En la cardiomiopatia de takotsubo, es perd una nova via mediada per mir-371a-5p, que porta a la regulació bag3 en cardiomiòcits en resposta a l'epinefrina | mort i malaltia cel·lular

En la cardiomiopatia de takotsubo, es perd una nova via mediada per mir-371a-5p, que porta a la regulació bag3 en cardiomiòcits en resposta a l'epinefrina | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Cardiomiopaties
  • Senyalització cel·lular
  • Patogènesi

Resum

Els mecanismes moleculars que protegeixen els cardiomiòcits de la mort induïda per l’estrès, inclosa l’estrès per tensió, són essencials per a la fisiologia cardíaca i els defectes d’aquests mecanismes de protecció poden produir alteracions patològiques. L’athanogen 3 associat a Bcl2 (BAG3) s’expressa en cardiomiòcits i és un component de la via d’autofàgia assistida per chaperona, essencial per a l’homeòstasi de cèl·lules alterades mecànicament. L’ ablació de BAG3 en els ratolins dóna lloc a una cardiomiopatia letal poc després del naixement i les mutacions d’aquest gen s’han associat a diferents cardiomiopaties incloses la cardiomiopatia de Takotsubo induïda per l’estrès (TTC). No s'ha definit el mecanisme patogen que condueix a la TTC, però s'ha suggerit que el cor es pot danyar per un vessament excessiu d'epinefrina (epi) en absència d'un mecanisme de protecció. L’objectiu d’aquest estudi era proporcionar més evidències sobre un paper de BAG3 en la patogènesi de TTC. Per tant, vam seqüenciar el gen BAG3 en 70 pacients amb TTC i en 81 donants sans amb l’absència de malalties cardiovasculars avaluables. Les mutacions i polimorfismes detectats en el gen BAG3 van incloure un freqüent canvi de nucleòtids g2252c a la regió 3’-no traduïda de BAG3 (3′-UTR) de pacients Takotsubo ( P <0.05), amb la qual cosa es va perdre la unió de microRNA-371a-5p (miR -371a-5p) com es demostra en assajos reporters de doble luciferasa i assajos de silenciació induïts per ARN de la composició catalítica 2 / desplegables. A més, es descriu una nova via de senyalització en cardiomiòcits que condueix a la regulació de BAG3 en exposició a epi mitjançant una subregulació ERK dependent de miR-371a-5p. En conclusió, la presència d’un polimorfisme de g2252c al BAG3 3′-UTR determina la pèrdua d’enllaç miR-371a-5p i dóna lloc a una resposta alterada a epi, representant potencialment un nou mecanisme molecular que contribueixi a la patogènesi de TTC.

Principal

La cardiomiopatia de Takotsubo (TTC), també coneguda com cardiomiopatia d'estrès o "síndrome del cor trencat", es caracteritza per un impactant miocardi transitori i reversible que condueix a globus apicals del ventricular esquerre sistòlic (LV) en absència de malaltia arterial coronària obstructiva. En general, es produeix en dones en postmenopausa i es produeix per estrès emocional o físic. 1 El pronòstic a llarg termini dels pacients amb TTC és favorable a causa de la recuperació espontània de la funció miocàrdica. Fins al moment no s'ha definit el mecanisme patogen que condueix a aquesta malaltia, 1 tot i que s'ha suggerit que el múscul cardíac pot ser danyat per l'alliberament excessiu d'epinefrina (epi), 2 cosa que suggereix que un mecanisme de protecció podria fallar en aquests subjectes.

L’athanogen 3 associat a Bcl2 (BAG3) és un membre de la família de co-chaperones BAG que interacciona amb el domini ATPase de la proteïna de xoc tèrmic 70. 3 En condicions fisiològiques, l’expressió BAG3 està restringida a pocs tipus de cèl·lules inclosos els cardiomiòcits. 4, 5, 6 La seva expressió pot ser induïda per una varietat d’estressors i es creu que contribueix a la resistència a l’estrès. 7, 8, 9 La presència de proteïnes que protegeixen els cardiomiocits de l’apoptosi induïda per l’estrès té un paper crucial en la fisiopatologia del miocardi. De fet, els cardiomiòcits són intrínsecament resistents a l’apoptosi, en part a causa d’elevats nivells d’inhibidors endògens de la caspasa, 10 proteïnes anti-apoptòtiques Bcl-2 i la cinasa Akt per a la supervivència. 11 En línia, vam trobar que els nivells de BAG3 augmenten durant la diferenciació dels mioblasts, cosa que suggereix que el seu paper biològic és rellevant per a miòcits diferenciats. 5 Això està d’acord amb l’observació que la supressió de Bag3 provoca una cardiomiopatia letal no als embrions, sinó als ratolins deficients de Bag3 postnatal. A més, es va trobar que el silenciament de Bag3 resulta en nivells de miogenina molt reduïts. 5 Aquestes troballes indiquen la implicació de la proteïna BAG3 en el desenvolupament cardíac tardà i s’ajusten al paper de BAG3 en la supervivència i la integritat de les miofibril·lars en els cardiomiòcits. Diversos informes associen mutacions de BAG3 amb miopatia. Selcen et al. 13 descrivia una forma mutada de BAG3, és a dir, Pro209Leu heterozigot, que va causar una debilitat muscular severa i progressiva en la cardiomiopatia infantil. A més, els polimorfismes d’un sol nucleòtid BAG3 no sinònims (SNPs) o altres formes BAG3 troncades es correlacionen amb cardiomiopatia dilatada familiar (DCM) 14 i amb la cardiomiopatia d’estrès també coneguda com TTC. 15 Finalment, es van identificar dues mutacions del gen BAG3 heterozigot, que causen un muntatge anormal de la Z -disc i una sensibilitat més gran a l’apoptosi en cardiomiocits cultivats, en pacients amb DCM familiar. 16 Aquestes troballes, juntament amb la nostra observació que la proteïna BAG3 s’allibera dels cardiomiòcits estressats i es poden detectar en sèrums de pacients amb insuficiència cardíaca crònica (HF), 6 suggereixen fortament que BAG3 té un paper en la regulació de la supervivència dels cardiomiòcits en condicions d’estrès.

