Orai1 contribueix a l'establiment d'un fenotip resistent a l'apoptosi en cèl·lules canceroses de pròstata | mort i malaltia cel·lular

Orai1 contribueix a l'establiment d'un fenotip resistent a l'apoptosi en cèl·lules canceroses de pròstata | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Canals de calci
  • Mecanismes de malalties
  • Càncer de pròstata

Resum

Són objecte de debat la naturalesa molecular del mecanisme que depèn del calci (Ca 2+ ) i els canals iònics que tenen un paper important en l'apoptosi de les cèl·lules cancerígenes. Aquí, mostrem que la proteïna Orai1 identificada recentment representa el component molecular més important de l’entrada de Ca 2+ endògena que s’emmagatzema (SOCE) endògena en cèl·lules de càncer de pròstata humana (PCa) i constitueix la principal font d’afluència de Ca 2+ que utilitza la cèl·lula. desencadenar l’apoptosi. La baixada de l’Orai1 i, per tant, del SOCE, protegeix les cèl·lules de diverses vies que indueixen l’apoptosi, com ara les induïdes per la thapsigargina (Tg), el factor de necrosi tumoral α i la cisplatina / oxaliplatina. La transfecció de mutants Orai1 funcionals, com R91W, un mutant de selectivitat i L273S, un mutant enrotllat a les cèl·lules, va disminuir significativament tant la SOCE com la taxa d’apoptosi induïda per Tg. Això suggereix que l’acoblament funcional de STIM1 a Orai1, així com l’electricitat Orai1 Ca 2+ com a canal, és necessari per als seus efectes pro-apoptòtics. També hem demostrat que la resistència a l’apoptosi de les cèl·lules PCa independents d’andrògens està associada a la descrelació de l’expressió Orai1 i també a SOCE. El rescat d'Ora1, després de la transfecció d'Ora1 de cèl·lules privades d'esteroides, va restablir el corrent de canal funcionat a la botiga i va restablir la taxa normal d'apoptosi. Així doncs, Orai1 té un paper fonamental en el desencadenament de l’apoptosi, independentment dels estímuls que indueixin l’apoptosi i en l’establiment d’un fenotip resistent a l’apoptosi a les cèl·lules PCa.

Principal

Es coneix que els esdeveniments primerencs i pivotals en l’apoptosi es donen a mitocondris i al reticle endoplasmàtic (ER), on l’alliberament del citocrom c del mitocondri i calci (Ca 2+ ) de l’ER al citosol és un requisit necessari per a l’apoptosi. casos. 1 Independentment dels estímuls induïts per l'apoptosi, una afluència letal de Ca 2+ constitueix una condició sine qua non d'apoptosi. El reclutament de tres principals mecanismes apoptòtics dependents del Ca 2+, mitocondrial, citoplasmàtic i ER, ja estava demostrat (per a ressenyes, vegeu Prevarskaya et al. , 2 Pinton et al. 3 i Norberg et al. 4 ). Tanmateix, fins ara, els mecanismes específics mitjançant els quals es controla la dinàmica de Ca 2+ i pels quals participa el Ca 2+ en cascades apoptòtiques han estat evidents. La funció de Ca 2+ en l’apoptosi és especialment fascinant, sobretot quan considerem la importància de Ca 2+ en la regulació de multitud de processos fisiològics i la implicació d’homeòstasi de Ca 2+ cel·lular pertorbada en la patogènesi.

El càncer de pròstata (PCa) és el segon tumor més letal entre els homes, en què el distintiu principal és la resistència adquirida a l’apoptosi en lloc de la proliferació més gran. 5, 6 L’etapa inicial de la PCa depèn dels andrògens necessaris per al creixement i la supervivència, i en aquest moment la teràpia d’ablació d’andrògens pot ser efectiva per provocar que el tumor es retrocedeixi a causa de la inducció d’apoptosi massiva. Malauradament, la PCa avança en un estadi independent dels andrògens, provocant una recaiguda del càncer amb l’aparició de fenotips cel·lulars més agressius caracteritzats per una major resistència a l’apoptosi. Malgrat un nombre creixent d’estudis, els mecanismes que condueixen a aquests fenotips encara estan mal definits, tot i que la comprensió dels factors que impulsen la resistència a l’apoptosi és essencial per al desenvolupament de noves teràpies per a PCa avançada.

Alguns estudis han demostrat que un important i sostingut flux de desencadenament de Ca 2+ que provoca apoptosi en cèl·lules cancerígenes és proporcionat per una entrada de Ca 2+ capacitada o funcionada en magatzem (entrada de calci capacitiva (CCE) o una entrada de calci operada per magatzem (SOCE)), mediada per canals operats per botigues (SOC). 8, 9 SOC es troben a la membrana plasmàtica (PM) i s’activen per esgotament del magatzem a l’ER. L’entrada de Ca 2+ a través de SOC indueix un augment sostingut de la concentració citosòlica de Ca 2+, restablint així el contingut d’ER Ca 2+ . Per tant, quan s’activen els SOC, regulen concentracions de Ca 2+ citosòliques i ER intraluminals. Aquesta és una de les raons per les quals les SOC s'han convertit en un gran interès com a possibles reguladors d'apoptosi. A més, prèviament, hem demostrat que la inhibició de l’apoptosi en cèl·lules PCa independents dels andrògens va estar associada a la baixada de la SOC, a causa d’una disminució del nombre de canals funcionals. Tot i això, malgrat els progressos considerables en la comprensió de les SOC, encara es desconeix la naturalesa molecular dels canals implicats en l’apoptosi de cèl·lules PCa i, per tant, que contribueix al desenvolupament de la resistència a l’apoptosi.

