La supressió de myt3 sensibilitza les cèl·lules illes a la mort cel·lular elevada per la glucosa mitjançant la inducció bim | mort i malaltia cel·lular

La supressió de myt3 sensibilitza les cèl·lules illes a la mort cel·lular elevada per la glucosa mitjançant la inducció bim | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Diabetis

Resum

La diabetis és una malaltia crònica que resulta de la incapacitat del cos per controlar adequadament els nivells de glucosa en circulació. La pèrdua d’homoeòstasi de glucosa pot originar-se per la pèrdua de massa β -cell a causa d’un atac intermèdia cel·lular, com en la diabetis tipus 1 i / o d’una disfunció de cèl·lules β individuals (conjuntament amb la resistència a la insulina de l’òrgan objectiu), com en la diabetis tipus 2. Una millor comprensió de les vies transcripcionals que regulen la supervivència de les cèl·lules illots és de gran importància per al desenvolupament d’estratègies terapèutiques dirigides a les cèl·lules β per a la diabetis. Amb aquesta finalitat, anteriorment identificàvem el factor de transcripció Myt3 com un factor pro-supervivència als illots després de la supressió aguda de Myt3 in vitro . Per determinar els efectes de la supressió de Myt3 sobre la supervivència de cèl·lules illots in vivo , es va utilitzar un adenovirus per expressar un shRNA dirigit a Myt3 en trasplantaments de illots òptics i marginals de massa òptics i genètics , i demostrar que la supressió de Myt3 deteriora la funció dels empelts de massa marginals. L'anàlisi d'empelts 5 setmanes posteriors al trasplantament va revelar que els empelts transductos amb l'adenovirus sh Myt3 contenien ~ un 20% el nombre de cèl·lules transduïdes com a empelts transductos amb un adenovirus control. De fet, l’augment d’apoptosi i la pèrdua de cèl·lules significativa en els empelts de Myt3 transvasats va ser evident després de només 5 dies, cosa que suggereix que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illes a les tensions presents en el període post-trasplantament inicial. Concretament, trobem que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illots a la mort de cèl·lules induïda per la glucosa elevada mitjançant la regulació del pro-apoptòtic de la família Bcl2 Bim. Unides aquestes dades suggereixen que Myt3 pot ser un enllaç important entre les vies de senyalització glucotòxica i immune.

Principal

La diabetis tipus 1 (T1D) resulta de l’autoimmunitat que condueix gradualment a una pèrdua de cèl·lules β i hiperglucèmia. Es creu que el reclutament i l'activació de cèl·lules T autoactives dirigides a cèl·lules β és el procés inflamatori primari que condueix la malaltia. 2, 3, 4 cèl·lules immunes reclutades produeixen Fas, perforina, IL-1 β , TNF α i IFN γ que s’uneixen als receptors a la superfície de les cèl·lules β , provocant l’activació de cascades de senyalització a l’aire i induint canvis en l’expressió gènica β -cell. amb la inducció de la disfunció β -cell i l'apoptosi. 5, 6, 7, 8, 9, 10 És fonamental que desenvolupem estratègies per aturar l’assalt immune als illots i prevenir els canvis induïts per la citocina en l’expressió i l’apoptosi del gen βcell. No obstant això, hi ha importants mancances en la comprensió dels processos reguladors i dels mediadors descendents de la disfunció β -cell induïda per la citocina i la mort que cal abordar per desenvolupar nous enfocaments terapèutics per bloquejar els efectes perjudicials de l’assalt immunitari durant la progressió de la diabetis. i trasplantament d’illots.

Per millorar la nostra comprensió dels canvis d’expressió gènica induïts per la citocina, vam optar per centrar-nos en el factor de transcripció de la mielina 3 ( Myt3 ), també conegut com a supressor de la tumorigenicitat 18 ( St18 ), un factor de transcripció del dit de zinc amb el dit C2HC molt expressat en illots pancreàtics. 11 Ja vam establir anteriorment que l'exposició dels illots a IL-1 β , TNF α i IFN γ suprimeix l'expressió Myt3 de manera concentrada i dependent del temps. També vam demostrar que la supressió de Myt3 a illots ex vivo , durant tan sols 48 h, produeix una mort augmentada de cèl·lules d’illots. 12 Aquestes dades suggereixen que Myt3 pot participar en el desenvolupament de la diabetis aigües avall d’assalt immune. Aquí, per determinar el paper de Myt3 en la funció de l’illot i la supervivència in vivo, es van realitzar trasplantaments d’ isuls sintènics de massa òptima i marginal i es va valorar l’homeòstasi de la glucosa i la histologia de l’empelt. Es va plantejar la hipòtesi que en aquest model la supressió de Myt3 induiria l'apoptosi de cèl·lules illetes , donant suport a la nostra hipòtesi que Myt3 és un regulador clau de la supervivència de les cèl·lules illots.

