Regulació negativa de la senyalització del receptor de la quimiocina i la quimiotaxi de cèl·lules b per p66shc | mort i malaltia cel·lular

Regulació negativa de la senyalització del receptor de la quimiocina i la quimiotaxi de cèl·lules b per p66shc | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Cèl·lules B
  • Senyalització cel·lular
  • Quimiocines
  • Quimiotaxi

Resum

Els adaptadors Shc (Src homology 2 contenent) són components omnipresents de les vies de senyalització desencadenades per receptors acoblats a la tirosina quinasa. En limfòcits, semblants a altres tipus de cèl·lules, les isoformes p52 i p66 de ShcA / Shc participen en un bucle autolimitant on p52Shc actua com un regulador positiu de la senyalització del receptor d’antigen promovent l’activació de Ras, mentre que p66Shc limita aquesta activitat mitjançant la inhibició competitiva de p52Shc . A partir de que molts mediadors de senyalització són compartits per antigen i receptors de quimiocines, inclòs p52Shc, hem valorat la possible implicació de p66Shc en la regulació de les respostes de les cèl·lules B a les quimiocines, centrant-se en els receptors que homing CXCR4 (receptor de la quimiocina CXC tipus 4 ) i CXCR5 (receptor de la quimiocina CXC tipus 5). Els resultats identifiquen p66Shc com un regulador negatiu de les respostes quimiotactiques desencadenades per aquests receptors, incloent adhesió, polarització i migració. També proporcionem evidència que aquesta funció depèn de la capacitat de p66Shc per interactuar amb els receptors de la quimiocina i promoure el muntatge d’un complex inhibidor, que inclou les fosfatases SHP-1 (Src homology phosphatase-1) i SHIP-1 (domini SH2) -que conté inositol 5'-fosfatasa-1), que dóna lloc a una reorganització deteriorada del Vav que depèn del citoesquelet de l'actina. Aquesta funció assigna els residus de tirosina fosforilables al domini d'homologia de col·lagen 1 (CH1). Els resultats identifiquen p66Shc com un regulador negatiu de la quimiotaxi de cèl·lules B i suggereixen un paper per a aquest adaptador en el control de l’allotjament de cèl·lules B.

Principal

L’homeòstasi i l’activació dels limfòcits requereixen el trànsit cíclic a través dels òrgans limfoides secundaris (SLOs). Els limfòcits que afecten les SLO, així com el seu trànsit, estan regulats per receptors que responen a quimiocines derivades de cèl·lules estromals. 1 Els principals receptors d'homing de cèl·lules B són CCR7 (receptor CC de quimiocina tipus 7) i CXCR4 (receptor de quimiocines tipus CXC 4) que són responsables de la seva sortida del flux sanguini i entrada als SLOs, 2 mentre que el trànsit de cèl·lules B als fol·licles està regulada per CXCR5 (receptor de la quimiocina tipus CXC 5). Aquests receptors també ajuden a retenir les cèl·lules B en els SLO que és essencial perquè les cèl·lules B rebin indicis de supervivència i s’activi en presència d’antigen. 3

Els receptors de la quimiocina orquestren els passos seqüencials de l’afany de limfòcits, és a dir, la detenció, la polarització i la migració transendotelial, ambdós desencadenant la conversió d’integrines a la seva conformació d’alta afinitat per als seus lligands a les cèl·lules endotelials (EC), que es tradueix en una adhesió ferma, i promovent els arranjaments citoesquelètics necessaris per a la polarització i la migració. 4 Els receptors de la quimiocina són receptors transmembranos de set-extensió acoblats a la proteïna Gi que redueixen la producció d’adenosina monofosfat (cAMP) cíclica inhibint l’adenilat ciclasa. 5 Src kinases participen de les vies dependents de Gi / cAMP desencadenades pels receptors de quimiocines, iniciant una cascada de fosforilació que promou tant la senyalització interior a les integrines com els reordenaments citosquelètics depenent de la Rho GTPase necessaris per a la polarització i la migració cel·lular. 6, 7, 8 receptors de la quimiocina també desencadenen un camí independent de la Janus cinasa (JAK) independent de Gi implicat en la migració cel·lular. Per tant, la quimiotaxi està regulada de manera coordinada per diverses vies de senyalització.

En diferència amb les cèl·lules T, on la senyalització per part dels receptors de la quimiocina s'ha caracteritzat en gran mesura, 9 la nostra comprensió de les cascades de senyalització desencadenades pels receptors d'homing a les cèl·lules B és notablement limitada, malgrat el fet que algunes de les molècules implicades, com la melsa tirosina quinasa (Syk), la fosfatidilinositida 3-cinasa (PI3-K) i la tirosina quinasa de Bruton (Btk), són explotades terapèuticament per al tractament de neoplasmes de cèl·lules B. 10, 11 En particular, el paper dels adaptadors que uneixen tirosina quinases proximals (TKs) a mediadors aigües avall en altres vies de senyalització de cèl·lules B segueix sent molt difícil.

Els adaptadors Shc (Src homology 2 contenent) han estat implicats en tots els processos cel·lulars centrals, inclosa la proliferació, la diferenciació, la supervivència i la motilitat. 12 En limfòcits, les isoformes p52 i p66 ShcA / Shc formen un bucle autolimitant, amb la senyalització p52Shc que regula positivament el receptor d’antigen (AgR) i p66Shc que actua com a inhibidor competitiu. En conseqüència, les respostes mitogèniques i de supervivència al compromís amb AgR es milloren en els ratolins p66Shc - / - donant lloc a una autoimmunitat. A més, les cèl·lules B de leucèmia limfocítica crònica (CLL) tenen un defecte en l’expressió p66Shc que contribueix a la seva supervivència estesa. 14 Basat en el fet que molts mediadors de senyalització són compartits per AgRs i receptors de quimiocines, incloent p52Shc, 15 aquí hem avaluat la possible implicació de p66Shc en la regulació de les respostes de les cèl·lules B a les quimiocines. Mostrem que p66Shc actua com un regulador negatiu de totes les etapes de les respostes quimiotàtiques desencadenades per CXCR4 i CXCR5 inhibint la reorganització de citoses d’actina depenent de Vav i proporcionen una visió del mecanisme pel qual p66Shc desacopula aquests receptors de l’activació de Vav.