En aquest estudi es descriu una nova via posttranscripció que condueix a la inducció de BAG3 en el tractament epi. Els microRNAs (miRNAs) són petits ARNs que no codifiquen que modulen l’expressió gènica mitjançant l’aparellament de bases incomplet amb els seus ARNs missatgers objectiu (ARNms), provocant normalment una repressió translacional. 17 miRNA tenen un paper crític en el manteniment normal dels processos cel·lulars fonamentals i la seva desregulació podria afectar un gran nombre de vies moleculars en malalties humanes. 18, 19, 20, 21 Entre aquestes, les patologies cardíaques estan relacionades amb miRNAs 22, 23, 24 i, en els darrers temps, s’han notificat canvis en els nivells de miRNA circulant específic en pacients amb TTC. 25 Hi ha pocs estudis que demostren que els ARNm també poden millorar la traducció dels ARNm. 26, 27 Aquí es descriu una via posttranscripcional que implica la unió d’un miRNA a la regió 3’-no traduïda (3′-UTR) del gen BAG3 , i es tradueix en un augment d’expressió BAG3. Trobem que epi indueix miR-371a-5p, donant lloc a una major expressió de proteïnes BAG3. També mostrem que una variant de nucleòtids del 3'-UTR del gen BAG3 , que es troba freqüentment en pacients amb TTC, provoca una alteració d'aquesta via posttranscripció.

Resultats

El gen BAG3 muta freqüentment en pacients de Takotsubo

Recentment hem reportat dues mutacions de missense relacionades amb la TTC a la regió codificant BAG3 en una cohort de 29 pacients 15 i vam ampliar el nostre estudi mitjançant un screening de 70 pacients amb TTC dones. Com a grup de control, es va utilitzar un grup de dones donants majors de 50 anys, per reduir la possibilitat que els donants de control desenvolupin la malaltia en el futur, ja que l’edat mitjana d’inici indicada oscil·la entre 58 i 75 anys en els diferents. informes. 28 Hem seqüenciat els exons 2-4 de la seqüència de codificació i els 3’-UTR sencers de BAG3 . No hem estat capaços d’amplificar de forma consistent l’exó 1 (com s’ha informat abans del 29 ) i, per tant, no hem inclòs dades d’aquest exó. Les taules que informen de totes les mutacions de la seqüència trobades es presenten a les taules suplementàries S1 i S2.

Els pacients amb TTC presentaven una freqüència més alta de mutacions en el gen BAG3 en comparació amb donants sans. De fet, la taula 1 mostra que només el 27, 1% dels pacients amb TTC analitzats no tenia mutació en la seqüència BAG3 en comparació amb el 53, 1% dels donants sans. A més, el 21, 4% dels pacients amb TTC i només el 12, 3% dels donants van mostrar un canvi de nucleòtid homozigot en la seqüència BAG3 . A més, el 47, 1% dels pacients amb TTC, però només el 29, 6% dels controls tenien més d'una mutació BAG3 i, per tant, portaven dos al·lels alterats. No podem excloure que la seqüenciació de la part restant de la seqüència de codificació i el 5'-UTR del gen BAG3 no resulti en el descobriment de mutacions addicionals a la cohort de TTC, millorant així la importància de l'anàlisi genètica.

Taula completa

Entre les variants genòmiques identificades, es va identificar una mutació particularment freqüent en el 3′-UTR (g2252c-SNP rs8946) (taula complementària S3). De fet, el 62, 8% dels pacients amb TTC portaven aquesta variant de nucleòtids, dels quals el 12, 8% eren homozigots per la variant g2252c. En canvi, aquesta mutació estava present només en el 45, 6% de les mostres del grup control i només el 7, 4% eren homozigots (el valor P de dues cues obtingut per la prova exacta de Fisher a la taula de contingència 2 × 2 és igual a 0, 04). A més, malgrat que les mostres de control provenien de donants femenines majors de 50 anys, és possible que alguns dels controls que porten aquesta mutació, en particular els casos homozigots, desenvolupin els símptomes si s’exposen a un fort esdeveniment desencadenant. Per tant, hem executat una sèrie d’experiments per determinar quina via molecular es pot alterar la variant g2252c en miocits cardíacs humans.

miR-371-5p augmenta els nivells de proteïnes BAG3

Per investigar si el canvi de nucleòtid g2252c pot afectar els nivells d'expressió de BAG3 alterant la unió de miRNAs reguladors, es va realitzar una anàlisi in-silico de la seqüència i es van identificar diversos miRNAs potencials que es preveien que unissin la seqüència que contenia aquest canvi de nucleòtids (suplementari Taula S4). Entre aquests, miR-371a-5p (miR-371a) (MI0000779) va mostrar la puntuació predictiu més alta i, per tant, es va triar per a investigacions posteriors. L’algoritme TargetScan va identificar la regió d’unió a miR-371a-5p al BAG3 3′-UTR com a “lloc mal conservat per a famílies de miRNA conservades només entre mamífers o vertebrats”. A més, una anàlisi de seqüències entre espècies, realitzada per l’eina d’alineació mVISTA, 30 posa de manifest que només els humans tenen el lloc d’unió correcte a BAG3 3′-UTR per a hsa-miR-371a-5p, que manca al ratolí, rata, porc, ximpanzé. i goril·la (figura suplementària S1).

En immunoprecipitar el complex silenciador induït per ARN (ARIS) del component catalitzador de composició 2 (AGO2) en les cèl·lules HEK293 mitjançant immunoprecipitació de proteïnes que uneix RNA o immunoprecipitació de proteïna que uneix ARN (RIP), vam confirmar que el complex RISC s'uneix al BAG3 3 ′ -UTR (Figura 1a). A més, la base de dades starBase (//starbase.sysu.edu.cn/index.php) que alberga el mapa d'interacció des de les dades 31, 32 d'Argonaute CLIP-seq també va demostrar la vinculació específica del miR-371a-5p a la BAG3 3′-UTR. Per validar experimentalment més si miR-371a-5p s'uneix directament al 3'-UTR de BAG3 i avaluar si aquesta vinculació està afectada pel canvi de nucleòtid g2252c, vam realitzar assajos de reporters de doble luciferasa utilitzant reporters pMIR amb un tipus salvatge. (wt) o llocs d'orientació miRNA posatius polimòrfics clonats aigües avall del gen de la cel·lebra luciferasa ( luc2 ). En aquest experiment, la tirolesa luciferasa es va utilitzar com a reporter principal per controlar la regulació gènica i Renilla luciferasa (lucre neo ) va actuar com a reportera de control per a la normalització del senyal. Les cèl·lules Cos-7 i una línia de cèl·lules de cardiomiòcit humà primari per a adults (HCMa) van ser transfectades de manera transitòria amb molècules precursores per als miRNAs previstos o un control remuntat (SCR) juntament amb els plasmides del reporter pMIR, que albergaven el wt BAG3 3′-UTR. o el BAG3 3′-UTR portant la mutació homozigota g2252c. Els nostres resultats demostren que miR-371a-5p va augmentar l'activitat luciferasa al reporter que alberga el pes BAG3 3'-UTR, però no va poder augmentar l'activitat del reporter amb el BAG3 3'-UTR mutat (figures 1b i c). En consonància amb aquesta troballa, la transfecció precursora de miR-371a-5p va donar lloc a un augment dels nivells de proteïnes BAG3 a les cèl·lules HCMa (Figura 1d). Notablement, no es van observar canvis en els nivells d'ARNm de BAG3 (Figura 1e), cosa que suggereix que miR-371a-5p va actuar influint en la traducció de BAG3 en lloc de l'estabilitat de l'ARNm BAG3. En conjunt, aquestes dades demostren que miR-371a-5p millora l'expressió de proteïnes BAG3, i que la interacció de miR-371a-5p amb BAG3 3'-UTR humana depèn críticament de la presència de la variant g2252.