Resultats

La supressió de Myt3 deteriora la funció marginal, però no òptima, de l'empelt d'illot syngeneic

Per confirmar la utilitat dels empelts de l’illot syngeneic com a model amb el qual estudiar els efectes in vivo de la supressió de Myt3 , primer es van presentar ratolins femenins C57 / B6N diabètics mitjançant tractament amb estreptozotocina (STZ) i posteriorment els vam trasplantar amb una massa òptima (300). d’illots i es va valorar l’expressió Myt3 en els empelts més de cinc setmanes. L’expressió Myt3 durant aquest període de temps semblava mantenir-se en els empelts a un nivell similar al dels illots adults, cosa que indica que és un model adequat per estudiar els efectes de la supressió de Myt3 sobre la supervivència i la funció de l’empelt (figura suplementària S1). Com a tal, hem trasplantat ratolins diabètics STZ, com anteriorment, amb una massa òptima (300) o amb una massa marginal (150) d’illots transducits amb adenovirus que expressen un shRNA dirigit a Myt3 (sh Myt3 ) o un control de la contraposició (sh Scramble ). El seguiment dels nivells de glucosa en sang alimentats aleatòriament de ratolins que reben òptims òptims va demostrar que tant els empelts transferits com el Scramble i el Myt3 eren igualment capaços de normalitzar els nivells de glucosa en sang (figures 1a i b). A més, no hi va haver cap diferència en la capacitat que els empelts de Sh Scramble o sh Myt3 de respondre a un repte a la glucosa determinat mitjançant la realització de proves de tolerància intraperitoneal a la glucosa (IPGTT) durant 5 dies o 5 setmanes després del trasplantament (Figs complementàries S2a-f).

Image

La supressió de Myt3 deteriora la funció marginal però no òptima de l'empelt d'illots. ( a ) Mesures de glucosa en sang alimentades a l’atzar per a ratolins trasplantats amb una massa òptima (300 illots) d’ il·lots transvasats de sh Scramble o de Myt3. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de set experiments independents. ( b ) Àrea sota la corba per fer mesures de glucosa en sang des del dia 1 fins al 35 trasplantament òptim. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de set experiments independents. ( c ) Mesures aleatòries de la glucosa en sang produïda per ratolins trasplantats amb una massa marginal (150 illots) de sh Scramble - o sh Myt3 -illots traduïts. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de cinc experiments independents. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 comparant ratolins que reben empelts mitjançant illots sh -transformats de Myt3 amb ratolins que reben empelts mitjançant sh Scramble - illots transduits (ANOVA bidireccional). ( d ) Àrea sota la corba per fer mesures de la glucosa en sang des del dia 1 fins al 35 trasplantament sub-òptim. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de cinc experiments independents. *** P <0.001 comparant ratolins que reben empelts utilitzant illots de Myt3 -transduits per ratolins que reben empelts mitjançant sh Scramble - illots transduïts (prova no t aparejada). ( e ) Corba de supervivència de Kaplan – Meier comparant el temps per tornar a la normoglicèmia per a ratolins que reben trasplantaments de massa marginals d’illots sh Scramble - o de Myt3. Els ratolins es consideraven no diabètics després de dues mesures consecutives de glucosa en sang <12 mM

Imatge a mida completa

D’altra banda, els ratolins trasplantats amb una massa marginal d’ il·lots transportats per Myt3 van tenir nivells de glucosa en sang significativament més alts dels dies 7 al 21 després del trasplantament ( P <0, 05), en comparació amb els ratolins trasplantats amb illots transvasats (Fig. 1c i d). Després del dia 21, els ratolins trasplantats amb illots de Myt3- transduïts van començar a normalitzar-se, però encara tenien nivells de glucosa en sang més elevats i van tenir un temps significativament endarrerit per restablir la normoglicèmia ( P <0, 01; dues mesures de glucosa en sang per sota dels 12 mM) ( Figura 1e). A les cinc setmanes posteriors al trasplantament, els ratolins que van rebre illots transduïts de Myt3 també van ser moderadament menys capaços de respondre a un desafiament de glucosa, però tampoc els empelts de Scramble i Myt3 van poder reestabilitzar els nivells de glucosa en sang en el període de temps de l’IPGTT. i aquesta diferència no va ser significativa (figures complementàries S2g – i). Agrupades, aquestes dades suggereixen que, tot i que en els ratolins trasplantats amb una massa òptima d’ il·lots de Myt3 sh resten massa massa β -cell per normalitzar els nivells sanguinis, en els trasplantaments de massa marginal la supressió de Myt3 perjudica la capacitat dels empelts per establir normoglicèmia.

La supressió de Myt3 augmenta la mort de les cèl·lules en trasplantaments d'illots syngeneic

