Efecte neuroprotector de l’osmotina contra la neurodegeneració apoptòtica induïda per l’etanol al cervell de rata en desenvolupament | mort i malaltia cel·lular

Efecte neuroprotector de l’osmotina contra la neurodegeneració apoptòtica induïda per l’etanol al cervell de rata en desenvolupament | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Resum

La síndrome d’alcoholisme fetal és un trastorn neurològic i de desenvolupament causat per l’exposició del cervell en desenvolupament d’etanol. L'administració d'osmotina a cadells de rata va reduir l'apoptosi induïda per etanol en neurones corticals i hipocampals. L’osmotina, una proteïna vegetal, va mitigar els augments induïts per l’etanol en el citocrom c , la caspasa-3 escindida i la PARP-1. L’osmotina i l’etanol van reduir la neurotoxicitat de l’etanol tant in vivo com in vitro mitjançant la reducció dels nivells de proteïnes del caspase-3 escindit, del cyt [Ca 2+ ] intracel·lular i del potencial transmembrana mitocondrial i també es va subregular la proteïna Bcl-2 antiapoptòtica. L’osmotina és un homòleg de l’adiponectina i controla el metabolisme energètic mitjançant la fosforilació. L’adiponectina pot protegir les neurones de l’hipocamp contra l’apoptosi induïda per l’etanol. L’abrogació de la senyalització mitjançant receptors AdipoR1 o AdipoR2, per transfecció amb siRNAs, va reduir la capacitat d’osmotina i adiponectina per protegir les neurones contra la neurodegeneració induïda per l’etanol. La metformina, un activador de l’AMPK (proteïna quinasa activada per l’adenosina monofosfat), va augmentar mentre que el compost C, un inhibidor de la via AMPK, va reduir la capacitat d’osmotina i adiponectina de protegir-se contra l’apoptosi induïda per l’etanol. L'osmotina va exercir la neuroprotecció mitjançant proteïnes de la família Bcl-2 i l'activació de la via de senyalització AMPK. La modulació de les vies AMPK per osmotina, adiponectina i metformina són prometedores com a teràpia preventiva per al síndrome de l'alcohol fetal.

Principal

El consum d'alcohol matern exposa el cervell fetal a l'etanol que pertorba el desenvolupament cerebral en humans i en models animals. 1 Les pertorbacions neurològiques resultants i els defectes del desenvolupament es manifesten durant tota la vida de la descendència i es denominen efectes d'alcoholisme fetal o síndrome d'alcoholisme fetal (FAS), segons la seva gravetat. En els humans, els efectes de l’exposició a l’alcohol al cervell fetal inclouen malformacions craniofacials, així com una sèrie de trastorns neurològics que inclouen hiperactivitat, dèficits d’aprenentatge i memòria, retard mental, psicosi, depressió i esquizofrènia. 2, 3 Actualment, no hi ha cap tractament eficaç per prevenir o revertir el FAS després de l’exposició a l’etanol. 4

Els estudis sobre exposició a alcohol a models animals en desenvolupament han proporcionat una visió dels possibles mecanismes de neurotoxicitat induïda per etanol i també han permès estudiar intervencions que mitiguin els efectes de l'etanol. Aquests estudis han establert que l'exposició a l'etanol està associada amb una reducció massiva del nombre de neurones de l'escorça cerebral, l'hipocamp, el cerebel i el bulb olfactiu. 5 Els estudis actuals proporcionen una forta evidència que la neurodegeneració a escala substancial és el mecanisme pel qual l'etanol interromp el desenvolupament cerebral del rosegador i, de la mateixa manera, l'exposició a l'etanol pertorba el desenvolupament del cervell fetal humà. 6, 7, 8 Diverses vies semblen contribuir a la inducció de la mort neuronal per etanol. Aquests inclouen l’estrès oxidatiu, els canvis ràpids en Ca 2+ intracel·lular, l’excitotoxicitat causada per l’antagonista de NMDA i les propietats mimètiques de l’etanol GABA, la interrupció de les interaccions cèl·lula-cèl·lula i la interferència amb l’activitat dels factors de creixement. 8, 9, 10 Independentment del desencadenant, l’apoptosi induïda per l’etanol està associada a un augment de la permeabilitat mitocondrial i una deteriorada funció mitocondrial.

Diversos informes recents sobre els mecanismes moleculars d’acció de l’etanol en els cervells suggereixen una connexió amb l’hormona del mamífer adiponectina. L’adiponectina és una proteïna de 30 kD secretada per adipòcits el nivell sèric dels quals està correlacionat positivament amb la sensibilitat a la insulina, l’ús de glucosa i àcids grassos, la protecció cardiovascular i la protecció contra la hipertensió. 11 A nivell mecanicista, aquests efectes metabòlics queden mediats per l’adiponectina en gran mesura a través dels seus efectes sobre el metabolisme energètic. 12, 13 Breument, la interacció de l’adiponectina amb els seus receptors de membrana plasmàtica AdipoR1 i AdipoR2 indueix la fosforilació i l’activació de la proteïna cinasa activada per l’adenosina monofosfat (AMPK), una proteïna que intueix l’esgotament de l’energia cel·lular.

L’adiponectina entra a la sang amb el líquid cefalorraquidi. 14 L' expressió del receptor 1 de l'adiponectina (AdipoR1) és omnipresent en el cervell de rata, mentre que l'expressió limitada de AdipoR2 es va observar en zones cerebrals específiques com l'hipotàlem, el còrtex i l'hipocamp. 15 L’ administració d’adiponectina per injecció intracerebroventricular protegeix les neurones hipocampals del ratolí contra la mort cel·lular induïda per l’àcid kainic, probablement millorant la funció endotelial vascular i preservant la integritat de la barrera hematoencefàlica. 16 Adiponectina protegeix contra lesions isquèmiques cerebrals. 17, 18 En conjunt, aquestes dades suggereixen que l’adiponectina té un paper generalitzat en el metabolisme cerebral. L’evidència limitada disponible suggereix que el mecanisme d’acció de l’adiponectina en el teixit cerebral és probable que sigui el mateix que en altres teixits. A l’hipotàlem arquejat de ratolins, l’adiponectina activa AdipoR1 / R2 i indueix posteriorment la fosforilació d’AMPK per equilibrar sistemàticament la ingesta d’energia i la despesa. 14 L’ administració d’adiponectina per injecció intracerebroventricular indueix la fosforilació AMPK a l’hipotàlem de rata. Així, els mecanismes d’acció de l’adiponectina al cervell i altres òrgans comparteixen similituds. En resum, existeixen receptors d’adiponectina i adiponectina en zones del cervell que se sotmeten a l’apoptosi induïda per l’alcohol que és responsable de FAS. Per tant, es van examinar els efectes neuroprotectors de les vies activades per l'adiponectina contra el FAS. Per raons d’economia, aquest estudi es va realitzar amb un homòleg d’adiponectina que es pot aïllar i purificar en grans quantitats del teixit vegetal. L’homolog d’adiponectina utilitzada era una proteïna del tabac anomenada osmotina.

