Nogo-c regula l'apoptosi de cardiomiòcit durant un infart de miocardi mort i malaltia cel·lular

Nogo-c regula l'apoptosi de cardiomiòcit durant un infart de miocardi mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Isquèmia
  • Infart de miocardi

Resum

L’infart de miocardi és causat per un subministrament de sang coronari insuficient, que provoca danys miocàrdics i, eventualment, una insuficiència cardíaca. Encara no s’entén del tot els mecanismes moleculars associats a la pèrdua de cardiomiòcits durant l’infart de miocardi (MI) i les malalties cardíaques relacionades amb la isquèmia. El Nogo-C és una proteïna del reticle endoplasmàtic que s’expressa de manera omnipresent en els teixits incloent-hi el cor. Tot i això, encara no es coneix la funció cardíaca del Nogo-C. En el present estudi, vam trobar que el Nogo-C estava regulat en els cors de ratolí després de la IM, i els tractaments hipòxics també van augmentar el nivell de proteïnes Nogo-C en els cardiomiòcits. La sobreexpressió mediada per Adenovirus amb Nogo-C va provocar una apoptosi de cardiomiòcit, mentre que el derrocament de Nogo-c per cardiomiòcits protegits per shRNA procedents de l’apoptosi cel·lular induïda per la hipòxia. És important destacar que els ratolins Nogo-C mostren una funció cardíaca millorada, àrea d'infart més petita i menys cèl·lules apoptòtiques després de la IM. A més, vam trobar que miR-182 regulava negativament l'expressió Nogo-C i estava regulada en el decurs del MI, que expressava miR-182 en hipopòxia cel·lular protegida per hipòxia i Nogo-C amb cardiomiòcits. Els nostres resultats indiquen que la major expressió cardíaca de Nogo-C és suficient i necessària per a l’apoptosi de cardiomiòcit induït per isquèmia i per a una disfunció cardíaca, cosa que suggereix que la desregulació de Nogo-C per miRNA pot ser un objectiu terapèutic potencial per a malalties cardíaques relacionades amb la isquèmia.

Principal

L’infart de miocardi (MI) provoca danys miocàrdics i condueix finalment a una insuficiència cardíaca, la principal causa de mort a nivell mundial. 1, 2 MI es caracteritza per un subministrament sanguini coronari insuficient, i la isquèmia perllongada durant la MI provoca pèrdues de cardiomiocits per apoptosi i necrosi. 3 Tot i que s’han notificat diverses vies de senyalització implicades en l’apoptosi de cardiomiòcit incloent espècies reactives d’oxigen (ROS), proteïna cinasa C, MAPK i factor nuclear kB, 4, 5, 6, 7 mecanismes moleculars associats a la IM i a l’isquèmia cardíaca. les malalties encara no estan completament enteses.

Les proteïnes inhibidores del desemborsament de la neurona (Nogo) pertanyen a la família de proteïnes del reticuló (RTN), que es caracteritza pel motiu d’orientació del reticle endoplasmàtic al terminal carboxil. El gen Nogo codifica tres isoformes empalmadores, Nogo-A, Nogo-B i Nogo-C. El Nogo-A és una proteïna de membrana expressada principalment en el sistema nerviós central com els oligodendròcits i les neurones, que serveix de factor inhibidor del creixement i restringeix la re-extensió de l’axó. 9, 10 Recentment, Nogo-A també s'ha trobat com un regulador negatiu important de l'angiogènesi del desenvolupament en el sistema nerviós central. 11 El Nogo-B és una isoforma més curta que la Nogo-A, expressada de manera ubiqüent al cos. 12 En el sistema nerviós perifèric, el Nogo-B s’expressa en cèl·lules de Schwann i la interacció de Nogo-B amb el seu receptor en les neurones media la ramificació axonal, cosa que indica un paper en la brotació axonal excessiva després de lesions del nervi perifèric. 13 Als vasos sanguinis perifèrics, Nogo-B regula la migració de cèl·lules endotelials, de manera que media la remodelació vascular després de lesions. 14 I en pacients amb hipertensió arterial pulmonar, el Nogo-B augmenta i provoca una sobreproliferació de cèl·lules musculars llises arterials pulmonars a causa de la supressió de l’apoptosi cel·lular. 15 Malgrat aquestes funcions importants dels estudis in vitro , el ratolí Nogo-A o Nogo-B mostra fenotips relativament normals. 16 Nogo-C és la proteïna més curta de la família Nogo i s’expressa en molts teixits, inclosos el fetge, la neurona, les cèl·lules musculars llises vasculars, els músculs esquelètics i el cor. 17 En ratolins transgènics que expressen Nogo-C en cèl·lules de Schwann, la lesió del nervi ciàtic causa una regeneració axonal endarrerida i una disminució de la recuperació de la funció motora. 18 En el carcinoma hepàtic, el nivell de proteïnes del Nogo-C està relacionat negativament amb la mida del tumor i el seu pronòstic. 19, 20 Tot i això, no s’ha investigat el paper de la proteïna Nogo-C en la patogènesi cardíaca.