El nostre treball aquí es va centrar en l'estudi dels mecanismes moleculars implicats en la resistència a l'apoptosi millorada de les cèl·lules PCa en la seva transició cap a la fase hormonal-refractària més agressiva.

Resultats

Expressió Orai1 i STIM1 i la seva participació en CCE en cèl·lules PCa privades d’esteroides

La configuració de cèl·lula sencera de la tècnica patch-pinça es va utilitzar per comparar les amplituds del corrent SOC ( I SOC ) en el carcinoma de ganglis limfàtics de les cèl·lules de pròstata (LNCaP) i les cèl·lules LNCaP privades d’esteroides (LNCaP-ST). Tal com es documenta a la figura 1a – c, I SOC induït per la diàlisi cel·lular, amb la solució bàsica intracel·lular complementada amb IP 3 (100 μ M) o EGTA (5 mM) (EGTA + BAPTA), era aproximadament un 50% inferior en LNCaP -Cèl·lules ST en comparació amb les cèl·lules regulars de LNCaP. Això es va correlacionar molt bé amb la disminució de l’expressió d’Orai1 a les cèl·lules LNCaP-ST (Figura 1d) segons es va analitzar per la PCR quantitativa i la Western blotting (figura 1f). Com que Orai1 és conegut per colocalitzar amb el sensor ER Ca 2+, STIM1, a les interseccions ER – PM i requereix la transferència de STIM1 a estructures puntuals per activar-se, 10 també es va comprovar la expressió STIM1 durant la privació d’esteroides. En contrast amb Orai1, l'expressió de STIM1 va romandre invariable, independentment de si els andrògens estaven presents o no en el medi de cultiu (figura 1d).

Image

L’expressió d’Orai1 i STIM1 en cèl·lules epitelials de càncer de pròstata privades d’esteroides i la seva participació en la SOCE. ( a, b ) Cursos de temps representatius del desenvolupament SOC I (mesurats a −100 mV potencial de retenció) en el control de cèl·lules LNCaP (cercles negres) i LNCaP-ST (quadrats blancs) en resposta a la diàlisi de 100 μ M IP 3 ( a ) o 5 mM EGTA ( b ). ( c ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en control LNCaP (columnes negres, 2, 25 ± 0, 23 pA / pF, n = 23 i 0, 73 ± 0, 18 pA / pF, n = 31, respectivament) i en LNCaP-ST (columnes blanques, 0, 96 ± 0, 32 pA / pF, n = 17 i 0, 42 ± 0, 12 pA / pF, n = 21, respectivament) cèl·lules. ( d ) PCR quantitativa en temps real que mostra l'expressió d'Orai1 i STIM1 en cèl·lules control LNCaP (CT) i cèl·lules LNCaP cultivades durant 3 dies en un medi privat d'esteroides (3 dies). ( e ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en LNCaP després de 24 h de transfecció amb siRNA de control (si-Ctrl, columnes blanques, 1, 78 ± 0, 18 pA / pF, n = 23 i 0, 56 ± 0, 13 pA / pF, n = 22, respectivament) i anti-Orai1 siRNA (si-Orai1, columnes negres, 0, 44 ± 0, 13 pA / pF, n = 19 i 0, 12 ± 0, 06 pA / pF, n = 22, respectivament). ( f ) Un experiment de blot occidental que mostra l'expressió relativa de la proteïna Orai1 després de la retirada d'andrògens a les cèl·lules LNCaP. Les dades es normalitzen a l’expressió de β -actina. ( g ) RT-PCRs representatius que mostren la dinàmica de l'expressió de mRNA d'Orai1 en cèl·lules LNCaP després de 24, 48 o 72 h de transfecció amb siRNA anti-Orai1 (si-Orai1); CT significa les cèl·lules transfectades amb si-RNA de control; els nombres representen les quantitats relatives d'ARNm d'Orai1 en comparació amb l'ARNm de β -actina. ( h ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en LNCaP després de 24 h de transfecció amb siRNA de control (si-Ctrl, columnes blanques, 2, 52 ± 0, 28 pA / pF, n = 18 i 0, 70 ± 0, 05 pA / pF, n = 24, respectivament) i anti-STIM1 siRNA (si-STIM1, columnes negres, 0, 49 ± 0, 23 pA / pF, n = 18 i 0, 11 ± 0, 03 pA / pF, n = 23, respectivament). ( i ) Western blot representatiu que mostra la dinàmica de l'expressió de proteïna hSTIM1 (77 kDa) en cèl·lules LNCaP després de 24, 48 o 72 h de transfecció amb siRNA anti-hSTIM1 (si-STIM1); CT significa les cèl·lules transfectades amb si-RNA de control; els nombres representen quantitats relatives de proteïna hSTIM1 en comparació amb la proteïna β -actina (42 kDa). Al llarg de la figura, ( * ) i ( ** ) denoten diferències estadísticament significatives amb P <0.05 i P <0.02, respectivament.