Image

miR-371a-5p regula l'expressió de BAG3. Per provar si els ARNm previstos podrien unir la diana BAG3, es va realitzar tant assaig Ago2 / pull-down com pMir dual-luciferase. l'ARNm de les cèl·lules HEK293 va ser IP amb l'anticòs anti-AGO2 i l'ARNm BAG3 es va quantificar mitjançant RT-PCR quantitativa ( a ). Les dades es van normalitzar sobre l’expressió de l’RNA pri-miRa 15a / 16-1, no IP (INPUT). A la part inferior de a també hi ha una representació esquemàtica del gen BAG3 . Es mostren la seqüència de codificació ARNm BAG3 i BAG3 (fletxes negres), la seqüència orientada hsa-miR-371-5p (barra vermella) i els fragments utilitzats per a la qRT-PCR en l'anàlisi RIP. Les cèl·lules Cos-7 ( b ) i HCMa ( c ) van ser co-transfectades amb la pre-miR-371a-5p (0, 1 nmol / l) (miR-371a-5p) o amb un control SCR (scr) i una firefly luciferasa pMir plasmidi reporter que conté a continuació el gen de luciferasa , la seqüència wt (pmir WT) o mutada (g2252c) (pmir mut) BAG3 3′-UTR. Les diferències d’activitat de la luciferasa entre mostres es van analitzar les 24 hores després de la transfecció i la Renilla luciferasa es va coprotectar com a control. Les dades representen la mitjana de sis rèpliques experimentals; Es mostra el valor P versus SCR i la seqüència mutada. Les cèl·lules HCMa es van transfectar amb seqüències pre-miR-371a-5p (2 nmol / l) (pre-miR-371a-5p) o SCR (SCR) com a control negatiu, i nivells de proteïna B (B) 3 ( d ) i d'ARNm ( e ) es van avaluar després de 24 h. ( d ) L'anàlisi densitomètrica de cinc taques, normalitzada a les intensitats de banda de GAPDH corresponents, es mostra a d (plafó inferior). Els nivells d’ARNm BAG3, avaluats per RT-PCR en temps real, es van comparar en tres experiments independents mitjançant el mètode ct relatiu: la quantitat d’objectiu, normalitzada a la quantitat de control endògena (GAPDH), en relació amb la mostra de control, és donada per 2 –ΔΔCt . Significació calculada per t- test: *** P <0, 0001, ** P <0, 005 i * P <0, 01; NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

Epi regula els nivells de BAG3 mitjançant la regulació miR-371a-5p

En la TTC s'ha implicat una exposició a nivells alts d'epis, com a conseqüència d'un fort estrès emocional o com a conseqüència de l'administració de catecolamines o la presència d'inhibidors de la reabsorció de serotonina / norefinefrina. 33, 34 Per tant , hem investigat si epi podia modular l'expressió de proteïna BAG3 en cardiomiocits humans adults i si miR-371a-5p podria participar en aquesta regulació. D'acord amb les nostres expectatives, el tractament epi de les cèl·lules HCMa va donar lloc a un augment de la proteïna BAG3 en funció de la dosi i del temps (figures 2a i b). En aquestes condicions experimentals, el tractament epi provocà l’activació de la resposta adrenèrgica, tal com es mostra en un augment de l’AMP cíclica intracel·lular (cAMP) (figura suplementària S2), però encara no en mort cel·lular (figura suplementària S3). Mitjançant l’ús d’inhibidors selectius dels receptors adrenèrgics, vam demostrar que la regulació BAG3 de tipus epi-dependent depenia críticament de l’estimulació de l’estímul del receptor α 1 (figura suplementària S4). Curiosament, els nivells d’ARNm de BAG3 es van mantenir constants en resposta a l’estimulació epi, cosa que indica un mecanisme regulador posttranscripcional en la regulació de l’expressió de proteïnes BAG3 (figura 2c). A més, el tractament amb epi també va donar lloc a una major expressió de miR-371-5p, cosa que indica que aquest miRNA pot tenir un paper en la inducció observada de BAG3 en resposta a epi (Figura 2d). Per confirmar que la inducció de BAG3 per epi depèn efectivament de la regulació de miR-371-5p, vam transfectar cèl·lules HCMa amb anti-miR-371-5p per silenciar miR-371-5p endògens. La transfecció amb anti-miR-371-5p, però no amb un control SCR, va donar lloc a una modesta reducció dels nivells de proteïnes basals BAG3, però va abolir completament la inducció de la proteïna BAG3 per epi (Figura 2e). La PCR de transcripció inversa en temps real (RT-PCR) va confirmar que la molècula anti-miR era capaç de reduir l'expressió de miR-371a-5p fins i tot en presència d'epis (figura 2f).

