h, taula suplementària S2), que tenia aproximadament el mateix rang de solapament que es va trobar entre els diferents estudis sobre ratolins. Això indica que, encara que un model bàsic d’objectius està present tant en models humans com en ratolins, els models de ratolí no recapitulen totalment la situació de la leucemogènesi humana.

Signatura epigenètica de gens objectiu MLL-AF9

Com es suggereix que les leucèmies de la MLL alteren la signatura epigenètica de les cèl·lules afectades, vam comparar l’estat epigenètic de la fusió de la MLL amb els gens objectius de la WT MLL centrats en H3K4me3, H3K79me2 i H3K27ac. Per això, vam agafar el conjunt d’esdeveniments vinculants MLL-AF9 i MLL WT d’alta confiança que s’encavalquen amb els gens RefSeq hg19, identificant 962 gens objectiu MLL-AF9 i 76 MLL WT, corresponents a l’11% i l’1% de tots els gens expressats (llegeix per quilobase d'exó per milió de lectures mapades (RPKM)> 0, 5, tallat basat en la distribució RPKM), respectivament (Figura 2a). Els promotors dels gens objectiu MLL-AF9 van ser marcats per H3K4me3 i H3K27ac, mentre que es va observar un senyal H3K79me2 sobre els cossos de gens que disminuïa en la direcció de 5 ′ a 3 ′ (figures 2b i c superior), cosa que indica que aquests gens es transcriuen activament. Es va observar un patró similar als gens objectiu WT MLL, i un conjunt aleatori de gens expressats, encara que amb una intensitat del senyal lleugerament reduïda per a H3K79me2 ( P = 3.79e −10 i P <2.2e −16, respectivament) (Figura 2c, mitjana, baix). La menor ocupació de H3K79me2 també es va reflectir en un nivell més baix d’expressió gènica de dianes WL MLL en contraposició a gens objectiu MLL-AF9, determinats per RNA-seq (Figura 2d). Això suggereix que els gens objectiu de fusió són més alts, en concordança amb el paradigma que MLLr activa els gens diana de MLL per allargament aberrant.

Image

Signatura epigenètica de gens objectiu de la MLL. ( a ) Distribució de gens expressats (RPKM> 0, 5), gens silenciosos, gens objectiu MLL-AF9 i MLL WT. ( b ) Visió general de l’activitat d’unió i transcripció de AF9, MLL, H3K79me2, H3K27ac i H3K4me3 al locus ZEB2 en cèl·lules THP-1. ( c ) Senyal mitjà de H3K27ac, H3K4me3 i H3K79me2 en els gens objectiu MLL-AF9 (superior) i MLL WT (mig), en comparació amb un conjunt aleatori de gens expressats (inferior) ( d ) Nivells d'expressió de MLL-AF9 i Gens objectiu de la MLL WT. *** P <0, 001 (prova de t de Welch). ( e ) Les famílies de motius enriquides en antecedents en els promotors de gen objectiu MLL-AF9 (a l'esquerra), els promotors de gen objectiu MLL WT (a la dreta) i les famílies de motius en els promotors de gen objectiu MLL-AF9 es van enriquir en els promotors de gen objectiu MLL WT (a baix).

Imatge a mida completa

L’anàlisi de l’enriquiment de camins dels gens objectiu de MLL-AF9 va revelar un enriquiment significatiu (valor P ajustat a Benjamini-Hochberg <1e- 6 ) del sistema immunitari, l’hemostàsia i les vies del sistema immunitari adaptatiu (figura suplementària S1D, superior). Els gens objectiu de la MLL WT, en canvi, només van revelar un enriquiment per a la via PDGFRB (figura suplementària S1D, inferior), sovint implicats en esdeveniments de translació conduint a trastorn mieloproliferatiu. L’ anàlisi del motiu 35 de les fites MLL-AF9 va revelar l’enriquiment de la família ETS, AP2 i C2H2-Zf, mentre que la família POU es va esgotar en un segon pla (figura 2e, a l’esquerra superior). Els gens objectiu WT MLL es van enriquir per motius reconeguts per les famílies C2H2-Zf i ETS, mentre que la família NR es va esgotar per segon pla (figura 2e, a la part superior dreta). La comparació directa dels objectius MLL-AF9 i MLL WT va revelar ambdós conjunts de gens iguals en termes d’enriquiment de motius, excepte les famílies de motius NR i AP-2, que es van enriquir en el conjunt de gens objectiu MLL-AF9 (Figura 2e, inferior) . Això suggereix que la desregulació de NR i AP-2 mediada per MLL-AF9 podria estar involucrada en processos hematopoètics i immunològics aberrants.