Imatge a mida completa

Per demostrar la implicació de STIM1 i Orai1 en I SOC en cèl·lules LNCaP, vam realitzar una sèrie d’experiments de derrocament mediats per siRNA. Com es mostra a la Figura 1e – h, un tractament de 24 h amb siRNA contra Orai1 (si-Orai1) va reduir significativament l’ARNm d’Orai1 (Figura 1g) i proteïnes (Figura 2e) a les cèl·lules LNCaP. Això es va paral·lelitzar amb una disminució de la IP 3, així com en la densitat SOC evocada per EGTA + BAPTA I en un 75, 4 ± 7, 5% i un 77, 8 ± 11, 3%, respectivament (Figura 1e). De la mateixa manera, l’ús de siRNA contra STIM1 (si-STIM1) va disminuir específicament l’expressió de proteïna STIM1 en un 80% aproximadament (Figura 1i) i es va correlacionar amb una reducció tant en la densitat de SOC I induïda per EGTA + BAPTA com en un 80, 5 ± 8, 4%. i 83, 5 ± 4, 2%, respectivament (Figura 1h).

Image

La subexpressió d'Orai1 protegeix les cèl·lules LNCaP contra l'apoptosi. ( a ) Cèl·lules apoptòtiques revelades mitjançant la tècnica TUNEL. ( b ) Quantificació mitjançant TUNEL de la velocitat d’apoptosi (Ctrl, tractada amb DMSO, columnes grises) i l’apoptosi induïda per Tg (1 μ M, 24 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP (si-Ctrl) i LNCaP amb cèl·lules si -Silenciació Orai1 mediada per ARN (si-Orai1). ( c ) Quantificació mitjançant la tècnica Hoechst de la velocitat d'apoptosi (Ctrl, tractada amb DMSO, columnes grises) i apoptosi induïda per Tg (1 μ M, 24 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP (si-Ctrl) i LNCaP cèl·lules amb silenciament Orai1 (si-Orai1) mediat per si-RNA. ( d ) Apoptosi induïda per TNF- α (10 ng / ml, 48 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP (si-Ctrl) i cèl·lules LNCaP amb silenciament Orai1 mediat per si-RNA (si-Orai1) (quantificat mitjançant Hoechst tècnica). ( e ) Una representació occidental representativa de la derrota de si-Orai1 a les cèl·lules LNCaP. Les dades es normalitzen a l’expressió de β -actina. Al llarg de la figura, ( * ) i ( *** ) denoten diferències estadísticament significatives amb P <0.05 i P <0.01, respectivament.

Imatge a mida completa

La descrelació de l’Orai1 confereix resistència a l’apoptosi a les cèl·lules LNCaP

A la vista del paper primordial d'Orai1 en la SOCE de les cèl·lules PCa i la disminució de l'expressió d'Oaii1 després de la retirada dels andrògens, es va intentar examinar la participació d'Orai1 en l'apoptosi. Es va fer servir el clàssic inductor d’apoptosi, thapsigargin (Tg, un inhibidor de la bomba SERCA que desencadena una apoptosi depenent del Ca 2+ a través de l’esgotament de la botiga ER Ca 2+ i SOCE (per exemple, Prevarskaya et al. 2 )).

Es va utilitzar la tècnica TUNEL (inclosos els controls negatius i positius) per mesurar la taxa d’apoptosi de les cèl·lules LNCaP (Figura 2a). Les cèl·lules es van transfectar amb si-Orai1 o si-Ctrl i el dia després es van tractar amb 1 μ M TG durant 24 hores. Tal com revela la tinció de TUNEL, un tractament de 24 h amb Tg és suficient per induir l’apoptosi a prop del 50% de les cèl·lules LNCaP (figura 2b). Tanmateix, la derrota de l’expressió Orai1 (amb si-Orai1, figura 2e) va fer que les cèl·lules fossin molt més resistents a l’apoptosi induïda per Tg (4, 24 ± 1, 47 enfront del 48, 4 ± 4, 9%; figura 2b). Aquest resultat va ser confirmat per la tinció nuclear de Hoechst, que va revelar el 27% de l’apoptosi en cèl·lules control després d’un tractament de 24 h Tg i aproximadament un 8% en cèl·lules transfectades si-Orai1 (figura 2c). Així, Orai1 sembla ser un actor important en l’apoptosi induïda per Tg, molt probablement com el proveïdor clau d’afluència letal de Ca 2+ en resposta a l’esgotament de la botiga ER Ca 2+ induïda per Tg i SOCE consecutiva. Per validar el paper d'Orai1 en resposta a senyals fisiològics pro-apoptòtics, vam realitzar experiments similars amb el factor de necrosi tumoral α (TNF α ). El tractament amb TNF α 10 ng durant 48 hores va desencadenar apoptosi en el 7, 25% de les cèl·lules LNCaP de control i en només el 2, 5% de les cèl·lules LNCaP de rebuig Orai1 (figura 2d).