Resultats

p66Shc inhibeix l’adhesió i polarització de cèl·lules B dependents de CXCR4 i CXCR5

L’adhesió de les cèl·lules B als EC està regulada per l’antigen-1 associat a la funció del limfòcit integrins (LFA-1), que interacciona amb la molècula d’adhesió intercel·lular-1 (ICAM-1), i l’antigen-4 molt tardà (VLA-4), que interactua tant amb el VCAM-1 com amb el component ECM, la fibronectina (FN). El paper de p66Shc en l’adhesió de cèl·lules B es va abordar inicialment a les cèl·lules B MEC deficients de p66Shc, 14 transfectades de manera estable amb una construcció de codificació p66Shc, utilitzant cèl·lules buides amb transfecte vectorial com a control. Tots els transfectants van expressar nivells similars de LFA-1 i VLA-4, així com CXCR4 i CXCR5 (figura suplementària S1A). Les cèl·lules es van xapar amb ICAM-1 o FN immobilitzat en presència o absència de CXCL12 (quimiocina 12 del motiu CXC) o CXCL13 (quimiocina del motiu CXC 13). La proporció de cèl·lules que s’havien adherit després d’una curta incubació va ser determinada per citometria de flux. Com era d’esperar, les cèl·lules control van patir canvis morfològics profunds en la presència de qualsevol quimiocina, des d’un punt de final fins a un fenotip polaritzat caracteritzat per protuberions riques en F-actina (Figura 1a). L’expressió p66Shc va resultar deteriorada per l’adhesió dependent de CXCR4 i CXCR5 a ICAM-1 / FN (Figura 1b). Consistent amb aquesta troballa, la imatge d’aquestes cèl·lules va demostrar que el patró puntuat de LFA-1, que resulta de l’agrupament d’integrines després del canvi conformacional d’alta afinitat, 16 es van perdre en cèl·lules MEC que expressaven p66Shc (figura suplementària S2). La polarització també es va veure deteriorada en presència de p66Shc, com es va valorar mitjançant la quantificació de cèl·lules tenyides de falloidina que contenien una morfologia polaritzada (figures 1a i c).

Image

p66Shc inhibeix l’adhesió i polarització de cèl·lules B dependents de CXCR4 i CXCR5 i dependents de CXCR5. ( a ) Anàlisi d'immunofluorescència dels transfectants MEC de control (ctr) en plaques recobertes amb 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc, no estimulades o estimulades amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 i etiquetades amb Phalloidin- Anticossos TRITC (vermell) i anti-actina (verd). Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. ( b, d ) Quantificació per citometria de flux del percentatge de ctr i p66 cèl·lules MEC transfectades de forma estable ( b ) o d’esplenòcits de ratolins pt i p66Shc - / - ( d ) que s’adherien a plaques de 48 pous recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc o 10 μ g / ml Fibronectina després de 10 min de tractament amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les cèl·lules del ratolí es van marcar amb anticossos anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE abans de l'anàlisi. Les dades, que es refereixen a mostres quadruplicades de quatre experiments independents, es presenten com a% del total de cèl·lules d’entrada que van quedar unides a cada pou. Barres d’error, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0, 001. ( c, e ) Quantificació del percentatge de cèl·lules polaritzades en els transfectants de ctr i p66 MEC ( c ) o en limfòcits B purificats a partir de mels de wt i p66Shc - / - ratolins ( e ) xapats durant 5 minuts en diapositives recobertes amb 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc o 10 μ g / ml Fibronectina estimulada durant 5 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 i etiquetada amb anticorps Phalloidin-TRITC i anti-actina. El percentatge de polaritzades contra cèl·lules no polaritzades es va calcular en quatre imatges diferents de camp ampli de cada pou en tres experiments independents. Barres d’error, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01

Imatge a mida completa

Experiments similars es van dur a terme amb cèl·lules B esplèniques de ratolins de tipus salvatge i p66Shc - / - . L’adhesió dependent de CXCL12 i CXCL13 a ICAM-1 / FN (Figura 1d), així com la polarització (Figura 1e), es van millorar notablement en les cèl·lules p66Shc - / - B en comparació amb les seves homòlegs de tipus salvatge, cosa que indica que aquesta expressió de p66Shc a nivells fisiològics és suficient per regular negativament les respostes de les cèl·lules B a aquestes quimiocines. No es va observar cap diferència en els nivells d'expressió de LFA-1 / VLA-4 o CXCR4 / CXCR5 entre cèl·lules silvestres i cèl·lules p66Shc - / - B (figura suplementària S1B). Per tant, p66Shc actua com un regulador negatiu de les vies interiors que s'uneixen CXCR4 / CXCR5 a l'activació de la integrina.

p66Shc inhibeix la quimiotaxi de cèl·lules B depenent de CXCR4 i de CXCR5

La implicació de p66Shc en la quimiotaxi de cèl·lules B es va abordar en assajos de migració transwell, utilitzant CXCL12 / CXCL13 com a quimioatractants. Tant la migració dependent de CXCR4 com la de CXCR5 es van veure afectades en cèl·lules MEC que expressaven p66Shc en comparació amb els controls (Figura 2a). Consistent amb aquesta observació, es va millorar la migració de les cèl·lules p66Shc - / - B cap a CXCL12 / CXCL13 en comparació amb els controls de tipus salvatge (Figura 2b).

Image

p66Shc inhibeix la quimiotaxi de cèl·lules B depenent de CXCR4 i de CXCR5. ( a ) Migració de transfectants de ctr i p66 MEC, mesurats després del tractament durant 3 h amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les dades obtingudes sobre mostres duplicades d’almenys tres experiments independents es presenten com a índex migratori mig ± SD (relació de cèl·lules migrades en mostres tractades amb quimiocina versus mostres no tractades). *** P ≤0, 001. Com a control negatiu es va utilitzar un estímul quimiotàctic no relacionat (10 μ M f-MLP). No es va observar cap migració de cèl·lules MEC de control ni de p66Shc que expressaven resposta a aquest tractament (dades no mostrades). ( b ) Migració de cèl·lules obtingudes a partir de melsa, medul·la òssia o ganglis limfàtics de pils i ratolins p66Shc - / - tractats durant 3 h amb 100 ng / ml mCXCL12 o 200 ng / ml mCXCL13 i després tenyides amb anti-CD3-FITC / anticossos anti-CD22-PE. Les dades obtingudes sobre mostres duplicades d’almenys tres experiments independents es presenten com a índex migratori mig ± SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01. ( c i d ) Quantificació per citometria de flux del percentatge de ctr i p66 cèl·lules MEC transfectades de forma estable ( c, panell inferior) o d’esplenòcits de ratolins wt i p66Shc - / - ( d ) que van romandre adherits a les cèl·lules estromals cultivades en 48- plaques de pou després d’estimulació amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Abans de comptar, les cèl·lules MEC es van marcar amb cèl·lules anti-CD19-FITC mAb i ratolins amb anticossos anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE. Les dades, que es refereixen a mostres quadruplicades d’almenys quatre experiments independents, es presenten com a% del total de cèl·lules d’entrada que van quedar unides a cada pou. Barres d’error, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0, 001. ( c, panell superior). Anàlisi d’immunofluorescència de transfectants de ctr i p66 MEC tacats respectivament amb DiO (verd) o Dil (vermell) incubats durant 10 min en cèl·lules estromals cultivades en diapositives de 8 pous i no estimulades o estimulades durant 40 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m