Per determinar si la pèrdua de cèl·lules va provocar la supressió de Myt3 en els empelts de l’illa, vam realitzar una immunohistoquímica en empelts recollits a partir de trasplantaments de massa d’illots òptims, per centrar-nos en els efectes directes de Myt3 en la pèrdua β -cell, en absència d’estrès ER i altres factors confusos que podria ocórrer en trasplantaments de massa marginal. L'anàlisi FACS dels illots transduits abans del trasplantament, basat en GFP (que es co-expressa amb el shRNA), va mostrar una eficiència de transducció del 35–40% tant per adenovirus sh Myt3 com sh ( Scramble Adenoviruses). L'anàlisi d'empelts 5 dies posteriors al trasplantament va demostrar que els empelts trans-traduïts amb Scramble encara contenien aproximadament un 40% de cèl·lules transduïdes, mentre que els empelts transmetats amb Myt3 només contenien ~ 25% de cèl·lules transduïdes ( P <0.05) (Figures 2a i c). En canvi, el cultiu de illots sh- Scramble o sh Myt3 -in -transducció in vitro durant 5 dies a la matriu extracel·lular 804G no va afectar el nombre de cèl·lules islotes positives de GFP (figures complementàries S3c i d), ni va augmentar significativament els nivells d'apoptosi ( Figs suplementàries S3e i f). Mentrestant, la quantificació de l'àrea GFP en els empelts 5 setmanes posteriors al trasplantament va demostrar que els empelts de Myt3 només contenien un 2-3% de cèl·lules positives amb PFP , cinc vegades menys que el que es troba en els empelts de rampes (13%; P <0, 001) ( Les figures 2b i c). Tenint en compte que la pèrdua de cèl·lules semblava ser la més ràpida a principis del període d’empelt (gairebé el 40% de les cèl·lules transferides de Myt3 es van perdre els primers 5 dies després del trasplantament), es va valorar el nombre de cèl·lules positives-caspasa-3-positives 5 dies. posttrasplantament. En aquest moment, els empelts trans-traduïts de Scramble només contenien unes quantes cèl·lules positives-caspasa-3-positives (~ 1, 7%), mentre que els empelts -transduïts de Myt3 contenien tres vegades més de cèl·lules positives-caspasa-3-positives (~ 5, 3%) ( Les figures 2d i e), indicant que la supressió de Myt3 va augmentar significativament el nivell d’apoptosi en els empelts ( P <0.05).

Image

La pèrdua de cèl·lules transferides de Myt3 es produeix en els cinc dies posteriors al trasplantament. sh Scramble - i sh Myt3 -empelts -transduits per empelts ( a ) 5 dies o ( b ) 5 setmanes després del trasplantament es van tacar per insulina (vermella) i GFP (verd) per marcar cèl·lules transduïdes. Els nuclis estan etiquetats amb Topro3 (blau). La línia de guions blanca representa el límit de l'empelt. Els capçals de fletxa groga indiquen cèl·lules co-positives d’insulina i insulina representatives. Barres d’escala: barra blanca = 75μm. ( c ) Quantificació de l’àrea de GFP en sh Scramble - i en greixos d’ il·lots transportats per Myt3 abans del trasplantament, 5 dies i cinc setmanes després del trasplantament. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents. * P <0, 05, *** P <0, 001 comparant empelts utilitzant illots de Myt3 -transducs versus empelts utilitzant illots transportats per Scramble ( test t desparellat). ( d ) Els greixos es van tacar amb insulina (vermell) i es va tallar la caspasa-3 (verda). Els nuclis estan etiquetats amb Topro3 (blau). La línia de guions blanca representa el límit de l'empelt. Els caps de fletxa grocs indiquen la insulina representativa i les cèl·lules co-positives de la caspasa-3 escindida. Barres d’escala: barra blanca = 25 μ m. ( e ) Quantificació del percentatge de cèl·lules empel·lades que han estat tacades per a la caspasa escindida-3. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents. * P <0.05 comparant els empelts utilitzant illots transportats per Myt3 versus empelts utilitzant illots transportats per Scramble ( test no separat)

Imatge a mida completa

L’eficàcia de transducció de cèl·lules illots entre el 35 i el 40% que hem obtingut ens explica probablement que no s’havia detectat cap disfunció d’empelt observable en ratolins que rebessin una massa òptima d’illots transduïts de Myt3 . De fet, la quantificació del nombre de cèl·lules α i β en aquests empelts tant als 5 dies (figures 3a i b) com a les 5 setmanes (figures 3c i d) posteriors al trasplantament van indicar que es mantenen un nombre adequat de cèl·lules α i β. per mantenir la normoglicèmia, malgrat la pèrdua selectiva de cèl·lules islotes traduïdes per Myt3. Independentment, el fet que la supressió de Myt3 va augmentar significativament el nivell d’apoptosi en els empelts transmetats per Myt3 després de només 5 dies, però no va augmentar significativament l’apoptosi de les cèl·lules illetes durant el mateix període de temps in vitro , fa pensar que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules de les illes a patir apoptosi en resposta a les tensions enfrontades específicament dins dels empelts.

Image

sh Les cèl·lules traduïdes de Myt3 es perden dels empelts sense alterar la composició de l'empelt. ( a ) sh Els empelts d’ isul transmetats a Scramble - i sh Myt3 5 dies després del trasplantament es van tacar d’insulina (vermella) i glucagó (verd) per marcar les cèl·lules transduïdes. Els nuclis estan etiquetats amb Topro3 (blau). Les línies de guions blanques representen els límits de l'empelt. Barres d’escala: barra blanca = 75 μ m. ( b ) Quantificació de la zona d'insulina i glucagó a ( a ). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents. ( c ) sh Els empelts d’illots transvasats en Scramble i Myt3 durant cinc setmanes després del trasplantament es van tacar d’insulina (vermell) i glucagó (verd). Els nuclis estan etiquetats amb Topro3 (blau). Les línies de guions blanques representen els límits de l'empelt. Barres d’escala: barra blanca = 75 μ m. ( d ) Quantificació de la zona d'insulina i glucagó a ( c ). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents

Imatge a mida completa

La supressió de Myt3 augmenta l’expressió de la quimiocina però no la infiltració immune