Similituds dels patrons d’enquadernació MLL-AF9 i MLL-AF4

Per identificar objectius comuns de fusió de MLL, hem ampliat la nostra anàlisi incloent una AML que expressa MLL-AF4. Com que es creu que tant MLL-AF9 com MLL-AF4 s'uneixen als gens diana de MLL i estan vinculats a l'allargament i a la transcripció aberrants dels seus objectius a través del SEC, es va proposar avaluar el subconjunt de gens diana MLL comunament units per les proteïnes de fusió. Primer, hem creat perfils d’unió a tot el genoma per a MLL, AF4, H3K4me3, H3K79me2 i H3K27ac, així com un perfil d’expressió RNA-seq a cèl·lules AML MV4-11 AML que expressen la proteïna de fusió MLL-AF4 (Figura 3a, figura suplementària S2A– B). Com abans, vam dividir els objectius MLL no filtrats (28 656) en 'mode ampli' (18 782) i 'mode agut' (9874), i per taxa d'ocupació AF4 els vam filtrar fins a la fusió (2560) i la WT (828) esdeveniments d’unió (figura 3b, figures suplementàries S2C i D, taula suplementària S3), que mostra una distribució similar a les cèl·lules THP-1 (figura suplementària S2E). L’expressió de gens objectiu MLL-AF4 (1722, identificats mitjançant la superposició dels esdeveniments d’unió de confusió d’alta confiança amb els gens RefSeq hg19) fou significativament superior als gens MLL WT (308) (Figura 3c). Les signatures epigenètiques i els enriquiments de vies també van ser comparables a les AML de MLL-AF9 (Figures suplementàries S2F – H), cosa que suggereix que tant MLL-AF9 com MLL-AF4 utilitzen mecanismes moleculars similars per induir la leucèmia. També es va trobar un solapament similar amb els altres conjunts diana com es va observar per a MLL-AF9 (figura suplementària S2I, taula suplementària S2).

Image

Comparació de gens objectiu MLL-AF4 i MLL-AF9. ( a ) Visió general de l’activitat d’enllaç i transcripció de AF4, MLL, H3K79me2, H3K27ac i H3K4me3 al locus ZEB2 a les cèl·lules MV4-11. ( b ) Distribució genòmica d'esdeveniments vinculants MLL-AF4 i MLL WT en els modes "amples" i "punxants". ( c ) Nivells d'expressió dels gens objectiu MLL-AF4 i MLL WT. *** P <0, 001 ( t -test de Welch) ( d ) Distribució de gens objectiu comú específics de MLL-AF9 i MLL-AF9 i MLL-AF4 (superior). Distribució de gens objectiu MLL WT a THP-1 i MV4-11 (a baix). ( e ) Senyal mitjà de H3K4me3, H3K27ac i H3K79me2 en gens objectiu comú i específic MLL-AF4 i MLL-AF9. ( f ) Nivell d'expressió de gens objectiu MLL-AF9 compartits (+) o no compartits (-) per MLL-AF4 a les cel·les THP-1 i MV4-11 (esquerra). Nivell d’expressió de gens objectiu MLL-AF4 compartits (+) o no compartits (-) per MLL-AF9 a les cel·les THP-1 i MV4-11 (dreta). *** P <0, 001 (prova de t de Welch).

Imatge a mida completa

Si comparem els conjunts de gens objectiu MLL-AF9 i MLL-AF4 (taula suplementària S4), es va revelar que un significatiu ( P = 1.98e −11 ) 29% (277) dels gens diana MLL-AF9 també està dirigit per MLL-AF4 (Figura 3d, inclòs objectius MLLr coneguts, com ara BCL2, HOXA9, MYB i BRD4. En canvi, només el 3% dels gens objectiu WT MLL trobats en THP-1 van ser objectius de WT MLL en MV4-11 (Figura 3d, inferior). A continuació, es va analitzar l'activitat d'aquests gens de fusió MLL comú i de targetes de MLL WT versus els gens específics de MLL-AF9- i -AF4. Els gens habituals de MLL-AF9 i MLL-AF4, així com els específics per a MLL-AF9 i -AF4, mostren un nivell comparable de H3K27ac i H3K4me3 (Figura 3e), mentre que H3K79me2 és lleugerament inferior en les AML de MLL-AF9. La presència de senyal H3K79me2 en gens objectiu MLL-AF4 confirma la deposició d'aquesta marca de cua d'histona també en objectius MLL-AF4 en AML. 22, 36