Imatge a mida completa

La capacitat de p66Shc per afectar la quimiotaxi es va avaluar més en assaigs de pseudoemperipolesi de cèl·lules B que mesuren la capacitat de les cèl·lules B de migrar per sota de cèl·lules stromals co-cultivades. L'emperipolesi espontània no es va veure afectada per p66Shc. A diferència, les cèl·lules MEC que expressen p66Shc van patir una pseudoemperipolesi depenent de CXCR4 i de CXCR5 amb una menor eficiència en comparació amb els controls (figura 2c). Aquest defecte es va confirmar en experiments de co-cultiu mitjançant una barreja de cèl·lules MEC de control i expressió de p66Shc marcades amb diferents sondes fluorescents. De fet, un nombre menor de cèl·lules que expressen p66Shc van patir pseudoemperipolesi en comparació amb els controls dins de la mateixa capa de cèl·lules estromals (figura 2c). Consistent amb aquests resultats, la pseudoemperipolesi es va millorar en les cèl·lules p66Shc - / - B en comparació amb les cèl·lules B de tipus salvatge (Figura 2d). Per tant, p66Shc actua com a regulador negatiu de la migració de cèl·lules B dependent de CXCR4 i de CXCR5.

p66Shc inhibeix la polimerització d’actina depenent de CXCR4 i CXCR5 i l’activació de Vav

La capacitat de p66Shc d’afectar la polarització i la migració de les cèl·lules B en resposta a CXCL12 / CXCL13 suggereix que pot estar implicada en l’acoblament de CXCR4 / CXCR5 a la polimerització d’actina. Aquest problema va ser abordat mitjançant microscòpia confocal de cèl·lules MEC de control i expressió de p66Shc en xifres ICAM-1 / FN en presència o absència de CXCL12 o CXCL13. Les cèl·lules es van etiquetar amb fal·lidina per identificar l'actina F i l'anticòs monoclonal anti-actina (mAb) com a control de normalització. La mesura de la intensitat de fluorescència de l'actina F va mostrar que l'expressió p66Shc va donar lloc a un deteriorament significatiu en la polimerització d'actina dependent de CXCR4 i CXCR5 (Figura 3a; no es mostra en FN). Experiments similars es van dur a terme amb cèl·lules B esplèniques silvestres i cèl·lules B p66Shc - / - B. Es va observar una polimerització d’actina més robusta en resposta a CXCL12 / CXCL13 de cèl·lules p66Shc - / - B placades amb ICAM-1 (Figura 3b) o FN (no mostrada) en comparació amb cèl·lules B de tipus salvatge, que suporten un paper per p66Shc en acoblament CXCR4 / CXCR5 a la polimerització d’actina.

Image

p66Shc inhibeix la polimerització d’actines de CXCR4 i CXCR5 i la fosforilació Vav. ( a i b ) Quantificació de la polimerització d’actina en transfectants de ctr i p66 MEC ( a ) o en limfòcits B purificats a partir de mels de pt i ratolins p66Shc - / - ( b ), xapats durant 5 min en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rHICAM-1 / Fc i estimulat durant 5 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les diapositives es van marcar amb anticorps de Ploloidin-TRITC i anti-actina. Les dades, calculades en quatre imatges de camp ampli diferents a partir de quatre experiments independents, es presenten com la intensitat de fluorescència mitjana (IMF) de la tinció de fal·lidina en mostres estimulades versus no estimulades, quantificades mitjançant el programari ImageJ i normalitzades al contingut intracel·lular d’actina. Barres d’error, SD ** P ≤0.01; *** P ≤0, 001. ( c ) Anàlisi d'immunoblot amb un anticòs anti-fosfo-Vav de sobrenedants postnuclears procedents de transfectants de ctr i p66 MEC, no estimulats o estimulats durant 1 o 5 min amb 100 ng / ml CXCL12 (esquerra) o 200 ng / ml CXCL13 (dreta). A continuació, es mostren els immunoblots anti-Vav de control dels filtres despullats. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. ( d, dreta) Anàlisi microscòpica confocal de la fosforilació de Vav en ctr i p66 transfectants MEC xapats durant 5 min en diapositives recobertes amb 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc i estimulades durant 2 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les diapositives es van marcar amb anticossos anti-fosfo-Vav i anti-Vav. Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. ( d, esquerra) Quantificació de la fosforilació de Vav en quatre imatges de camp ampli diferents a partir de tres experiments independents presentats com la IMF de la tinció de fosfo-Vav en mostres estimulades versus no estimulades, quantificades mitjançant programari ImageJ i normalitzades al contingut intracel·lular de Vav. Barres d’error, SD *** P ≤0.001

Imatge a mida completa

La polimerització d’actina està orquestrada per Rho GTPases. L'activació de Rac1 (substrat 1 de toxina botulínica C3 relacionada amb Ras) i l'activació de Cdc42 (proteïna de control de divisió cel·lular 42 homolog) depèn de l'intercanviador de nucleòtids de guanina, Vav, que s'activa per la fosforilació de tirosina i està regulada per PIP 2 / PIP 3 ( 4, 5-bifosfat / (3, 4, 5) -trisfosfat) de fosfatidilinositol) que s'uneix al seu domini d'homologia (PH) pleckstrina. L’anàlisi d’immunoblot de la fosforilació de Vav en els transfectants de MEC va demostrar que l’expressió p66Shc va provocar un deteriorament en la fosforilació Vav depenent de CXCR4 i de CXCR5 en comparació amb els controls (figura 3c). La imatge de fosfaviv en el transfectant de control va revelar un enriquiment de fosfo-Vav en les protuberàncies riques en F-actina que no es va detectar en presència de p66Shc (Figura 3d). Per tant, p66Shc modula la reorganització de la actina F depenent de la quimiocina atenuant l’activació de Vav.

p66Shc inhibeix tant les vies dependents del Src kinasa com de la PI3-K desencadenades per CXCR4 i CXCR5

Les proteïnes Gi promouen l’activació de Vav a través de dues vies activades respectivament per les subunitats G α i G βγ . L’ activació 20, 21 G α i dóna com a resultat una reducció de l’activitat de la proteïna quinasa A (PKA) que reforça el bucle inhibidor que controla les Src cinases potenciant l’activitat de la C-terminal Src kinasa (Csk). 20 Com a resultat, Lyn s'activa i inicia una cascada de fosforilació que implica Syk i Btk que junts promouen la fosforilació per Vav. 20 G βγ promou l'activació de PI3-K 22 que convergeix en l'activació de Vav estabilitzant-se a la membrana plasmàtica tant de Vav com de Btk mitjançant la seva interacció mediada pel domini PH amb PIP 2 / PIP 3 . 21