Image

Epi indueix la sobreexpressió de BAG3 a través de miR-371a-5p. Les cèl·lules HCMa es van tractar amb epi HCl epi (als punts de temps ( a ) o concentracions ( b ) indicats i es van recollir. Es mostra l’anàlisi del WB de la proteïna BAG3 ( a i b ). Es mostra un dels sis experiments independents i es mostra l’anàlisi densitomètrica de rèpliques experimentals, normalitzada a les intensitats de banda de β- actina corresponents, a la part inferior de a i b . ( c ) Els nivells d'ARNm de BAG3 després de l'epinètica i cinètica, avaluats per RT-PCR en temps real, normalitzats a la quantitat de control endògena (GAPDH) i en relació amb la mostra de control, es donen a 2 ºC . ( d ) els nivells de miR-371a-5p es van detectar mitjançant RT-PCR en temps real: les quantitats de transcripcions es van comparar mitjançant el mètode Ct relatiu, on la quantitat de l'objectiu, normalitzada a la quantitat de control endògena (RNU6) i relativa a la la mostra de control ve donada per 2 –ΔΔCt . Per silenciar l’activitat del miRNA i generar un model de knockout miRNA-371a-5p transitori, es van transfectar cardiomiòcits amb les seqüències anti-miR-371-5p (anti-miR) o SCR com a control negatiu (10 nmol / l) i 24 h. més tard es va estimular amb epi (500 μ mol / l) durant 2 h o 15 min. Posteriorment es van analitzar les cèl·lules per WB, per avaluar els nivells de proteïna BAG3 ( e ) i per RT-PCR en temps real, per avaluar els nivells de miR-371a-5p ( f ), tal com es descriu anteriorment. Les dades són representatives de tres experiments independents amb resultats similars i l’anàlisi densitomètrica WB de rèpliques experimentals, normalitzada a les intensitats de banda de GAPDH corresponents, es mostra a la part inferior de e . La significació versus la SCR o les mostres de control es van calcular per t- test: *** P <0, 0005, ** P <0, 005 i * P <0, 01; NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

A continuació, investigem la via molecular que condueix a la inducció de miR-371a-5p per epi. Curiosament, el tractament de cèl·lules HCMa amb epi també va donar lloc a una fosforilació ERK aproximadament al mateix temps quan s’observa l’augment de miR-371a-5p (figures 3a i b, plafó inferior esquerre) i el tractament amb U0126, un inhibidor de la fosforilació ERK, Regulació bloquejada induïda per epi i nivells de miR-371a-5p i BAG3 (figura 3b, respectivament, esquerra i dreta).

Image

Epi indueix la fosforilació ERK, la translació de β- catenina i la transcripció de miR-371a-5p, que condueixen a la regulació de BAG3. ( a ) Les cèl·lules HCMa es van tractar amb epi HCl epi (500 μ mol / l) i es van recollir en els punts indicats, i els lisats cel·lulars van ser analitzats per WB amb anticossos per BAG3, ERK fosforilats (pERK1 / 2) i ERK total (ERK1 / 2). GAPDH es va utilitzar com a control de càrrega; L’anàlisi densitomètrica BAG3 i pERK, normalitzada a la GAPDH corresponent o a les intensitats totals de banda ERK1 / 2, es mostren a la part inferior de a . ( b ) Les cèl·lules es van tractar prèviament durant 30 min amb inhibidor de fosfo-ERK U0126 (10 μ mol / l en sulfoxid de dimetil (DMSO)), o amb dissolvent sol, i durant 15 min addicionals (esquerra) o 2 h (dreta) amb epi HCl (epi) (500 μ mol / l); els extractes cel·lulars van ser analitzats per WB per BAG3, ERK fosforilat (pERK1 / 2) i ERK total (ERK1 / 2). GAPDH es va utilitzar com a control de càrrega (panells superiors). El tauler inferior esquerre mostra nivells d'expressió miR-371a-5p, analitzats per RT-PCR en temps real. Les quantitats de transcripció es van comparar mitjançant el mètode Ct relatiu, tal com es va descriure abans. Les fraccions citosòliques ( c ) i nuclears ( d ) de cèl·lules HCMa pretractades amb U0126 tal com es va descriure abans i després es van tractar amb epi en els moments indicats van ser analitzades per WB per BAG3, ERK fosforilada (pERK1 / 2), ERK total (ERK1 / 2 ) i β -catenina. GAPDH i LAMIN A / C es van utilitzar com a control de càrrega en la fracció citosòlica i nuclear. Les imatges mostrades són representatives de tres experiments independents. ( e ) Anàlisi densitomètrica de senyals β- catenines, normalitzada al GAPDH corresponent (citosol) o LAMIN A / C (nucli). Significació calculada per t- test: * P <0, 01 i ** P <0, 001

Imatge a mida completa

S'ha demostrat que la regió promotora del clúster miR-371-373 conté elements d'unió TCF / LEF1 i que la β- catenina és necessària per a la inducció que depèn de Wnt del clúster miR-371-373. 35 Per tant, vam provar la possibilitat que el tractament epi derivés en la transferència de β- catenina al nucli. De fet, tal com es demostra a les figures 3c – e i la figura 4, el tractament amb epi va suposar una ràpida translocació de β- catenina al nucli. Això depenia de la fosforilació ERK, ja que U0126 va bloquejar de forma eficient la translocació nuclear β- catenina (figures 3c – e i figura 4), així com l’augment de l’expressió BAG3 (figura 3b del quadre dret i la figura 3c). Finalment, també vam demostrar que BAG3 es co-localitza amb filaments d’actina F en cardiomiocits i és essencial per al seu correcte muntatge. En línia, el silenciament de BAG3 en HCMa va donar lloc a l'estructura de filament de l'actina F alterada, així com una reducció dels nivells d'actina (Figura 5).

Image

Epi indueix la translocació nuclear de β- catenina. HCMa es va pretractar prèviament amb l’inhibidor de fosfo-ERK U0126 (10 μ mol / l en dimetil sulfoxid (DMSO)), o amb solvent, i després es va estimular amb epi 500 μ mol / l durant 10 min. Per a la immunofluorescència indirecta, es van tacar cèl·lules per a la detecció de β- catenina amb un Ab conjugat anti-conill FITC-488. Es va utilitzar IgG de conill de control negatiu en lloc d'un anticorp policlonal de conill primari per avaluar la tinció inespecífica. Hoechst 33342 es va utilitzar per a la tinció nuclear (DAPI). Les mostres es van analitzar mitjançant un microscopi confocal, (objectiu × 63; barres = 20 μ m)