Els nivells d'expressió gènica determinats per RNA-seq són comparables per a objectius de fusió compartida en THP-1 i MV4-11, mentre que els gens objectiu específics de MLL-AF9 i -AF4 són més baixos expressats en MV4-11 i THP-1, respectivament, amb valors medians de RPKM de 23 i 17 per als gens objectiu específics de MLL-AF9 i 25 i 18 per als gens objectiu específics de MLL-AF4, respectivament (Figura 3f). En conjunt, això indica que el conjunt de gens objectiu de fusió de MLL compartits podria representar un conjunt “bàsic” d’objectius importants per impulsar el potencial leucèmic tant de MLL-AF9 com de -AF4.

Interacció de gens objectiu MLLr amb RUNX1 i CTCF

Com que RUNX1 és un factor conegut en diversos tipus d’AML translocada i TOTS 37, 38, 39, 40 i se li ha suggerit que estiguin implicats en leucèmies MLLr, 15, 16, 41, hem investigat la unió d’ADN RUNX1 en AML induïda per fusió de MLL . Al costat d'això, es va demostrar recentment que les leucèmies traduïdes per MLL es veuen afectades per la inhibició de la cinasa mediadora. 19 El complex mediador 42 està associat a la regulació de l’ARN-polimerasa II en promotors i elements reguladors distals. La cohesina, important per a l'establiment d'interaccions promotor-potenciador, co-localitza amb CTCF 43 i el mediador. 44 Les mutacions de cohesina prevalen en les AML 45 i no translocades i CTCF està implicada en T-ALL. 46 Per tant, hem investigat l’enquadernació CTCF en els objectius de fusió de MLL, com a representant d’enllaç de mediador / cohesina. CTCF 47 (GSM1335528) i RUNX1 mostren un enriquiment en els gens objectiu MLL-AF9, mentre que el senyal dels gens WT MLL és lleugerament inferior per a RUNX1 i gairebé absent per a CTCF (figura 4a, figura suplementària S3A). Un total del 22% (215) dels promotors de gen objectiu de MLL-AF9 estan ocupats per CTCF, versus un 11% per a gens objectiu de MLL WT. Per a RUNX1, aquest solapament és del 80% (767) i el 61% (46), respectivament (Figura 4b, a l'esquerra). A més, els gens diana MLL-AF9 co-ocupats per RUNX1 són més alts que els gens objectiu MLL-AF9 sense la coocupació RUNX1 (Figura 4b, dreta). Com que la unió de RUNX1 als gens objectiu de MLL-AF4 a les cèl·lules MV4-11 segueix un patró similar com es va discutir per a MLL-AF9 en cèl·lules THP-1 (figura suplementària S3B), junts aquests resultats suggereixen que l’orientació al programa del gen RUNX1 és una característica habitual de AML MLLr.