Per identificar quina d'aquestes vies està regulada per p66Shc, es van realitzar assajos migratoris en presència d'inhibidors farmacològics de la senyalització del receptor de la quimiocina. Com era d’esperar, el tractament de les cèl·lules MEC de control amb toxina de tos ferina (PTX), un inhibidor de G α i, o l’inhibidor de la fosfodiesterasa 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), que neutralitza els efectes de G α i, va provocar un bloqueig en Migració depenent de CXCR4 / CXCR5 (Figura 4a). La migració també va ser inhibida per l’inhibidor de la Src kinasa PP2 i l’inhibidor de la PIort-K wortmannina (figura 4a), així com per l’inhibidor de Jak AG490 (figura suplementària S3). La capacitat de p66Shc per atenuar la quimiotaxi depenent de CXCR4 i CXCR5 va ser millorada per PTX i IBMX, així com per PP2 i wortmannin (Figura 4a), però no per AG490 (figura suplementària S3), cosa que indica que p66Shc participa selectivament a la Les vies Src i PI3-K desencadenades per aquests receptors aigües avall de l’activació de Gi.

Image

p66Shc inhibeix la senyalització tant de Src kinasa com de PI3-K en resposta a CXCL12 i CXCL13. ( a ) Migració de transfectants de ctr i p66 MEC no tractats o tractats durant 2 h amb PP2 o 500 ng / ml PTX o 500 μ M IBMX o 100 μ M Wortmannina i després estimulats durant 3 h amb 100 ng / ml CXCL12 (esquerra ) o 200 ng / ml CXCL13 (dreta). Les dades obtingudes sobre mostres duplicades d’almenys tres experiments independents es presenten com a índex migratori mig ± SD (relació de cèl·lules migrades en mostres tractades amb quimiocina versus mostres no tractades). * P ≤0, 05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0, 001. ( b ) Anàlisi d'immunoblot amb anticossos anti-fosfo-Lyn, anti-fosfo-Syk o anti-fosfo-Btk de sobrenedants postnuclears procedents de transfectants de ctr i p66 MEC o no estimulats o estimulats durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. A continuació es mostren els immunoblots de control dels filtres despullats. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. ( c ) Anàlisi d'immunofluorescència de cèl·lules de ctr i p66 MEC transfectades de forma transitòria per expressar una fusió de PH-GFP, immobilitzada 24 hores després de la transfecció en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc o no estimulades o estimulades amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 i marcat amb anticossos Phalloidin-TRITC (vermell) i anti-GFP (verd). Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. Es va utilitzar un antagonista farmacològic CXCR4 (50 μ M AMD3100, afegit 1 h abans de la quimiocina) en combinació amb CXCL12 com a control d'especificitat. No es va observar cap migració en aquestes condicions ni en cèl·lules MEC que expressaven control ni p66Shc (dades no mostrades), coherent amb la supressió en aquestes condicions de totes les cascades de senyalització desencadenades per CXCR4 implicades en la migració cel·lular

Imatge a mida completa

Per fer un mapa de p66Shc en la via dependent de Src desencadenada per CXCL12 / CXCL13, es va mesurar la fosforilació de la cinasa iniciadora Lyn i l'efector cinases Syk i Btk mitjançant immunoblot amb anticossos específics de fosfo. Lyn es va activar en una mesura similar mitjançant la implicació de CXCR4 / CXCR5 en el control i les cèl·lules MEC que expressen p66Shc (Figura 4b). Per contra, l'activació de Syk i Btk depenent de la quimiocina es va veure significativament deteriorada en presència de p66Shc (Figura 4b), cosa que indica que p66Shc participa en la ruta depenent de TK desencadenada per CXCR4 / CXCR5, atenuant la senyalització a baix de Lyn.

També es va abordar la implicació de p66Shc en la ruta PI3-K desencadenada per CXCL12 / CXCL13, utilitzant com a lectura un reporter PI3-K que codificava un domini PH gravat en una proteïna fluorescent verda (GFP). La microscòpia confocal de cèl·lules MEC de control i p66Shc que transferen transitòriament amb la construcció de PH-GFP va demostrar que l'estimulació amb CXCL12 o CXCL13 va suposar un enriquiment de membrana plasmàtica en PH-GFP en control, però no en cèl·lules que expressen p66Shc (Figura 4c). Per tant, p66Shc desvincula CXCR4 / CXCR5 de l'activació de Vav afectant la senyalització tant dependent de TK com de fosfoinositides.

La inhibició de la senyalització dependent de CXCR4 i CXCR5 per p66Shc requereix la fosforilació del seu domini CH1

La capacitat del p66Shc de modular la senyalització depèn de dues activitats que associen diferents dominis de la proteïna. p66Shc actua com a adaptador utilitzant els dos dominis d’unió a la fosfotirosina i el domini d’homologia 1 (CH1) ric en prol·lagen que recluta proteïnes a través de tres residus de tirosina fosforilables (YYY239 / 240/317). D'altra banda, p66Shc té una activitat pro-oxidant que es correspon tant amb un residu serin fosforilable al domini CH2 (S36) com amb dos residus d'àcid glutàmic (EE132 / 133) en el domini d'unió del citocrom c . 12

Per entendre si la inhibició de la senyalització de CXCR4 / CXCR5 per p66Shc depèn del seu adaptador o de la seva activitat pro-oxidant, hem utilitzat un panell de transfectants MEC que expressen mutants puntuals de p66Shc defectuosos per a aquestes activitats. Aquests inclouen p66Shc3F (AAA239 / 240 / 317FFF), p66ShcSA (S36A) i p66ShcQQ (EE132 / 133QQ). Aquests mutants van ser expressats pels respectius transfectants a nivells equiparables a la proteïna de tipus salvatge en cèl·lules M66 p66 (Figura 5a). No es van observar diferències en l'expressió de LFA-1, VLA-4, CXCR4 o CXCR5 en comparació amb cèl·lules que expliquen control o p66Shc (figura suplementària S1A).