Imatge a mida completa

Image

Paper funcional BAG3 en els cardiomiòcits estimulats en epi: l’epu indueix un augment de l’expressió BAG3 i dóna suport a la co-localització de BAG3-F-actina; a més, l’expressió BAG3 és essencial per a l’estructura de fibra d’actina F. Es van sembrar HCMa 60 × 10 3 cèl·lules / pou (plaques de 6 pous) i 4 hores després es van transfectar amb un shRNA BAG3 humà o un vector sense objectiu hu-shNT com a control negatiu (0, 5 μ g / pou), per silenciar el Gen BAG3 . Després de 72 h, les cèl·lules es van estimular amb epi 500 μ mol / l durant 2 h. Per a una immunofluorescència indirecta, es van tacar cèl·lules per a la detecció de BAG3 amb un Ab conjugat de FITC-488 anti-ratolí. Es va utilitzar IgG de ratolí de control negatiu en lloc d’un mAb de ratolí primari per avaluar la tinció inespecífica. Per tacar filaments d’actina F, es van incubar les cèl·lules amb la fal·lidina conjugada amb TRITC. Hoechst 33342 es va utilitzar per a la tinció nuclear (DAPI). Les mostres es van analitzar mitjançant un microscopi confocal (objectiu × 60; barres = 20 μ m). L'eficàcia de shRNA BAG3 humana en silenciar BAG3 també va ser assimilada pel WB. Les imatges mostrades són representatives de tres experiments independents i es mostra l'anàlisi densitomètrica de senyals BAG3 WB, normalitzats a GAPDH. epi, epinefrina; shNT, ARNA de pinça curta sense objectiu; shBAG3, ARN de pinça curta BAG3 humana. Significació calculada per t- test: * P <0, 01 i ** P <0, 001

Imatge a mida completa

Agrupades, aquestes dades demostren que en els cardiomiòcits humans, epi indueix la translocació nuclear β- catenina depenent de la fosforilació ERK, produint una expressió miR-371-5p augmentada, 35 que al seu torn influeix en el nivell d’expressió de proteïnes BAG3. La inducció correcta de BAG3 sembla ser un component necessari per a un correcte muntatge de sarcomer en cardiomiòcits. Intrigantment, aquesta via posttranscripcional que regula l'expressió de proteïna BAG3 està alterada per la presència de la variant de g2252c al 3'-UTR de BAG3 humà, que es troba sovint en una cohort de pacients amb TTC, cosa que suggereix que miR-371-5p i-induïda per epi BAG3 pot representar nous components moleculars en la patogènesi de la malaltia de TTC.

Discussió

Les nostres dades proporcionen evidència d’un nou mecanisme induït d’epia posttranscripció que implica unió de miR-371-5p a BAG3 3’-UTR que podria fallar en subjectes que porten variants genòmiques de BAG3 . La TTC, o la síndrome del cor trencat, es caracteritza per un impactant miocàrdic transitori i reversible que condueix a l’aplicació de LV sistòlica en LV, és més freqüent en dones postmenopàusiques i es desencadena per estrès emocional o físic per l’alliberament excessiu d’epis. 1, 2 En el nostre mecanisme proposat, epi augmenta els nivells de proteïnes BAG3 mitjançant la unió directa de miR-371a-5p a la regió 3'-UTR de BAG3, com demostra el test de doble luciferasa. Curiosament, l’SNP rs8946 es troba en aquesta regió i les nostres dades suggereixen que aquest canvi de nucleòtids, més freqüent en els pacients amb TTC, impedeix o desestabilitza la unió de miR-371a-5p a BAG3 3′-UTR. Més detalladament, mostrem que en els cardiomiòcits epi desencadena la fosforilació ERK que al seu torn resulta en la transferència de β- catenina al nucli. Abans s'ha demostrat que la β- catenina nuclear coopera amb el factor de transcripció LEF-1, per promoure l'expressió de miR-371-5p 35 (Figura 6). Curiosament, en el mecanisme que descrivim, la unió directa de miR-371a-5p al 3'-UTR de BAG3 dóna lloc a una major expressió de la proteïna BAG3 presumiblement mitjançant la regulació translacional, que requereix més anàlisis en els nostres futurs estudis. Tot i que els ARNm s'han implicat principalment en la repressió posttranscripcional de la proteïna diana, les dades acumulades indiquen que els miRNAs i els seus complexos proteics associats també poden estimular l'expressió gènica a nivell posttranscripció amb una varietat de mecanismes directes i indirectes. 26, 27, 36, 37

Image

Ruta reguladora Epi en expressió BAG3. L’epi en cardiomiòcits indueix, possiblement mitjançant PKA, 42 fosforilació ERK. L'ERK fosforilat també es va demostrar fosforilat CK2 α , que després fosforilava α- catenina, abrogant el seu efecte inhibidor sobre la β- catenina com es va descriure anteriorment. El 43 β -Catenina és lliure de traduir-se al nucli on actua com a factor de transcripció, juntament amb LEF-1, millorant la transcripció del cluster mir-371-373. 35 El miR-371a-5p madur s'uneix a la traducció de proteïnes que millora el pes BAG3 3'-UTR ( a ). Quan es produeix la mutació homozigota de g2252c, miR-371a-5p ja no es pot unir a la 3'-UTR de BAG3 i no s'obté cap augment de BAG3 en resposta a epi ( b )

Imatge a mida completa

A partir dels coneixements actuals sobre el paper funcional de BAG3 en els cardiomiòcits, és raonable proposar que la pèrdua de la regulació BAG3 pugui sensibilitzar els cardiomiòcits a les condicions d’estrès. En línia, recentment s’ha demostrat que BAG3 és essencial per a l’homeòstasi de cèl·lules amb tensió mecànica, 38, 39 és un component important de la via d’autofàgia assistida per chaperona (CASA) que condueix a la degradació lisosomal selectiva de proteïnes desplegades. A les cèl·lules musculars, la maquinària CASA està ubicada al disc Z i sembla essencial per a l'eliminació de mecanismes-sensors desplegats i proteïnes de citoesquelet que resulten de tensions mecàniques. La deterioració de la maquinària CASA comporta una interrupció del disc z en la contractació muscular. 38, 39 A més, s'ha demostrat que les mutacions de BAG3 donen com a resultat una funció muscular anormal i són responsables tant de les distrofies musculars com de les cardiomiopaties, mentre que els nivells reduïts de BAG3 contribueixen a l'aparició de malalties en casos no familiars de cardiomiopaties dilatades. 40 A més, l'esgotament de BAG3 provoca una cardiomiopatia letal no als embrions, sinó a ratolins amb deficiència de borsa 3 postnatal. 12 D'acord amb aquests informes, es va trobar que el silenciament de BAG3 en els cardiomiòcits humans primaris d'adults resulta en una alteració dramàtica dels filaments d'actina F. Els nostres estudis poden suggerir que els nivells basals de BAG3 en pacients amb TTC són suficients per evitar alteracions de les cèl·lules musculars, i que la mutació de g2252c al 3'-UTR de BAG3 podria resultar en la pèrdua de la capacitat de subregular aquesta proteïna a l'exposició elevada. nivells de epi. L'absència de regulació BAG3 podria ser generalment ben tolerada; tanmateix, en condicions especialment estressants, la no-regulació de BAG3 a un nivell suficient pot provocar danys cardíacs i un fenotip clínic obert.