Les citocines produïdes per cèl·lules immunes infiltradores de illots indueixen l'expressió de quimiocines i citocines proinflamatòries en cèl·lules β que actuen per reclutar cèl·lules immunes addicionals, contribuint a la disfunció β -cell i a l'apoptosi. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17, 18 La reanàlisi de les dades de RNA-seq que prèviament generavem 19 va demostrar que la supressió de Myt3 indueix l'expressió de diverses quimiocines, incloses Ccl2, Cxcl10 i Ccl20 (Figura suplementària S4a) i, per tant, es va intentar determinar la importància d'aquesta augment de l'expressió de quimiocines per a la pèrdua de cèl·lules illotes que es va transferir per Myt3 en els nostres empelts. La validació en cadena de la polimerasa en temps real quantitativa (qPCR) va demostrar que una reducció de 2, 4 vegades ( P <0, 001) en l'expressió Myt3 va donar lloc a un augment significatiu de l'expressió de Ccl2 (3, 7 vegades, P 0, 05) , Cxcl10 (7, 7- plec, P 0.05) i Ccl20 (8.3-plec, P 0.05) (figura suplementària S4b). Per determinar si l'expressió de quimiocines proinflamatòries induïda per Myt3 era suficient per impulsar el reclutament de cèl·lules immunes, es van inmunitzar els empelts dels illots per al marcador CD45 de les cèl·lules panimmunes tant als 5 dies com a les cinc setmanes posteriors al trasplantament. Tanmateix, la quantificació de la infiltració de cèl·lules immunes en els empelts demostrava que la infiltració era insignificant i equivalent entre sh Scramble i sh Myt3 -illots traduïts (figura suplementària S4c). Aquestes dades suggereixen que el nivell de producció de quimiocines induït per la supressió de Myt3 és insuficient per conduir el reclutament addicional de cèl·lules immunes a empelts de l’illa d’interior.

La supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illots a la mort cel·lular induïda per l’estrès metabòlic

Tenint en compte que la supressió de Myt3 va induir un nivell important de pèrdua de cèl·lules illots durant el període de temps en què es produeix l'empelt, es va intentar determinar si les cèl·lules islotes sensibilitzades per la supressió Myt3 van patir la mort cel·lular com a resposta a estrès experimentat durant aquest procés. 20, 21 Concretament, durant l'empelt, els trasplantaments d'illots estan exposats a estrès metabòlic significatiu, incloent hipòxia i privació de nutrients abans de la revascularització, hiperglucèmia després de revascularització inicial, així com estrès oxidatiu i estrès induït per exposició a citocines produïdes per cèl·lules immunes reclutades a el lloc de l’empelt. 21, 22, 23, 24, 25 Anteriorment , havíem determinat que l’exposició a la citocina suprimeix Myt3, 12 per la qual cosa inicialment hem intentat determinar l’efecte d’aquestes tensions cel·lulars addicionals en l’expressió Myt3 . Per això vam exposar cèl·lules illots a citocines (0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α ), glucosa alta (30 mM glucosa), glucosa baixa (2, 8 mM glucosa), hipòxia (1% O 2 ) o privació de nutrients (retirada sèrica). Això va confirmar que l'expressió de Myt3 està inhibida per l'exposició a citocines (1, 9 vegades, P <0, 01) i va demostrar que la hipòxia (2, 2 vegades, P <0, 01) i la glucosa baixa (2, 9 vegades, P <0, 01) inhibeixen de manera similar Myt3 (figura 4a ). Per determinar si la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illots a aquestes tensions, vam transduir cèl·lules illots disperses cultivades a 804G amb els nostres adenovirus Sh, Myt3 i sh, i posteriorment vam exposar les cèl·lules a cadascun dels estressors cel·lulars i vam controlar la mort cel·lular (mitjançant incorporació de PI). L’exposició de cèl·lules illots transduïdes de Myt3 a glucosa elevada durant 48 h va augmentar el nombre de cèl·lules positives PI per 3, 4 vegades ( P <0, 001) en comparació amb les cèl·lules transduïdes amb control d’arramplament (figura 4b) i 22, 5 vegades ( P <0, 001) en comparació amb els illots transportats per Myt3 en condicions normals de glucosa. La supressió de Myt3 , però, no va afectar significativament el nivell de mort cel·lular induït per cap dels altres estressors. Aquests resultats indiquen que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illots a la mort cel·lular elevada per la glucosa.

Image

La supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illots a la mort cel·lular elevada per la glucosa. ( a ) L’ expressió Myt3 es va determinar per qPCR després de l’exposició a glucosa d’11 mM (Control), 0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α (Citocina), glucosa elevada (30 glucosa mM), glucosa baixa (2, 8 mM glucosa), hipòxia (1% O 2 ) o inaminació sèrica (Sense FBS). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de quatre experiments independents. * P <0, 05, ** P <0, 01 comparant cèl·lules illots exposades als tractaments indicats en comparació amb la glucosa d’11 mM (Control) (ANOVA unidireccional). ( b ) La mort cel·lular es va mesurar mitjançant la incorporació d’ iòdur de propidi a les illes disperses de les illes transduïdes amb sh Scramble o els adenovirus sh Myt3 van ser exposats a glucosa d’11 mM (Control), 0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α (citocina), glucosa alta (30 mM glucosa), glucosa baixa (2, 8 mM glucosa), hipòxia (1% O 2 ) o inaminació sèrica (Sense FBS). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de cinc experiments independents. *** P <0.001 comparant les barres indicades (ANOVA de doble sentit)