Image

La inhibició de l'adhesió i la quimiotaxi dependents de CXCR4 i CXCR5 per p66Shc requereix la fosforilació de tirosina del seu domini CH1. ( a ) Anàlisi immunoblot de l’expressió Shc en cèl·lules B MEC transfectades de manera estable amb un vector buit (ctr) o una construcció d’expressions que codifica ja sigui de tipus salvatge p66Shc (MEC p66) o S36A (p66SA), EE132 / 133QQ (p66QQ) o YYY239 / 240 / 317FFF (p663F) mutants. A continuació, es mostra un control anti-actina del filtre despullat. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. L’estructura de domini de p66Shc que mostra la localització dels residus d’aminoàcids substituïts en els mutants s’esquema a la part superior del quadre. ( b ) Migració de transfectants MEC ctr, p66, p66SA, p66QQ i p663F estimulats durant 3 h amb 100 ng / ml CXCL12 (panell superior) o 200 ng / ml CXCL13 (panell inferior). Les dades obtingudes sobre mostres duplicades d’almenys tres experiments independents es presenten com a índex migratori mig ± SD (relació de cèl·lules migrades en mostres tractades amb quimiocina versus mostres no tractades). *** P ≤0, 001. ( c ) Quantificació per citometria de flux del percentatge de cèl·lules de ctr, p66 i p663F que es van adherir a plaques de 48 pous recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc després d'un tractament amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 durant 10 min. Les dades, que es refereixen a mostres quadruplicades de quatre experiments independents, es presenten com a% del total de cèl·lules d’entrada que van quedar unides a cada pou. Barres d’error, SD * P ≤0.05; *** P ≤0, 001. Quantificació del percentatge de polimerització ( d ) o actina ( e ) en cèl·lules ctr, p66 i p663F placades en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc, estimulades durant 5 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 i etiquetat amb anticorps de Ploloidin-TRITC i anti-actina. El percentatge de cèl·lules polaritzades ( d ) i la intensitat mitjana de fluorescència (IMF) de la tinció de fal·lolina en mostres estimulades versus no estimulades ( e ) es van calcular en quatre imatges diferents de camp ampli de cada pou en tres experiments independents. Es va quantificar la tinció de fal·loidina mitjançant el programari ImageJ i es va normalitzar al contingut intracel·lular d’actina. Barres d’error, SD * P ≤0.05; *** P ≤0, 001

Imatge a mida completa

L’expressió de les espècies reactives d’oxigen (ROS) -mutants defectuosos va donar lloc a una deterioració de la migració i adhesió de cèl·lules B en comparació amb cèl·lules control, similars a p66Shc (Figura 5b i figura suplementària S4A), que descarta un paper per a l’activitat pro-oxidant de p66Shc en aquesta funció. Per la seva banda, la mutació 3F va revertir la capacitat del p66Shc per inhibir la quimiotaxi de les cèl·lules B (figura 5b), així com l’adhesió i polarització (figures 5c i d i figures suplementàries S4A i B). En conseqüència, LFA-1 va formar el patró de puntuació típic resultant de l'agrupació d'integrines en cèl·lules que expressen p66Shc3F (figura suplementària S2). La mutació 3F també va abolir totalment la capacitat de p66Shc d’inhibir la polimerització d’actina depenent de CXCR4 / CXCR5 (figura 5e i figura suplementària S4C), fosforilació de Vav (figura 6a) i l’enriquiment de fosfo-Vav en protuberancies riques en actines F (figura 6b i Figura suplementària S4D). A més, no es va observar cap defecte en l’activació de Syk, Btk o PI3-K depenent de la quimiocina (figures 6c i d) a les cèl·lules que expressen p66Shc3F, cosa que indica que YYY239 / 240/317 és necessari per als efectes inhibidors de p66Shc a les vies de senyalització. que controlen l’activació Vav i la reorganització d’actina en cèl·lules B.

Image

La inhibició de la senyalització de CXCR4 i CXCR5 per p66Shc requereix la fosforilació de tirosina del seu domini CH1. ( a ) Anàlisi d'immunoblot amb anticorp anti-fosfo-Vav de sobrenedants postnuclears procedents de transfectants de ctr, p66 i p663F MEC, sense estimular o estimulats durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. A continuació, es mostra un immunoblot anti-actina de control del filtre despullat. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. ( b, top) Anàlisi microscòpica confocal de la fosforilació de Vav en els transfectants MEC ctr, p66 i p663F placada en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc i estimulada durant 2 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les diapositives es van marcar amb anticossos anti-fosfo-Vav i anti-Vav. Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. ( b, inferior) Quantificació de la fosforilació per Vav en quatre imatges diferents de camp ampli a partir de tres experiments independents presentats com la intensitat de fluorescència mitjana (IMF) de tinció de fosfo-Vav en mostres estimulades versus no estimulades, quantificades mitjançant programari ImageJ i normalitzades al contingut intracel·lular. de Vav. Barres d’error, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0, 001. ( c ) Anàlisi d'immunoblot amb anticorp anti-fosfos-Syk de sobrenedants postnuclears procedents de transfectants de ctr, p66 i p663F MEC o bé no estimulats o estimulats durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. A continuació, es mostra un immunoblot anti-actina de control del filtre despullat. El mateix filtre es va sondar amb l'anticòs anti-fosfo-Btk. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. ( d ) Anàlisi d'immunofluorescència de cèl·lules MEC de ctr, p66 i p663F transfectades de forma transitòria per expressar una fusió PH-GFP, immobilitzada 24 h després de la transfecció en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rHICAM-1 / Fc o no estimulades o estimulades amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13 i etiquetat amb anticossos Phalloidin-TRITC (vermell) i anti-GFP (verd). Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. ( e ) Anàlisi d'immunoblot amb anticossos anti-fosfotirosina d'immunoprecipitats específics de p66Shc procedents de lisats de cèl·lules M66 p66 i p663F o bé no estimulats o activats durant 1 min amb 500 ng / ml CXCL12 o 1, 25 μ g / ml CXCL13. El filtre despullat es va retreure amb anticossos anti-Shc

Imatge a mida completa

D'acord amb el requisit de fosforilació YYY239 / 240/317 en la regulació de la senyalització de CXCR4 / CXCR5 per p66Shc, es va trobar que p66Shc fosforilava a la tirosina en resposta a CXCL12 / CXCL13 (Figura 6e).

p66Shc recluta SHIP-1 i SHP-1 a CXCR4 i CXCR5

Els resultats obtinguts amb els mutants p66Shc suggereixen que p66Shc pot interferir amb l'acoblament de CXCR4 / CXCR5 a Vav actuant com a adaptador per reclutar reguladors negatius de les vies dependents del TK o de la PI3-K activades per aquests receptors. Per solucionar aquest problema, p66Shc / p66Shc3F va ser immunoprecipitat a partir de transfectants del MEC que expressaven les proteïnes marcades amb GFP i va sondar la presència de CXCR4 i CXCR5. Es va trobar que els dos receptors es van comprometre en una interacció constitutiva amb p66Shc, així com amb p66Shc3F (Figura 7a). Per tant, l’anàlisi d’immunofluorescència va demostrar que una proporció de p66Shc, així com p66Shc3F, es localitza a la membrana plasmàtica en condicions basals (figura 7b).