Hem demostrat aquí que l’osmotina protegeix in vitro les neurones de l’hipocampal fetal de rata, així com les neurones hipocampals i corticals neonatals in vivo contra l’apoptosi induïda per etanol. L’adiponectina també es va protegir contra l’insult d’etanol en cultius neurones de l’hipocamp fetal de rata. La neuroprotecció per osmotina i adiponectina es va mediar mitjançant receptors d’adiponectina i activitat de l’AMPK. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els efectes devastadors del FAS es poden prevenir o revertir mitjançant intervencions terapèutiques que generen l’activació d’AMPK, que pot incloure la metformina antidiabètica àmpliament utilitzada així com l’adiponectina i l’osmotina. Aquest estudi també demostra el valor de l'osmotina com a alternativa experimental econòmica a l'adiponectina. Les proteïnes semblants a l’osmotina són omnipresents en les plantes i es troben en fruites, verdures i cereals comestibles. Per tant, els nostres resultats també suggereixen que les proteïnes vegetals similars a l’osmotina podrien ser una font valuosa d’agents neuroprotectors contra el FAS.

Resultats

L’osmotina protegeix contra la neurodegeneració apoptòtica induïda per l’etanol en cultius primaris de neurones de l’hipocamp

Malformacions craniofacials induïdes per l’etanol comporten apoptosi i neurodegeneració que es produeixen en les 12 h de l’exposició. 7, 8 Es va estudiar un examen preliminar de l'efecte d'osmotina en la neurodegeneració induïda per etanol en cultius primaris de neurones hipocampals del cervell de rata fetal mitjançant la doble tinció amb Fluoro-Jade B (FJB) i iodur de propidio (PI). Després del tractament amb etanol durant 24 hores, les neurones es van condensar marcadament i van presentar taques intenses de FJB i PI en comparació amb els grups control (Figura 1A). El grup etanol més osmotina tenia un patró de tinció intermèdia i les mesures quantitatives van confirmar que hi havia menys cèl·lules degeneradores en el grup tractat amb osmotina més amb etanol en comparació amb les cèl·lules exposades a l'etanol sol i que la neurodegeneració es va invertir pel tractament de l'osmotina. La colocalització de taques de FJB i PI a totes les mostres va suggerir que la degeneració induïda per etanol estava estretament associada a la mort cel·lular.

Image

L’osmotina protegeix contra la toxicitat de l’etanol a cultius primaris de neurones fetals. ( A ) Anàlisi de fluorescència de neurodegeneració en cultius primaris de neurones hipocampals del cervell de rata fetal. Els cultius van estar exposats a suports de creixement sense (Control) i amb etanol (EtOH, 100 mM) o osmotina (Osm, 0, 16 μ M) més suplements EtOH (100 mM) durant 24 hores abans de tenyir-se amb Fluoro-Jade B (FJB; verd) i iodur de propidi (PI; vermell). Ampliació × 60; barra d’escala, 20 μ m. A la gràfica es mostren els percentatges de cèl·lules FJB i PI positives per secció ( n = 4). Els parells indicats són significativament diferents a P <0, 05. ( B ) Test MTT de viabilitat cel·lular en cultius primaris de neurones hipocampals de cervell de rata fetal. Es va mesurar la viabilitat cel·lular després de l’exposició a etanol i osmotina a les concentracions indicades durant 12 i 24 hores. Les dades són la mitjana ± SE de tres experiments independents ( n = 3), amb tres plaques a cada experiment. Els símbols indiquen diferències significativament estadístiques a P <0, 05. Símbols: a , diferents del control; b , diferent de l’etanol (100 mM). ( C ) Es descriu l'anàlisi de concentracions de calci citosòliques en cultius primaris d'hipocampal i de neurones corticals del cervell de rata fetal exposats als tractaments indicats durant 24 hores, seguit d'un marcatge fura-2 AM

Imatge a mida completa

L’efecte neuroprotector de l’osmotina es va quantificar més mitjançant l’assaig MTT (3- [4, 5 – dimetilthiazol – 2 – yl] -2, 5-difenil tetrazolium) assaig mitjançant cultius primaris de la neurona hipocampal exposada a l’etanol durant 12 i 24 h. Tal com es mostra a la figura 1B, l’etanol de suplementació en cultiu va reduir la viabilitat cel·lular al 55-60% en comparació amb el grup control. No obstant això, l'osmotina i la combinació d'etanol milloraven significativament la viabilitat cel·lular, fins a un 80-90% en comparació amb grups tractats amb etanol (Figura 1B). L’etanol té antagonistes NMDA i propietats mimètiques de GABA i es creu que la inhibició anormal de l’activitat neuronal per part de l’etanol desencadena una neurodegeneració apoptòtica. 20 Els agents que contribueixen a l’excitotoxicitat neuronal o a l’apoptosi alteren l’homeòstasi de calci augmentant el nivell de Ca +2 intracel·lular. 21, 22, 23 Anteriorment, també s’ha suggerit que els agents que inhibeixen l’augment de Ca 2+ intracel·lulars tinguin un efecte neuroprotector. 21, 22, 24 Per tant, va ser important determinar els efectes de l’osmotina, l’etanol i l’etanol més l’exposició a l’osmotina al nivell de Ca 2+ intracel·lular. Vam observar que la concentració intracel·lular de Ca 2+ va ser elevada significativament en les cèl·lules exposades a etanol (100 mM) durant 24 h en comparació amb els grups control (Figura 1C). L’osmotina va revertir l’efecte de l’etanol sobre el nivell de Ca 2+ intracel·lular de manera dependent de la concentració, de manera que es podrien restaurar els nivells normals de Ca 2+ intracel·lular mitjançant una dosi d’osmotina adequada (0, 16 μ M).

Els danys oxidatius als mitocondris i la disfunció mitocondrial acompanyen la neurodegeneració i l’apoptosi induïda per l’etanol. 24 El valor de la membrana mitocondrial es va mesurar per tant en cultius de neurones hipocampals primàries exposades a etanol, osmotina o osmotina més etanol durant 24 hores per investigar el mecanisme mitjançant el qual es restaura la viabilitat cel·lular mitjançant tractament amb osmotina. Tal com es mostra a la figura 2, el tractament de les neurones amb etanol va donar lloc a una subpoblació significativa de cèl·lules amb un potencial de membrana mitocondrial baixa (cèl·lules FL1, 45, 14%). Un percentatge més reduït de cèl·lules del grup controlat amb osmotina i d’osmotina més amb etanol tenien un potencial de membrana mitocondrial comparativament baix (29, 29%, 31, 47% i 33, 01%, respectivament), demostrant que l’etanol indueix el col·lapse del potencial de membrana mitocondrial. i l’osmotina té un efecte protector contra els danys mitocondrials induïts per l’etanol.