Image

Caracterització d'elements reguladors distals lligats a MLL-AF9. ( a ) Senyal mitjà de RUNX1 i CTCF als gens objectiu MLL-AF9 i MLL WT. ( b ) Taxa de coocupació dels gens objectiu MLL-AF9 i MLL WT de RUNX1 i CTCF (esquerra). Nivell d'expressió de gens objectiu MLL-AF9 agrupats per coocupació RUNX1. *** P <0, 001 (prova de Welch's) (dreta). ( c ) Senyal mitjà sobre potenciadors lligats MLL-AF9 (esquerra) i MLL WT (dreta) per a H3K4me3 i H3K27ac (superior), MLL i AF9 (mig) i RUNX1, CTCF i H3K79me2 (a baix). ( d ) Distribució genòmica dels potenciadors MLL-AF9 i MLL WT (a l'esquerra superior). Coocupació de potenciadors lligats MLL-AF9 i MLL WT mitjançant CTCF, H3K79me2 i RUNX1 z (a la part superior dreta). Nivells d’expressió de potenciadors intergènics MLL-AF9 i MLL WT (a l’esquerra inferior). Nivell d’expressió de potenciadors lligats a MLL-AF9 agrupats per la coocupació H3K79me2. * P <0, 05 (prova de t de Welch). ( e ) Enriquiment de motius familiars per a potenciadors lligats a MLL-AF9. ( f ) Vista general del locus HOXA a les cel·les THP-1 que mostren l'alineació d'AF9, MLL, H3K79me2, H3K4me3, H3K27ac, RUNX1 i senyal d'expressió RNA amb el límit d'HOXA TAD (caixa gris). ( g ) Enriquiments de camins de gens actius més propers a un potenciador lligat a MLL-AF9 dins del mateix TAD. ( h ) Interaccions de llarg abast dels promotors BCL2 i PHLPP1, mesurades per 4C-seq en cèl·lules THP-1 (barres negres, q <0, 01) alineades amb patrons ChIP-seq de MLL, AF9 i H3K27ac en potenciadors lligats a MLL-AF9 ( caixes grises). Les fletxes posen de manifest exemples d'interaccions dels promotors amb garantia lligada a MLL-AF9.

Imatge a mida completa

Unió de fusió MLL a les regions reguladores distals

Les leucèmies de MLL s'han descrit en gran mesura per funcionar mitjançant l'allargament aberrant de gens objectiu de MLL. Tot i això, ja que vam observar una part significativa (~ 25%) dels pics MLL-AF9 i MLT WT que es produeixen a les regions distals (Figura 1g, dreta), es va proposar a continuació caracteritzar aquests potenciadors de lligat MLL. Els pics de MLL distals superposats amb els pics H3K27ac van produir 342 potenciadors actius lligats a MLL-AF9 i 75 MLL WT amb un senyal H3K27ac alt i baix H3K4me3 (figura 4c, superior i mitjana, taula suplementària S5). Curiosament, mentre que RUNX1 es va detectar tant en els pics de potenciació MLL-AF9 com MLL WT, els senyals CTCF i H3K79me2 eren específics per a potenciadors lligats a MLL-AF9 (figura 4c inferior, figura suplementària S4A).

Com que els potenciadors MLL-AF9 i MLL WT ocupen regions tant intergèniques com intròniques (figura 4d, a la part superior esquerra), encara hem caracteritzat només el conjunt de potenciadors intergènics lligats a MLL per evitar la barreja de signatures de cromatina del cos genètic i potenciadors intrònics. Un percentatge més gran de potenciadors enllaçats amb MLL-AF9 (39%) que els potenciadors lligats a WT (12%) van ser marcats per H3K79me2 (figura 4d, a la part superior dreta). Això podria reflectir la deposició aberrant de la marca d'histona per DOT1L lligada a la proteïna de fusió MLL-AF9. Les diferències RUNX1 van ser menys marcants, mentre que el pic de CTCF està present en el 50% de totes les regions intergèniques lligades a MLL-AF9, enfront de l’11% per a MLL WT, apuntant cap a una interacció més gran amb el mediador per als potenciadors de fusió de MLL. Al costat d'això, les regions potenciadores intergèniques lligades a MLL-AF9 mostraven una expressió significativament més alta de RNA potenciador que les regions lligades a WT de MLL (Figura 4d, a l'esquerra inferior), amb les regions intergèniques lligades a MLL-AF9 co-ocupades per H3K79me2 mostrant un parell expressió superior (figura 4d, a la part inferior dreta). En conjunt, aquestes troballes indiquen que les regions potenciadores lligades a MLL-AF9 estan activades epigenèticament més que les seves homòlegs WT i podrien mostrar una deposició i expressió aberrants de H3K79me2 degut a la unió de la proteïna de fusió MLL.