Image

p66Shc recluta les fosfatases SHIP-1 i SHP-1 a CXCR4 i CXCR5. ( a ) Anàlisi d'immunoblot amb anticossos anti-CXCR4, CXCR5, SHIP-1 o SHP-1 d'immunoprecipitats específics de GFP procedents de lisats del GFP-p66 i GFP-p663F MEC o no estimulats o estimulats durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. A continuació, es mostren els immunoblots anti-GFP de control dels filtres despullats. La migració de marcadors de massa molecular està indicada. ( b ) Anàlisi microscòpic confocal de SHIP-1 en els transfectants de ctr, p66 i p663F MEC placat en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc i estimulat durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les diapositives es van etiquetar amb un anticòs anti-SHIP-1. Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m. ( c ) Anàlisi microscòpic confocal de GFP i SHIP-1 en els transfectants MF GFP-p66 i GFP-p663F placat en diapositives recobertes de 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc i estimulat durant 1 min amb 100 ng / ml CXCL12 o 200 ng / ml CXCL13. Les diapositives es van etiquetar amb un anticòs anti-SHIP-1. Es mostren seccions òptiques medianes. Barra de mides , 5 μ m

Imatge a mida completa

La PIP 3 es desfosforila ràpidament mitjançant la fosfatasa SHIP-1 (domini SH2 que conté el inositol 5'-fosfatasa-1) 23 que regula negativament la quimiotaxi de les cèl·lules B depenent de la CXCR4. 24 experiments de coimmunoprecipitació van mostrar una associació basica de SHIP-1 amb p66Shc que va ser fortament millorada com a resposta a CXCL12 / CXCL13 (figura 7a). Es va observar una proporció substancial de SHIP-1 a la membrana plasmàtica en condicions basals en cèl·lules MEC que expressen p66Shc, amb una colocalització significativa amb p66Shc marcada amb GFP (Figura 7c). Tot i que també es va observar una associació basal de SHIP-1 amb p66Shc3F, no es va millorar amb el tractament amb quimiocines (figura 7a). Moreover, SHIP-1 was largely cytosolic in the absence of stimulation in p66Shc3F-expressing cells, and a substantial cytosolic pool was also observed following chemokine treatment (Figure 7b). Hence, p66Shc inhibits PI-3K signaling by recruiting SHIP-1 to CXCR4/CXCR5 through its CH1 domain.

The fact that p66Shc negatively regulates the TK cascade triggered by CXCR4/CXCR5 suggests that it may counteract TKs by recruiting tyrosine phosphatases to these receptors. The tyrosine phosphatase SHP-1 (Src homology phosphatase-1) is implicated in negative signaling by a variety of receptors in hematopoietic cells. 25 Probing p66Shc-specific immunoprecipitates revealed the presence of SHP-1 under basal conditions that was enhanced in response to CXCL12/CXCL13 (Figure 7a). A basal interaction, which however did not increase in response to chemokine stimulation, was observed in cells expressing p66Shc3F (Figure 7a), indicating that p66Shc inhibition of TK signaling involves SHP-1 recruitment to CXCR4/CXCR5 through YYY239/240/Y317.

Discussió

Despite our limited mechanistic understanding of CXCR4 and CXCR5 signaling in B-cells, several signaling mediators have been identified. The integrin high-affinity conformational shift triggered by CXCR4 involves Ras-proximate-1 (Rap1), protein tyrosine kinase 2 (Pyk2) and focal adhesion kinase (FAK) activation. 26 Moreover, CXCR4 triggers the Lyn-, Syk- and PI3-K-dependent activation of Rho GTPases through a cascade involving Btk and phospholipase C, γ (PLC γ ). 27 Less is known about CXCR5, although the signaling mediators identified in this pathway, such as Rap1, PI3-K and Pyk2, 27, 28, 29 suggest that it may recapitulate the CXCR4 pathway. The role of the adaptors that act as scaffolds to promote the activation and function of these molecules in the pathways triggered by AgRs has been addressed only for very few instances. Both SLP-76 (SH2 domain-containing leukocyte protein of 76 kDa), which controls TCR-dependent Rap1 activation, 30 and LAT, which couples the TCR to Vav and Rho GTPases, 31 are dispensable for CXCR4 signaling in T cells, 32, 33 suggesting that different adaptors may be implicated in the assembly of the chemokine receptor-associated signalosome. However, SLP-76 has been recently identified as a common target of TCR and CXCR4 in the generation of signaling microclusters; 34 moreover, the role for SLP-76 in LFA-1-dependent T-cell adhesion has been re-evaluated in the setting of shear flow. 35 The adaptors CrkL and Cbl-b are recruited in a multimolecular complex in response to CXCR4 engagement in a pre-B lymphoma line, 36 but their role in B-cell migration has not been directly addressed. The results presented here contribute to filling this gap by identifying p66Shc, which participates as a negative regulator in B-cell receptor (BCR) signaling, 37 as a central component of the pathways that couple CXCR4/CXCR5 to integrin activation and actin dynamics in B-cells. Although the physiological levels of p66Shc expression in primary B-cells are relatively low, they are clearly sufficient to tune down the responses triggered by these receptors, as highlighted by their significant enhancement in p66Shc −/− B-cells.

p66Shc appears to function downstream of Gi activation at the early steps of CXCR4/CXCR5 signaling in the pathways that couple Lyn and PI3-K to Vav, but not in the Gi-independent Jak pathway, as supported by the exacerbation of the chemotaxis defects in p66Shc-expressing B-cells when treated with either PTX or PP2 or wortmannin, but not AG490. A comparison of Lyn, Syk and Btk activation in B-cells differing in p66Shc expression maps p66Shc downstream of Lyn. Lyn activation is believed to occur through its recruitment to lipid rafts with the activated chemokine receptors. 38 That p66Shc does not affect Lyn activation indicates that its constitutive interaction with CXCR4/CXCR5 does not impinge on either their raft clustering or their ability to recruit Lyn. A mechanism by which p66Shc attenuates TK signaling downstream of Lyn can be proposed based on our finding that it interacts with SHP-1 that binds to and dephosphorylates Syk in B-cells. 39 This does not rule out the possibility of a transdominant inhibition of p52Shc that participates in TCR transactivation by CXCR4 in T cells. 15 Nevertheless, this possibility appears unlikely, as this inhibitory function of p66Shc relies on S36 phosphorylation, 12 whereas the data presented here indicate that this molecular determinant is dispensable for the negative regulation of CXCR4/CXCR5 signaling by p66Shc in B-cells.