Com que les proteïnes Nogo han estat informades per mediar l’apoptosi de cèl·lules múltiples, 21, 22, 23 i l’apoptosi és una característica comuna de l’infart cardíac, llavors hipòtesisem que el Nogo-C pot tenir un paper en la mediació de l’apoptosi de cardiomiòcit durant l’infart cardíac. En el present estudi, mitjançant la combinació d’enfocaments in vitro i in vivo , es va investigar el paper del Nogo-C en l’IM i els cardiomiòcits isquèmics. Hem trobat un nivell proteic regulat de Nogo-C en teixits cardíacs MI i cardiomiòcits hipòxics. La supressió de Nogo-C va preservar les funcions cardíaques després de la MI. El nostre estudi proporciona, per primera vegada, evidències in vivo que Nogo-C té un paper fonamental en la regulació de la funció cardíaca i que pot servir com a objectiu terapèutic potencial per al tractament clínic de MI.

Resultats

L'expressió Nogo-C es va regular en el cor de MI i en cardiomiòcits hipòxics

El nogo-C s’expressa de manera omnipresent en teixits de ratolí incloent el cor tal i com indica el seu patró d’expressió (dades no mostrades). Per entendre el paper patològic del Nogo-C al cor, vam comprovar el nivell d’expressió en MI. La tinció immunohistoquímica per anticossos Nogo-C va demostrar que el Nogo-C estava regulat a la zona fronterera de la zona d’infart 24 h després de la LAD (Figura 1a). El resultat de Western Blot va confirmar l’augment del nivell de proteïnes Nogo-C a la zona fronterera de l’IM, com s’indica per l’augment de 2, 3 vegades en el cor del ratolí MI que en el control de la tristesa (figura 1b). A continuació, vam provar si la hipòxia va promoure el nivell de proteïnes del Nogo-C en els cardiomiòcits neonatals cultivats mitjançant dos enfocaments. Primer, vam tractar cardiomiòcits amb CoCl 2, un compost habitualment utilitzat com a inductor hipòxic degut al seu paper en la inducció i estabilització del factor 1 α (HIF-1a) induïble. CoCl 2 (600 μ M durant 24 h) va provocar un augment del nivell de proteïnes Nogo-C fins al 3, 2 vegades superior a les de les cèl·lules de control del vehicle (figura 1c). A continuació, vam cultivar cardiomiòcits a la incubadora hipòxica amb gas que conté 94% N 2, 1% O 2 i 5% CO 2 durant 12 h, i vam trobar que el tractament amb hipòxia també va augmentar el Nogo-C fins a 3, 3 vegades en comparació amb cardiomiòcits cultivats en condició de normòxia. (Figura 1d). En conjunt, aquests resultats van demostrar que la proteïna Nogo-C es va canviar durant la hipòxia o MI, cosa que suggereix que el Nogo-C pot tenir un paper en la patogènesi de malalties cardíaques relacionades amb la hipòxia.

Image

El Nogo-C està regulat en cors MI i cardiomiòcits hipòxics. ( a ) La tinció d'hematoxilina / eosina i la tinció immunohistoquímica de Nogo-C del cor de ratolí i de ratolí MI, la tinció d'IgG com a control. ( b ) Western blot i dades mitjanes que mostren nivells de proteïnes Nogo-C en els cors de ratolí xam i MI 24 hores després de l'operació. n = 6-7 ratolins. ( c ) i ( d ) Nivells de proteïnes Nogo-C en cardiomiòcits neonatals de rata tractats amb CoCl 2 (600 μ M) durant 24 h ( c ) o amb incubació d'hipòxia (1% O 2 ) durant 12 h ( d ). n = 6 experiments independents. * P <0, 05 vers cèl·lules de control o grup xamf

Imatge a mida completa

Apoptosi de cardiomiòcit induït pel nogo-C

A continuació, es va investigar si l’alteració del nivell de proteïna del Nogo-C mediava la funció de cardiomiòcit. La transfecció de cardiomioactes neonatals de rata amb adenovirus que conté ADNc Nogo-C (Ad-Nogo-C) va provocar un augment de nivell de proteïnes Nogo-C cel·lulars (figura 2a). La sobreexpressió de l’apoptosi de cardiomiòcit augmentat de Nogo-C, tal com indica el test de citometria de flux, amb un LR (quadrant LR indica el percentatge de cèl·lules apoptòtiques primerenques a cèl·lules tacades Alexa 488) del 17, 53 ± 3, 085% en cèl·lules que expressen Ad-Nogo-C i 6, 4. ± 1, 112% en cèl·lules de control vectorial i un UR (quadrant UR indica el percentatge de cèl·lules apoptòtiques tardanes a Alexa 488 i cèl·lules tenyides d'iode) de 9, 982 ± 1, 045% en cèl·lules Ad-Nogo-C i 7, 373 ± 1, 134% en control (Figura 2b). L’efecte apoptòtic del Nogo-C sobre els cardiomiòcits també es va confirmar per la tinció de TUNEL, amb una taxa apoptòtica augmentada de 2, 2 vegades a les cèl·lules adeno-Nogo-C respecte a la de les cèl·lules de control (figura 2c). Així, els nostres resultats suggereixen que Nogo-C és suficient per induir l’apoptosi de cardiomiòcit.