A continuació, ens vam preguntar com es compararien els llocs d’unió distal identificats a les cèl·lules MV4-11 per a la fusió de MLL-AF4 amb els potenciadors lligats a MLL-AF9, ja que una diferència d’elements reguladors distals podria explicar la diferència d’expressió gènica que vam trobar entre la MLL. Gens de destinació específic -AF9- i -AF4 (Figura 3f). Les regions d'unió distal activa MLL-AF4 es van agrupar de manera similar basant-se en H3K27ac (tot i que el senyal mitjà H3K27ac era menor en comparació amb les regions distants MLL-AF9), senyals MLL i AF4 (figura suplementària S4B, taula suplementària S5). A diferència dels gens objectiu de fusió MLL, no hi havia pràcticament cap solapament (2%) entre els potenciadors MLL-AF9 i MLL-AF4, cosa que indica que el conjunt principal de gens objectiu comú podrien estar regulats per un conjunt variable de regions reguladores en les diferents fusions MLL. . Curiosament, vam observar la mateixa disminució de la coocupació de H3K79me2 en els potenciadors intergènics MLL-AF4 versus MLL WT, mentre que la coocupació RUNX1 va ser lleugerament més elevada en el conjunt WT, i no hi va haver cap diferència significativa en l’expressió d’ARN augmentador entre MLL-AF4 i WT. Es van observar potenciadors intergènics de la MLL (figura suplementària S4C). Això podria indicar que, com que el paisatge epigenètic dels potenciadors actius lligats a MLL-AF9 i MLL-AF4 és similar a excepció d’un senyal H3K27ac inferior, l’activitat transcripcional d’aquests elements podria restringir-se a la leucèmia basada en MLL-AF9, potencialment com a resultat de diferències de presència complexa (DOTCOM vs SEC) o d’ocupació H3K27ac.

A continuació, ens proposem determinar els gens amb els que potser interactuen. La majoria de regions potenciadores lligades a la fusió de MLL es troben entre 5 i 500 kb del TSS més proper (Figures suplementàries S4D i E). Tanmateix, com el TSS més proper a un potenciador no és necessàriament el que actua, vam perfeccionar la nostra llista de gens més propers en comparació amb les dades de domini (TAD) associades topològicament i només incloent gens actius. Per a això, vam combinar les dades d’enllaç de CTCF en THP-1 amb TADs en monòcits humans, determinats per HiC (TK, S-YW i HGS, en preparació) per obtenir una distribució aproximada de TADs. Posteriorment, vam relacionar els potenciadors lligats a MLL-AF9 al gen actiu més proper (marcat amb H3K27ac) dins del mateix TAD, resultant en 247 gens regulats posativament per potenciadors lligats a MLL-AF9, inclosos BCL2, PHLPP1, RUNX1 i SPI1 (taula complementària) S6). Vam confirmar que la nostra llista TAD THP-1 inclou la frontera als 5 ′ del clúster HOXA, tal com es descriu a les cel·les THP-1 47 (Figura 4f), i vam realitzar una validació addicional mitjançant experiments 4C-seq en els promotors de BCL2 i PHLPP1, ambdós gens identificats en aquest estudi MLL-AF9 són identificats com a esquer. Això va permetre confirmar les interaccions formades per aquests promotors amb potenciadors actius lligats a MLL-AF9 (Figura 4h).

Curiosament, dels 247 gens regulats per potenciadors ocupats per MLL-AF9, el 25% (61) són gens ocupadors del gen / promotor de MLL-AF9, gens significativament ( P <0, 0001) que en una selecció aleatòria de gens. Al costat d’això, l’anàlisi de la ruta de GSEA (gene set enriching analysis) d’aquest conjunt de 247 gens va revelar un fort enriquiment del càncer ( q <1e −5 ), CMYB ( q <1e −5 ), AML ( q <1e −4 ) i les vies del sistema immune ( q <1e −4 ) (figura 4g), que proporcionen una forta indicació que aquests gens i els seus potenciadors putatius estan implicats efectivament en la leucemogènesi i / o manteniment mediada per MLL-AF9.

Expressió de targetes MLL-AF9 a les cel·les primàries

Finalment, vam comparar l’expressió gènica de les línies de cèl·lules de fusió MLL i les explosions primàries d’AML amb les cèl·lules progenitores hematopoietiques CD34 + i els monòcits humans primaris (taula suplementària S7). Vam establir que el pacient explota cúmul per separat de cèl·lules CD34 + i monòcits (Figura 5a), A continuació, ens vam centrar en el subconjunt de gens objectiu de fusió MLL i vam investigar la seva propagació per l'anàlisi del component principal (PC) (Figura 5b, Taula complementària S8). Vam trobar que les mostres de fusió de MLL primàries i les línies cel·lulars es diferencien dels monòcits per un component principal (PC1) i de les cèl·lules CD34 + per un altre (PC2), fet que es confirma amb l’anàlisi funcional de les vies associades a PC1 (figura 5c, a l’esquerra superior) i anàlisi de la RPKM mitjana de gens en PC1 en els diversos tipus de cèl·lules, que va revelar una major difusió dels nivells d’expressió d’aquest subconjunt en monòcits (figura 5c, a l’esquerra inferior). L’anàlisi funcional analògica de PC2 va revelar l’enriquiment per a les vies més associades a les cèl·lules progenitores divisores (CD34 + ) (figura 5c, a la dreta superior) i una mitjana CD34 + RPKM amb una propagació més alta (figura 5c, a la part inferior dreta). Juntament, això suggereix que les fusions MLL associades a les AML imposen un bloqueig durant la diferenciació de monòcits.