Per avaluar si la subexpressió Orai1 podria estar implicada en la resistència a l’apoptosi induïda per la quimioteràpia, també es va investigar l’apoptosi evocada per cisplatina i oxaliplatina. L’ús de 20 μ M cisplatina (Y) i 40 μ M d’oxaliplatina (X), dos agents d’alquilat molt forts, va donar lloc a una taxa d’apoptosi que es va reduir significativament en les cèl·lules LNCaP de rebaixament d’Orai1 (figura 3a). Fins i tot en el cas d’aquests forts agents alquilants si-Orai1 va ser capaç de protegir les cèl·lules contra l’apoptosi (figura 3b). A més, un pretractament de 24 hores amb cisplatina de 20 μ M o oxaliplatina de 40 μ M va mostrar un augment significatiu estadísticament del nivell de Ca 2+ basal en comparació amb cèl·lules tractades amb DMSO (dades no mostrades). Aquestes dades proporcionen l’evidència del possible enllaç entre l’agent alquilant i l’homeòstasi de Ca 2+ . Així, les nostres dades suggereixen que la subexpressió d'Orai1 pot evitar que l'apoptosi es desencadeni fisiològicament o per quimioteràpies, podent ser important en la progressió del PCa.

Image

El paper d'Orai1 en l'apoptosi induïda per agents alquilants cisplatina i oxaliplatina. ( a ) Imatges representatives de la taxa d'apoptosi mesurada mitjançant la tècnica Hoechst de cèl·lules LNCaP tractades amb cisplatina de 20 μ M. Les fletxes blanques indiquen els nuclis apoptòtics. ( b ) Histograma corresponent que mostra l'apoptosi de cèl·lules LNCaP tractades amb 20 μ M cisplatina (Y) o 40 μ M oxaliplatina (X) en cèl·lules pretractades siCT i siOrai1. ( * ) denota diferències estadísticament significatives amb P <0.05 (quantificades mitjançant la tècnica Hoechst)

Imatge a mida completa

La funció de pèrdua de l’Orai1 protegeix les cèl·lules LNCaP contra l’apoptosi induïda per Tg

Per estudiar més el paper d'Orai1 en l'apoptosi, es van utilitzar dos mutants Orai1 funcionals descrits com a inhibidors del SOC I : el 'mutant de selectivitat' R91W, que impedeix la permeabilitat de Ca 2+ a través d'Orai1, 11 i el 'mutant enrotllat en espiral' L273S, que deteriora la interacció entre STIM1 i Orai1 i inhibeix la seva activació. 12 mesures electrofisiològiques en cèl·lules LNCaP transfectades transitòriament amb el mutant R91W etiquetat per YFP (YFP-Orai1-R91W) o mutant L273S etiquetat amb YFP (YFP-Orai1-L273S) (Figura 4a) van revelar una IP 3 reduïda significativament - i EGTA + BAPTA densitat SOC evocada en comparació amb les cèl·lules LNCaP control, d'acord amb l'acció negativa d'aquests mutants sobre la funció Orai1 endògena.

Image

La funció Loss of Orai1 protegeix les cèl·lules LNCaP contra l’apoptosi induïda per thapsigargin (Tg). ( a ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en cèl·lules LNCaP de control (pcDNA3, columnes negres, 1, 8 ± 0, 15 pA / pF, n = 18 i 0, 8 ± 0, 15 pA / pF, n = 14, respectivament) ) i cèl·lules LNCaP transfectades amb YFP-Orai1 L273S (columnes de color gris fosc, 0, 41 ± 0, 18 pA / pF, n = 18 i 0, 34 ± 0, 12 pA / pF, n = 16, respectivament) o YFP-Orai1 R91W (columnes grises, 0, 46 ± 0, 12 pA / pF, n = 18 i 0, 25 ± 0, 08 pA / pF, n = 16, respectivament). ( b ) Quantificació de l’apoptosi de base (pcDNA3, tractada amb DMSO, columnes grises) i l’apoptosi induïda per Tg (1 μ M, 24 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP (Ctrl) i cèl·lules LNCaP transfectades amb Orai1-L273S o Mutants Orai1-R91W (quantificats mitjançant la tècnica Hoechst). ( c ) Quantificació de les densitats SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en cèl·lules LNCaP de control (Ctrl, columnes grises, 2, 1 ± 0, 18 pA / pF, n = 19 i 19 ± 2, 8 pA / pF, n = 32, respectivament) ) i cèl·lules LNCaP co-transfectades amb YFP-STIM1 i CFP-Orai1 (columnes negres, 0, 75 ± 0, 12 pA / pF, n = 16 i 3, 1 ± 0, 75 pA / pF, n = 33, respectivament). ( d ) Quantificació de l’apoptosi de base (pcDNA3, tractada amb DMSO, columnes grises) i l’apoptosi induïda per Tg (1 μ M, 24 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP (pcDNA3) i cèl·lules LNCaP co-transfectades amb YFP- STIM1 i CFP-Orai1 (quantificades mitjançant la tècnica Hoechst). ( e ) Imatges representatives de la cèl·lula LNCaP co-transfectada amb YFP-STIM1 (esquerra) i CFP-Orai1 (mig) i la seva superposició (dreta). Una barra blanca del tauler esquerre representa 5 μ m de distància. Al llarg de la figura, ( * ) i ( ** ) denoten diferències estadísticament significatives amb P <0.05 i P <0.01, respectivament.