Image

El Nogo-C regula l’apoptosi de cardiomiòcit. ( a ) Western blot que mostra el nivell de proteïna Nogo-C en cardiomiòcits neonatals de rata transfectats amb Ad-Nogo-C a 50 MOI o Ad-laz durant 48 h. n = 3 experiments independents. ( b ) Anàlisi de citometria de flux i ( c ) Tinció de TUNEL que mostra taxes d'apoptòtiques de cardiomiòcit neonatal de rata transfectades amb Ad-Nogo-C o Ad-laz. n = 3 experiments independents per a l'anàlisi de citometria de flux; i n = 6 experiments independents per a tinció de TUNEL. Barra d’escala = 25 μ m. ( d ) Western blot que mostra el nivell de proteïna Nogo-C en cardiomiòcits neonatals de rata transfectats amb Ad-sh-Nogo-C a 50 MOI o Ad-scramble durant 48 h. n = 3 experiments independents. ( e ) Anàlisi de citometria de flux i ( f ) Tinció de TUNEL que mostra taxes d'apoptòtiques de cardiomiòcits neonatals de rata infectats amb Ad-sh-Nogo-C o Ad-scramble en resposta a l'estimulació de CoCl 2 (600 μ M). n = 6 experiments independents. Barra d’escala = 25 μ m. * P <0, 05 contra cèl·lules de control d'arrambats. # P <0, 05 versus scramble + cel·les CoCl 2

Imatge a mida completa

A continuació, es va investigar si la disminució del nivell de proteïna Nogo-C podria protegir els cardiomiòcits d’estímuls apoptòtics infectant cardiomiocits amb adenovirus que contenia ARN de pinça curta Nogo-C (shRNA) (Ad-sh-Nogo-C) per eliminar la proteïna Nogo-C (Figura 2d) . El test de citometria de flux va demostrar que l’apoptosi de cardiomiòcit protegit per la derrota de Nogo-C induïda per CoCl 2 va passar del 12, 61 ± 3, 444% al 6, 103 ± 1, 166% (LR) i del 13, 21 ± 2, 472% al 7, 315 ± 1, 637% (UR) (Figura 2e). De la mateixa manera, la tinció de TUNEL va demostrar que la derrota de Nogo-C va disminuir l’apoptosi de cardiomiòcit induït per CoCl 2 del 25, 8% al 13, 3% (Figura 2f). En conjunt, els nostres resultats van demostrar que Nogo-C és suficient i necessari per a l’apoptosi de cardiomiòcit.

Assoliment de ratolins Nogo-C protegits de disfunció cardíaca induïda per MI

Per entendre la funció in vivo de Nogo-C, hem generat ratolins Nogo-C - / - mitjançant la tècnica TALEN per eliminar l'exó 1c específic de Nogo-C (figures 3a i b). Bàsicament, les relacions de pes cardíac amb pes corporal i pes cardíac i longitud de tíbia en ratolins Nogo-C - / - són similars a les de ratolins control a l'edat de 8 setmanes (figura 3c). Així mateix, el diàmetre intern del ventricular esquerre (LVID) / el gruix de la paret posterior del ventricular esquerre (LVPW) no mostren cap diferència entre els ratolins Nogo-C - / - i els de control (figura 3d). L’àrea de cardiomiòcit per tinció d’hematoxilina / eosina i ultraestructura per microscopi electrònic de tansmissió són totes semblants als cors de ratolins Nogo-C - / - i controladors (figures 3e i f). A més, la tesi Nogo-C no va alterar la funció cardíaca com es va revelar per l’ecocardiografia (taula 1) i el test d’electrocardiògraf (figura 3g). Aquestes dades suggereixen que la supressió del Nogo-C no afecta la morfologia cardíaca i la seva funció en condicions basals.

Image

Generació i caracterització del ratolí Knockout Nogo-C. ( a ) Esquema esquemàtic de la construcció de ratolins Nogo-C - / - mitjançant la tècnica TALEN. ( b ) Western blot que mostra el nivell de proteïnes Nogo-C en cors de tipus salvatge i ratolins Nogo-C - / - . ( c ) Relació pes pes cardíac (esquerra) i Ràtio pes pes cardíac / tíbia (HW / TL) (dreta) de 8 setmanes WT masculí i Nogo-C - / - ratolins. n = 11 ratolins. ( d ) Tinció d’hematoxilina i eosina que mostra les cambres cardíaques dels ratolins masculins de 8 setmanes WT i ratolins Nogo-C - / - (esquerra) i la relació LVID a LVPW de la diàstola (dreta). Barra d’escala = 0, 5 cm. n = 6. ( e ) Imatge de secció de WT masculí de 8 setmanes i cor de ratolí Nogo-C - / - ratolí mitjançant hematoxilina i eosina (esquerra) i dades mitjanes (dreta). WT, n = 70 cel·les (de 4 ratolins); Nogo-C - / -, n = 63 cèl·lules (de 5 ratolins). Potència magnificant: 400X. ( f ) Imatges representatives de TEM de 8 setmanes WT masculines i Nogo-C - / - cors de ratolí. Barra d’escala = 0, 5 μ m. ( g ) Imatges electrocardiògraf de ratolins masculins de 8 setmanes i ratolins Nogo-C - / - (a l'esquerra) i dades estadístiques per a l'amptitud P, l'interval PR i l'interval QT (dreta). n = 4-5 ratolins