Image

Nivells d’expressió gènica de explosions de pacients amb MLL-AF9 en comparació amb cèl·lules CD34 +, monòcits i explosions d’AML. ( a ) Agrupació basada en distància en l'expressió de tots els gens refSeq hg19. ( b ) Anàlisi de PC sobre l'expressió de gens objectiu de MLL-AF9. ( c ) Enriquiments de ruta dels gens objectiu MLL-AF9 a PC1 (a l'esquerra superior) i a PC2 (a la part superior dreta). Nivells d’expressió de gens objectiu MLL-AF9 a PC1 (a l’esquerra inferior) i PC2 (a baix a la dreta). ( d ) Distribució de TFs AP2, C2H2-Zf, ETS, NR, POU i T-box expressats de manera diferent. Punts verds: valor ajustat de Benjamini – Hochberg -P4; punts taronja: Valor P ajustat per Benjamini – Hochberg. ( e ) La agrupació a distància euclidiana de 74 TF es va expressar de manera significativa en cèl·lules MLL-AF9 enfront de monòcits, cèl·lules CD34 + i MLL-AF4. ( f i g ) Mitjana RPKM de MLL-AF9 AML AML alta ( f ) i baixa ( g ) TF expressada en cèl·lules CD34 + ( n = 3), THP-1 ( n = 2), MV4-11 ( n = 1), explosions monòcits ( n = 3), explosions MLL-AF9 ( n = 5), explosions AML-ETO (CGA, n = 7), explosions CBFß-MYH11 (CGA, n = 11), explosions MLLr (CGA, n = 11) ), Explosions PML-RAR (CGA, n = 16) i altres AML (CGA, n = 134).

Imatge a mida completa

Per identificar els factors de transcripció (TFs) que cooperen amb la fusió de MLL en la leucemogènesi impulsora, es va investigar si l’expressió de 878 TF associades a les famílies de motius enriquits amb fusió MLL (Figures 2e i 4e, Figures complementàries S2H i S4F) és diferent entre Cèl·lules positives amb fusió MLL, cèl·lules CD34 + i monòcits. S'han identificat 146 TF diferenciades expressades en un o més tipus de cèl·lules (figura 5d, punts verds, taula suplementària S9). Posteriorment, vam filtrar aquests TF basant-nos en un tall de RPKM de 5 en almenys una mostra, similar a la de les mostres MLL-AF9, i una desviació de la mitjana en la mateixa direcció en almenys 2 mostres, i vam agrupar les 74 restants. TF en patró d’expressió en monòcits, cèl·lules CD34 + i cèl·lules que expressen MLL-AF9 i MLL-AF4, revelant 6 grups de TF (figura 5e), cadascun dels quals s’expressa diferencialment en cèl·lules MLL-AF9 en comparació amb tipus de cèl·lules normals o MLL. -Cèl·lules que expressen AF4 i que poden estar implicades en la co-regulació de llocs d’unió a MLL-AF9. Per confirmar aquesta especificitat, vam comparar els resultats de agrupament amb l’expressió en altres tipus d’AML (Ley et al. 48 ). Això va identificar tres factors, ZNF521, ZNF433 i ZNF532, per als quals es va augmentar l'expressió (figura 5f) en cèl·lules positives MLL-AF9 només, cosa que suggereix que aquestes col·laboren amb MLL-AF9 en la desregulació de l'expressió gènica i la conducció de la leucemogènesi i diversos factors que supprimeixen tumors., com ETV3, NR4A1 i EGR2 l'expressió dels quals (figura 5g) està regulada a la MLLr i tots els altres tipus d'AML inclosos en l'anàlisi. La desregulació de, per exemple, ZNF521, NR4A1 i EGR2, ha estat efectivament prèviament implicada en AML. 49, 50, 51