Inhibition of phosphoinositide signaling by p66Shc is likely to contribute to the Vav activation defect in response to CXCR4/CXCR5, as both Btk and Vav are provided of a phosphoinositide-binding domain. 21 The ability of p66Shc to reduce phosphoinositide accumulation may moreover contribute to the impairment of inside-out signaling to integrins by affecting the assembly of the complex that promotes Rap1 activation that in B-cells includes the PH domain-containing adaptor Src kinase-associated phosphoprotein-homology (SKAP-hom). 40 Although a modulation of PI3-K activity by p66Shc cannot be ruled out, inhibition of CXCR4/CXCR5-dependent phosphoinositide accumulation by p66Shc stems, at least in part, from its ability to enhance SHIP-1 recruitment to the plasma membrane, similar to what we have described for Fc ɛ RI signaling in mast cells. 41 SHIP-1 associates with p52Shc through a bidentate interaction involving binding of the SHIP-1 SH2 domain to phosphorylated YYY239/240/317, as well as binding of the phosphorylated SHIP-1 NPXY motif to the Shc PTB domain. 42, 43 The basal association of p66Shc with CXCR4/CXCR5 suggests that p66Shc could recruit an initial SHIP-1 pool to the receptors in the absence of stimulation, as supported by the constitutive membrane localization of SHIP-1 in p66Shc-expressing cells. Following chemokine binding, CXCR4/CXCR5 could promote p66Shc and SHIP-1 phosphorylation, thereby stabilizing the p66Shc-SHIP-1 complex at the plasma membrane, as supported by the chemokine-dependent enhancement in SHIP-1 binding to p66Shc, but not p66Shc3F. It is noteworthy that SHIP-1 −/− B-cells display adhesion and chemotaxis defects similar to the ones described here for p66Shc −/− B-cells, 24 supporting the notion that p66Shc negatively regulates these processes through SHIP-1.

The ability of p66Shc to generate ROS appears in contrast to its inhibitory effects on B-cell adhesion and migration, as these processes are regulated by oxidants. During EC migration, the NADPHox (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase) subunits NOX2 and p47 phox are targeted to the leading edge where they generate superoxide 44, 45 that promotes cell migration through the oxidation-dependent inhibition of protein phosphatases. 46 ROS also promote leukocyte adhesion to ECs by enhancing ICAM-1 and P-selectin expression, 47, 48 and by inducing a turnover of EC junction proteins. 49 p66Shc promotes ROS accumulation by both inhibiting forkhead transcription factors that control the expression of anti-oxidant enzymes 50 and interrupting the mitochondrial respiratory chain. 51 Subcellular compartmentalization of ROS generation has emerged as an important feature of ROS signaling. 52 We can hypothesize that p66Shc may generate ROS at locations that are not relevant to the signaling pathways that mediate CXCR4/CXCR5-dependent B-cell migration. In support of this notion, NADPHox inhibition did not affect the ability of p66Shc to increase intracellular ROS in T cells (A Nuccitelli and CT Baldari, unpublished). It is noteworthy that p66Shc mediates anoikis in fibroblasts by promoting RhoA activation and focal adhesion formation 53 and promotes VEGF-dependent ROS production in ECs by activating Rac1 and NAPDHox. 54 Hence, the effects of p66Shc on chemotaxis and the role of its pro-oxidant activities in this process appear to be cell type-specific.

We have recently shown that p66Shc modulates the expression of receptors that control B-cell entry (CCR7) and egress (sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1P1)) through its pro-oxidant activity, 14 suggesting its implication in their trafficking to SLOs. The results presented here show that p66Shc can additionally participate in B-cell homing by attenuating signaling to the actin cytoskeleton by CXCR4/CXCR5, acting as an adaptor to recruit negative regulators. Collectively, the data identify p66Shc as a multifunctional regulator of B-cell trafficking.

Materials i mètodes

Cell lines, plasmids, antibodies and reagents

A panel of MEC-1 B-cell stable transfectants expressing either p66Shc (p66) or the p66ShcSA (p66SA) or p66ShcQQ (p66QQ) point mutants, as well as an empty vector transfectant (ctr), were previously described. 14 A MEC-1 transfectant was generated using a construct encoding a p66Shc point mutant lacking the three phoshorylatable tyrosine residues (YYY239/240/317) in the CH1 domain (p66Shc3F). 55 The cDNAs encoding p66Shc and p66Shc3F were cloned into pEGFP-C3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and stably transfected into MEC-1 cells as described previously. 14 A vector encoding the GFP-tagged Akt PH domain 56 was transiently transfected into the stable control, p66 and p663F transfectants. Murine OP9 57 and human HS-5 58 stromal cells were used for pseudoemperipolesis experiments.

Phosphospecific antibodies recognizing the phosphorylated active forms of Syk, Btk and Lyn were from Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) and anti-phospho-Vav was from Biosource (Camarillo, CA, USA). Anti-Erk2, anti-SHIP-1 and anti-Shc antibodies were from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-actin was from Chemicon Int. (Temecula, CA, USA), and anti-phosphotyrosine, anti-Vav and anti-Shc antibodies were from Millipore (Billerica, MA, USA). Anti-CXCR5 and anti-SHP-1 antibodies were from Abcam (Cambridge, UK), anti-CXCR4 polyclonal antibodies were from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), anti-CXCR4 mAbs were from Abnova (Aachen, Germany), anti-GFP polyclonal and mAbs were from Invitrogen. Anti-CXCR4 (12G5) antibodies were kindly provided by J Hoxie, Leukosite Inc. and the MRC AIDS Reagent Project (Cambridge, MA, USA). p66Shc was immunoprecipitated using a rabbit polyclonal antiserum raised against a CH2-glutathione S -transferase (GST) fusion protein. 59 Secondary peroxidase-labeled antibodies were from GE Healthcare (Fairfield, CT, USA). Anti-CD11a, anti-human CD3 and CD19, anti-mouse CD3 and CD22 and secondary fluorochrome-labeled antibodies were from eBioscience (San Diego, CA, USA); anti-GFP and Alexa Fluor 488- and 555-labeled secondary antibodies were from Invitrogen (Leek, The Netherlands). Human and mouse CXCL12 and CXCL13, FN, AG490, PP2, AMD3100, IBMX, f-MLP and TRITC-labeled Phalloidin were purchased from Sigma-Aldrich. PTX was purchased from Sigma-Aldrich. rhICAM-1/Fc was purchased from R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). The chemiluminescence detection kit was from Pierce (Rockford, IL, USA). DiO and Dil fluorescent dyes were purchased from Molecular Probes (Invitrogen).

Ratolins

p66Shc −/− /129 mice (p66Shc −/− ) have been previously described. 59 Analyses were performed on age- and sex-matched 2–9-month-old wild-type 129 mice (wt). All experiments were carried out in agreement with the Guiding Principles for Research Involving Animals and Human Beings and approved by the local ethics committee. Experiments were carried out on spleen, lymph nodes and bone marrow suspensions, or splenic B-cells negatively purified by immunomagnetic sorting using the Dynabeads Mouse CD43 Negative Isolation Kit (Invitrogen) (>85% purity).

Activations and immunoprecipitations

Cells were starved for 2 h in RPMI/1% BSA. Activations with CXCL12 or CXCL13 (10–500 ng/ml, 0.1–1.25 μ g/ml, respectively, depending on cell concentration) were carried out at 37°C in RPMI/1% BSA. Cells were lysed in 1% Triton X-100 in 20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl (in the presence of protease inhibitor cocktail, Invitrogen), resolved by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose (Whatman, GE Healthcare). Alternatively, postnuclear supernatants from 2.5–5 × 10 7 cells/sample were immunoprecipitated using the appropriate antibodies and protein A-Sepharose (GE Healthcare).