Imatge a mida completa

Taula completa

A continuació, es va investigar el possible efecte de la deficiència de Nogo-C en la funció cardíaca durant la IM. Tot i que l’anàlisi d’ecocardiografia va mostrar gran part de la fracció d’expulsió (EF) i el canvi fraccional d’àrea (FAC) en els ratolins control després de MI (EF: 67, 26 ± 3, 148% versus 23, 51 ± 3, 694%, FAC: 50, 9 ± 2, 992% contra 15, 44 ± 2, 338%, abans i després de la MI), l’eliminació de Nogo-C va millorar significativament la funció cardíaca després del MI fins al 44, 61 ± 4, 164% (EF) i el 30, 49 ± 2, 77% (FAC) (figura 4a). La mida de l’infart (IR) dels cors de ratolins Nogo-C- / - també va disminuir en comparació amb les cames de tipus salvatge després de la MI (figura 4b). Nivells de lactat deshidrogenasa (LDH) en sèrum de ratolí Nogo-C - / - després de MI es va reservar com a comparació amb l'augment dels nivells de matricula de control després de MI (1004 ± 76, 79 en Nogo-C - / - ratolí contra 1740 ± 289, 9 en ratolí de control després de MI) (Figura 4c), que indica que la eliminació de Nogo-C té un efecte protector sobre lesions cardíaques induïdes per MI. A més, vam examinar l’apoptosi de cardiomiòcit per tinció de TUNEL després de MI, i vam trobar que l’apoptosi de cardiomiòcit protegit per eliminacions de Nogo-C passava d’un 10, 64 ± 2, 255% en els cors de control després de MI a 2, 907 ± 1, 163% en Nogo-C - / - cors (figura 4d). Col·lectivament, aquestes dades donen suport al paper protector de l’eliminació de Nogo-C en els danys cardíacs provocats per MI.

Image

La eliminatòria Nogo-C protegeix el cor del ratolí de lesions de MI. ( a ) Exemple típic d’ecocardiogrames en mode M de tipus salvatge i de coratge de ratolí Nogo-C - / - amb ratolí (MI) o sense lligament (trist) de LAD durant 24 hores (esquerra), i dades mitjanes d’EF (mig) i FAC ( dret). n = 6 ratolins per a cada grup. * P <0, 05 davant de ratolins de tipus silvestre; # P <0, 05 davant de ratolins de tipus salvatge MI. ( b ) Les imatges de coloració de clorur de trifeniltetrazoli (TTC) representants de seccions cardíaques seqüencials (a l'esquerra), i les dades mitjanes de la mida d'infart de TTC (dreta) de ratolins WT i Nogo-C - / - després de la lliga LAD durant 24 hores. n = 4 ratolins, * P <0, 05 versus tipus ratolins. ( c ) Activitats sèriques de LDH de tipus salvatge i ratolins Nogo-C - / - amb o sense lligament LAD durant 24 hores. n = 5-11 ratolins. * P <0, 05 enfront de WT sham; # P <0, 05 vers WT MI. ( d ) Tinció del TUNEL que mostra cèl·lules apoptòtiques a la zona fronterera de la MI mitjançant WT i Nogo-C - / - cors de ratolí 24 hores després de la lliga LAD (esquerra) i les dades mitjanes (dreta). n = 4 ratolins. Barra d’escala = 25 μ m. * P <0, 05 contra ratolins de tipus salvatge

Imatge a mida completa

MiR-182 va regular negativament l'expressió Nogo-C durant la MI

Els miRNA tenen un paper crític en els processos patològics cardíacs. En aquest estudi es va intentar identificar el possible miRNA que regula l'expressió del gen Nogo-C durant la IM. En anàlisis silico , es va predir que miR-182 es dirigeix ​​als 3 'regió no traduïda (3'UTR) de Nogo-C (Figura 5a). És important destacar que l’expressió miR-182 va disminuir significativament al cor durant l’IM (figura 5b) o en cardiomiòcits tractats amb CoCl 2 (figura 5c). La sobreexpressió de miR-182 va reduir dràsticament l’expressió de proteïnes Nogo-C en els cardiomiòcits (figures 5d i e). A més, miR-182 va disminuir l'activitat del reporter de la luciferasa Nogo-C 3'-UTR (Figura 5f), confirmant a més que el Nogo-C és un gen diana del miRNA-182.