En resum, aquests resultats mostren que els gens objectiu de fusió de MLL identificats en aquest estudi es poden dividir en un grup que es comporta més com les cèl·lules CD34 + i un grup que es comporta més com els monòcits. De la mateixa manera, l'expressió de membres de la família TF els motius dels quals es van enriquir amb els gens i potenciadors MLL-AF9 i -AF4 objectiu i potenciadors també es poden classificar com a CD34 + similar, com a monòcits o específics de MLLr. La pertorbació dels patrons d’expressió gènica normal tant d’objectius directes de MLLr com de TFs co-reguladores produeix potencialment el fenotip leucemogènic presenciat en AML translocada per MLL.

Discussió

En aquest estudi, es va investigar la signatura epigenètica i unió a tot el genoma de MLL-AF9, MLL-AF4 i WT MLL en línies cel·lulars derivades d’AML que porten les respectives fusions MLL. L’enriquiment del senyal H3K79me2, H3K27ac i RUNX1 va ser elevat tant en els gens objectiu MLL-AF9 com en MLL-AF4. L’enriquiment d’H3K79me2 confirma que la deposició d’aquesta modificació d’histona en gens gens de fusió de MLL activats de forma aberrant també és una característica d’AML induïda per MLL-AF4, com es va demostrar per a MLL-AF4 en models ALL murins i humans. 22, 36 La deposició de H3K79me2 és possiblement desregulada en totes les leucèmies agudes de MLLr que impliquen un component de la SEC mitjançant associació indirecta de la SEC amb DOT1L via AF9 o ENL. 52, 53 Tanmateix, ja que l’H3K79me2 s’enriqueix en tots els gens activats en general i no només en els objectius de fusió de MLL activats de manera anormal, la inhibició de la funció DOT1L per aturar la deposició 9 de H3K79me2 no específicament , 54 pot introduir efectes no desitjos fora de la destinació.

L’enriquiment d’H3K27ac en els promotors de gen objectiu de la MLLr activat de manera aberrant -i BRD4 que és un objectiu de MLLr- corrobora el paper facilitador de les proteïnes de bromodomana en la transcripció de les dianes de MLLr, 55 com es desprèn de la susceptibilitat de la AML a la inhibició de la BET. 56 Això suggereix un bucle de retroalimentació positiva on la transcripció de les targetes MLLr és facilitada per BRD4, i BDRD4 es transcriu perquè és una destinació de MLLr.

El gran solapament entre llocs d’unió de MLLr i RUNX1 i la identificació de RUNX1 com a gen objectiu de MLLr suggereix que MLLr AML desregula (un subconjunt) el programa RUNX1, important per al desenvolupament hematopoètic. 57 Aquesta és una reminiscència de la forma en què la oncofusió CBFß-MYH11 modula l'expressió de les dianes RUNX1 37 i AML1-ETO pot augmentar l'expressió d'un subconjunt de objectius RUNX1. 58, 59 Junt amb l'expressió aberrant de gens com MYC en la majoria de subtipus AML, 60, 61 això suggereix l'existència d'un conjunt bàsic de gens, inclòs un subconjunt del programa RUNX1, important per a la transformació i el manteniment leucèmics en la translocació. AML induït

A més de la fusió de MLL que s'uneix a les regions promotores, tal com s'esperava pel consens de MLLr que actua mitjançant l'activació aberrant de gens objectiu de MLL, vam determinar un nombre significatiu de llocs d'unió a la fusió de MLL en elements reguladors distals actius enriquits per a H3K27ac, H3K79me2 i RUNX1 i a prop dels gens enriquits per les vies relacionades amb la leucèmia. A la vista d’això, sembla probable que MLLr no només actuï directament sobre els seus gens objectiu, sinó que també pugui modular l’expressió dels gens objectiu mitjançant elements reguladors distals. Els potenciadors lligats a MLL-AF4 i MLL-AF9 no mostraven gairebé cap solapament, cosa que indica que cada subtipus MLLr té un repertori de potenciadors distint. Això està en línia amb diversos estudis que vinculen diferències en la resistència adquirida i innata a la inhibició de la BET en diverses línies cel·lulars AML i diferents clons a un paisatge dinamitzador o variable. 12, 62