Image

L’osmotina protegeix contra l’enfonsament induït per l’etanol del potencial de membrana mitocondrial en cultius primaris de neurones de l’hipocamp fetal. Es va controlar la polarització mitocondrial mitjançant anàlisi citomètrica de flux de cèl·lules tenyides de JC-1 que es van tractar durant 24 h amb etanol (EtOH, 100 mM), osmotina (Osm, 0, 16 μ M), osmotina més etanol (Osm, 0, 16 μ M + EtOH, 100 mM) o no tractats (control). El col·lapse del potencial de membrana mitocondrial està associat a una fluorescència FL1 elevada (verda) i fluorescència FL2 baixa (vermella). El nombre de cada quadrant indica el percentatge de població cel·lular en aquest quadrant del total de cèl·lules

Imatge a mida completa

La segona alteració important dels mitocondris durant l’apoptosi és un augment de la permeabilitat de la membrana externa mitocondrial. 25, 26 A més, es va observar el canvi en l’expressió de proteïnes a l’exposició a etanol durant 24 hores en cultius primaris de neurones hipocampals mitjançant l’anàlisi de Western blot. Els nostres resultats van mostrar que la mort de cèl·lules induïda per etanol va anar acompanyada d’una major acumulació de la proteïna proapoptòtica Bax i d’una petita però significativa reducció del nivell de la proteïna antiapoptòtica Bcl-2 (figures 3a i b). L’efecte general va ser una reducció significativa de la proporció Bcl-2 / Bax que va suggerir que l’etanol té un efecte nocivi significatiu sobre la permeabilitat de la membrana mitocondrial. L’efecte més destacat de l’exposició a osmotina va ser un augment del nivell de la proteïna antiapoptòtica Bcl-2 en comparació amb el tractament amb etanol i gairebé cap pertorbació de la proporció Bcl-2 / Bax en comparació amb el grup control (figura 3b). Les cèl·lules exposades a osmotina i etanol tenien proporcions significativament més elevades de Bcl-2 / Bax que les cèl·lules tractades amb etanol, cosa que suggereix que l'osmotina protegeix contra l'apoptosi induïda per etanol pel seu efecte protector sobre la permeabilitat mitocondrial.

Image

L’acció protectora de l’osmotina contra l’apoptosi induïda per l’etanol en cultius primaris de neurones hipocampals fetals es demostra per nivells cel·lulars de proteïnes marcadores apoptòtiques. ( a ) Les cèl·lules van estar exposades durant 24 hores a un medi de creixement normal que no contenia suplements (Control), ni es van complementar amb etanol (EtOH) i osmotina (Osm), tal com es va indicar. Es mostren immunoblots d'extractes cel·lulars fraccionats per SDS-PAGE. L'anticòs usat per la caspasa-3 era capaç de reconèixer la caspasa-3 pro- i escindida. Tot i això, només es van veure en aquestes mostres les bandes de caspasa-3 clivellades. Es van reaccionar els blots amb anticossos a la β -actina com a control de càrrega. ( b ) Es mostra una anàlisi quantitativa de les dades de la ( a ). Els valors de densitat, normalitzats a senyals d’actina, s’expressen com a mitjana ± SD ( n = 5) i s’expressen com a unitats arbitràries. Els parells indicats són significativament diferents a P <0, 05. L'inserció mostra la relació de senyal de Bax mitjana a mitjana de Bax entre els tractaments

Imatge a mida completa

Les caspases són proteases que tenen un paper central en l’inici i l’execució de la mort de les cèl·lules apoptòtiques. 27 Es va observar un augment del nivell de caspasa-3 escindida a les cèl·lules tractades amb etanol mitjançant l'anàlisi de blot occidental, d'acord amb la idea que l'exposició a l'etanol indueix la mort de cèl·lules apoptòtiques en cultius primaris de neurones de l'hipocamp fetal (figures 3a i b). El tractament amb osmotina va reduir el nivell de caspasa escindida-3. Com que la caspasa-3 es pot activar per vies d’apoptosi mitocondrial i no mitocondrial, això suggereix que l’osmotina podria tenir un efecte antiapoptòtic contra una àmplia gamma d’estímuls apoptòtics. El nivell de caspasa-3 escindida va ser menor en les cèl·lules tractades amb osmotina més etanol en comparació amb només etanol, cosa que confirma que l'osmotina té un efecte antiapoptòtic en les neurones de l'hipocamp cultivades exposades a l'etanol.

L’osmotina inhibeix l’apoptosi induïda per l’etanol al cervell de rata neonatal

Per estudiar l'efecte protector de l'osmotina contra l'apoptosi induïda per etanol in vivo , les rates P7 Sprague-Dawley es van injectar intraperitonealment amb 20% d'etanol en una solució salina normal amb 4 mg / g de pes corporal. Els cadells van ser assassinats en diferents moments després de la injecció i es va controlar la neurodegeneració apoptòtica com un augment del nivell de caspasa escindida a l'hipocamp (Figura Suplementària Figura S1). La neurodegeneració apoptòtica es va manifestar des de les 4 h fins a almenys les 28 h després de la injecció d’etanol. Per establir una dosi d’osmotina adequada, els cadells van ser injectats per via subcutània amb diverses dosis d’osmotina en solució salina fins a 30 min després de la injecció d’etanol i el nivell d’expressió de caspasa escindida-3 es va examinar per western blot 12 hores després en teixit hipocampal (figura 4A). El tractament amb osmotina va reduir el nivell de caspasa-3 escindida en teixits exposats a l’etanol de forma dependent de la concentració. Es va observar una reducció significativa del nivell de caspasa-3 escindida a dos o més sobre osmotina de 7 μ g / g de pes corporal. A partir d’aquestes troballes, es va administrar etanol a 4 mg / g de pes corporal i d’osmotina a 15 μ g / g de pes corporal 30 min després del tractament amb etanol en els experiments següents.

Image

L’osmotina inhibeix l’apoptosi induïda per etanol in vivo . Els cadells de rata P7 van ser injectats amb solució salina (-) o etanol (EtOH; 4 mg / g pc) i de nou amb osmotina (Osm) o salina 30 min després. ( A ) Els tractaments estan indicats per sobre de les taques. Es va analitzar el nivell de caspasa-3 i β -actina escindida a la part de l'hipocamp del cervell mitjançant western blot a les 12 h després de l'administració d'etanol. El gràfic mostra la quantificació dels nivells de caspasa-3 escindits per densitometria. Els valors es van normalitzar en senyals β- actines i representen la mitjana ± SD ( n = 3). Una diferència significativa del grup d'etanol a P <0, 01 és indicada per un asterisc. ( B ) La fragmentació de l’ADN apoptòtic en els teixits del cervell es va avaluar amb una tinció de TUNEL 12 h després de l’administració d’etanol. La dosi d’osmotina era de 15 μ g / g pc Les fletxes indiquen nuclis tenyits de TUNEL a les neurones. Ampliació × 40; barra d’escala, 50 μ m. ( C ) Els cadells de rata P7 van ser injectats amb solució salina (Control) o etanol (EtOH; 4 mg / g pc) i de nou amb osmotina (Osm; 15 μ g / g pc) o salina 30 min després. Els cadells van morir a les 12 hores després de la injecció d’etanol per a l’anàlisi de la neurodegeneració mitjançant la tinció de iodur de propidi (PI) i el fluor-jade B (FJB). ( C ) Les seccions es presenten tacades de la regió CA1 de l'hipocamp. Ampliació × 60; barra d’escala, 20 μ m. ( D ) Es mostren seccions tacades de l'escorça cingulada anterior. (a – f) ampliació × 40; barra d’escala, 20 μ m; (g – i) ampliació × 100; barra d’escala, 10 μ m. ( E ) Quantificació de les dades representades a ( A ) i ( B ). Les dades representen significa ± SD ( n = 4, hipocamp; n = 3, còrtex). S’indica els parells d’exemple que eren significativament diferents a P <0, 05. ( F ) Es mostren les vistes de les regions de l'hipocamp CA1, CA3 i DG després de la tinció de PI a baixa (× 20; barra d'escala = 20 μm) i alta (× 100; barra d'escala = 10 μ m). Els rectangles indiquen les regions CA1 que es mostren a les vistes magnificades. Les fletxes indiquen neurones estroncades i danyades