Image

miR-182 regula l'expressió Nogo-C. ( a ) Anàlisi de la regió Nogo-C 3′UTR que preveu miR-182 com a regulador. Dades de PCR que mostren l'expressió de miR-182 en cors MI ( b ) o cardiomiòcits ( c ) tractats amb CoCl 2 . ( d ) L'expressió de miR-182 en control i miR-182 imiten cardiomiocits de neonatals de transfectats de rata. ( e ) dades Western blot (esquerra) i mitjana (dreta) que mostren els nivells de proteïna Nogo-C en control i miR-182 que sobreexpressen els cardiomiòcits neonatals de rata. ( f ) Activitat reportera de la luciferasa de la UTR de rato Nogo-C 3 ′ en cèl·lules transfectades amb mímica de miR-182 o mímica miRNA revoltada durant 48 h. ( g ) Anàlisi de citometria de flux que mostra taxes de apoptòtica de cardiomiòcits neonatals de rata transfectats amb o sense mímica de miR-182 en resposta a l'estimulació de CoCl 2 (600 μ M) o la sobreexpressió Nogo-C. n = 6 experiments independents. * P <0, 05 vers cel·lules de control. # P <0, 05 vers CoCl 2 o cèl·lules que sobreexpressen Nogo-C

Imatge a mida completa

Per comprovar si el miR-182 tenia un paper en l'apoptosi de cardiomiòcit induït per Nogo-C, es van co-transfectar cardiomiòcits amb miR-182 i Ad-Nogo-C, o es van transfectar amb miR-182 en presència de CoCl 2 . Tot i que la sobreexpressió de Nogo-C o el tractament de l’apoptosi de cardiomiòcit induïda per CoCl 2, la sobreexpressió de cèl·lules protegides de miR-182 procedents de l’apoptosi induïda per Nogo-C o CoCl 2, tal com es valora la citometria de flux (figura 5g). En conjunt, els nostres resultats indiquen que miR-182 té un paper important en les malalties cardíaques relacionades amb l'hipòxia a través de la regulació negativa de l'expressió Nogo-C.

Discussió

Les proteïnes de la família Nogo estan profundament involucrades en diversos processos cel·lulars. A més de les seves funcions ben estudiades en el sistema nerviós, el nostre estudi presentat va trobar que Nogo-C és un jugador determinant en l’apoptosi de cardiomiòcit relacionada amb isquèmia durant la IM. Hi ha diverses línies que donen suport a les nostres nocions. En primer lloc, la proteïna Nogo-C s’incrementa en el cor MI i en els cardiomiòcits apoptòtics induïts per estímuls hipòxics. En segon lloc, la sobreexpressió de Nogo-C per si és suficient per induir l’apoptosi de cardiomiòcit, mentre que la derrota de Nogo-C impedeix l’apoptosi induïda per l’hipòxia. En tercer lloc, la eliminació in vivo de Nogo-C (Nogo-C - / - ) va preservar la funció cardíaca i els cardiomiòcits protegits contra l’apoptosi després de la IM. Finalment, es va identificar que Nogo-C és un gen objectiu de miR-182, que va regular negativament el Nogo-C i està regulat a la baixa durant la IM.

L’apoptosi és una característica important que condueix a la disfunció cardíaca després d’IM i malalties isquèmiques cardíaques. 24, 25 Així, la investigació dels mecanismes moleculars subjacents a l'apoptosi és útil per entendre millor la MI, i fins i tot per proporcionar objectius terapèutics per al tractament de la IM. En el nostre estudi actual, vam comprovar que tant els nivells d’ARNm com les proteïnes de Nogo-C estaven regulats en els cors de MI, i la proteïna Nogo-C augmentà principalment a la zona fronterera de la zona d’infart on la majoria de cèl·lules apoptòtiques es van enriquir, cosa que suggereix un possible paper del Nogo. C en el procés patogen de l’apoptosi de cardiomiòcit. De fet, la sobreexpressió de Nogo-C en els cardiomiòcits va causar apoptosi cel·lular i la derrota de Nogo-C va inhibir l’apoptosi de cardiomiòcit induïda per la hipòxia. Les nostres conclusions que Nogo-C regula l’apoptosi cel·lular al cor estan d’acord general amb les troballes de Nogo-A, una de les isoformes empalmadores de Nogo-C, en cardiomiocits. 23 Tot i que està altament expressat en el sistema nerviós central, també s'ha indicat que Nogo-A està regulat en els cors humans de cardiomiopatia dilatada i cardiomiòcits neonatals de rata sotmesos a hipòxia / reperfusió i la derrota de Nogo-A hipoxia / reperfusió, apoptosi induïda per cardiomiòcit per inhibició via de la mort cel·lular relacionada amb les mitocondries, acumulació de ROS i anormalitat calciosa diastòlica. 23 Estructuralment, Nogo-C comparteix el domini transmembrana i el domini C-terminal amb Nogo-A, mentre que falta el domini N-terminal contingut per la proteïna Nogo-A. 26, 27 Per tant, és possible que els dominis comuns compartits per les dues proteïnes Nogo contribueixin als efectes apoptòtics, el mateix que l'efecte inhibidor de la regeneració del sistema nerviós. 18 No obstant això, els mecanismes moleculars exactes de l’apoptosi de cardiomiòcit induït per Nogo-C necessiten una exploració més.