Imatge a mida completa

Com que la supressió de Myt3 va sensibilitzar les cèl·lules illots específicament fins a la mort cel·lular elevada per la glucosa, vam determinar si la supressió de Myt3 agreuja l'expressió genètica relacionada amb l'estrès pro-apoptòtic, ER o oxidatiu-induït per la hiperglucèmia. La supressió de Myt3 va suposar un augment de 1, 7 vegades ( P <0, 01) en l'expressió de Bim induïda per una gran glucosa en comparació amb els controls tractats amb Scramble , però va tenir poc efecte en l'expressió d'altres gens pro-apoptòtics o gens induïts per ER- o estrès oxidatiu (figures 5a-d). A més, els nivells de proteïna homòloga C / EBP (CHOP) o factor d’iniciació eucariota fosforilat-2 (eIF2 α ) no van ser alterats, implicant que la supressió de Myt3 no afecta l’estrès ER induït per la hiperglicèmia en aquest context (figures 5e – g).

Image

La supressió de Myt3 augmenta l'expressió de Bim induïda per la glucosa a les cèl·lules illetes . Anàlisi qPCR de ( a ) l'expressió Myt3 , ( b ) gens de la família Bcl pro i anti-apoptòtics i ( c ) estrès ER o ( d ) gens induïts per l'estrès oxidatiu, en sh Scramble - o illots Myt3- traduïts sota normalitat. glucosa (NG) o altes condicions de glucosa (HG). ( e ) CHOP i ( g ) eIF2 fosforilats α enfront dels nivells de proteïna eIF2α total es van determinar per western blot en sh Scramble - o illots de Myt3 traduïts en condicions de NG o HG. ( f ) Quantificació de la proteïna CHOP com a fracció de la proteïna Gapdh en ( c ). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents. ( h ) Quantificació dels eIF2 α fosforilats com a fracció del nivell total de proteïnes eIF2 α en ( g ). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents

Imatge a mida completa

Aquests resultats suggereixen que la supressió de Myt3 pot sensibilitzar específicament les cèl·lules illes a la mort cel·lular induïda per la glucosa a través de Bim. En suport d'això, la supressió de Myt3 va suposar un augment aproximat de cinc vegades ( P <0, 001) en els nivells de proteïnes Bim (Figures 6a i b) en cèl·lules tractades amb glucosa elevada. A continuació, es va mesurar la mort de cèl·lules illetes en cèl·lules de Myt3- transduïdes exposades a alta glucosa i co-transduïdes amb un lentivirus que expressa un shRNA dirigit a Bim , que va suposar una reducció de cinc vegades en l’expressió de Bim (figura 6c) . La supressió bim abrogà essencialment l’augment de l’apoptosi de cèl·lules illotransduïdes de Myt3, en resposta a una elevada glucosa, en comparació amb els controls de transmetació de Scramble (Figura 6d). Aquestes dades indiquen que l’exposició de les cèl·lules illots, en què es suprimeix Myt3 , comporta una elevada glucosa en una subregulació de Bim, provocant un desequilibri en els membres de la família Bcl2 pro-apoptòtics i pro-supervivència que produeixen la mort de cèl·lules illots.

Image

La supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules illes a la mort cel·lular elevada per la glucosa per mitjà de la regulació de Bim. ( a ) La proteïna Bim es va determinar per western blot en sh Scramble - o illots de Myt3- traduïts en condicions normals de glucosa (NG) o d’alta glucosa (HG). ( b ) Quantificació de la proteïna Bim com a fracció de la proteïna Gapdh en ( a ). Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de tres experiments independents. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 comparant les barres indicades (ANOVA bidireccional). ( c ) anàlisi qPCR de l'expressió de Bim a les illes disperses transduïdes amb sh Scramble (L-shScram) o sh Bim (L-shBim) que expressen lentívirus. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de quatre experiments independents. *** P <0.001 en comparació de L-shScram amb cèl·lules transduïdes de L-shBim (test no aparellat). ( d ) La mort cel·lular es va determinar mitjançant la incorporació de iòdur de propidi a cèl·lules illots disperses co-transduïdes amb sh lentiviral Scramble (L-shScram) o sh Bim (L-shBim), i adenoviral sh Scramble (Ad-shScram) o sh Myt3 (Ad -shMyt3), en altes condicions de glucosa. Els resultats es representen com a mitjana ± SEM de quatre experiments independents. *** P <0.001 comparant les barres indicades (ANOVA de doble sentit)

Imatge a mida completa

Discussió

Durant la progressió de la diabetis, l’exposició de les cèl·lules β a les citocines produïdes per infiltració de les cèl·lules immunes activa cascades de senyalització pro-inflamatòries que finalment condueixen a l’ampliació de senyals inflamatoris i a l’inici de l’apoptosi. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17 Ja vam demostrar que el factor de transcripció Myt3 és un dels objectius a baix de la senyalització IL-1 β , TNF α i IFN γ en β - i que la seva supressió és suficient per induir un augment de dues vegades de l’apoptosi quan es cultiven in vitro les cèl·lules de l’illot, sense afectar la funció dels illots. Tot i això, aquestes anàlisis es van dur a terme durant un període molt curt (~ 48 h), a falta de matriu extracel·lular, i no van proporcionar informació sobre els efectes a llarg termini de la supressió de Myt3 sobre la funció dels illots i la supervivència in vivo . En el treball actual, es va intentar abordar aquest dèficit mitjançant un model de trasplantament d’illots syngeneic per examinar els efectes de la supressió de Myt3 sobre la supervivència i la funció de l’empelt.