Imatge a mida completa

L'apoptosi es va observar en els teixits corticals i hipocampals mitjançant TUNEL (etiquetat amb nick-end de la desoxinucleotidil-transferasa dUTP terminal) després del tractament amb etanol i l'extensió de l'apoptosi es va reduir significativament amb el tractament post-osmotina (figura 4B). La neurodegeneració també es va visualitzar i quantificar mitjançant la tinció de FJB i PI. La còrtex cingulada anterior i la regió de l'hipocamp CA1 que van rebre etanol tenien un nombre significativament més gran de cèl·lules FJB i PI-positives en comparació amb el control (Figures 4C i D). En canvi, els cadells de rata tractats amb etanol que posteriorment van rebre osmotina van mostrar una reducció significativa de les cèl·lules FJB- o PI-positives en aquestes regions cerebrals vulnerables, en comparació amb el tractament amb etanol només (Figura 4E). Tot i això, el tractament post-osmotina no va reduir el nombre de cèl·lules positives amb FJB i PI fins al nivell que es troba en el grup de control tractat amb salina, cosa que indica que la inversió completa de l'efecte neurodegeneratiu de l'etanol no es va aconseguir en les nostres condicions experimentals. Un examen més ampli de les seccions de teixit hipocampal tenyit de PI de cervells de cadells de P7 va revelar que al subcamp CA1 de l’hipocamp, les neurones piramidals estaven disperses, tenyides de manera més intensa amb PI, i tenien diferents mides i formes en el grup tractat amb etanol en comparació amb l’osmotina i grups de control (figura 4F).

Es va controlar més aviat la disfunció mitocondrial i l’apoptosi mitjançant l’anàlisi del western blot (figura 5). La deficiència de citocrom c redueix la sensibilitat cel·lular als estímuls apoptòtics que funcionen a través de la via mitocondrial. 28 Això es deu al fet que el citocrom c s’allibera de l’espai intermembrana del mitocondri al citosol en resposta a estímuls apoptòtics que alteren el potencial o la permeabilitat de la membrana mitocondrial que activa la cascada de la caspasa. Els nostres resultats (figura 5 i figura suplementària S2a i b) mostren que la neurodegeneració apoptòtica induïda per l’etanol en els teixits hipocampals i corticals del cervell de rata en desenvolupament es va caracteritzar per una baixada significativa de la relació de proteïnes antiapoptòtiques (Bcl-2 i Bcl-XL) amb proapoptòtics. proteïnes (Bax i Bak) i per regulació significativa de proteïnes marcadores proapoptòtiques com el citocrom c , la caspasa-9 escindida i la caspasa-3 escindida. El tractament amb osmotina sola i l’osmotina després del tractament amb etanol exposat a desenvolupar cervells de rata va augmentar la proporció de proteïnes antiapoptòtiques (Bcl-2 i Bcl-XL) amb proteïnes proapoptòtiques (Bax i Bak). L’osmotina per si mateixa va afectar alguns, però no tots els marcadors apoptòtics a l’aigua avalats. Els nivells d'almenys dues de les tres proteïnes marcadores, el citocrom c , la caspasa-9 escindida i la caspasa-3 escindida, van ser significativament més baixos en els teixits hipocampals i corticals de cadells que van rebre osmotina després de l'exposició amb etanol en comparació amb el grup tractat amb etanol. A més, tant els nivells de PARP-1 (poli [ADP-ribosa] polimerasa 1), com total i escindits, es van reduir significativament per tractaments amb osmotina sola o amb osmotina més etanol en comparació amb grups no tractats i tractats amb etanol, respectivament. L’osmotina i l’osmotina més l’etanol van causar una disminució del nivell total de PARP-1 respecte dels grups no tractats i tractats amb etanol, respectivament.

Image

Els nivells de proteïnes marcadores apoptòtiques en el desenvolupament de cervells de rata suggereixen una acció protectora d’osmotina in vivo contra l’apoptosi induïda per l’etanol. Els cadells de rata P7 van ser injectats amb solució salina (-) o etanol (EtOH; 4 mg / g pc) i de nou amb osmotina (Osm; 15 μ g / g pc) o salina 30 min més tard. Es mostren immunoblots que representen nivells de les proteïnes marcadores apoptòtiques indicades en extractes de teixit a les 12 h després de l'administració d'etanol. β- L'actina es pren com a control de càrrega en cada cas. L'experiment es va repetir tres vegades i es mostra un experiment representatiu. Quantificació i anàlisi estadística de les dades completes es mostren a les figures suplementàries S2a i b

Imatge a mida completa

A més, aquests teixits cerebrals van ser analitzats histològicament mitjançant tècniques d’immunofluorescència per al citocrom c i la caspasa-3 escindida. Tal com es mostra a les imatges representatives (Figures 6A i B), en consonància amb els resultats de l'anàlisi de blot occidental (Figura 5 i Figures Suplementàries S2a i B), la injecció d'etanol va augmentar els nivells de citocrom c (marcats amb FITC, verd) i caspasa-3. (Marcada amb TRITC, vermell) a la regió CA1 de l'hipocamp i a l'escorça cingulada anterior del cervell de rata en desenvolupament. La disminució dels nivells de citocrom c i caspasa-3 en els teixits corticals després del tractament post osmotina, en comparació amb el tractament només amb etanol (figura 6B), també va ser conseqüent amb els resultats de Western blot (figura 5 i figures suplementàries S2a i b). En canvi, el tractament post-osmotina només va reduir significativament el nivell de citocrom c al teixit hipocamp total en comparació amb el tractament només amb etanol (Figura 5 i Figures Suplementàries S2a i b).

Image

Anàlisi d'immunofluorescència dels nivells de citocrom c i caspasa-3 que mostren l'acció neuroprotectora in vivo d'osmotina contra l'apoptosi induïda per etanol en el cervell de rata. Els cadells de rata P7 van ser injectats amb solució salina (Control) o etanol (EtOH; 4 mg / g pc) i de nou amb osmotina (Osm; 15 μ g / g pc) o salina 30 min després. Els cadells van morir a les 12 hores després de la injecció d'etanol per a la seva anàlisi. Es mostren seccions de teixit de la regió CA1 de l’hipocamp ( A ) i del còrtex cingulat anterior ( B ) que es tenien una doble taca per al citocrom c (etiqueta FITC, verd) i caspasa-3 (etiqueta TRITC, vermella). El color groc (unió) indica colocalització. (a – c) ampliació × 20; (d –i) ampliació, × 40; barra d’escala, 20 μ m

Imatge a mida completa

En general, les anàlisis moleculars donen suport a les dades d’imatge per demostrar que l’administració d’etanol a cadells de rata neonatal va induir neurodegeneració apoptòtica, mentre que l’osmotina va tenir un efecte protector en els mitocondris en els teixits del cervell de rata neonatal in vivo .