Els resultats anteriors sobre Nogo-C i d’altres estudis anteriors sobre Nogo-A indiquen que l’augment de les proteïnes Nogo durant l’IM o les malalties cardíaques isquèmiques pot contribuir a la disfunció cardíaca mitjançant la regulació de l’apoptosi de cardiomiòcit. Per entendre millor la importància fisiopatològica del Nogo-C al cor, vam generar el model de ratolí Nogo-C, el primer model Nogo-C per a la nostra comprensió. El nostre estudi funcional in vivo en ratolins nuls de Nogo-C proporciona evidències sòlides que recolzen la nostra hipòtesi, que l'esgotament de l'apoptosi de cardiomiòcit protegit amb cardiomiòcit Nogo-C al cor de MI, va disminuir en gran part la IR i, el que és més important, va conservar la funció cardíaca després de lesió MI, cosa que suggereix que Nogo- La C pot servir com a diana terapèutica per al tractament de la malaltia cardiaca o de malaltia cardíaca relacionada amb la isquèmia. El nostre estudi actual sobre l'efecte protector de l'eliminació de Nogo-C al cor està d'acord amb el model de ratolí Nogo-A. Tot i que el knockout de Nogo-C va protegir el cor dels danys de MI, no va mostrar cap fenotip cardíac a nivell basal, cosa que suggereix que el Nogo-C és prescindible per a funcions normals o hi ha vies redundants al cor. Les nostres dades preliminars van trobar que els nivells d'ARNm d'altres dos membres de la família Nogo, el Nogo-A i el Nogo-B, van augmentar els cors de ratolins Nogo-C KO, cosa que suggereix que les proteïnes elevades de Nogo podrien oferir una funció compensatòria almenys parcialment als cors Nogo-C KO. . En aquest sentit, l'efecte protector de l'eliminació de Nogo-C independentment de l'increment compensatori Nogo-A suggereix que Nogo-C i Nogo-A poden regular diferentment l'apoptosi de cardiomiòcit. De fet, l’apoptosi de cardiomiòcit induït per Nogo-A a través d’una via dependent dels mitocondris, 23 mentre que el Nogo-C no tenia cap efecte sobre els mitocondris (dades no mostrades).

Els microARN (miRNAs) tenen un paper crucial en la patogènesi de diverses malalties cardíaques, incloent MI, fibrosi postinfart i insuficiència cardíaca. 28, 29, 30, 31, 32, 33 En el cor i el ratolí humans, el perfil d’expressió dels miRNAs a la zona fronterera de la regió d’infart es va alterar després de la IM i durant la subsegüent fibrosi cardíaca. 32 La desregulació dels miRNAs, especialment la família miR-29, va reprimir els seus gens objectiu, que codifiquen les proteïnes relacionades amb la fibrosi, provocant fibrosi postinfart i disfunció cardíaca. 34 En el present estudi, vàrem preveure, segons la regió 3'UTR del Nogo-C, que el Nogo-C és un gen diana del miR-182. L’ expressió in vitro de miR-182 va reduir el nivell de proteïnes Nogo-C i l’activitat de reporter de luciferasa Nogo-C 3′-UTR, confirmant la nostra predicció que miR-182 regula negativament l’expressió Nogo-C. A més, es va disminuir l'expressió de miR-182 a la zona fronterera del cor infart i en els cardiomiòcits hipòxics, cosa que suggereix que miR-182 pot estar implicat en els processos patològics de MI i malalties isquòmiques del cor. S'ha informat que MiR-182 participa en la regulació de múltiples processos fisiològics i patològics incloent desenvolupament i degeneració de la retina, 35, 36 càncers, 37, 38, 39, 40 inflamacions, 41, 42 i hipertròfia cardíaca. 43 Controversalment, miR-182 mostrava una funció supressora del tumor en alguns càncers com el glioblastoma 44, mentre que mostrava una funció ongogènica en altres càncers com l’adenocarcinoma pulmonar. 45 En el nostre estudi, vam trobar que miR-182 protegia els cardiomiòcits de Nogo-C i l’apoptosi induïda per la hipòxia. No està clar per què miR-182 funciona de manera diferent en el creixement cel·lular o l’apoptosi en càncers o al cor, l’efecte específic del teixit pot ser un possible motiu d’aquesta discrepància. Tanmateix, la manera com es regula el miR-182 durant el MI i el cor isquèmic encara no està clar i mereix una investigació addicional.

En resum, el nostre estudi presentat va trobar que la proteïna Nogo-C estava regulada en cardiopatia MI i cardiomiòcits hipòxics, l’augment d’apoptosi de cardiomiòcit induït per Nogo-C i que va reduir els cardiomiòcits protegits de Nogo-C per apoptosi induïda per la hipòxia. El knockout de Nogo-C va protegir el cor de lesions de MI i de la funció cardíaca preservada. A més, vam identificar que miR-182 és un regulador negatiu del Nogo-C, i que la regulació minva del miR-182 pot contribuir a l’augment del Nogo-C i a la disfunció cardíaca durant la IM. Els nostres resultats revelen un paper crític del Nogo-C al cor i, per tant, aporten una nova llum sobre el desenvolupament d’objectius terapèutics per a malalties cardíaques relacionades amb la isquèmia.