Flow cytometry and chemotaxis assay

Transwell migration assays were carried out as described previously. 15 Migrated cells were counted by flow cytometry. Mouse cells were stained with anti-CD3/anti-CD22 antibodies before analysis. The migration index was calculated by determining the ratio of migrated cells in treated versus untreated samples.

Test d’adhesió

The 48-well plates were coated o/n at 4°C with either 10 μ g/ml FN or 10 μ g/ml rhICAM-1/Fc, washed with PBS and incubated for 30 min at 37°C with RPMI/1% BSA. Then, 2 × 10 5 cells/well serum-starved B-cells were added. The plates were incubated at 37°C for 10 min, then added with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13 for further 10 min. Cells that had not adhered (recovered in medium and washes) were resuspended in 0.2 ml RPMI. Cells that remained adherent after 3 washes were recovered by 1-min incubation with trypsin/EDTA, immediately added with RPMI-10% BCS, washed and resuspended in 0.2 ml RPMI. Cells were counted by flow cytometry. Mouse cells were stained with anti-CD3/CD22 antibodies before flow cytometry. The percentage of adherent cells was calculated as follows:

Image

where 'total' is the sum of adherent and nonadherent cells/well.

Pseudoemperipolesis assay

Stromal cells were seeded on 48-well plates (1.5 × 10 5 cells/well) in RPMI/10% BCS and cultured to confluence. Then, 2 × 10 5 cells/well serum-starved B-cells were added. Plates were incubated at 37°C for 10 min, then added with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13 for 40 min. Wells were vigorously washed three times with RPMI and the cells that had not adhered (recovered in medium and washes) were resuspended in 0.2 ml medium. The stromal cell layer containing migrated cells was trypsinized as described above and cells were suspended in 0.2 ml medium. Cells were counted by flow cytometry. All samples were stained with anti-CD19 (human cells) or anti-CD3/CD22 (mouse cells) antibodies before flow cytometry to exclude stromal cells. The percentage of migrated cells was calculated as above.

Immunofluorescence, confocal microscopy and polarization assay

Diagnostic microscope slides were coated with FN or rhICAM-1/Fc and cells (1 × 10 5 /sample) were allowed to adhere for 5 min before stimulation for 2–5 min with 100 ng/ml CXCL12 or 200 ng/ml CXCL13. Cells transiently transfected with the PH-GFP-expressing vector were used 24 h after transfection. Slides were immediately fixed in 4% paraformaldehyde at RT for 20 min as previously described. 60 For SHIP-1 and SHP-1 staining, cells were plated for 15 min on polylysine-coated slides and then stimulated as above. Following fixation, samples were washed 5 min in PBS and incubated with primary antibodies or TRITC-labeled Phalloidin o/n at 4°C or 1 h at RT. After washing in PBS, samples were incubated for 1 h at RT with Alexa Fluor 488- and 555-labeled secondary antibodies.

Confocal microscopy was carried out on a Zeiss LSM700 (Carl Zeiss, Jena, Germany) using a × 63 objective. Images to quantify were acquired with pinholes opened to obtain 0.8 μ m-thick sections. Detectors were set to detect an optimal signal below the saturation limits. Images were processed with Zen 2009 image software (Carl Zeiss) and analyses were performed using ImageJ software (downloaded from //www.embl-heidelberg.de/eamnet/).

For the polarization assay, slides were stained with TRITC-labeled Phalloidin and anti-actin mAb, four different wide-field images/well (at least 25 cells/field) were taken and the percentage of polarized cells (with protrusions or with irregular morphology; see representative images in Figure 1a) against total cells was calculated. In the same images, mean fluorescence intensity (MFI) of Phalloidin and actin staining was quantitated using ImageJ software. For each the Phalloidin staining was normalized to the actin staining.

RNA purification and real-time PCR

Total RNA was extracted from MEC transfectants or mouse B lymphocytes and retrotranscribed as previously described. 37 Real-time PCR was performed in triplicate on 96-well optical PCR plates (Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany) as previously described 14 using SSoFast EvaGreen SuperMix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) and a CFX96 Real-Time system (Bio-Rad Laboratories, Waltham, MA, USA). Transcript levels were normalized to the housekeeping gene HPRT1 .

Anàlisi estadística

Els valors mitjans, la SD i la prova t de Student (no aparellada) es van calcular mitjançant Microsoft Excel (Redmont, WA, EUA). A P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Xifres suplementàries

Glossari

AgR

receptor d'antigen

BCR

Receptor de cèl·lules B

Btk

Tirosina quinasa de Bruton

campament

monofosfat d’adenosina cíclica

CCR7

Receptor de quimiocina CC tipus 7

Cdc42

proteïna de control de divisió cel·lular 42 homolog

CH1

homologia del col·lagen 1

CLL

leucèmia limfocítica crònica

Csk

C-terminal Src cinasa

CXCL12

Quimiocina 12 amb motiu CXC

CXCL13

Quimiocina 13 amb motiu CXC

CXCR4

Receptor de quimiocines CXC tipus 4

CXCR5

Receptor de quimiocines CXC tipus 5

EC

cèl·lula endotelial

FAK

adhesió focal cinasa

FN

fibronectina

GFP

proteïna fluorescent verda

IBMX

3-isobutil-1-metilxantina

ICAM-1

molècula d’adhesió intercel·lular-1

JAK

Janus kinase

LFA-1

antigen-1 associat a la funció del limfòcit

mAb

anticorp monoclonal

NADPHox

nicotinamida adenina dinucleòtid fosfat-oxidasa

PH

homologia de pleckstrin

PIP 2 / PIP 3

4, 5-bisfosfat / (3, 4, 5) -trisfosfat fosfatidilinositol

PI3-quinasa

fosfatidilinositida 3-cinasa

PKA

proteïna cinasa A

PLC γ

fosfolipasa C, γ

PTX

toxina pertussis

Pyk2

proteïna tirosina quinasa 2

Rac1

Substrat de toxina botulínica C3 relacionada amb el ras

Rap1

Ras-pròxim-1

ROS

espècies reactives a l'oxígen

Shc

Src homology 2 domini que conté

ENVIAMENT-1

Inositol 5'-fosfatasa-1 que conté domini SH2

SHP-1

Src homologia fosfatasa-1

SKAP-hom

Homopràfia associada a la fosfoproteïna cinasa

SLO

òrgan limfoide secundari

SLP-76

Proteïna leucòcita que conté domini SH2 de 76 kDa

Syk

melsa tirosina quinasa

S1P1

receptor 1 de esfingosina-fosfat

TK

tirosina quinasa

VEGF

factor de creixement endotelial vascular

VLA-4

antigen-4 molt tard

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)