L’activitat AMPK està implicada en la protecció contra l’apoptosi neuronal induïda per l’etanol

L’osmotina és un homòleg estructural de l’adiponectina. L’ adiponectina és present en el líquid cefalorraquidi i els receptors d’adiponectina s’expressen a la majoria de teixits cerebrals. 14, 30, 31 No hi ha informes sobre la participació de l'adiponectina en la protecció contra danys neuronals induïts per l'etanol en el desenvolupament de teixits cerebrals. Per tant, era important comprovar si l'adiponectina imita l'osmotina per protegir-se contra la neurotoxicitat de l'etanol. En aquest estudi es va observar una anàlisi citomètrica de flux de la mort cel·lular per una tinció de l'annexina V-PI en neurones hipocampals cultivades tractades amb etanol, osmotina, etanol més osmotina o adiponectina. Els nostres resultats van demostrar que la neurodegeneració va induir etanol, mentre que l’adiponectina, com l’osmotina, estava protegida contra la mort cel·lular induïda per l’etanol (Figures 7a i b) que confirmen encara més els nostres resultats, com ja es va demostrar anteriorment per Miele et al. 32, que l'osmotina es comporta com l'adiponectina, ja que les semblances estructurals i funcionals són iguals entre l'osototina i l'adiponectina humana. Una conclusió similar es va arribar al observar que la caspasa-3 escindida en aquestes cèl·lules es va incrementar mitjançant tractament amb etanol i que la combinació d’osmotina o adiponectina amb etanol va invertir parcialment l’efecte de l’etanol (figura 7c).

Image

L’activitat AMPK està implicada en la protecció contra l’apoptosi induïda per l’etanol. ( a ) Anàlisi citomètrica de flux de cèl·lules apoptòtiques mitjançant una tinció de iodur de l'annexina V-propidi. Els cultius primaris de les neurones hipocampals fetals (GD 17, 5) es van tractar amb un medi de creixement fresc sense (Control) o amb combinacions indicades d’etanol (100 mM), osmotina (0, 16 μ M), adiponectina (0, 1 μ M), Compost compost C (20 μ) M), o suplements de metformina (5 mM) durant 24 hores i després analitzats. Es comptabilitzen cèl·lules positives tant per a l’annexina V (apoptòtica precoç) com per l’annexina V i el iòdur de propidi (apoptòtic tardà) i es troben en els quadrants indicats per l’òval vermell. A la cantonada inferior dreta es mostren els resultats de l’anàlisi immunoblot dels nivells de fosfo-AMPK (P-AMPK) en aquestes cèl·lules en diferents moments després del tractament amb osmotina (0, 16 μ M). Els senyals P-AMPK es van normalitzar a senyals β- actines i s'expressaven com a mitjana ± SD ( n = 5). L’asterisme indica una diferència significativa respecte al grup zero hora a P <0, 01 ( b ) Es mostren els resultats quantitatius de l’anàlisi citomètrica de flux ( n = 3), expressada en els percentatges de cèl·lules apoptòtiques de la població. ( c ) Es mostren els resultats de l’anàlisi de blot occidental d’extractes cel·lulars de les neurones de l’hipocamp al final d’aquests tractaments. Els extractes cel·lulars es van fraccionar per SDS-PAGE i es van analitzar per caspase-3 i β -actina mitjançant immunoblot. Els senyals Caspase-3 es van normalitzar a senyals β -actines i s’expressaven com a mitjana ± SE ( n = 5). S’indica els parells d’exemple que són significativament diferents l’un de l’altre a P <0, 05

Imatge a mida completa

La senyalització d’osmotina a través de receptors d’adiponectina en miotubs C2C12 murins condueix a l’activació d’AMPK. 33 L’activació d’AMPK per la fosforilació Thr 210 és un component clau a baix de la senyalització d’adiponectina que media molts dels efectes beneficiosos de l’adiponectina. 14, 34, 35 Es va trobar que la senyalització d’osmotina en cultius neurones hipocampals també va induir la fosforilació d’AMPK Thr 210 (figura 7a). A més, per comprovar si l’activació d’AMPK podria tenir un paper en la protecció que ofereix l’osmotina i l’adiponectina contra la toxicitat de l’etanol a les neurones de l’hipocamp fetal, vam provar l’efecte de la coadministració del compost C juntament amb osmotina, etanol i adiponectina amb diferents combinacions. El compost C és un inhibidor de la competència àmpliament utilitzat de l’activitat AMPK. La coadministració del compost C amb osmotina i etanol o adiponectina i etanol va revertir parcialment l’acció protectora d’osmotina i adiponectina sobre la mort cel·lular induïda per etanol, mesurada per l’anàlisi FACS mitjançant cèl·lules tacades d’annexina V-PI (figures 7a i b) i total nivell d’expressió de proteïna caspasa-3 mitjançant l’anàlisi del Western blot (figura 7c). Es va produir un augment significatiu de la quantitat de caspasa-3 escindida després del tractament amb compost C, cosa que suggereix que la inhibició de l’activitat AMPK va accelerar la progressió de l’apoptosi.

La metformina és un medicament antidiabètic molt utilitzat que activa AMPK indirectament mitjançant la seva acció sobre una quinasa amunt. 36 Per confirmar que l’activació d’AMPK pot protegir-se contra l’apoptosi induïda per l’etanol, també es va examinar l’efecte de la coadministració de metformina i etanol. Com es mostra a la figura 7, la metformina va reduir l'efecte tòxic de l'etanol mesurat per una tinció de l'annexina V-PI. El nivell de caspasa-3 de les cèl·lules tractades amb metformina més etanol no era diferent significativament del grup tractat amb etanol. És possible que la metformina no fos tan eficaç com l’osmotina o l’adiponectina perquè la dosi de metformina no era prou alta o perquè la cinasa objectiu per la metformina contribueix només parcialment a la senyalització d’osmotina i adiponectina.

Després d’haver demostrat que l’efecte protector de l’osmotina requereix l’activació de la via de senyalització d’AMPK, vam provar a continuació si també eren necessaris receptors d’adiponectina tal com es mostra a la figura 8a. A més, les cèl·lules hipocampals fetals cultes transfectades amb siRNA no relacionat tenien nivells més alts de PARP-1 escindida quan estaven exposades a etanol, cosa que indica apoptosi. L’exposició a osmotina més etanol o adiponectina més etanol va donar lloc a una reducció significativa dels nivells de caspasa-3 escindida i PARP-1 escindida en comparació amb el grup tractat amb etanol, cosa que suggereix que l’osmotina i l’adiponectina estaven protegides contra la toxicitat d’etanol. Les cèl·lules transfectades amb una combinació de siAdipoR1 i siAdipoR2, que havien reduït l'expressió tant de AdipoR1 com d'AdopoR2 (Figures 8b i c), tenien nivells més alts de caspasa-3 escindida i PARP-1 escindida que les cèl·lules transfectades amb siRNA no relacionat, cosa que suggereix que la senyalització basal a través d’aquests receptors tenien una funció prosurvival. Com era d’esperar, el tractament amb etanol va elevar els nivells de caspasa-3 escindida i PARP-1 escindida en comparació amb el grup de control en cèl·lules transfectades amb una combinació de siAdipoR1 i siAdipoR2, cosa que indica que l’apoptosi va induir l’etanol. No obstant això, a les cèl·lules transfectades siAdipoR1- més siAdipoR2, els nivells de grup cascat i-PARP-1 escindits en els grups tractats amb osmotina més etanol o adiponectina més amb etanol eren superiors o iguals al del grup tractat amb etanol (Figures 8b i c) que suggereix que l'osmotina i l'adiponectina estan protegides contra la toxicitat d'etanol. A més, també es va estudiar l’exposició d’osmotina més etanol i adiponectina més etanol tant en cèl·lules no relacionades com AdipoR1 més amb AdipoR2 siRNA transfectades, resultant en un augment significatiu dels nivells d’expressió p-AMPK en comparació amb el grup tractat amb etanol en siRNA no relacionat i significatiu. disminució de l’expressió p-AMPK en cèl·lules transfectades siAdipoR1- més siAdipoR2 (Figura 8d). Per tant, es conclou que l’osmotina va mostrar el seu efecte neuroprotector mitjançant receptors d’adiponectina necessaris per a l’acció protectora d’osmotina i adiponectina contra la neurodegeneració induïda per l’etanol en les neurones de l’hipocamp.