Materials i mètodes

Model de ratolí MI

Tots els procediments de manipulació d'animals van ser aprovats pel Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals del Centre de Ciències de la Salut de la Universitat de Pequín. El model de ratolí MI es va establir amb ratolins masculins C57BL / 6 a l'edat de 8-12 setmanes, tal com s'ha descrit anteriorment. 46 ratolins van ser anestesiats amb injecció intraperitoneal de pentobarbital sodi (60 mg / kg). El quart espai intercostal sobre el pit esquerre es va exposar i el cor es va esprémer ràpidament fora de l’espai toràcic, el LAD per sota de la punta de l’aurícula esquerra va estar lligat amb una sutura de seda estèril. Els subjectes descarats van passar per una mateixa operació, excepte que el LAD no estava lligat. Vint-i-quatre hores després de l’operació, es va realitzar ecocardiografia amb un Vevo 710 RMV-707B (VisualSonics, Toronto, Ontario, Canadà), i els cors van ser recollits i preparats per a experiments.

Generació del model de ratolí Nogo-C

Els ratolins eliminatoris Nogo-C (Nogo-C - / - ) van ser generats per la tècnica TALEN de fons C57BL / 6. Breument, es van picar 8 parells de base de l'exó 1c del gen Nogo, l'exó específic de Nogo-C, per induir una mutació de canvi de trama, donant lloc a una proteïna truncada, que pot estar sotmesa a una càries no mediada per sentit. L'eliminació del Nogo-C es va confirmar mitjançant la seqüenciació del gen i el western western.

Assaig immunohistoquímic de tinció

Les mostres cardíaques es van fixar amb paraformaldehid al 4% i es van incrustar amb cera de parafina. Les seccions van ser perfusades en 3% H 2 O 2 per eliminar la peroxidasa endògena i microondes en tampó citrat sòdic (1 mM, pH 6). Les diapositives es van bloquejar en 1% de BSA durant 30 min a 37 ° C i després es van sondar amb anticossos anti-Nogo-C (1: 100) durant la nit a 4 ° C i un anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de cavall a 37 ° C durant 30 min. .

Aïllament i cultiu de cardiomiòcits neonatals de rata

Els cardiomiòcits neonatals de rata es van aïllar i cultivar com es va descriure anteriorment. 22 Breument, es van digerir ventricles de rates Sprague – Dawley postnatal entre 1 i 2 dies en solució de HBSS (KCl 0, 4 g / l, KH 2 PO 4 0, 06 g / l, NaHCO 3 0, 35 g / l, NaCl: 8 g / l, Na 2 HPO 4 12H 2 O 0, 12 g / l, glucosa 1 g / l, pH 7, 4) que conté un 0, 1% de trypsina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) i un 0, 05% de colagenasa tipus II (Worthington, Lakewood, CO, EUA). Les cèl·lules es pre-placaven durant 2 hores i el sobrenedant que contenia cardiomiocits purificats es va recollir, es va replantejar i es va cultivar durant 48–72 h més abans de transfectar l’adenovirus.

Construcció d’adenovirus

L'ADNc de longitud total de Nogo-C es va amplificar per PCR amb primer: 5'-CACCATGGACG GACAGAAGAAACA-3 ′ (endavant) i 5′-TCAATCTGCTTTGCGCTTCAATCC-3 ′ (inversa), el producte amplificat es va introduir a pENTR / TEV / Vector D-TOPO (Invitrogen). El producte de nova construcció es va recombinar amb el vector pAd / CMV / V5-DEST (Invitrogen). La seqüència objectiu per Nogo-C-shRNA va ser de 5′-GGCAGATCGTGGCAAGAAA-3 ′. La seqüència Nogo-C-shRNA es va inserir en el vector pENTR TM / U6 i després es va recombinar amb el vector pBLOCK-iT TM 6-DEST. L’adenovirus es va produir amb el sistema d’expressió Adenoviral (Invitrogen) i es va purificar mitjançant el kit Vivapure AdenoPACK20RT (Sartorius, Göttingen, Alemanya).

Immunoblotting

La proteïna es va extreure del miocardi de ratolí o cardiomiòcits aïllats amb tampó de lisi Roth (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, EGTA 5 mM, NaF 20 mM, Triton X-100 1%, pH 7, 4) complementat amb còctel inhibidor de proteases 100X. (Sigma, Santa Clara, CA, EUA). A continuació, es va separar un total de 40–100 ug de proteïnes per SDS-PAGE i es va transferir a les membranes PVDF. Les membranes es van sondar amb anticossos primaris indicats (Nogo-C o α -tambulina), i després es van incubar amb els anticossos secundaris (IgG anti-conill conjugada amb peroxidasa de raig de ZSGB-BIO, Beijing, Xina). Els immunoblots es van avaluar mitjançant l'instrument Chemi Doc XRS + (Bio-RAD, Hercules, CA, EUA).