A més, els potenciadors enllaçats amb MLL-AF9 estan enriquits per a la unió CTCF, que està en línia amb les cèl·lules AML MLLr que responen al tractament amb inhibidors de la cinasa mediadora. Això suggereix un paper actiu per a la MLL-AF9 en la modulació de la conformació de la cromatina per facilitar l'expressió gènica objectiu mitjançant la interferència amb la interacció entre CTCF, RAD21 (cohesina) i el complex mediador. 63, 64

Hem extret un conjunt estès de gens de target target MLLr bàsics incloent objectius coneguts com MYC, RUNX1, BCL2 i CDK6, que pot ser utilitzat per desenvolupar noves estratègies de lluita contra les leucèmies MLLr, per exemple, per ajustar l’orientació de tractaments potencials existents., com ara la inhibició de DOT1L, 7, 9, 54 BLC2i 65 o BET 11 només de gens objectiu de fusió MLL. Al costat d’això, els conjunts descoberts de gens objectiu específics de MLL-AF9 i -AF4, com ZNF521 i CDKN2A, respectivament, indiquen que cada soci de fusió específic també té la seva signatura d’enllaç única, que pot ser explotada contra explosions de MLLr amb resistència davant un tractament més general, com la inhibició de la BET. 55

Finalment, demostrem que l'expressió gènica dels gens objectiu de MLL-AF9 es pot dividir en grups CD34 + i com a monòcits, mantenint així les cèl·lules leucèmiques positives MLL-AF9 en un estat entre les cèl·lules progenitores CD34 + i els monòcits totalment diferenciats. Així mateix, els TF de famílies amb motius enriquits en els objectius de fusió de MLL es poden dividir en grups CD34 +, similars a monòcits i específics de MLLr, descobrint TFs com ZNF521 i ZNF433 que participen indirectament en l’expressió o la selecció de gens objectiu de MLLr. i TF que suprimeix tumor, com ETV3 i NR4A1, que estan regulades a la baixa en les leucèmies MLLr. Curiosament, ZNF521 també és un objectiu de MLL-AF9, cosa que suggereix un bucle de feed-forward de ZNF521 i el programa leucèmic MLL-AF9.

Materials i mètodes

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules THP-1 33 i MV4-11 66 es van cultivar de forma rutinària en RPMI 1640 complementades amb 10% sèrum fetal de vedella i 1% penicil·lina / estreptomicina a 37 ° C en una incubadora humidificada amb 5% de CO 2 . L’estat del micoplasma es va determinar cada 6 mesos.

Mostres de pacients

En el diagnòstic es van recollir mostres de medul·la òssia de pacients amb LMA positiva amb MLL-AF9. L’estudi s’ha realitzat d’acord amb la Declaració de Hèlsinki i les directrius i regulacions institucionals (OCM 2013/064). Les dades del pacient es resumeixen a la taula 1.

Taula completa

ChIP i ChIP-seq

La cromatina a partir de les línies cel·lulars es va collir tal com es descriu. 67 ChIPs es van realitzar mitjançant anticossos contra MLL-1, AF9, AF4, RUNX1, H3K4me3, H3K27ac i H3K79me2 i es van analitzar per qPCR o seqüenciació. L’ocupació relativa es va calcular com a doble sobre fons, per a la qual cosa es va utilitzar el promotor del gen Myoglobina.

Revers transcriptasa: qPCR i ARN-seq

Es va extreure ARN total amb TRIzol (Invitrogen, Bleiswijk, Països Baixos) o RNAsol (GenDepot, Barker, TX, EUA), tractat amb ADNse a la columna (Qiagen, Venlo, Països Baixos) i analitzat per transcriptasa inversa-qPCR o específica per cadena. seqüenciació.

Seqüenciació d'alt rendiment a la llum

ChIP-seq and RNA-seq libraries were prepared according to the manufacturer's instructions (Illumina, Eindhoven, The Netherlands). All data can be downloaded from the Gene Expression Omnibus GSE79899, GSM1631708, GSM1704846 and GSM1704847 or through the Blueprint DCC (//dcc.blueprint-epigenome.eu/#/home).

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

Fitxers Excel

  1. 1.

    Informació complementària

    La informació complementària acompanya aquest article al lloc web d'Oncogene (//www.nature.com/onc)