En conclusió, es va identificar una nova via de senyalització que condueix a la regulació de BAG3 en resposta a epi en cardiomiòcits humans i aquesta via potser és menys activa en els subjectes que porten el canvi de nucleòtids del g2252c en homozigòtia i es deteriora en els que la porten en heterozigotosi. És possible que els pocs casos de control que mostren aquesta mutació en l’homozigosi puguin desenvolupar la malaltia més tard a la vida només si se sotmet a un fort estrès emocional o com a conseqüència d’una exposició iatrogènica a catecolamines. En els subjectes que porten el polimorfisme BAG3 g2252c en heterozigosi, és possible que es produeixin variants addicionals que afecten la funció o la regulació de BAG3 en l'altre al·lel i contribueixin a la funció alterada de BAG3. En conclusió, la freqüència augmentada significativament del canvi de nucleòtid de g2252c en pacients amb Takotsubo proporciona evidències circumstancials que la variant de g2252c pot predisposar cardiomiòcits a danys induïts per epi i pot tenir un paper funcional en la patogènesi de la malaltia.

Materials i mètodes

Pacients i donants

Tots els pacients van ser inscrits segons els criteris de diagnòstic de la Clínica Mayo de TTC de la següent manera: akinesia transitòria o discinesia de LV apical i / o midventricular segments; no hi ha evidència angiogràfica de ≥50% d'estenosi coronària o ruptura de la placa ni formació de trombes intracoronàries; noves anormalitats en l'electrocardiograma (ECG) (canvis dinàmics de ST-T o inversió d'ona T); i l’absència de sagnat intracranial, feocromocitoma i miocarditis.

Es van recollir mostres de sang a l'Hospital Universitari 'San Giovanni di Dio e Ruggi d'Aragona', Salern, Itàlia, en un període de 3 anys, des de gener de 2011 fins a desembre de 2013, i a l'Hospital San Luca, Vallo della Lucania, Salern, Itàlia, en un període de tres anys, des del gener del 2007 fins al desembre del 2009. Tots els participants van proporcionar el consentiment informat i escrit, l'estudi va ser aprovat pel comitè d'ètica local i s'ajusta als principis de la Declaració de Hèlsinki.

La cohort de pacients Takotsubo va incloure 70 dones (edat mitjana de 64, 3 ± 12 anys; entre 35 i 82 anys). En el conjunt de la població, entre els factors típics de risc cardiovascular, hi predominava la hipertensió (55%) en comparació amb la diabetis, l’hipercolesterolèmia i el tabaquisme. La majoria dels pacients (82%) es trobaven en estat de menopausa. Es va informar d'un esdeveniment desencadenant agut, anterior a l'aparició de TTC, en 52 pacients (desencadenant emocional i físic en 41 i 11 pacients, respectivament). El dolor de tòrax era el símptoma freqüent en el moment de l’ingrés en 44 pacients (62%). En la presentació d’ECG, l’elevació ST va ser més freqüent (56%) en comparació amb l’elevació no ST (18%) i la inversió d’ona T (26%). Hi va haver una important prevalença (81%) de globus apicals. Es van detectar formes variants en 13 pacients (11 globus ventriculars mitjans i 2 en globus basals). La funció sistòlica del VV es va reduir notablement entre un 34 i un 8%. Com es va informar en sèries més grans de pacients amb TTC, es van produir complicacions agudes en un 28% dels pacients. La HF va ser la complicació més freqüent detectada en 14 pacients, mentre que es va diagnosticar un xoc cardiogènic en 6 pacients.

Com a grup de control, vam seqüenciar mostres d’ADN de 81 dones donants sanes, majors de 50 anys, amb l’absència de malalties cardiovasculars avaluables en el moment de la recollida de sang. Les mostres de control es van recollir al Departament Immunitari Transfusional de l’Hospital Universitari “San Giovanni di Dio e Ruggi d’Aragona”.

Anàlisi de seqüències

Els primers específics de BAG3 es van dissenyar per amplificar per PCR exon 2 (Fw5′-AGGAGGGTTCACTTCCCAGT-3 ′, Rw5′-CCCACTGAAGAACAGCCCTA-3 ′), exona 3 (Fw5′-TGCCCTCTACCCTGTGTCTC-3 ′ CAC), exó 4 (part Ist) (Fw5′-TTCCCAGCCTGAAAACAAAC-3 ′, Rw5′-CTGGACTTGACCTGGGACAT-3 ′) i exó 4 (segona part) (Fw5′-GAGGGACGAGCCGATGTGCG-3 ′, RW5′GGGT-AG) utilitzant com a plantilla 50 ng d’ADN genòmic (gDNA), purificat a partir de sang fresca sencera (200 µl ), (DNeasy Blood and Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA, EUA) recollida de pacients i donants sans. PCR products (20–100 ng) were sequenced using BigDYE v3.1 (1 μ l; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), SBDD buffer (1.9 μ l; Applied Biosystems), Fw or Rw primer (5 pmol) and water to reach the final volume of 10 μ l, by following the supplier instructions for cycling conditions. The reaction volumes were purified by precipitation with ethanol and NaAc (50 mmol/l), and shipped to the sequencing facility.