Imatge a mida completa

A més, similar al que s'ha observat amb un knockout Orai1 mediat per siRNA, les cèl·lules LNCaP transfectades amb qualsevol mutant Orai1 van mostrar una resistència millorada a l'apoptosi induïda per Tg. Una exposició de 24 hores a Tg va causar un 22 ± 4% d’apoptosi a les cèl·lules LNCaP de control i a les cèl·lules transfectades amb YFP-Orai1-R91W o YFP-Orai1-L273S, la taxa d’apoptosi va disminuir aproximadament entre el 70 i el 80% ( 6 ± 3% i 5 ± 2%, respectivament; Figura 4b).

En conjunt, aquestes dades indiquen que Orai1 forma una via d’entrada de Ca 2+ major necessària en l’apoptosi induïda per Ca 2+ : la regulació baixa o la pèrdua de la funció Orai1 desencadena la resistència a l’apoptosi. D'altra banda, el guany de funció d'Orai1 en coexpressar tant STI1 etiquetat amb CFP com Orai1 i YFP STIM1 en cèl·lules LNCaP va produir un augment de deu vegades en la densitat de SOC I en resposta a la infusió de IP 3 o EGTA + BAPTA en comparació amb els controls respectius (figura 4c). Al mateix temps, la co-expressió d’Orai1 i STIM1 va duplicar més l’apoptosi induïda per Tg (50 ± 6% enfront de la taxa d’apoptosi 22 ± 4%; figura 4d). El control de transfeccions STIM1 marcades amb CFP Orai1 i YFP en cèl·lules LNCaP es va realitzar mitjançant microscòpia confocal (Figura 4e). Així, l'amplificació de SOCE a causa de la sobreexpressió d'Orai1 i STIM1 es correlaciona amb el marcat augment de l'apoptosi induïda per Tg.

El rescat d'Ora1 restableix l'apoptosi induïda per Ca 2+ a les cèl·lules LNCaP-ST: una possible regulació per andrògens

Hem demostrat que la disminució de l’expressió Orai1 i la densitat de I SOC eren responsables de la resistència a l’apoptosi de cèl·lules LNCaP-ST privades d’andrògens. Per demostrar més el paper d'Orai1 en l'apoptosi, vam rescatar l'expressió Orai1 a les cèl·lules LNCaP-ST. Les cèl·lules van ser transfectades amb Orai1 etiquetat amb CFP. La sobreexpressió Orai1 a les cèl·lules LNCaP-ST va donar lloc a un augment aproximat de dues densitats tant de densitats de SOC IP 3 - com de EGTA + BAPTA activades en comparació amb els respectius controls (Figura 5a), cosa que indica que la sobreexpressió Orai1 era capaç, almenys en part, de rescat de les SOC desregregades per la privació dels andrògens. Aquest rescat fonamentalment va restablir la taxa d'apoptosi induïda per Tg de cèl·lules sobreexpressores Orai1 (del 9 ± 4% al 16 ± 6%), apropant-la al valor de les cèl·lules normals LNCaP (24 ± 7%, figura 5b).

Image

El rescat d'Orai1 en cèl·lules de càncer de pròstata privades d'andrògens aboleix la resistència a l'apoptosi. ( a ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 i EGTA + BAPTA en cèl·lules control LNCaP-ST (pcDNA3, columnes grises, 0, 89 ± 0, 13 pA / pF, n = 13 i 0, 33 ± 0, 11 pA / pF, n = 14, respectivament) i cèl·lules LNCaP-ST transfectades amb CFP-Orai1 (columnes negres, 2, 1 ± 0, 18 pA / pF, n = 21 i 0, 75 ± 0, 12 pA / pF, n = 23, respectivament). ( b ) Quantificació de l’apoptosi de base (pcDNA3, tractada amb DMSO, columnes grises) i l’apoptosi induïda per Tg (1 μ M, 24 h, columnes negres) en cèl·lules control LNCaP i en cèl·lules LNCaP-ST amb o sense Orai1 rescatat per transfecció amb CFP-Orai1 (quantificat mitjançant la tècnica Hoechst). ( c ) Quantificació de densitats de SOC I induïdes per EG 3 + i EGTA + BAPTA en LNCaP després de 48 h de transfecció amb siRNA de control (si-Ctrl, columnes blanques, 2, 01 ± 0, 19 pA / pF, n = 19 i 0, 78 ± 0, 25 pA / pF, n = 18, respectivament) i si anti-AR siRNA (si-AR, columnes negres, 0, 81 ± 0, 14 pA / pF, n = 21 i 0, 32 ± 0, 10 pA / pF, n = 15, respectivament). ( d ) RT-PCRs representatius que mostren canvis en l'expressió d'ARNm de Orai1 i androgen receptor (AR) en cèl·lules LNCaP després de 48 h de transfecció amb siRNA anti-AR (si-AR) en comparació amb les cèl·lules transfectades amb si-RNA de control (CT) ; els nombres representen quantitats relatives de mRNA d'Orai1 i AR en comparació amb l'ARNm de β -actina. Al llarg de la figura, ( * ) i ( ** ) denoten diferències estadísticament significatives amb P <0.05 i P <0.02, respectivament.