Anàlisi del miRNA

Es va detectar un assaig de microRNA amb cebes de bucle tallats adquirits a Ribobio (Guangzhou RiboBio, Guangzhou, Xina). Per a la normalització es va utilitzar un petit ARN nucleolar U6 (Guangzhou RiboBio). La seqüència de rno-mir-182 va ser de 5′-ACGCGGGUCUAGCUGCCGGAGGCCUCCCACCGUUUUUGGCAAUGGUAGAACUCACACCGGUA-3 '. Els mímics de Rno-mir-182 (Guangzhou RiboBio) van ser transfectats en cardiomiòcits neonatals de rata amb Lipofectamine 3000 (Invitrogen).

Doble assaig de reporter de la luciferasa

Les seqüències Nogo-C 3′-UTR es van amplificar per PCR amb primers: 5′-GCGCTCGAGAAAAGC CCCAAACAGAAGT-3 ′ (endavant) i 5′-AATGCGGCCGCAAACACTAAACACAAACAT-3 ′ (inversa). Els productes PCR es van construir llavors en un plasmidi pmiR-RB-REPORT (Guangzhou RiboBio) que conté dos reporters, una renilla luciferasa (hRluc) per a l'avaluació de l'expressió i una firefly luciferasa (hluc) com a control intern per a la correlació de quantitats. Les cèl·lules Hela es van co-transfectar amb 100 ng plasmidi reporter Nogo-C 3′RT i 2 μ g rno-miR-182 imitar o vector buit. Les cèl·lules es van recollir 48 hores després de la transfecció i es van analitzar mitjançant un sistema de dosi de reportatge de Luciferasa Dual (Promega, Madison, WI, EUA). El luminòmetre Veritas (Turner BioSystems, Sunnyvale, CA, EUA) va examinar l'activitat de la luciferasa. L’activitat de la renilla luciferasa de cada mostra es va normalitzar a l’activitat de la luciferasa de tirolines.

Anàlisi de la mort cel·lular mitjançant tinció i citometria de flux de TUNEL

L’apoptosi cel·lular es va determinar mitjançant un assaig de detecció de la mort de cèl·lules in situ (Roche, Indianapolis, IN, EUA) o per annexina conjugada de fluoceceïna isotiopihanat / fluidiceanina. Citometria de flux de doble tinció amb iodur mitjançant Kit de detecció d'apoptosi annexina-V-FITC (Laboratoris Dojindo, Kumamoto-Ken, Japó).

Anàlisis de microscòpia electrònica de transmissió

Els cors es van fixar amb un tampon de cacodilat de sodi glutaraldehidina al 2% (0, 1 M, pH 7, 2) a 4 ° C durant la nit i després es van fixar durant 1 h en 1% d'osmiumtetròxid. Les imatges digitals van ser adquirides per un sistema de microscopi electrònic d’alta transmissió de contrast i JEM-1230 (Soft Imaging Microscopi) (JEOL, Tòquio, Japó).

Tinció de TTC

Els ratolins van ser assassinats amb anestèsic 24 h després de l'operació de MI. Els cors es van congelar a -20 ° C durant 20 min, i després es van seccionar en llesques de 5 mm de gruix. Es van incubar cinc talls contínues entre l’àpex i el lloc d’occlusió en clorur de trifeniltetrazoli (TTC) a 37 ° C durant 5 min. Després de la fixació amb un 4% de paraformaldehid durant tota la nit, es va pesar cada llesca ( w ) i es va fotografiar amb una càmera digital. Les zones d’infart es van indicar com la zona no tacada per TTC. Photoshop es va avaluar la irrisió i la mida ventricular esquerra (LV) esquerra. El percentatge d’àrea d’infart es va calcular com a IR / LV = (∑IR (per rodanxa) × w (per rodanxa) ) / (∑LV (per rodanxa) × w (per rodanxa) ).

Anàlisi de LDH

Es va recollir un mil·lilitre de sang venosa del ventricular dret amb una xeringa i després es va centrifugar a 3000 rpm durant 15 min, 4 ° C. Les mostres de sèrum van ser enviades al laboratori clínic del Tercer Hospital de la Universitat de Pequín per analitzar els nivells de LDH.

Anàlisi estadística

Les dades es presenten com a mitja ± SEM La importància estadística de les diferències entre grups es va analitzar mitjançant t -test independent o ANOVA unidireccional seguit de SNK (Student-Newman-Keuls) quan es van comparar més de dos grups. P <0, 05 es va considerar estadísticament significatiu.

Glossari

MI

infart de miocardi

ROS

espècies reactives a l'oxígen

3′UTR

3 'regions no traduïdes

TUNEL

dUTP-digoxigenina terminal etiquetat per la desoxirribonucleotidil-transferasa (TDT) terminal

AV

annexina V

TTC

clorur de trifeniltetrazoli

IR

mida d’infart

LV

ventricule esquerre

MATEIX

lactat deshidrogenasa

shRNA

ARN de pinça curta

miRNA

microARN

LVID

diàmetre intern del ventricular esquerre

LVPW

gruix de paret posterior del ventricular esquerre

EF

Fracció d’expulsió

FAC

canvi de zona fraccional

HW / BW

Relació pes pes cardíac

HW / TL

relació pes pes cardíac i tibia

ELL

hematoxilina / eosina