Image

L’efecte protector de l’osmotina sobre l’apoptosi induïda per l’etanol requereix receptors d’adiponectina. ( a ) Desregulació de l'expressió del receptor adiponectina per transfecció amb siRNA. Es mostra l’anàlisi RT-PCR de l’expressió d’ARNm AdipoR1 i AdipoR2 en les neurones hipocampals fetals primàries (GD 17.5) que van ser transfectades amb siRNA no relacionat o AdipoR1 més amb SiRNA AdipoR2 (1: 1). Els nivells d’ARNm de GAPDH es mostren per normalitzar els nivells d’expressió. ( b - d ) Els cultius primaris de neurones hipocampals fetals que van ser transfectades amb una barreja (1: 1) de SiRNAs AdipoR1 i AdipoR2 (AdipoR1 + R2) i siRNA no relacionats van ser tractats amb etanol (EtOH; 100 mM), osmotina (Osm; 0, 16 μ M), o adiponectina (Adipo; 0, 1 μ M) en combinacions durant 24 h. A continuació, es van analitzar els nivells de PARP-1, clases de capsasa-3 i p-AMPK en extractes de les neurones de l'hipocamp cultivades mitjançant una eixutació occidental. Es mostren els immunoblots per a la detecció de PARP-1 ( b ) escindida, caspasa escindida-3 ( c ), p-AMPK ( d ) i β -actina com a control de càrrega en tots els casos. El gràfic representa valors de densitat normalitzats per als senyals d'immunoblots expressats com a mitjana ± SD ( n = 4). S’indica els parells d’exemple que són significativament diferents l’un de l’altre a P <0, 05

Imatge a mida completa

Discussió

En aquest estudi hem demostrat que l’osmotina proteïna vegetal, un homòleg d’adiponectina, protegeix contra la neurodegeneració induïda per l’alcohol en el desenvolupament del cervell de rata. La coadministració d’osmotina amb etanol a cultius primaris de neurones hipocampals derivades del cervell de rata prenatal protegit contra l’apoptosi induïda per l’etanol. L’acció neuroprotectora de l’osmotina contra l’apoptosi induïda per l’etanol en neurones de rata prenatal va resultar de la seva capacitat de funcionar com l’adiponectina i iniciar la senyalització intracel·lular a través de receptors d’adiponectina. L’osmotina post tractament per injecció subcutània va evitar l’apoptosi neuronal induïda per l’etanol a l’escorça cingulada anterior i a la regió hipocampal CA1 del cervell de rata en desenvolupament neonatal. L’adiponectina protegeix indirectament les neurones de l’hipocamp contra l’excitotoxicitat induïda per l’àcid kainic millorant la funció endotelial vascular per evitar les fuites de barrera hematoencefàlica. 16 Recentment, es va demostrar que l'osmotina mostrava similitud estructural i funcional amb l'adiponectina humana. 32

Les observacions realitzades a nivell cel·lular mitjançant FACS i tècniques d’immunofluorescència i a nivell de teixit mitjançant tècniques d’immunoblocació van demostrar que l’apoptosi induïda per l’etanol al cervell de rata en desenvolupament estava associada a una disfunció mitocondrial (figures 2, 3, 5 i 6), similar a la seva efecte sobre l'hipocamp del cervell fetal. 37 L’acció protectora de l’osmotina contra la toxicitat induïda per etanol sembla funcionar a nivell mitocondrial (figures 2, 3, 5 i 6).

L’efecte més significatiu i consistent de l’administració combinada d’osmotina i etanol va ser l’augment dels nivells de membres de la família antiapoptòtics (per exemple, Bcl-2, Bcl-XL) als membres de la família proapoptòtica (per exemple, Bax, Bak) en comparació amb el tractament amb etanol només (Figures 3 i 5 i Figures suplementàries S2a i b). Això suggereix que la influència de l'osmotina sobre els nivells de les proteïnes de la família Bcl-2 podria ser un component significatiu de la seva acció neuroprotectora. Els membres de la família Bcl-2 antiapoptòtics són especialment importants en la prevenció de l’apoptosi neuronal i la neurodegeneració. Els seus papers en el manteniment de la integritat de la membrana externa mitocondrial i la generació d’energia ineficient mitjançant el control de l’organització de xarxes mitocondrials independent del seu efecte sobre la permeabilitat de la membrana mitocondrial exterior contribueixen al seu efecte neuroprotector. 38, 39 Per tant, la regulació dels nivells cel·lulars de membres de la família Bcl-2 pot ser una forma directa d’influir en l’apoptosi. Curiosament, l’adiponectina protegeix contra la toxicitat d’ions 1-metil-4-fenilpiridini a les cèl·lules del neuroblastoma, probablement augmentant els nivells d’antioxidants i afectant la relació Bax / Bcl-2. Es necessiten 40 experiments per dilucidar la connexió entre osmotina i els nivells cel·lulars de les proteïnes de la família Bcl-2 i la seva importància.

L’activació d’AMPK sembla ser un factor important en l’acció protectora de l’osmotina i l’adiponectina contra la neurotoxicitat d’etanol (Figura 7). Així, la metformina, un activador amunt d’AMPK, també es va protegir contra la neurotoxicitat d’etanol (figura 7). L’administració de metformina a rates diabètiques evita el desequilibri oxidatiu del cervell. 41 La metformina també protegeix contra els danys induïts per l’etoposida en cultius primaris de neurones corticals obtingudes a partir de cervells de rata prenatal. En aquest model de neuropatia diabètica, la prevenció de la disfunció mitocondrial (col.lapse del potencial de membrana mitocondrial i alliberament de citocrom c ) per metformina ha estat suggerida com a base per als seus efectes neuroprotectors. 42 Queda per diluir la contribució relativa de les proteïnes de la família Bcl-2 i de les vies dependents d’AMPK a l’acció protectora de l’osmotina cap al mitocondri en el desenvolupament de neurones.

L’osmotina pertany a una família de proteïnes vegetals ubiqües anomenades proteïnes PR-5. 22 El membre més ben estudiat d’aquesta classe és l’edulcorant disponible comercialment, la taumatina. Les proteïnes PR-5 són força abundants en fruites i verdures com ara raïms madurs, plàtans i plàtans. 43, 44 Aquesta classe de proteïnes representa per tant una rica font de mímiques potencials d’adiponectina que es podrien utilitzar per a estudis d’estructura de funcions d’adiponectina o per al disseny de tractaments per a FAS.