Imatge a mida completa

Per establir el vincle entre Orai1 i el fenotip PCa independent dels andrògens, es va intentar examinar si el receptor d’andrògens (AR) podria regular l’expressió Orai1. Per demostrar directament que el gen o rai1 depèn de l’AR funcional, es va utilitzar siRNA contra AR (si-AR). Com es mostra a la figura 5d, després de 48 h de transfecció de siAR, el nivell d’ARNm d’Orai1 es va reduir en un 70% a les cèl·lules LNCaP. Els experiments amb pinça de pinça utilitzant cèl·lules transfectades de siAR van revelar que el seu SOC IP evocat amb IP 3 i EGTA + BAPTA també es va reduir en un 63% i un 67%, respectivament (Figura 5c). Aquest resultat indica que l'AR podria regular l'expressió Orai1. Per estudiar aquesta regulació potencial, també hem utilitzat el programa MatInspector 7.7.3 (Genomatix Software GmbH, Munic, Alemanya) per analitzar els llocs d’enllaç de put putat al promotor Orai1 (vegeu la secció adequada de la discussió).

Discussió

L’aparició de resistència apoptòtica a les cèl·lules canceroses és un pas crucial per al desenvolupament i la progressió de la PCa humana cap al fenotip hormonal refractari i androgènic. En el present estudi, informem de tres principals troballes que permetran comprendre els mecanismes per a l’adquisició de la resistència a l’apoptosi per part de les cèl·lules PCa: (i) la disminució de la SOC SOC endògena és un tret característic del fenotip independent d’andrògens, causat per la baixada del canal Orai1; (ii) les regulacions tant de l'expressió Orai1 com de la SOC I són utilitzades per les cèl·lules PCa per desenvolupar la resistència a l'apoptosi crucial per al desenvolupament de PCa i la seva progressió a la fase hormonal-refractària; (iii) Orai1 és un enllaç comú entre Ca 2+ i apoptosi, independentment de la naturalesa dels estímuls desencadenants de l'apoptosi.

La implicació de mecanismes dependents de Ca 2+ en la inducció i la regulació de l’apoptosi ja està ben establerta. Les alteracions en la capacitat d’emmagatzematge de l’ER i l’activitat SOC semblen tenir un paper important en l’establiment d’un fenotip resistent a l’apoptosi resistent a l’apoptosi de les cèl·lules PCa. De fet, com hem demostrat en els nostres treballs anteriors sobre fenotips independents dels andrògens, resistents a l’apoptosi de cèl·lules PCa LNCaP (com ara cèl·lules LNCaP privades d’andrògens, cèl·lules LNCaP que sobreexpressen la proteïna Bcl-2 anti-apoptòtica i cèl·lules LNCaP diferenciades de neuroendocrina), l’augment de la resistència a l’apoptosi induïda per Tg i TNF- α es caracteritza per (i) l’ompliment de Ca 2+ basal reduït de la piscina ER i (ii) l’entrada de Ca 2+ reduïda en botiga. 5, 13 El desencadenant principal de l’apoptosi a les cèl·lules dependents dels andrògens és l’esgotament del magatzem d’ER i és possible que ni tan sols sigui necessària una afluència de Ca 2+ . Curiosament, per a les cèl·lules independents dels andrògens, l'esgotament del magatzem ER no és suficient per induir la mort cel·lular sense l'afluència letal de Ca 2+ de la SOCE. 2, 9, 14 Per tant, la identificació de la naturalesa molecular del SOC i dels seus mecanismes d’activació / regulació són de gran importància per controlar l’apoptosi de cèl·lula PCa independent dels andrògens.

Durant els darrers anys, s'ha identificat i caracteritzat un nou candidat molecular per a SOC anomenat Orai1. Orai1 media els corrents CRAC i la SOCE en una gran varietat de cèl·lules i participa en una àmplia gamma de funcions cel·lulars, inclosa la proliferació de cèl·lules endotelials, 15 proliferació de limfòcits, 16 activació de les cèl·lules mastes, 13 així com el desenvolupament del múscul esquelètic i una funció contràctil. Tot i això, malgrat el paper pivot suggerit dels SOC en la resistència a l’apoptosi de les cèl·lules PCa, mai s’ha estudiat la participació d’Orai1 en la SOC específica de pròstata, així com en l’apoptosi dependent de Ca 2+ .

En el present estudi, hem demostrat que Orai1, un canal iònic en el PM, i STIM1, com a transductor de senyal de l'ER, representen els components moleculars principals de la SOCE a les cèl·lules epitelials PCa: l'eliminació mediada per siRNA de qualsevol d'ells. disminueix fortament el SOC en cèl·lules LNCaP. Tanmateix, com només es va trobar una expressió Orai1 que disminuïa en les cèl·lules LNCaP després de la privació dels andrògens, es va plantejar que la baixada de la I SOC, que segueix la transició de les cèl·lules PCa a la independència dels andrògens i la resistència a l’apoptosi, està associada, almenys en part, a la reducció dels nivells d’Ora1.