Anàlisi bioinformàtica

Sequencing data were analyzed and aligned using ClustalW software (available at www.clustal.org, UCD Dublin, Ireland). We assessed miRNA-binding potential to the BAG3 3′-UTR at position 2252 (±10 bp) using open computational software tools developed by the Segal Lab of Computational Biology (//genie.weizmann.ac.il/), miRBase, miRWalk and TargetScan. Sequence conservation analysis among species was performed using the mVISTA tool. 30

Cell cultures, treatments and transfections

HCMa were purchased both from Sciencell Research Laboratories (San Diego, CA, USA) and Promo Cell GmbH (Heidelberg, Germany), and grown respectively in cardiac myocyte medium supplemented with fetal bovine serum (FBS) (5%), cardiac myocyte growth factors (1%), penicillin/streptomycin solution (1%) (Sciencell Research Laboratories) or myocyte growth medium supplemented with fetal calf serum (5% V/V), human epidermal growth factor 0.5 ng/ml, basic fibroblast growth factor 2 ng/ml, insulin 5 μ g/ml (Promo Cell GmbH) (Supplementary Figure S5).

All experiments were performed on low-passage cell cultures. Cos-7 cells (ECACC 87021302) were cultured in DMEM supplemented with FBS (10%) and penicillin/streptomycin (1%) solution in a 5% CO 2 incubator at 37 °C. Transfections were performed using serum-free media. Cardiomyocytes were seeded 50 000 cells/well (12-well plate for protein expression analysis) or 100 000 cells/well (6-well plate for mRNA and miRNA expression analysis) and transfected with precursor (2, 5 and 10 nmol/l) or inhibitors (1, 10 and 100 nmol/l) of miR-371a-5p or SCR sequences as a negative control (Ambion, Foster City, CA, USA), by using Oligofectamin (Invitrogen). HCMa cells were stimulated with epi HCl (25, 50, 100, 250 and 500 μ mol/l for 5, 10, 15, 30, 60 and 120 min) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and cells were then collected in the Cell Disruption Buffer provided by the miRVana Paris Kit (Ambion) at the indicated time points. pERK inhibition was obtained by pretreating cells with the pERK inhibitor U0126 (10 μ mol/l) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) for 20 min, then epi was added (500 μ mol/l). To assay which epi receptor is involved in the signaling, cells were pretreated for 30 min with α 1 antagonist Prazosin (5 μ M), β 2 antagonist ICI 118–551 (1 μ M), β 1 antagonist Atenolol (10 μ M) and then stimulated for 2 h with epi HCl (500 μ M). Dimethyl sulfoxide (Sigma Aldrich) was used as a solvent control for U0126 and epi receptor antagonists, and its concentrations never exceeded 0.1% v/v. To silence BAG3 expression, HCM cells were seeded 60 000 cells/well (6-well plates) and 4 h later transfected by using 2 μ l of X-treme Gene 9 reagent (Roche, Indianapolis, IN, USA) with 0.5 μ g/well of BAG3-human 29mer shRNA retroviral construct (gene ID=9531; Origene Cat.Nr.TR314524) or HuSH 29-mer shRNA non-effective expression (No target; Origene Cat.Nr.TR30003) for 72 h.

RNA-binding protein immunoprecipitation assay

RIP assay was performed with Magna RIP kit (Millipore, Billerica, MA, USA) according to the manufacturer's instruction. HEK293 cells were lysed and the RNA-associated proteins were immunoprecipitated (IP) with anti-AGO2 Antibody (Millipore, 03-110). The precipitated RNA was retro-transcribed and measured by quantitative real-time PCR (Roche, Universal Probe Library System) by normalization to the non-IP control (Input). Primers were designed using the Universal Probe Library Assay Design Center (Roche). Primers and probes sequences were as follows: U87_BAG3_741F 5′-TCAGCCAGATAAACAGTGTGGA-3′, U87_BAG3_826R 5′-GAGACTGGGACCGCTCAG-3′ with the UPL#87 (Roche) and U77_BAG3_2298F 5′-TCTGCAGCCCTGTCTACTTG-3′, U77_BAG3_2338R 5′-AGACAGTGCACAACCACAGC-3′ with the UPL#77 (Roche).

Plasmids and luciferase assay

BAG3 (NM_004281.3) 3′-UTR, 504-bp long, encompassing the predicted miRNA targeting sequence, was amplified by PCR by using the modified primer pair FW5′-TCATGTATAGAGCT|CCTCTGCCCTGTAAAAATCAGA-3′( Sac I) and RW5′-TCATGTATAA|AGCTTAAAATGTAGCATTAAAGTCATCCAA-3′( Hind III), and gDNA template isolated from a patient carrying the SNP rs8946 in homozygosis or from a donor carrying the wt sequence. PCR products were digested with the suitable restriction enzymes and cloned into the pMIR-REPORT luciferase miRNA expression reporter vector (Ambion) previously digested with Hind III and Sac I. All plasmids were fully sequenced before use. The dual-luciferase method used to assay miRNA binding affinity for the target sequence was the same used by da Costa Martins et al. 41

COS-7 or HCMa cells were seeded 5, 000 cells/well (96-well plate) and transfected with pre-miR-371a-5p, (0.1, 0.5 and 1 nmol/l) or negative control#1 miR precursor molecules, by using Oligofectamine (Invitrogen). Six hours later, cells were co-transfected by using Fugene reagent (Roche) with pMIR-report plasmid (0.15 μ g/well) containing BAG3 3′-UTR (wt or carrying the homozygous SNP) and pRL Renilla luciferase control reporter vector (10 ng/well), which provides constitutive expression of Renilla luciferase and was used for normalization. Firefly luciferase activity was measured 24 h after transfection with a Dual-Glo Luciferase Reporter Assay kit (Promega, Madison, WI, USA) using Renilla luciferase as internal control.

Antibodies and western blotting

Control and treated cells were collected, washed in ice-cold PBS and re-suspended in ice-cold cell disruption buffer (300 μ l). miRVana Paris kit (Ambion) and proteins (10 μ g) were used for western blot (WB) analysis; blots were probed with anti-BAG3 TOS-2 polyclonal antibody (Biouniversa srl, Fisciano (SA), Italy), anti-phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) antibody (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA, #9101), anti-p44 MAP kinase ERK1 antibody (Cell Signaling Technology Inc., #4372) or anti ERK2 (C-14) antibody (SC-154, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti- β -catenin antibody (ab32572, Ambion), anti-GAPDH mouse antibody (sc-47724, Santa Cruz Biotechnology) or anti- β -actin mouse mAb (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology). Nuclear and cytoplasmic fractions were prepared from cells using NE-PER Reagent (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Nuclear fractions were used for WB analysis with anti- β -catenin antibody (ab32572 Ambion), anti-lamin A/C antibody (Cell Signaling Technology Inc.) and anti-GAPDH mouse antibody (sc-47724, Santa Cruz Biotechnology). Immunoreactivity was detected by sequential incubation with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies (Sigma Aldrich) and ECL detection reagent (GE Healthcare, Amersham Place, Little Chalfont, UK). Signal detection and scanning densitometry of the bands was performed with ImageQuant LAS4000 and ImageQuantTL respectively (GE Healthcare). The results of optical density ratio of target proteins versus either GAPDH, β -actin or lamin A are presented as the mean±SD of at least three different experiments; each experiment run at least on two different gels.