Demostrem que, tot i que ni el pes corporal ni l’homoeòstasi de la glucosa en sang es van veure afectats significativament en els ratolins trasplantats amb una massa òptima d’ il·lots transduïts de Myt3 , en els trasplantaments de massa marginal La supressió de Myt3 retarda substancialment el temps necessari perquè els receptors d’empelt reestableixin la normoglicèmia. A més, en els trasplantaments de massa òptims, durant 5 setmanes després del trasplantament, només el 2-3% de les cèl·lules que restaven en els empelts de Myt3- islàndols traduïts eren cèl·lules transmeses de Myt3. Tot i que, en aquests moments també hi va haver alguna pèrdua d’expressió de GFP en els empelts d’isul·les transmetats per Scramble , atès que la nostra eficiència de transducció inicial era de ~ 40% i la presència de cinc vegades menys cèl·lules positives de GFP en els empelts de Myt3. els empelts de Scramble , aquesta baixa freqüència de cèl·lules traduïdes per Myt3 en els empelts en aquest moment suggereix que la majoria de cèl·lules transferides de Myt3 havien sofert la mort cel·lular. En suport d’això, la supressió de Myt3 va augmentar significativament el nivell d’apoptosi en els òptims de massa òptims després de només 5 dies, i la pèrdua de cèl·lules transduïdes ja era evident en aquest moment. És important destacar que la supressió de Myt3 no va tenir cap efecte significatiu en la mort de cèl·lules illots a les cèl·lules illots cultivades in vitro a la matriu extracel·lular 804G durant la mateixa quantitat de temps. Aquestes dades suggereixen que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules de les illes a patir apoptosi en resposta a les tensions que s'enfronten a l'empelt d'illots.

La supressió de Myt3 en illots in vitro condueix a la regulació de diverses quimiocines, probablement mitjançant la supressió de Myt3 indirectament o directament permetent la seva despressió , ja que la mort de les cèl·lules de les illetes no es va incrementar significativament per la supressió de Myt3 en aquestes condicions. Com que les quimiocines induïdes per la supressió de Myt3 són capaces de reclutar cèl·lules immunes, hem estimat que la seva expressió pot contribuir a la pèrdua de cèl·lules illotes després del trasplantament. 2, 3, 4, 6, 7, 8, 13, 14, 15, 16, 17 Tanmateix, el nivell d’inducció d’aquestes quimiocines semblava ser insuficient per conduir el reclutament de cèl·lules immunes addicionals als empelts, cosa que suggereix mecanismes alternatius. probablement responsable de l’augment de la mort cel·lular observada en els empelts d’ isul·les traduïts per Myt3.

Els trasplantaments d’illots estan exposats a nivells importants d’estrès cel·lular durant el procés d’empelt. La major mort cel·lular observada durant els primers 5 dies després del trasplantament en el nostre model va implicar aquestes tensions cel·lulars com a modificador potencial de la mort de cèl·lules islotes provocades per Myt3 . De fet, l’anàlisi de diversos estressors cel·lulars va demostrar que la supressió de Myt3 va augmentar significativament la mort de cèl·lules illots induïdes per la glucosa. En el context del trasplantament, això suggereix que la pèrdua de Myt3 afavoreix la mort cel·lular quan els illots gravats estan exposats a altes concentracions circulants de glucosa en sang immediatament després del trasplantament. La supressió de Myt3 no sensibilitzava més les cèl·lules illots a la mort de cèl·lules induïdes per citocines, baixes en glucosa o per hipòxia, probablement perquè aquests estressants ja redueixen l’expressió de Myt3 . A més, mostrem que la sensibilitat de les cèl·lules illots a la mort cel·lular alta induïda per la glucosa després de la supressió de Myt3 depèn de la inducció del membre pro-apoptòtic de la família Bcl2 Bim. La inducció de Bim és críticament similar a la mort de cèl·lules illots com a resposta a la deficiència de Pdx1 i IRS2 i en resposta a la glucotoxitat. 26, 27, 28

L’exposició de cèl·lules β a citocines inflamatòries pot agreujar els efectes de la glucotoxicitat; tanmateix, la forma en què es produeix aquesta "glucocitotoxicitat" no està ben caracteritzada. 29, 30, 31 Les nostres dades anteriors mostren que la supressió de Myt3 per citocines inflamatòries té un paper significatiu en l’apoptosi β induïda per la citocina, mentre que les nostres dades indiquen que la supressió de Myt3 sensibilitza les cèl·lules β a la mort cel·lular elevada per la glucosa. Junts, aquestes dades suggereixen que Myt3 pot actuar com a mediador de la ruta de senyalització inflamatòria i glucotòxica, amb la supressió de Myt3 induïda per la senyalització inflamatòria, com pot ocórrer en les T1D i T2D, sensibilitzant les cèl·lules β per patir la mort cel·lular en resposta a episodis hiperglicèmics mitjançant permetent l’activació precoç de Bim. Creiem que els futurs esforços han de dirigir-se a descobrir els mecanismes subjacents als efectes de la supressió de Myt3 a l’apoptosi β- cell i a determinar si el manteniment dels nivells de Myt3 pot reduir la mort i la disfunció de β .