La teràpia d’ablació d’andrògens en l’adenocarcinoma de pròstata indueix una involució del teixit de la pròstata principalment mitjançant la millora de l’apoptosi cel·lular. Tanmateix, apareix un subconjunt de cèl·lules malignes com a nova població de cèl·lules resistents a l’apoptosi. L’enriquiment de la pròstata amb fenotips cel·lulars amb el temps fa que pràcticament tots els tumors recaigui en un tipus independent i androgènia, de forma més agressiva en creixement. 18

Els andrògens tenen un paper essencial en la carcinogènesi de pròstata i la independència dels andrògens del fenotip més maligne independent dels andrògens, que se sap que es deriva de la pèrdua de la AR (per exemple, Bonkhoff 19 ). Per tant, vam suposar que la disminució de l’expressió Orai1 i la densitat de SOC I després de la inducció de la diferenciació de cèl·lules LNCaP per retirada d’andrògens es produeix perquè l’expressió del gen orai1 podria estar regulada per l’AR funcional. Les nostres dades mostren que el silenciament AR a les cèl·lules LNCaP condueix a una disminució dramàtica de l’expressió Orai1, així com de la densitat I SOC . L’estructura del promotor d’un gen clàssic androgènic dependent com l’antigen específic de la pròstata inclou generalment un element sensible als andrògens (ARE) proper al lloc d’inici transcripcional i altres zones situades a diversos parells de kilobasa aigües amunt dins dels potenciadors. 20 Per tal d’estimar una possible regulació del gen orai1 per AR, es va estudiar la seqüència del promotor d’ Orai1 humà. Per a l'anàlisi del factor de transcripció es va utilitzar la seqüència genòmica corresponent a 6200 pb aigües amunt i 100 pb aigües avall de hOrai1 ATG. El programa MatInspector 7.7.3 es va utilitzar per analitzar els llocs d'enquadernació AR. 21 La seqüència del promotor orai1 es va analitzar per a la presència de AREs mitjançant una matriu específica de la pròstata, associada a factors de transcripció expressats i transcripcionalment actius en aquest teixit. Es van identificar diverses àrees: tres d'elles situades a -3700, -4105 i -4700 pb del codó Orai1 ATG amb més del 80% de semblança de la matriu. Aquests resultats poden suggerir que Orai1 és probablement un gen sensible als andrògens a la pròstata. D'altra banda, tenint en compte que Orai1 representa un component clau del SOC específic per a la pròstata, hem estimat que la disminució dels SOC funcionals durant la progressió de PCa a l'etapa agressiva independent dels andrògens resulta de la baixada de l'AR funcional i, finalment, de la desregulació d' Orai1 .

La transició al fenotip independent dels andrògens no només influeix en l’expressió Orai1 i en la SOCE, sinó que, el que és més important, l’adquisició de resistència a l’apoptosi també. Hem detectat que la susceptibilitat de les cèl·lules a la inducció de l’apoptosi dependent de Ca 2+ sempre estava en correlació directa amb l’expressió Orai1 i la densitat I SOC : com més baixa sigui la densitat actual (és a dir, baixa expressió d’Ora1), més alta és la resistència a l’apoptosi. (és a dir, baixa taxa d’apoptosi). Aquesta correlació existia independentment de les eines experimentals utilitzades per reduir l’expressió i l’activitat Orai1: l’estat de dependència dels andrògens de les cèl·lules LNCaP (és a dir, la privació d’andrògens o el silenciament d’AR), la baixada regulada de mutants Orai1 (anti-Orai1 siRNA) o Orai1. Curiosament, els efectes pro-apoptòtics d'Orai1 eren independents dels estímuls inductors per l'apoptosi. La regulació descendent d’Orai1 pot disminuir l’augment citosòlic sostingut de Ca 2+ i protegir les cèl·lules PCa de l’apoptosi. Primer hem utilitzat un inductor d'apoptosi de tipus 2- Ca, de tipus T 2, de qualitat. Tg és una eina molt potent i, fins i tot, es va proposar fins i tot recentment com a "bomba intel·ligent" per orientar-se a PCa independent dels andrògens. 22 Les nostres dades demostren que l’apoptosi evocada per Tg estava mediada predominantment mitjançant l’activació d’Orai1 i que la derrota eficient d’aquesta pot ser un mitjà important per protegir la cèl·lula de la mort eventual. Per distingir entre una apoptosi depenent de Ca 2+ directa i indirecta, es va utilitzar un altre inductor d’apoptosi, TNF α , una citocina proinflamatòria que desregula l’homeòstasi de Ca 2+ induint estrès ER. Segons les nostres observacions anteriors, TNF α és un agent pro-apoptòtic eficaç de cèl·lules epitelials PCa. 9 De fet, l’apoptosi induïda per TNF α de les cèl·lules LNCaP; tanmateix, fins i tot aquest mecanisme no directe amb dependència del Ca 2+ va ser bloquejat significativament per la derrota d'Orai1, cosa que suggereix que l'entrada de Ca 2+ mediada per Orai1 té un paper important en l'apoptosi, especialment en la seva fase inicial. A més, es van utilitzar altres dos inductors forts d'apoptosi: cisplatina i oxaliplatina. Aquests agents alquilants reaccionen in vivo en unir-se i provocar la reticulación de l'ADN, que en última instància desencadena l'apoptosi (per a una revisió, vegeu Gonzalez et al. 23 ). El dany a l'ADN provocat per Cisplatí sembla un procés llarg i complex de mort cel·lular i perquè el cisplatí és un fàrmac inespecífic que reacciona no només amb l'ADN, sinó també amb proteïnes, hi ha la possibilitat que es faci un procés més senzill d'inici, com ara el dany al citoplasmàtiques. proteïnes poden tenir lloc. 23 A més, la inhibició del proteasoma indueix estrès ER i també activa la resposta de proteïna desplegada, provocant així l’apoptosi. 24 Cisplatin també s'ha demostrat que estimula l'estrès ER i augmenta la dilatació ER, els nivells de Ca 2+ intracel·lulars i la mort cel·lular. 25 Això eventualment uneix la cisplatina amb l'estrès ER i l'augment dels nivells de Ca 2+ intracel·lulars, la qual cosa pot ser inhibida amb èxit per la fallada d'Orai1 amb la consegüent baixada de la SOC i l'apoptosi en general. De fet, anteriorment hem demostrat que l’estrès ER indueix l’entrada de Ca 2+, 26 i vam observar que el pretractament de 24 hores amb cisplatina o oxaliplatina augmenta el citoplasmàtic [Ca 2+ ].