Analysis of cell viability

Cells were incubated for the established times in the absence and in the presence of different concentrations of epi. The number of viable cells was quantified by MTT ([3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide]) assay. Absorption at 550 nm for each well was assessed using a microplate reader (LabSystems, Vienna, VA, USA).

Apoptosis evaluation

Epi-treated and control cells were collected and then incubated with a propidium iodide (PI) solution (0.1% sodium citrate, 0.1% Triton X-100 and 50 mg/ml of PI) for 30 min at 4 °C. Apoptosis was quantified as the proportion of cells with hypodiploid DNA (sub G0–G1 peak) using flow cytometry (FACScan, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Data were normalized as percentage relative to positive control (doxorubicin).

To analyze Caspase-3 activity, cells (2 × 10 4 ) were lysed in a buffer containing HEPES 50 mM, DTT 1 mM, EDTA 0.1 mM, NP-40 0.1% and CHAPS 0.1%, and protein concentration was determined. Protein aliquots (20 μ g) were incubated with 20 μ M peptide substrate Ac-DEVD-AMC (Pharmingen, San Diego, CA, USA) at 37 °C for 3 h in the lysis buffer. Caspase-3 activity was determined in the cytosolic extracts by analyzing the release of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) monitored by a spectrofluorometer, with excitation wavelength of 380 nm and emission wavelength of 440 nm.

Analysis of intracellular cAMP

cAMP intracellular concentrations were assayed in HCM cells after epi stimulation. HCMa cells (1 × 10 5 ) were seeded in 12-well plates and stimulated with epi at different concentrations (0, 0.5, 5, 50 and 500 μ M) for 15 min. Cells were lysed with 300 μ l of 0.1 M HCl. Lysates were immediately used for a competitive immunoassay (Direct cyclic AMP Enzyme-linked Immunosorbent Assay kit, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA), to measure the intracellular concentration of cAMP. Data were analyzed by using Microplate Manager 4.0 software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

mRNA/miRNA isolation and real-time RT-PCR

Total RNA isolation (mRNA/miRNA) was performed by using the Ambion mirVana PARIS Kit (Ambion). RNA (1 μ g) was reverse transcribed by using miScriptII Reverse Transcription Kit (Qiagen) and the HiFlex Buffer. Primers were designed to detect transcripts for hBAG3 (NM_004281.3) and hGAPDH (NM_001256799.1). Real-time PCR was performed on Light Cycler480 (Roche) using LightCycler480 SYBR Green Master Mix. For real-time PCR detection of miRNAs, miScript Primer Assays for miR-371a-5p and RNU6, and the miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) were used. Transcript quantities were compared using the relative Ct method, where the amount of target normalized to the amount of endogenous control (GAPDH or RNU6) and relative to the control sample is given by 2 (–ΔΔCt) . The results are presented as mean SD of the mean of experimental triplicates.

Immunofluorescència

In the first experiment aimed at showing β -catenin nuclear translocation, HCMa were seeded 100 000 cells/well (6-well plate), and 1 day later were pretreated with the pERK inhibitor U0126 and/or stimulated with epi 500 μ mol/l for 15 min. In the second experiment aimed at testing functional effects of BAG3 misregulation, as an in-vitro model of TTC, HCM cells were seeded 60 000 cells/well (6-well plates) and transfected with shBAG3-human retroviral construct or HuSH non-effective expression (No target). Seventy-two hours later, cells were treated with epi 500 μ mol/l for 2 h. Cells were fixed in 3.7% formaldehyde 1 × PBS for 30 min at room temperature, incubated for 5 min with 1 × PBS 0.1 mol/l glycine, then permealized with 0.1% Triton X-100 and incubated with 5% NGS. Following overnight incubation at 4 °C with rabbit anti- β -catenin mAb (1 : 250) (ab32572, Ambion), or mouse anti-BAG-3 mAb (AC-1) (Biouniversa srl, 3 ng/ μ l), coverslips were washed and incubated at room temperature for 45 min with goat anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG DyLigth 488-conjugated antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) and then washed, and to stain F-actin filaments cells were incubated 40 min at room temperature with TRITC-conjugated Phalloidin (P1951) (Sigma Aldrich, 1 ng/ μ l), then cells washed and incubated with Hoechst 33342 (Sigma Aldrich, 2 μ g/ml) at room temperature for 10 min. Samples were analyzed using a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM510 Meta Confocal Microscope, Carl Zeiss, Jena, Germany). Images were acquired in sequential scan mode by using the same acquisition parameters. LeicaQ9 Confocal software (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), was used for data analysis.

Anàlisi estadística

The results are presented as mean±SD Statistical analyses were performed using Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) and GraphPad software (GraphPad, San Diego, CA, USA). Student's t -test was used to compare two experimental groups and differences were considered significant when P <0.05. Allele frequencies were estimated by direct counting. The significance of the distribution of alleles between the patients and the controls was tested by the χ 2 -method with Fisher's exact probability test ( P -value test). The odds ratio of the risk of stress cardiomyopathy was calculated by the 2 × 2 contingency table.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Glossari

BAG3

BCL2-associated athanogene 3

TTC

Takotsubo cardiomyopathy

HCMa

human cardiomyocytes adult

SNP

polimorfisme d’un sol nucleòtid

miR-371a-5p

microRNA 371a-5p

RT-PCR

reverse-transcription PCR

3′-UTR

3′-untranslated region

epi

epinephrine

RISC

RNA-induced silencing complex

Ago2

argonaute RISC catalytic component 2

ECG

electrocardiogram

LV

left ventricular

gDNA

genomic DNA

WB

western blotting

DESCANSI EN PAU

RNA-binding protein immunoprecipitation

campament

AMP cíclica

SCR

scrambled

Supplemental Information accompanies this paper on Cell Death and Discovery website (//www.nature.com/cddiscovery)