L’osmotina és una proteïna vegetal i aquests components derivats de les plantes poden ser utilitzats per a la investigació de trastorns neurodegeneratius, obesitat i càncers, i tenen un paper important en la prevenció de malalties. Es recomana control energètic nutricional o restricció calòrica per proporcionar llarga vida i reduir la carcinogènesi. 45 Diversos mecanismes, com ara factors de creixement, hormones anabòliques, citocines inflamatòries i marcadors d’estrès oxidatiu vinculats a diverses malignes, s’han previst els efectes beneficiosos i van mostrar connexió amb molècules com l’adiponectina i l’AMPK. 46, 47 En aquest estudi, hem demostrat que l'osmotina és una proteïna estable i els receptors de l'adiponectina del cervell de rata s'uneixen a l'osmotina i a l'adiponectina. L’osmotina, un compost dietètic, presentava similitud funcional amb l’adiponectina. D'altra banda, l'homolog derivat de plantes adiponectines, l'osmotina, va mostrar efectes beneficiosos contra la colitis. 48

L’osmotina, una proteïna vegetal, pot tenir un paper important per imitar l’hormona que mitiga la diabetis, l’obesitat, el càncer i els trastorns neurodegeneratius. Això demostra el valor de l’osmotina com a alternativa experimental econòmica a l’adiponectina. Els nostres resultats també van suggerir que l'osmotina podria ser una font valuosa d'agents neuroprotectors contra el FAS i que es pot utilitzar per proporcionar beneficis per a la salut. Amb l'homologu de l'adiponectina derivada de plantes, l'osmotina pot convertir-se en una opció terapèutica contra trastorns neurodegeneratius com el FAS.

Materials i mètodes

Purificació d’osmotina

L’osmotina es va purificar a partir de cèl·lules de tabac cultivades adaptades a la sal com es descriu anteriorment. La endotoxina s'ha eliminat amb una columna ActiClean Etox preembalada (Sterogene Bioseparations, Carlsbad, CA, EUA). Es va considerar que la preparació final va ser> un 99% homogènia per 2DGE i per LC-MS de fragments de pèptids obtinguts per la digestió de la tripsina. El contingut d’endotoxina d’osmotina era <0, 03 UE / mg de proteïna.

Tractament amb animals

Les rates femenines ( n = 35) rates Sprague-Dawley (250 g, Universitat Nacional de Gyeongsang, Laboratori de Neurobiologia, Chinju, Corea del Sud) es van allotjar en un entorn controlat per la temperatura amb llums de 0600 a 2000 h amb menjar i aigua ad libitum . Els animals van ser tractats d’acord amb les directrius estàndard per a la cura d’animals de laboratori. Es van fer tots els esforços per minimitzar el nombre d'animals utilitzats i el seu patiment. All the experimental procedures were approved by the local animal ethics committee of the Division of Applied Life Sciences, Department of Biology, Gyeongsang National University, South Korea.

The animals were randomly divided into two experimental groups:

  1. Timed pregnant (the day of insemination equals to gestational day (GD) 0.5). At GD 17.5, rats received an iv injection of pentobarbital sodium (3 mg/100 g body weight) and were then killed by decapitation.

  2. Postnatal day 7 (P7) Sprague-Dawley pups were used in in vivo experiments and were equally distributed in four groups, that is, control, ethanol, osmotin, and osmotin plus ethanol. Ethanol (4 mg/g body weight) was delivered by subcutaneous injection. A saline solution of osmotin (15 μ g/g) was delivered by subcutaneous injection at 30 min after ethanol injection. Saline injections of equal volume were used for the control group.

Primary cell culture and drug treatment

Primary cultures of hippocampal and cortical neurons were generated from hippocampus and cortex isolated from rat fetuses at GD 17.5 as described previously. 50 After 4 days of growth, the growth medium was replaced with fresh medium without (control) or with supplements as indicated in the Figures. Cultures were analyzed 24 h later.

Western blot

Western blot analysis was done as previously described with some modification. 50 Briefly, primary cultured hippocampal cells and tissue from both hippocampal and cortical brain from P7 rat pups were homogenized in cell lysis buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and were supplemented with 100 mM PMSF. Extracts were fractionated by SDS-PAGE and, after transfer to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane, immunoreaction was carried out for 24 h at 4°C using a 1 : 1000 dilution of the primary antibodies. Antibodies used in immunoblotting for detecting proteins included rabbit-derived anti-actin, anti-Bcl-2, anti-Bax; goat-derived anti-cytochrome c and anti-caspase-9; and anti-PARP-1 polyclonal antibodies (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). We also used rabbit-derived anti-caspase-3 and anti-AMPK (Cell Signaling Technology) and anti-p-AMPK (ABCAM, Cambridge, MA, USA). After reaction with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody, as appropriate, proteins were detected using an ECL-detecting reagent according to the manufacturer's instructions (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The X-ray films were scanned, and the optical densities of the bands were analyzed by densitometry using the computer-based Sigma Gel program, version 1.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).

MTT assay for cell viability

Cell viability in cultured neurons was estimated using MTT. Primary cultures of hippocampal neurons in the logarithmic growth phase were used to seed 96-well plates. Each well contained 200 μ l Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing indicated supplements and 1 × 10 5 cells. The cells were incubated at 37°C in a humidified 5% CO 2 incubator. At the end of incubation, MTT (5 mg/ml in PBS, pH 7.4) was added to each well and incubation was continued for 4 h at 37°C after which the A 570nm, indicating viable cells, was measured using a microplate reader (Anthos 2020, Anthos Labtech Instruments, Wals, Austria). Percent cell viability was calculated as 100 × the ratio of A 570nm of the treated cells to A 570nm of control cells.

Flow cytometric analysis of ΔΨm

Mitochondrial membrane potential was monitored using JC-1 mitochondrial membrane potential detection kit (Biotium Inc., Hayward, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. Primary cultures of hippocampal neurons from G17.5 fetal brain were grown and treated with ethanol and osmotin as described earlier. After 24 h of drug treatment, cells in triplicate culture plates were harvested, stained with JC-1 reagents at 37°C for 15 min, washed twice in 1 × assay buffer, and resuspended in 0.5 ml PBS for FACS analysis (FACSCalibur Flow Cytometer; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). JC-1 aggregates in healthy polarized mitochondria emit red fluorescence at 590 nm. JC-1 monomers that leak from stressed depolarized mitochondria emit green fluorescence at 530 nm. 51 The red and green fluorescence was measured in the Green (FL-1) and Red (FL-2) channel of the flow cytometer, respectively. The cells were then immediately observed with a fluorescence microscope using a 'dual-band pass' filter designed to simultaneously detect fluorescein and rhodamine or fluorescein and Texas Red (Hayward, CA, USA).

Measurement of apoptosis by annexin-V staining

The Annexin-V-FLUOS Staining Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) was used for the detection and quantification of the apoptotic cells. This kit uses a dual-staining protocol in which the apoptotic cells are stained with annexin-V (green fluorescence) and the necrotic cells are stained with PI (red fluorescence). Briefly, hippocampal neuronal cells were grown on triplicate culture plates and then treated with fresh medium (control), and fresh medium containing supplements as indicated in the figure legend for 24 h (Figure 7). The cells were harvested with PBS and processed for labeling with annexin-V and PI according to the manufacturer's protocol. The fluorescence was measured by flow cytometric analysis on a FACSCalibur Flow Cytometer using 488 nm excitation and a 515 nm band pass filter for fluorescein detection and a 600 nm filter for PI detection (FL1: Annexin-V-FLUOS; FL2: PI).