Materials i mètodes

Manteniment i maneig del ratolí

Els ratolins van ser mantinguts segons les directrius del Consell canadenc sobre cura dels animals mitjançant protocols aprovats pel Comitè de cura d'animals de la UBC. Els ratolins es van allotjar en un grup de fins a cinc ratolins per gàbia amb controls de salut diàriament i manteniment de gàbies realitzats pels membres del personal de la instal·lació animal. A la nostra colònia, els ratolins es mantenien en un cicle de 12 h de llum / fosc, alimentats amb una dieta estàndard amb baix contingut en greixos (LabDiet, St. Louis, MO, EUA) i adbit i el seu entorn es va enriquir mitjançant l'administració de llavors de gira-sol i amagatalls. Els ratolins van ser allotjats en aquesta configuració fins que van ser necessaris per fer experiments. S'han utilitzat ratolins C57 / B6N (entre 8 i 12 setmanes) en tots els estudis.

Els ratolins utilitzats en procediments de no supervivència van ser anestesiats mitjançant la inhalació d’isofluoranes seguida de luxació cervical. Es va comprovar el reflex de puny dels peus abans de la luxació cervical per tal de garantir que els animals es trobaven en un pla quirúrgic d’anestèsia.

Aïllament i cultura dels illots

Es van perfeccionar pancreades de ratolins femenins d’entre 8 i 12 setmanes amb 1000 U / ml de col·lagenasa XI (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadà) i es van incubar durant 15 min a 37 ° C. Les pancreades es van interrompre manualment i es van passar per un filtre de 70 μM (Corning, Nova York, Nova York, EUA) i els illots van ser seleccionats a mà. Els illots es van cultivar en RPMI 1640 (glucosa d'11 mM) complementada amb FBS al 10%, 50U / ml de penicilina / estreptomicina i 2 mM l-glutamina a 37 ° en una incubadora humidificada al 5% de CO 2 . Tots els reactius de cultiu de teixits es van comprar a ThermoFisher (Burlington, ON, Canadà). Els illots es van transduir amb adenovirus sh Scramble o sh Myt3 com es feia anteriorment 12 i es van cultivar durant 48 h abans del trasplantament.

Trasplantament d’illots

Els ratolins receptors del trasplantament van ser diabètics per injecció de streptozotocina de 230 mg / kg (Sigma-Aldrich) a l’espai intraperitoneal. Diariàriament vam controlar aquests animals per detectar signes de malaltia i mesurar la glucosa en sang mitjançant un test de glucosa One Touch Ultra (LifeScan Canada Ltd, Burnaby, BC, Canadà) per determinar la inducció d’hiperglucèmia. Després del desenvolupament de la diabetis induïda per estreptozotocina en aquests ratolins, es van trasplantar sota la càpsula renal amb 300 illots per a trasplantaments de massa òptims o 150 illots per a trasplantaments de massa marginal. Una hora abans de la cirurgia, els ratolins van rebre una injecció subcutània d’una combinació de meloxicam (1 mg / kg) i buprenorfina (0, 1 mg / kg). Els ratolins van ser anestesiats per a la cirurgia amb isofluorane (2% en 2 l / min de flux d’oxigen) i es va avaluar el pla quirúrgic d’anastèsia mitjançant un reflex de pessic del peu. Es va fer un petit malnom a la càpsula del ronyó i es van injectar lentament els illots a sota de la càpsula. Les incisions es van suturar tancades i es va permetre que els ratolins es recuperessin de l'anestèsic abans de ser retornats a les seves gàbies. 32

Proves de tolerància a la glucosa

La funció de illots in vivo es va avaluar mitjançant un test intraperitoneal de tolerància a la glucosa (IPGTT). Els ratolins es van subjugar durant 6 hores i es van injectar amb 1 g / kg de glucosa D50 (Sigma-Aldrich), i es va mesurar la glucosa en sang a safena a 0, 15, 30, 60 i 120 minuts.

Immunohistoquímica

La immunohistoquímica es va realitzar en seccions de parafina dels illots incrustats a la càpsula del ronyó. Les seccions es van tacar amb anti-glucagó de cabra (1: 500; Santa Cruz, Dallas, TX, EUA), anti-insulina de porcs de Guinea (1: 500; Linco, St. Charles, MO, EUA), anti-PF de conill (1 : 1000; MBL, Woburn, MA, EE. UU. I caspasa 3 de conill anti-clivellat (1: 500; Santa Cruz). Es van detectar anticossos primaris amb l'anti-conill de ruc Alexa 488 (1: 1000; Molecular Sondes, Eugene, OR, EUA), anti-Guinea de cabra Alexa 546 (1: 500; Molecular Sondes) o anti-cabra Alexa 488 (1 / 1000; Sondes moleculars).