Finalment, estudis recents, relacionats amb l’activació d’Orai1, han demostrat que la sobreexpressió tant d’Orai1 com de STIM1 indueix un augment de 20 vegades en la SOC I , provocant un “CRAC monstre”. El guany de la funció SOC a les cèl·lules LNCaP dependents dels andrògens en resposta a la sobreexpressió d’Orai1 i STIM1 es va manifestar per l’aparició d’un SOC I d’ alta amplitud, que va provocar la millora marcada de l’apoptosi dependent de Ca 2+ . A més, el rescat de la funció SOC per la sobreexpressió d'Orai1 en cèl·lules LNCaP resistents a l'apoptosi amb andrògens és capaç de restablir la taxa d'apoptosi propera a la de les cèl·lules PCa dependents dels andrògens. Aquest resultat és especialment impressionant, ja que és rellevant per al desenvolupament de teràpies de perspectiva per a PCA avançats i independents dels andrògens.

Així, hem demostrat la participació d’Orai1 com a component molecular principal de les SOC natives a l’apoptosi dependent de Ca 2+ de les cèl·lules PCa. Els nostres resultats conclouen que la transició al fenotip PCa independent dels andrògens està associada a la pèrdua de l’expressió Orai1 que condueix a la baixada de la SOCE, que impedeix augment de citosòlics de Ca 2+ que siguin prou suficients per induir l’apoptosi mitjançant mecanismes mitocondrials i citosòlics coneguts. . A més, la reducció de la SOCE pot contribuir a l’abastament crònic de les botigues ER Ca 2+, que representen el nou estat d’equilibri per a les cèl·lules PCa independents d’andrògens, 2 millorant encara més la seva resistència a l’apoptosi (figura 6).

Image

Diagrama esquemàtic que resumeix les principals conclusions d’aquest estudi. La progressió cap a PCa independent dels andrògens s’associa amb l’aparició de nous fenotips cel·lulars caracteritzats per disminució de la SOCE a causa de la descregulació d’Orai1, que redueix en una resistència més gran a l’apoptosi depenent de Ca 2+ . Aquest procés natural, ocorregut en tumors in vivo , es pot imitar pel silenciament artificial de l’expressió Orai1 o la inhibició de la funció Orai1 amb mutants dominants-negatius. D'altra banda, rescatar Orai1 en fenotips de cèl·lules PCa independents dels andrògens pot restablir la taxa normal d'apoptosi independent de Ca 2+, proporcionant així els mitjans per a les teràpies en perspectiva de PCa avançada

Imatge a mida completa

Les nostres dades són coherents amb la idea que SOCE i Orai1 són protagonistes importants en la inducció de l’apoptosi. Tot i això, sembla que l’apoptosi no és l’únic procés relacionat directament amb la SOCE. Un estudi recent va revelar que Orai1 / STIM1 i SOCE també són essencials per a la migració de cèl·lules tumorals de mama, la invasió i la metàstasi. 28 S'ha demostrat també que SOCE i STIM1 / Orai1 participen en la migració, la proliferació, la progressió 29 i el cicle cel·lular. 30 Així, Orai1 / STIM1 i SOCE semblen tenir un paper important en l'ampli espectre de conductes relacionades amb el càncer relacionades amb el Ca 2+ i es preveu que tinguin un impacte significatiu en les futures investigacions.

Glossari

AR

receptor d’andrògens

Ca 2+

calci

CCE

entrada de calci capacitat

ER

reticle endoplàsmic

I SOC

Actualitat SOC

LNCaP

Carcinoma de ganglis limfàtics de les cèl·lules de la pròstata

LNCaP-ST

LNCaP privat d’esteroides

PCa

càncer de pròstata

PM

membrana plasmàtica

SOC

canals funcionats a la botiga

SOCE

entrada de calci a la botiga

Tg

thapsigargin

TNF α

factor de necrosi tumoral α