Intracellular Ca 2+ measurement

The intracellular Ca 2+ concentration was measured with the fluorescent Ca 2+ indicator, Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2AM). 52 After 4 days of growth and 24 h of treatment, cultured cortical or hippocampal neurons (triplicate culture plates each containing 1 × 10 6 cells) were washed twice with Krebs buffer and then incubated in the DMEM media containing 5 μ M Fura-2AM at 37°C in a humidified incubator with 5% CO 2 for 60 min. They were washed twice with Locke's solution (pH 7.8) and fura-2 fluorescence signals of [Ca +2 ] cyt were measured by a luminescence spectrophotometer (LS50B, Perkin Elmer, Boston, MA, USA). Excitation light from a Xenon lamp was alternated between 340 and 380 nm band-pass filters and the fluorescence emitted at 510 nm was revealed by a photon-counting photomultiplier. The 340/380-nm fluorescence ratio, averaged over a period of 2 s, was measured. Fluorescence signals were acquired stored and analyzed using a computer and universal imaging software, or a MicroVax II computer and software (origin 7, Northampton, MA, USA). Intracellular calcium was determined using the ratio method as mentioned above, and from the Grynkiewicz equation. 53

Image

where K d is the dissociation constant of the fura-2 Ca +2 interaction as 225 nM in the cytosolic environment; R is the fluorescence ratio at 340 and 380 nm; R min is the ratio with zero Ca +2 ; R max is the ratio with saturating Ca +2 (using calcium chloride); Sf2 is fluorescence at 380 nm with zero Ca +2 ; Sb2 is fluorescence at 380 nm with saturating Ca +2 .

RNA interference and transfection

Small interfering RNAs (siRNAs) were designed and synthesized by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). The sequences of the sense siRNAs were: Rat AdipoR1 siRNA 5′-UACAACACCACUCAAGCCAAGUCCC; Rat AdipoR2 siRNA 5′-AACAGGUGUCUCUAAACUGGGCUCC; and Rat unrelated siRNA 5′-AUUUAACUUCUGGUGACGAUACUGG. Cultured primary hippocampal neuronal cells were transfected for 6 h with 200 nM siRNA using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After the cultures were washed, the medium was replaced with DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) and test compounds as indicated in the Figures. Cells were grown for 24 h and then analyzed.

Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR)

RT-PCR analysis was performed using cDNA from transfected and nontransfected cells as previously explained. 54 Thermal cycling was performed under the following conditions: 94°C for 5 min, 28 cycles at 94°C for 1 min, 54°C for 1 min, and 72°C for (1 min), followed by 72°C (5 min) for the final extension. The GAPDH housekeeping gene was used for normalization of target gene expression. PCR products were separated on a 1% agarose gel containing ethidium bromide and viewed under UV light. The primers used were the following: Rat AdipoR1, forward 5′-TCTTCCTCATGGCTGTGATG-3′, reverse 5′-AGCACTTGGGAAGTTCCTCC-3′; Rat AdipoR2, forward 5-GGAGCCATTCTCTGCCTTTC-3′, reverse 5′-ACCAGATGTCACATTTGCCA-3′; GAPDH, forward 5′-GCCATCAATGACCCCTTCATT-3′, reverse: 5′-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3′.

Histological analysis and detection of apoptosis

FJB staining was performed as previously described. 55 Briefly, immunofluorescence was performed on GD 17.5 primary hippocampal cells cultures grown in vitro on poly- D -lysine-coated chamber slides. Three-day-old cultures were treated for 24 h at 37°C as indicated in the figure legends. Treated cultures were fixed for 5 min with 4% paraformaldehyde in PBS and stored at −70°C. Slides were air dried for 3 h and then subjected to the following treatments in order: 10 min in 0.06% potassium permanganate solution, distilled water rinse, 20 min in 0.1% acetic acid containing 0.0004% FJB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) and three washes in distilled water. The slides were then allowed to dry at 55°C for 10 min and viewed under a FITC filter in a confocal microscope (Olympus Fluoview FV1000, Tokyo, Japan). For PI staining, slides were dipped in PI solution (1 μ g/ml) in PBS with gentle mixing for 20 min at room temperature and washed twice with PBS for 10 min. Glass cover slips were mounted on the slides with mounting medium.

FJB and PI staining were also performed for in vivo analysis. At P7, the pups were anesthetized by intraperitoneal administration of sodium pentobarbital (50 mg/g body weight). Brains were removed, fixed in cold 4% neutral buffer paraformaldehyde for 48 h, and cryoprotected by immersion into 20% sucrose phosphate buffer for 48 h at 4°C. Whole brains were frozen in OCT compound (Sakura, Torrance, CA, USA) and 14 μ m sections were made in the coronal planes (Leica cryostat CM 3050S, Nussloch, Germany). Sections were thawed mounted on the probe-on plus charged slide (Fisher, Pittsburgh, PA, USA). Tissue sections were stained with FJB and PI as described above. Images were acquired using a Zeiss fluorescent microscope (Zeiss, Gottingen, Germany) and confocal laser scanning microscope (Fluoview FV 1000, Olympus, Hamburg, Germany).

TUNNEL assay for apoptosis

In situ detection of apoptotic cell death was performed on cryosections (16 μ m) using the In situ Cell Death Detection kit Fluorescein, according to the manufacturer's instructions (GenScript Corporation, Piscataway, NJ, USA). Glass cover slips were mounted onto the glass slides with mounting medium. The FITC filter was used was to detect TUNEL staining (green). TUNEL-positive staining patterns were acquired with a confocal laser scanning microscope (FluoView FV1000; Olympus, Japan). TUNEL-positive cells in the different regions of each section were counted using a computer-based program.

Immunofluorescence analyses

For in situ analysis of cytochrome c release and caspase-3 expression after in vivo treatments, P7 neonatal rat pups were perfused with 4% ice-cold paraformaldehyde following 1 × PBS perfusion transcardially as explained above. For hippocampal neuronal cells in primary culture, conditions of growth and treatment have been described above. Treated cultures were fixed with 4% neutral buffer paraformaldehyde and washed with cold PBS. Cytochrome c was detected by incubating with mouse anti-cytochrome c antibody overnight at 4°C and rabbit anti-mouse FITC-labeled antibody for 90 min at room temperature in dark (1 : 250 and 1 : 100, respectively; Santa Cruz Biotechnology). Subsequently, caspase-3 expression was detected by using rabbit anti-caspase-3 antibody (Cell Signaling) and goat anti-rabbit TRITC labeled antibody (Santa Cruz Biotechnology; 1 : 250 and 1 : 100, respectively) under the same conditions. Slides were mounted with Prolong Antifade reagent (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Cytochrome c (green) and caspase-3 (red) staining patterns were acquired using a confocal laser scanning microscope (Fluoview FV1000).

Anàlisi de dades i estadístiques

Images of ethidium bromide-stained gels and western blots were scanned and analyzed by densitometry using a computer based on the Sigma Gel System (SPSS). Density values were expressed as mean±SEM Comparisons between treated groups and controls were done by Student's t -test to determine the significance of differences between relevant treatment groups. In every case, the acceptance level of statistical significance was P <0.05.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Supplementary Figure 2a

  3. 3.

    Supplementary Figure 2b

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

Glossari

FAS

fetal alcohol syndrome

AdipoR

adiponectin receptor

AMPK

adenosine monophosphate-activated protein kinase

P7

postnatal day 7

GD

gestational day

DMEM

Dulbecco's modified Eagle's medium

FJB

Fluoro-Jade B

PI

propidium iodide

PARP-1

poly [ADP-ribose] polymerase 1

TUNEL

terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling

PVDF

polyvinylidene difluoride

FBS

sèrum boví fetal

MTT

3-[4, 5–dimethylthiazol–2–yl]-2, 5-diphenly tetrazolium bromide

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)