Anàlisi de mort cel·lular

Els illots es van aïllar com es va descriure anteriorment i es va preparar una suspensió monocel·lular per trypsinització. Dos-cents equivalents d’illots per pou es van xapar en plaques de cultiu de teixits de 24 pous tractades amb 804G, una matriu extracel·lular completa (ECM) produïda per una línia cel·lular de carcinoma de bufeta de rata. 33 Les cèl·lules es van transduir amb els adenovirus sh Scramble o sh Myt3 durant la nit a un MOI de 10 i es van cultivar en presència o absència de diversos estressors cel·lulars durant 48 hores més. Els medis RPMI complementats amb glucosa d’11 mM (glucosa normal) servien com a condició de control, mentre que els estressors incloïen un còctel de citocines (0, 4 ng / ml IFN γ , 0, 07 ng / ml IL-1 β i 0, 04 ng / ml TNF α ), inanació sèrica., glucosa baixa (2, 8 mM glucosa), glucosa alta (30 mM glucosa) o hipòxia (1% O 2 ). El shRNA pLKO-Bim (TRCN0000009692-9695), que té com a objectiu tots els isoformes de Bim, els vectors 26 i control lentiviral (RHS6848) es van comprar a GE Dharmacon (Ottawa, ON, Canadà). sh Els illots de transfiguració i sh Myt3 van ser co-transduits amb 2, 5 μ l lentiviral sh Scramble o sh Bim (1 × 10 9 pfu) durant la nit. El medi es va canviar a RPMI de glucosa a 30 mM fresc i es van cultivar cèl·lules durant 48 hores més. Afegim 1 µl de iodur de propidi (PI, 1 mg / ml; Sigma-Aldrich) i 0, 5 μ l de Hoescht a cada pou 24 hores abans de la imatge. Les cèl·lules es van imaginar amb un microscopi confocal SP8 (Leica, Wetzlar, Alemanya) i es va realitzar la quantificació amb el programari d’anàlisi d’imatges de CellProfiler (Broad Institute, Cambridge, MA, EUA).

qPCR

Els illots dispersos es van transduir com anteriorment o es van deixar sense traduir i es van cultivar en medis RPMI complementats amb els estressors cel·lulars descrits anteriorment durant 36 h. Es va aïllar RNA mitjançant Trizol i el kit de purificació de l'ARN PureLink (Ambion, Burlington, ON, Canadà). L’ADNc es va generar mitjançant Superscript III (Invitrogen, Burlington, ON, Canadà). Les sondes Taqman es van utilitzar per quantificar β-actina i Myt3, totes les altres cebes van ser dissenyades utilitzant Primer3plus i ordenades a IDT. Per a totes les reaccions es va utilitzar un sistema de PCR en temps real Viia7 i un supermix SYBR Green (Applied Biosystems, Burlington, ON, Canadà) o Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems). L’ADNc (10ng) es va utilitzar en cada reacció, amb totes les reaccions fetes per triplicat. La β-actina es va utilitzar com a control intern i el canvi d'expressió es va calcular mitjançant 2 ΔΔCt .

Anàlisi de taquilla occidental

Els lisats cel·lulars es van preparar a partir d’illots dispersos i transduïts cultivats en condicions normals de glucosa (11 mM de glucosa) o d’alt contingut de glucosa (30 mM de glucosa) durant 48 h. Les cèl·lules van ser recuperades per trypsinització i lisades per sonicació en tampó RIPA (ThermoFisher). Es van carregar vint-i-cinc microgrames de proteïna total en cada pou d’un gel del TGX del 4-15% (Biorad, Mississauga, ON, Canadà). Els gels van ser transferits a membranes de difluorur de polivinil de 0, 2 μ m (Biorad) mitjançant l'aparell Trans-Blot Turbo (Biorad) segons les instruccions del fabricant. Les membranes es van sondar amb anticossos contra Bim (1: 500; Cell Signaling, Danvers, MA, EUA), CHOP (1: 500; Santa Cruz), fosfo-eIF2α (1: 1000; Cell Signaling) i eIF2α total (1: 500 ; Abcam, Cambridge, MA, EUA) a 4 ° C en 5% de llet descremada diluïda en TBS complementada amb 0, 05% de Tween-20. Posteriorment es van extirpar els blots mitjançant el protocol Abcam de stripping lleu i es van tornar a sondar amb anti-Gapdh (1: 10000; Senyalització cel·lular). Els anticossos secundaris conjugats anti-conill o anti-ratolí (Santa Cruz) HRP es van utilitzar a 1:10 000 en PBS durant 1 h a temperatura ambient. Les membranes van ser tractades amb reactiu ECL (ThermoFisher) durant 1 min abans de desenvolupar pel·lícules.

Anàlisi estadística

L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant un ANOVA bidireccional amb una prova de comparació múltiple de Sidak per a mesures fisiològiques al llarg del temps. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant un ANOVA amb una prova de comparació múltiple de Tukey per a mesures de qPCR, Western blot i mort de cèl·lules. La resta de dades es van analitzar mitjançant una prova de t d' estudiant de dos cues que no es compara. Les dades d'almenys tres experiments independents es representen com a mitjana ± SEM Es va acceptar la importància estadística a valors P <0, 05.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

  4. 4.

    Figura suplementària 4

Glossari

St18

supressió de la tumorigenicitat 18

Myt3

factor de transcripció de la mielina 3

INF γ

interferó-gamma

IL-1 β

interleukina-1 beta

TNF α

factor-necrosi tumoral alfa

qPCR

reacció en cadena quantitativa en temps real de la polimerasa

MOI

multiplicitat d'infecció

STZ

estreptozotocina

IPGTT

proves de tolerància intraperitoneal a la glucosa

FACS

ordenació de cèl·lules activades per fluorescència

GFP

proteïna de fluorescència verda

TUNEL

terminal de desoxinucleotidil transferasa dUTP etiquetatge final

shRNA

ARN de pinça curta

T1D

diabetis tipus 1

T2D

diabetis tipus 2

ECM

matriu extracel·lular

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)